CN104286828A - 一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖的制备方法 - Google Patents

一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品或医药技术领域，具体涉及一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖的制备方法。所述组合物包括0.01-90重量份松茸醇和/或松茸多糖、0.01-30重量份维生素、0.01-30重量份矿物质。本发明所述的组合物具有抗氧化，能够提神补脑、抗衰老、增强人体免疫力的作用。根据本发明的制成组合物保留松茸中的松茸醇等生理活性物质的组合物，该组合物可以用于制备口服液、药酒等。

Description

一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖的制备方法
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖制备方法。
背景技术
松茸是世界上珍稀名贵的天然药用菌、我国二级重点保护野生物种。松茸含有18种氨基酸、14种人体必需微量元素、49种活性营养物质、5种不饱和脂肪酸、8种维生素、2种糖蛋白、丰富的膳食纤维和多种活性酶，另含有3种珍贵的活性物质，分别是双链松茸多糖、松茸多肽和全世界独一无二的抗癌物质——松茸醇，是世界上最珍贵的天然药用菌类。松茸的营养价值和药用价值极高。现代医学表明，松茸具有提高免疫力、抗癌抗肿瘤、治疗糖尿病及心血管疾病、抗衰老养颜、促肠胃保肝脏等多种功效，因此又在全球范围内被广泛用于研发药品、保健品和化妆品。
发明内容
本发明的目的是利用发酵技术提供一种松茸维生素组合物。本发明主要解决的技术问题是提供一种制作工艺简单、口味较好、抗氧化，能够提神补脑、抗衰老、增强人体免疫力的含有松茸的组合物。根据本发明的制成组合物保留松茸中的松茸醇等生理活性物质的组合物，该组合物可以用于制备口服液、药酒等。
本发明的另一个目的是提供一种松茸醇制备方法，该方法采用共生发酵的方法制得松茸醇。
本发明的另一个目的是提供一种松茸多糖制备方法，该方法采用共生发酵的方法制得松茸多糖。
本发明通过下述技术方案实现的。
一种松茸维生素组合物，所述组合物包括0.01-90重量份松茸醇和/或松茸多糖、0.01-30重量份维生素、0.01-30重量份矿物质。
一种松茸维生素组合物，所述组合物包括0.01-90重量份松茸醇和/或松茸多糖、0.01-30重量份维生素、0.01-30重量份矿物质、0.01-50重量份番茄红素和/或谷胱甘肽。
所述的松茸多糖和/或松茸醇由松茸子实体或发酵松茸菌粉制备而得。
所述的维生素为维生素A、维生素B族、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素H、维生素P、维生素PP、维生素M、维生素T、维生素U、生物素、胡萝卜素、类胡萝卜素、叶酸、烟酰胺、泛酸中的一种或几种。
所述的矿物质为钙、铁、锌、硒、磷、钾、氯、镁、铜、锰、碘、铬、钼、镍、锡、硅、钒、钻、硫、钠、氟、锶中的一种或几种。
所述的松茸醇由以下方法制备：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵0.1-180小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比5-20％接入共生发酵培养基中，在20-40℃，搅拌转速为50-600转/分钟、通气速率为30-50升/分钟条件下发酵1-20天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐的一种或几种；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉或麦芽膏粉5-100g/L、葡萄糖10-200g/L、松针汁或松树愈伤组织匀浆液100-900ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入酶制剂于40-55℃下进行水解1-6小时后迅速加热到80-150℃并保温1-5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩或氮吹浓缩后在30-80℃下真空干燥使含水量为5％-11％，得到发酵松茸粉；所述的酶制剂为纤维素酶、内生青霉菌纤维素酶、风味蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、果胶酶或β-葡萄糖苷酶中的一种或几种；
步骤3：将发酵松茸粉与浓度为60％-100％的乙醇按重量比100：(1-200)的比例混合后，于20-70℃、20-80KHz下超声波处理1-120分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力为20-50MPa、温度为30-60℃条件下萃取1-24小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
步骤4：将重量比为(0-5)：1：(1-5)的海藻糖、蔗糖、葡萄糖，加入1-20倍的水中混合均匀并加热至70-98℃成熔融状态，冷却到40-70℃时边搅拌边加入占水重量1-40％的松茸醇粗提物，在2000-5000rpm转速下搅拌1-30分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在20-40℃下均质0.1-5小时；将均质过的混合液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥，加工成松茸醇微胶囊粉；或将均质过的混合液置于-10--25℃温度下冷冻24小时后取出，放入真空度20-50pa的冷冻干燥器中冻干，粉碎后得到松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备用。
所述的松茸多糖由以下方法制备：
将发酵松茸粉按ml∶g为(5-70)∶1加入水中，在超声功率100-500W、温度70-100℃的条件下提取1-3次，每次3-20min；将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4℃静置过夜，在2000-5000rpm下离心3-30min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
所述的松茸产香菌为松茸子囊果组织中分离的菌种、松茸孢子、松茸内生菌、松茸共生菌的一种或几种。
所述的松茸产香菌种子液由以下方法制备：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各5-10g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡10-60min，从中取100-1000μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧或厌氧条件下用平板划线分离或稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲或菌液形式；对菌株可以通过自然变异或人工诱导变异来提高松茸醇含量；所述筛选培养基由葡萄糖或蔗糖5-300克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏0.1-20克/升、磷酸二氢钾0.1-10克/升、硫酸镁0.01-10克/升、松针汁或松树内生菌发酵液1-900毫升/升、琼脂1-30克/升，pH值4-9组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在20-40℃、转速0-150rpm条件下振荡培养1-40小时，连续转接1-5次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖1-50克/升、松针汁或松树内生菌发酵液1-900毫升/升、蛋白胨1-10克/升、酵母膏1-10克/升、硫酸镁0.1-5克/升、磷酸二氢钾0.1-5克/升组成，pH4-10。
所述的松树内生菌发酵液由以下方法制备：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，20-40℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，20-40℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由葡萄糖或蔗糖5-300克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏0.1-20克/升、磷酸二氢钾0.1-10克/升、硫酸镁0.01-10克/升、新鲜松茸汁或松茸产香菌发酵液1-200克/升、琼脂1-30克/升组成，pH值4-9；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，20-40℃活化1-48小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养1-10天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖20-50克/升，蛋白胨1-20克/升，硫酸镁1-10克/升，磷酸二氢钾1-10克/升，琼脂10-30克/升组成，pH4-8。
