CN106190902A - 富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，是属于生产活性乳酸菌发酵剂工艺技术领域。由富硒鍺普通酸乳发酵剂，富硒锗活性益生菌的酸乳发酵剂，富硒鍺直投式酸乳发酵剂及发酵及条件的确定感官化学酸的测定，富硒鍺能力的测定组成。这种含活性乳酸菌发酵剂与硒和锗三者的结合，所开发的富硒鍺活性乳酸菌功能性乳制品，能更好地发挥三者的保健功能，从而推进乳业制品的发展，为人们补硒锗元素防癌，抗肿瘤，抗炎症，抗病毒，抗衰老，排毒止痒，延年益寿，预防疾病提高人类的健康水平起到了一定的积极推动作用。

Description

富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺

技术领域：

本发明公开了一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，是属于生产活性乳酸菌发酵剂工艺技术领域。

背景技术：

研究表明，人体的克山病，大骨节病，癌症，心血管病，糖尿病，肌体免疫力肩托和衰老等80余种疾病均与缺硒有关，我国是个缺硒的国家，多数土壤中硒含量小于0.01μg/mL，这对于要达到人体预防疾病的需要量来说，是微不足道的。适量补硒对于人体有益。但是如果服用过量则会产生一定毒副作用，会出现疲倦，体重下降，呕吐，口中有金属味感，皮肤改变，脱发，声音沙哑，牙齿脱落和指甲断裂等症状。因此科学补硒，研究开发安全的富硒乳制品非常必要。

锗是一种具有多种生物活性的微量元素，近年科学发现，锗对于人体健康具有积极作用，有抗肿瘤，抗炎症，抗病毒，抗衰老等生理作用。据瑞典和美国报道，有机锗治疗恶性淋巴癌，卵巢癌，子宫肌瘤，大肠癌，前列腺癌和黑色素癌均有较好的疗效。因此，有机锗被誉为“人类健康的保护神”。锗主要由消化道吸收，吸收后的锗经血液分布到体内各脏器，大部分位于细胞外血浆中，小部分在血细胞里，口服3h后小肠浓度最高，肾和肝浓度也较高，最后从尿和粪便排除体外，无明显的蓄积作用。有机锗的保健剂量为15-30mg/d。

大量的动物性实验和临床研究已证明有机锗与生命具有重要的联系。有机锗Ge-132不仅是一种免疫强化剂，而且还是一种免疫调节剂。麻生等人实验证明了Ge-132抗癌，抗高血压，抗衰老作用是通过机体诱发干扰素及增强自然杀伤细胞(NK)细胞活性，巨噬细胞获得实现的，有机锗能增加机体免疫功能已被临床证实。现在国内有学者进行用有机锗治疗艾滋病的尝试。艾滋病患者获得满意疗效。病人的症状及NK细胞活性，T细胞亚群等有明显改善。

锗能诱发干扰素，活化负