实施例
实施例1
松茸维生素组合物包括0.01g松茸醇、0.01g维生素A、0.3g钙、0.1g铁、2.3g氯、0.8g镁。
松树内生菌发酵液的制备方法：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，20℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，20℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由葡萄糖5克/升、蛋白胨1克/升、酵母膏0.1克/升、磷酸二氢钾0.1克/升、硫酸镁0.01克/升、新鲜松茸汁1克/升、琼脂1克/升组成，pH值4；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，20℃活化1小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养1天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖20克/升，蛋白胨1克/升，硫酸镁1克/升，磷酸二氢钾1克/升，琼脂10克/升组成，pH4。
松茸产香菌种子液的制备方法：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各5g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡10min，从中取100μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用平板划线分离纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲；所述筛选培养基由葡萄糖5克/升、蛋白胨1克/升、酵母膏0.1克/升、磷酸二氢钾0.1克/升、硫酸镁0.01克/升、松针汁1毫升/升、琼脂1克/升，pH值4组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在20℃、转速0-150rpm条件下振荡培养1小时，连续转接1次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖1克/升、松针汁1毫升/升、蛋白胨1克/升、酵母膏1克/升、硫酸镁0.1克/升、磷酸二氢钾0.1克/升组成，pH4。
松茸醇的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵1小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比5％接入共生发酵培养基中，在20℃，搅拌转速为50转/分钟、通气速率为30升/分钟条件下发酵1天得共生发酵液，所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L、松针汁100ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入纤维素酶于40℃下进行水解1小时后迅速加热到80℃并保温1小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在30℃下真空干燥使含水量为5％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉100g与浓度为60％的乙醇1g混合后，于20℃、20KHz下超声波处理1分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力为20MPa、温度为30℃条件下萃取1小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
步骤4：将海藻糖5g、蔗糖5g、葡萄糖5g，加入10倍的水中混合均匀并加热至90℃成熔融状态，冷却到40℃时边搅拌边加入占水重量10％的松茸醇粗提物，在2000rpm转速下搅拌10分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在20℃下均质0.5小时；将均质过的混合液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥，加工成松茸醇微胶囊粉，放入橡木桶储存备用。
实施例2
松茸维生素组合物包括10g松茸多糖、1g维生素B族、1g维生素C、0.7g维生素E、1.8g维生素H、1.2g胡萝卜素、0.5g叶酸、3g烟酰胺、0.1g钙、2.2g磷、2.8g钾、0.7g镁、1.4g锌、0.04g铬、0.03g钒、0.04g钴、3.5硫、0.08g锶。
松树内生菌发酵液的制备方法：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，40℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，40℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由蔗糖300克/升、蛋白胨100克/升、酵母膏20克/升、磷酸二氢钾10克/升、硫酸镁10克/升、松茸产香菌发酵液200克/升、琼脂30克/升组成，pH值9；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，40℃活化48小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养10天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖50克/升，蛋白胨20克/升，硫酸镁10克/升，磷酸二氢钾10克/升，琼脂30克/升组成，pH8。
松茸产香菌种子液的制备方法：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各10g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡60min，从中取1000μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在厌氧条件下用稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌液形式；所述筛选培养基由蔗糖300克/升、蛋白胨100克/升、酵母膏20克/升、磷酸二氢钾10克/升、硫酸镁10克/升、松树内生菌发酵液900毫升/升、琼脂30克/升，pH值9组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在40℃、转速150rpm条件下振荡培养40/小时，连续转接5次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖50克/升、松树内生菌发酵液900毫升/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁5克/升、磷酸二氢钾5克/升组成，pH10。
松茸多糖的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵10小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比20%接入共生发酵培养基中，在40℃，搅拌转速为600转/分钟、通气速率为50升/分钟条件下发酵20天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由麦芽膏粉100g/L、葡萄糖200g/L、松树愈伤组织匀浆液900ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入果胶酶于55℃下进行水解6小时后迅速加热到150℃并保温5小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后在80℃下真空干燥使含水量为11％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉10g加入50ml水中，在超声功率500W、温度100℃的条件下提取3次，每次3min；将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4℃静置过夜，在2000rpm下离心30min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
实施例3
松茸维生素组合物包括19g松茸醇、23g松茸多糖、0.3g维生素A、0.9g维生素P、7.3g维生素M、5g胡萝卜素、3.8g铁、2.3g锌、6.8g氯、0.2g碘、0.01g铬、0.7g镁、0.09g铜、0.01g锰。
松树内生菌发酵液的制备方法：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，30℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，30℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由蔗糖100克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、磷酸二氢钾1克/升、硫酸镁0.05克/升、新鲜松茸汁10克/升、琼脂10克/升组成，pH值5；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，30℃活化10小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养3天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖30克/升，蛋白胨5克/升，硫酸镁2克/升，磷酸二氢钾3克/升，琼脂15克/升组成，pH5。
松茸产香菌种子液的制备方法：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根6g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡20min，从中取300μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用平板划线分离纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由蔗糖50克/升、蛋白胨30克/升、酵母膏10克/升、磷酸二氢钾2克/升、硫酸镁3克/升、松针汁150毫升/升、琼脂15克/升，pH值6组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在30℃、转速100rpm条件下振荡培养5小时，连续转接3次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖20克/升、松针汁700毫升/升、蛋白胨3克/升、酵母膏7克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾1.5克/升组成，pH9。
松茸醇的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵80小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比10％接入共生发酵培养基中，在30℃，搅拌转速为200转/分钟、通气速率为35升/分钟条件下发酵15天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、葡萄糖、松针汁、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L、松针汁300ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入β-葡萄糖苷酶于50℃下进行水解2小时后迅速加热到100℃并保温1.5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在50℃下真空干燥使含水量为8％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉100g与浓度为100％的乙醇150g混合后，于30℃、40KHz下超声波处理100分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力为25MPa、温度为36℃条件下萃取12小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
步骤4：将海藻糖0.5g、蔗糖1g、葡萄糖2.5g，加入40g水中混合均匀并加热至78℃成熔融状态，冷却到47℃时边搅拌边加入占水重量20％的松茸醇粗提物，在2500rpm转速下搅拌13分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在24℃下均质0.5小时；将均质过的混合液置于-10℃温度下冷冻24小时后取出，放入真空度20pa的冷冻干燥器中冻干，粉碎后得到松茸醇微胶囊粉，放入橡木桶储存备用。
松茸多糖的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵100小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比18％接入共生发酵培养基中，在30℃，搅拌转速为550转/分钟、通气速率为40升/分钟条件下发酵8天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、松针汁、麸皮汁、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由麦芽膏粉80g/L、葡萄糖120g/L、松树愈伤组织匀浆液500ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入芽孢杆菌蛋白酶于48℃下进行水解3.5小时后迅速加热到90℃并保温2.7小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在40℃下真空干燥使含水量为8％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉5g按加入水350ml中，在超声功率370W、温度78℃的条件下提取2次，每次10min；将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4℃静置过夜，在2800rpm下离心20min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
实施例4
松茸维生素组合物包括90g松茸醇、0.8g维生素A、3.2g维生素C、0.7g维生素E、1.2g维生素PP、0.3g维生素T、5.2g生物素、2.3g胡萝卜素、0.9g类胡萝卜素、1.3g叶酸、0.8g泛酸、4.7g铁、2.3g锌、6.8g氯、0.7g镁、2.1g铜、0.5g番茄红素。
松树内生菌发酵液的制备方法：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，25℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，25℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由葡萄糖100克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏5克/升、磷酸二氢钾2克/升、硫酸镁5.5克/升、松茸产香菌发酵液180克/升、琼脂20克/升组成，pH值7；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，40℃活化20小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养7天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖30克/升，蛋白胨18克/升，硫酸镁4克/升，磷酸二氢钾2克/升，琼脂30克/升组成，pH6。
松茸产香菌种子液的制备方法：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各7g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡40min，从中取800μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由葡萄糖100克/升、蛋白胨70克/升、酵母膏6克/升、磷酸二氢钾3克/升、硫酸镁2克/升、松针汁300毫升/升、琼脂1-30克/升，pH值5组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在40℃、转速0-150rpm条件下振荡培养20小时，连续转接4次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖30克/升、松针汁600毫升/升、蛋白胨4克/升、酵母膏1.8克/升、硫酸镁0.9克/升、磷酸二氢钾3.8克/升组成，pH7。
松茸醇的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵130小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比8％接入共生发酵培养基中，在28℃，搅拌转速为500转/分钟、通气速率为45升/分钟条件下发酵16天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉80g/L、葡萄糖150g/L、松针汁850ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入纤维素酶于50℃下进行水解5.5小时后迅速加热到90℃并保温3.7小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后在60℃下真空干燥使含水量为10％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉10g与2000g浓度为70％的乙醇按混合后，于50℃、60KHz下超声波处理100分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力为35MPa、温度为50℃条件下萃取18小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
步骤4：将海藻糖50g、蔗糖10g、葡萄糖40g，加入100g水中混合均匀并加热至88℃成熔融状态，冷却到60℃时边搅拌边加入占水重量25％的松茸醇粗提物，在4500rpm转速下搅拌8分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在20℃下均质3小时；将均质过的混合液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥，加工成松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备用。
实施例5
松茸维生素组合物包括20g松茸醇、3g维生素D、4g维生素E、5.2g维生素K、2.8g维生素P、0.7g维生素PP、0.03g硒、3.2g氯、0.05g镁、0.09g铜、1.2g碘、0.07g铬、0.05g钼、0.02g镍、0.01g锡、0.03g硅、0.01g钒、0.02g钴、2.3g硫、3.2g钠、0.02g氟、0.04g锶、0.01g谷胱甘肽。
松树内生菌发酵液的制备方法：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，35℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，35℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由葡萄糖100克/升、蛋白胨1-1090克/升、酵母膏5克/升、磷酸二氢钾2克/升、硫酸镁0.5克/升、新鲜松茸汁150克/升、琼脂18克/升组成，pH值4-9；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35℃活化25小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养3天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖40克/升，蛋白胨5克/升，硫酸镁9克/升，磷酸二氢钾2.5克/升，琼脂25克/升组成，pH8。
松茸产香菌种子液的制备方法：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各9g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡40min，从中取500/μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌液形式；所述筛选培养基由葡萄糖250克/升、蛋白胨50克/升、酵母膏1克/升、磷酸二氢钾3克/升、硫酸镁5克/升、松树内生菌发酵液650毫升/升、琼脂2克/升，pH值5组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在2∶5℃、转速100rpm条件下振荡培养20小时，连续转接4次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖20克/升、松针汁900毫升/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁0.1克/升、磷酸二氢钾0.1克/升组成，pH10。
松茸醇的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵2小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比9％接入共生发酵培养基中，在25℃，搅拌转速为160转/分钟、通气速率为45升/分钟条件下发酵19天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉90g/L、葡萄糖180g/L、松树愈伤组织匀浆液500ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入内生青霉菌纤维素酶于55℃下进行水解2小时后迅速加热到140℃并保温4.5小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后在60℃下真空干燥使含水量为9％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉20g与浓度为98％的乙醇3000g混合后，于68℃、70KHz下超声波处理90分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力为40MPa、温度为55℃条件下萃取18小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
步骤4：将海藻糖8g、蔗糖10g、葡萄糖30g，加入1-20倍的水中混合均匀并加热至95℃成熔融状态，冷却到65℃时边搅拌边加入占水重量20％的松茸醇粗提物，在4500rpm转速下搅拌3分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在30℃下均质2.5小时；将均质过的混合液置于：-25℃温度下冷冻24小时后取出，放入真空度40pa的冷冻干燥器中冻干，粉碎后得到松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备用。
实施例6
松茸维生素组合物包括15g松茸多糖、0.7g维生素PP、2.7g维生素M、1.5g维生素T、3.1g维生素U、4.2g生物素、0.6g胡萝卜素、2.1g类胡萝卜素、5.2g叶酸、1g烟酰胺、1g泛酸、4.6g钙、3.8g铁、2.1g锌、0.09g硒、1.6g磷、5.2g钾、2.7g氯、3g番茄红素。
松树内生菌发酵液的制备方法：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，38℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，25℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由葡萄糖200克/升、蛋白胨30克/升、酵母膏15克/升、磷酸二氢钾7克/升、硫酸镁1克/升、新鲜松茸汁200克/升、琼脂10克/升组成，pH值7；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35℃活化28小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养8天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖30克/升，蛋白胨16克/升，硫酸镁3克/升，磷酸二氢钾2克/升，琼脂20克/升组成，pH4.5。
松茸产香菌种子液的制备方法：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各8g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡50min，从中取200μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在厌氧条件下用稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由葡萄糖180克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏0.5克/升、磷酸二氢钾2.5克/升、硫酸镁3.5克/升、松树内生菌发酵液700毫升/升、琼脂18克/升，pH值6组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在20℃、转速150rpm条件下振荡培养20小时，连续转接3次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖30克/升、松针汁750毫升/升、蛋白胨9克/升、酵母膏3克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸二氢钾0.5克/升组成，pH5。
松茸多糖的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵10小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比12％接入共生发酵培养基中，在25℃，搅拌转速为400转/分钟、通气速率为40升/分钟条件下发酵16天得共生发酵液；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉80g/L、葡萄糖170g/L、松针汁550ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入风味蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶于50℃下进行水解2.6小时后迅速加热到110℃并保温1.5小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后在75℃下真空干燥使含水量为6％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉3g加入水60ml中，在超声功率450W、温度90℃的条件下提取1次，每次20min；将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4℃静置过夜，在4500rpm下离心10min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
实施例7
松茸维生素组合物包括9g松茸多糖、1g维生素C、3g维生素E、0.8g维生素K、2.1g维生素P、0.9g维生素PP、3.2g维生素M、2.1g维生素U、7.1g胡萝卜素、0.3g叶酸、1.7g烟酰胺、3.9g钙、0.08g硒、2.2g磷、1.8g钾、2.8g氯、0.2g铜、0.02g锰、0.7g碘、2.7g硫、3.2g钠、10g谷胱甘肽。
松树内生菌发酵液的制备方法：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，40℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，35℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由蔗糖150克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏2克/升、磷酸二氢钾3克/升、硫酸镁0.9克/升、新鲜松茸汁180克/升、琼脂17克/升组成，pH值7.5；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35℃活化28小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养7天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖45克/升，蛋白胨14克/升，硫酸镁7克/升，磷酸二氢钾3克/升，琼脂20克/升组成，pH4.5。
松茸产香菌种子液的制备方法：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各7g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡45min，从中取800μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在厌氧条件下用稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由葡萄糖300克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏6克/升、磷酸二氢钾3克/升、硫酸镁2克/升、松针汁750毫升/升、琼脂28克/升组成，pH值8.5；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在30℃、转速130rpm条件下振荡培养28小时，连续转接3次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖30克/升、松树内生菌发酵液650毫升/升、蛋白胨7克/升、酵母膏4.5克/升、硫酸镁3.8克/升、磷酸二氢钾2.5克/升组成，pH6.8。
松茸多糖的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵18小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比9％接入共生发酵培养基中，在30℃，搅拌转速为550转/分钟、通气速率为48升/分钟条件下发酵12天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入葡萄糖、麸皮汁、蛋白胨、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉60g/L、葡萄糖120g/L、松树愈伤组织匀浆液700ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入果胶酶于45℃下进行水解3.5小时后迅速加热到120℃并保温2.8小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后在50℃下真空干燥使含水量为10％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉30g加入水1000g中，在超声功率380W、温度100℃的条件下提取3次，每次10min；将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4℃静置过夜，在3000rpm下离心20min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
实施例8
松茸维生素组合物包括30g松茸醇、45g松茸多糖、1g维生素A、1.3g维生素B族、0.7g维生素C、0.9g维生素D、2.4g维生素E、1.7g维生素K、1.6g维生素H、1g维生素P、0.9g维生素PP、1g维生素M、2.3g维生素T、1.5g维生素U、1.1g生物素、1.9g胡萝卜素、3.1g类胡萝卜素、1g叶酸、2g烟酰胺、1g泛酸、3.01g钙、2.3g铁、2.4g锌、0.3g硒、1.2g磷、2.3g钾、2.7g氯、0.3g镁、0.05g铜、0.02g锰、0.2g碘、0.01g铬、0.01g钼、0.01g镍、0.01g锡、0.02g硅、0.01g钒、0.03g钴、3.5硫、3.6g钠、0.02氟、0.01g锶、23g番茄红素、27g谷胱甘肽。
松树内生菌发酵液的制备方法：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，400恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，20℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由葡萄糖100克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏2克/升、磷酸二氢钾3克/升、硫酸镁3.5克/升、新鲜松茸汁180克/升、琼脂15克/升组成，pH值8.5；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35℃活化24小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养5天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖40克/升，蛋白胨18克/升，硫酸镁3.5克/升，磷酸二氢钾7.8克/升，琼脂25克/升组成，pH5.5。
松茸产香菌种子液的制备方法：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各8g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡45min，从中取950μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在厌氧条件下用稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由葡萄糖180克/升、蛋白胨75克/升、酵母膏13克/升、磷酸二氢钾7克/升、硫酸镁3.8克/升、松树内生菌发酵液550毫升/升、琼脂23克/升，pH值6.5组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在35℃、转速150rpm条件下振荡培养30小时，连续转接4次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖44克/升、松树内生菌发酵液700毫升/升、蛋白胨5克/升、酵母膏4.8克/升、硫酸镁3.8克/升、磷酸二氢钾2.8克/升组成，pH8.8。
松茸醇的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵100小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比8％接入共生发酵培养基中，在25℃，搅拌转速为350转/分钟、通气速率为30升/分钟条件下发酵7天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉70g/L、葡萄糖130g/L、松树愈伤组织匀浆液600ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入纤维素酶、风味蛋白酶于55℃下进行水解3小时后迅速加热到120℃并保温3.8小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩在40℃下真空干燥使含水量为6％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉20g与浓度为75％的乙醇3500g混合后，于45℃、75KHz下超声波处理80分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力为40MPa、温度为30℃条件下萃取4小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
步骤4：将海藻糖3g、蔗糖1g、葡萄糖4.5g，加入水150g中混合均匀并加热至95℃成熔融状态，冷却到50℃时边搅拌边加入占水重量35％的松茸醇粗提物，在5000rpm转速下搅拌20分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在40℃下均质1小时；将均质过的混合液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥，加工成松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备用。
松茸多糖的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵20小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比15％接入共生发酵培养基中，在30℃，搅拌转速为480转/分钟、通气速率为30升/分钟条件下发酵8天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入松针汁、维生素、无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉30g/L、葡萄糖110g/L、松树愈伤组织匀浆液200ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入芽孢杆菌蛋白酶、β-葡萄糖苷酶于55℃下进行水解3小时后迅速加热到130℃并保温3.5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在60℃下真空干燥使含水量为6.5％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉50g加入水1000ml中，在超声功率450W、温度80℃的条件下提取3次，每次20min；将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4℃静置过夜，在2000rpm下离心20min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
实施例9
松茸维生素组合物包括30g松茸醇、60g松茸多糖、3g维生素A、3g维生素E、5g维生素K、7g维生素PP、1g维生素T、4g类胡萝卜素、1g叶酸、6g泛酸、0.9g铁、0.7g锌、0.07g硒、1.3g磷、1.28g钾、3.1g氯、0.7g镁、0.09g铜、0.01g锰、0.5g番茄红素、3.8谷胱甘肽。
松树内生菌发酵液的制备方法：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，30℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，35℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由葡萄糖200克/升、蛋白胨50克/升、酵母膏13克/升、磷酸二氢钾7.3克/升、硫酸镁0.9克/升、新鲜松茸汁170克/升、琼脂22克/升组成，pH值6.5；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35℃活化36小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养7天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖45克/升，蛋白胨18克/升，硫酸镁3克/升，磷酸二氢钾6克/升，琼脂22克/升组成，pH5。
松茸产香菌种子液的制备方法：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各8g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡40min，从中取700μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用平板划线分离纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌液形式；所述筛选培养基由蔗糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、磷酸二氢钾1克/升、硫酸镁1克/升、松树内生菌发酵液900毫升/升、琼脂10克/升，pH值4.9组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在30℃、转速120rpm条件下振荡培养30小时，连续转接5次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖30克/升、松树内生菌发酵液700毫升/升、蛋白胨8克/升、酵母膏3克/升、硫酸镁1.5克/升、磷酸二氢钾2.5克/升组成，pH9.5。
松茸醇的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵38小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比15％接入共生发酵培养基中，在35℃，搅拌转速为350转/分钟、通气速率为40升/分钟条件下发酵18天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由麦芽膏粉10g/L、葡萄糖150g/L、松针汁350ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入内生青霉菌纤维素酶于40℃下进行水解3小时后迅速加热到110℃并保温3.5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在50℃下真空干燥使含水量为5％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉100g与浓度为65％的乙醇10000g的比例混合后，于50℃、40KHz下超声波处理110分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力为25MPa、温度为55℃条件下萃取10小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
步骤4：将海藻糖0.8g、蔗糖1g、葡萄糖3g，加入1-20倍的水中混合均匀并加热至75℃成熔融状态，冷却到60℃时边搅拌边加入占水重量30％的松茸醇粗提物，在4000rpm转速下搅拌15分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在30℃下均质3.5小时；将均质过的混合液置于-15℃温度下冷冻24小时后取出，放入真空度30pa的冷冻干燥器中冻干，粉碎后得到松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备用。
松茸多糖的制备方法：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵90小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比10％接入共生发酵培养基中，在28℃，搅拌转速为300转/分钟、通气速率为38升/分钟条件下发酵16天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、葡萄糖、松针汁、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉60g/L、葡萄糖50g/L、松针汁200ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得的共生发酵液加入芽孢杆菌蛋白酶于48℃下进行水解4.5小时后迅速加热到110℃并保温4.5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在60℃下真空干燥使含水量为11％，得到发酵松茸粉；
步骤3：将发酵松茸粉7g加入水300ml中，在超声功率200W、温度80℃的条件下提取3次，每次20min；将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4℃静置过夜，在4000rpm下离心20min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
试验例
试验例1：全身免疫的活化-迟发型超敏反应
为了检测对肿瘤抗原产生的特异的全身免疫应答的活化，进行迟发型超敏反应的评价。对迟发型超敏反应的评价方法进行说明。
试验药物：取实施例1-9所得组合物各1g，加入100ml注射用水中，待用。
实验方法：以腹水的形式采取Sarcoma180肿瘤细胞，该细胞在ICR小鼠(雌性，4周龄)腹腔内移植传代，用生理盐水调成3x107/ml。用25G注射器将该细胞稀释液移植到ICR小鼠(雌性，4周龄)的右腰背部皮下，0.1ml/只。
次日，根据体重进行分组(7只/组)，进行个体标记后，开始施用药物1-9组。1日1次经口施用，施用5次后休息2天，共进行9次。每次的施用量是0.1ml/kg。
各组提供7只小鼠，正常小鼠提供3只，进行迟发型超敏反应(DTH：Delayer TypeHypersensitivity)试验。即，在肿瘤移植后第9天(开始施用后第8天)，向右足垫注射50μl生理盐水作为对照，向左足垫注射50μl将Sarcoma180细胞进行3M KC1可溶化法或冻融法(处理5x107/ml细胞悬浮液)而得到的肿瘤抗原溶液，24小时后，测定左右足的厚度，根据下面的公式算出足的肿胀程度，进行DTH反应的检测。
足肿(mm)-左足厚度(mm)-右足厚度(mm)
表1：迟发型超敏反应：足肿(mm)
*1：正常小鼠由于未进行肿瘤移植(抗原致敏)，所以未发生DTH反应。
t-检验：Student/st-检验：分别将各组相对于无处置组进行t-检验。
N.S.：无显著性差异；P＜0.05，有显著性差异；p＜0.01有显著性差异。
如表1所示，正常小鼠、无处置组基本未见到足肿胀，与此相对，实施例组与无处置组相比可见到显著性的足肿胀。这些结果提示，经本发明所述组合物可诱导针对肿瘤抗原的全身性免疫应答。
试验2：抗疲劳试验
试验药物：
对照组：生理盐水
取实施例1-9所得组合物各1g，加入100ml注射用水中，待用。
将上述各组药物分别加入1000ml水中，浸泡36小时，待用。
试验动物：动物2-3月龄，昆明种雄性健康小鼠，体重(25±3)g。
试验方法：将实验动物小鼠分为10组，每组12只小鼠，进行5天水浸饲养。水浸饲养是指在塑料笼内装入水深1.5cm的水的状态下进行饲养。在此环境下，对于逃避水的大鼠来说不能得到充分的睡眠、不能采用休息姿势，精神上和肉体上总是处于不能休息的状态。已知当进行7天以上的水浸饲养后便开始出现死亡个体，进行5天水浸饲养后的大鼠可以说是实现疲劳困惫而过劳死的动物模型。从水浸饲养的第1天开始，1天1次以灌胃法，每天以10ml/kg给药量给小鼠灌胃不同药物，对照组给予等量蒸馏水。第6天进行各项抗疲劳指标的测定。
进行5天的水浸饲养后，使大鼠在载荷相当于体重80％的重物的状态下游泳，测定直到鼻尖被水没过10秒以上的时间，记录游泳时间用于评价疲劳度。血清尿素氮的测定：①血清的制备：末次给小鼠受试剂30min后，将小鼠不负重置于水深30cm的游泳箱中，水的温度控制在30℃左右，游泳90min，休息30min后立刻尾部采血，采血大约0.5ml(不加抗凝剂)。置4℃冰箱约3h，血凝固后2500r/min离心15min，取血清并测定血清尿素氮值。②尿素氮测定方法：按文献[魏旭东.3种血清尿素氮测定方法的比较[J].重庆医学.1997，26(4)：246.]方法测定。肝糖原的测定：①肝糖原的提取：末次给小鼠受试剂30min后，立刻脱颈处死，取肝脏，迅速以滤纸吸去附着的血液。称取约1g，置乳钵中，加洗净细砂少许及10％三氯乙酸1ml研磨。再加5％三氯乙酸2ml继续研磨，至肝脏组织已经充分磨成肉糜状为止。然后以2500r/min离心10min。将上清液转入另一离心管并量取体积，加入同体积的95％乙醇，混合后，静置10min。此时糖原成絮状沉淀析出。沉淀溶液以2500r/min离心10min。弃去上清液，并将离心管倒置于滤纸上2min。沉淀内加入蒸馏水1ml用玻璃棒搅拌沉淀至溶解。②肝糖原的测定：按文献方法蒽酮-浓硫酸法测定肝糖原含量，每组重复3次，取平均值。
表2：力竭游泳时间
注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与药物1组比较ΔP＜0.05。
表3：血清尿素氮含量
注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与药物1组比较ΔP＜0.05。
表4：肝糖原含量
注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与药物1组比较ΔP＜0.05。
试验结论：上述试验表明，本发明药物组合物对抗疲劳具有很好作用。
试验3：松茸多糖含量测定
对比例
精密称取干燥的松茸子实体粉末约5g置索氏提取器中，加入石油醚(沸程60～90℃)100ml90℃回流提取1小时脱脂，放置干燥，挥发溶剂后，加甲醇100ml，95℃水浴回流1小时，重复提取1次，放置干燥，挥发溶剂后加100ml蒸馏水，沸水浴回流1.5小时，重复提取1次，合并水提液，减压浓缩至小体积，加入乙醇使乙醇浓度达80％，醇沉过夜，沉淀物用乙醇洗2次，挥发溶剂后干燥得对照品。
1、标准溶液的制备
标准葡萄糖溶液：精密称取105℃烘干至恒重的葡萄糖对照品25mg，置于250ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.1mg/ml的葡萄糖溶液。使用时，再稀释成浓度为20.0、40.0、60.0、80.0、100.0μg/ml的标准使用液。
5％苯酚溶液：取苯酚100g，加入铝片0.1g和NaH2CO30.05g蒸馏，收集182℃馏分，称取12.58精制苯酚，加入适量蒸馏水溶解后转移至250ml容量瓶中定容，置冰箱内备用。
2、标准曲线的绘制
精密移取蒸馏水2.00ml和上述标准葡萄糖溶液各2.00ml置于干燥的具塞试管中，加入5％苯酚溶液1.00ml摇匀，立即加入浓H2SO45.00ml充分摇匀，室温放置15分钟后置40℃的水浴中加热10分钟，取出再放置15分钟，以加入蒸馏水的溶液做空白，在490nm处测定吸光度。以葡萄糖的浓度C(μg/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制吸光度-葡萄糖浓度的关系曲线，其线性回归方程为C＝0.21216A-6.37×10-3，相关系数r＝0.9971，葡萄糖含量在20.0～100.0μg/ml范围内呈良好的线性关系。
3、松茸多糖含量测定
取对照品、实施例2、3、6、7、8、9提取并经105℃干燥至恒重的松茸多糖50mg，置于50ml容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，摇匀，准确吸取10ml，置100ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，配成0.1mg/ml的松茸多糖溶液。吸取上述溶液0.5ml，置25.0ml容量瓶中，加蒸馏水补充至2ml，依法测定吸光度值，并代入回归方程计算，求得松茸多糖的相对含量。
4.松茸多糖的含量测定结果
表5松茸多糖粗提物相对含量
组别 吸光度 浓度(mg/ml) 相对含量
对比例 0.185 0.0326 65.20％
实施例2 0.216 0.0398 79.60％
实施例3 0.232 0.0427 85.40％
实施例6 0.215 0.0395 79.00％
实施例7 0.225 0.0414 82.80％
实施例8 0.229 0.0422 84.40％
实施例9 0.22 0.0405 81.00％
从表4可见，对比例中的松茸多糖的含量为65.2％；本发明实施例的的松茸多糖的含量为79.00％-85.40％，平均为82.03％；本发明实施例的的松茸多糖的含量比对比例平均提高松茸多糖含量17个百分点，差异显著(P＜0.05)。
试验4：松茸醇含量测定
对比例
称取干燥的松茸子实体粉末约2～4g，精密称定，置具塞三角瓶中，加入乙酸乙酯-丙酮(1∶1)30mL，25℃超声提取40min，滤过，残渣再同法超声提取1次。合并上清液，减压蒸干，残渣加入石油醚(20ml×3次)，超声洗涤3次，离心分离。弃去石油醚液，残渣挥干石油醚，加入氯仿(20ml×4次)，超声振荡，离心分离。上清液合并，减压浓缩至干，作为待用样品。
1、标准溶液的制备
标准葡萄糖溶液：精密称取80℃烘干至恒重的葡萄糖对照品100mg，定容至100ml，吸取2.5ml于25ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.1mg/ml的葡萄糖溶液。
2、标准曲线的绘制分别吸取标准葡萄糖溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9ml于不同的试管中，补水至1ml，并分别加入0.2％蒽酮-硫酸4ml，(先加入的浸入冰水中，各管加完后一起沸水浴)，管口用硅胶试管塞塞住，沸水浴10min，用自来水冷却，室温放置10min，于415nm吸光度A。以葡萄糖的浓度C(μg/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制吸光度-葡萄糖浓度的关系曲线，其线性回归方程为C＝0.07605A+10.032，相关系数r＝0.9996，葡萄糖含量在20.0～100.0μg/ml范围内呈良好的线性关系。同样处理的1ml蒸馏水作为对照。
3、松茸醇含量测定
取对照品、实施例1、3、4、5、8、9提取并经105℃干燥至恒重的松茸醇50mg，置于50ml容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，摇匀，准确吸取10ml，置100ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，配成0.1mg/ml的松茸醇溶液。吸取上述溶液0.5ml，置25.0ml容量瓶中，加蒸馏水补充至2ml，依法测定吸光度值，并代入回归方程计算，求得松茸醇的相对含量。4.松茸醇的含量测定结果
表6松茸醇粗提物相对含量
组别 吸光度 浓度(mg/ml) 相对含量
对比例 0.2085 0.0113 22.60％
实施例1 0.2436 0.0167 33.40％
实施例3 0.2566 0.0176 35.20％
实施例4 0.2407 0.0165 33.00％
实施例5 0.2465 0.0169 33.80％
实施例8 0.2493 0.0171 34.20％
实施例9 0.2552 0.0175 35.00％
从表6可见，对比例中的松茸醇的含量为22.6％；本发明实施例的的松茸醇的含量为34.20％-35.20％，平均为34.10％；本发明实施例的的松茸醇的含量比对比例平均提高松茸醇含量12个百分点，差异显著(P＜0.05)。

Claims (10)

1.一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述组合物包括0.01-90重量份松茸醇和/或松茸多糖、0.01-30重量份维生素、0.01-30重量份矿物质。
2.根据权利要求1所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述组合物包括0.01-90重量份松茸醇和/或松茸多糖、0.01-30重量份维生素、0.01-30重量份矿物质、0.01-50重量份番茄红素和/或谷胱甘肽。
3.根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的松茸多糖和/或松茸醇由松茸子实体或发酵松茸粉制备而得。
4.根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的维生素为维生素A、维生素B族、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素H、维生素P、维生素PP、维生素M、维生素T、维生素U、生物素、胡萝卜素、类胡萝卜素、叶酸、烟酰胺、泛酸中的一种或几种。
5.根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的矿物质为钙、铁、锌、硒、磷、钾、氯、镁、铜、锰、碘、铬、钼、镍、锡、硅、钒、钴、硫、钠、氟、锶中的一种或几种。
6.根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的松茸醇由以下方法制备：
步骤1：将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵0.1-180小时后，再将松茸产香菌种子液按照体积比5-20％接入共生发酵培养基中，在20-40℃，搅拌转速为50-600转/分钟、通气速率为30-50升/分钟条件下发酵1-20天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐的一种或几种；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉或麦芽膏粉5-100g/L、葡萄糖10-200g/L、松针汁或松树愈伤组织匀浆液100-900ml/L制成；
步骤2：将步骤1所得共生发酵液加入酶制剂于40-55℃下进行水解1-6小时后迅速加热到80-150℃并保温1-5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩或氮吹浓缩后在30-80℃下真空干燥使含水量为5％-11％，得到发酵松茸粉；所述的酶制剂为纤维素酶、内生青霉菌纤维素酶、风味蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、果胶酶或β-葡萄糖苷酶中的一种或几种；
步骤3：将发酵松茸粉与浓度为60％-100％的乙醇按重量比100：(1-200)的比例混合后，于20-70℃、20-80KHz下超声波处理1-120分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在萃取釜压力为20-50MPa、温度为30-60℃条件下萃取1-24小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
步骤4：将重量比为(0-5)∶1∶(1-5)的海藻糖、蔗糖、葡萄糖，加入1-20倍的水中混合均匀并加热至70-98℃成熔融状态，冷却到40-70℃时边搅拌边加入占水重量1-40％的松茸醇粗提物，在2000-5000rpm转速下搅拌1-30分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在20-40℃下均质0.1-5小时；将均质过的混合液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥，加工成松茸醇微胶囊粉；或将均质过的混合液置于-10--25℃温度下冷冻24小时后取出，放入真空度20-50pa的冷冻干燥器中冻干，粉碎后得到松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备用。
7.根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的松茸多糖由以下方法制备：
将权利要求6步骤2所得的发酵松茸粉按ml：g为(5-70)∶1加入水中，在超声功率100-500W、温度70-100℃的条件下提取1-3次，每次3-20min；将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4℃静置过夜，在2000-5000rpm下离心3-30min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
8.根据权利要求6所述的松茸产香菌，其特征在于，所述的松茸产香菌为松茸子囊果组织中分离的菌种、松茸孢子、松茸内生菌、松茸共生菌的一种或几种。
9.根据权利要求6所述的松茸产香菌，其特征在于，所述的松茸产香菌种子液由以下方法制备：
步骤1：取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外生菌根各5-10g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡10-60min，从中取100-1000μL液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧或厌氧条件下用平板划线分离或稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲或菌液形式；所述筛选培养基由葡萄糖或蔗糖5-300克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏0.1-20克/升、磷酸二氢钾0.1-10克/升、硫酸镁0.01-10克/升、松针汁或松树内生菌发酵液1-900毫升/升、琼脂1-30克/升，pH值4-9组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
步骤2：将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在20-40℃、转速0-150rpm条件下振荡培养1-40小时，连续转接1-5次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖1-50克/升、松针汁或松树内生菌发酵液1-900毫升/升、蛋白胨1-10克/升、酵母膏1-10克/升、硫酸镁0.1-5克/升、磷酸二氢钾0.1-5克/升组成，pH4-10。
10.根据权利要求6所述的松树内生菌发酵液，其特征在于，由以下方法制备：
步骤1：选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75％的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米的小块分别接种到PDA培养基平板上，20-40℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，20-40℃纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生菌；筛选培养基由葡萄糖或蔗糖5-300克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏0.1-20克/升、磷酸二氢钾0.1-10克/升、硫酸镁0.01-10克/升、新鲜松茸汁或松茸产香菌发酵液1-200克/升、琼脂1-30克/升组成，pH值4-9；
步骤2：将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，20-40℃活化1-48小时得到松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养1-10天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基由葡萄糖20-50克/升，蛋白胨1-20克/升，硫酸镁1-10克/升，磷酸二氢钾1-10克/升，琼脂10-30克/升组成，pH4-8。
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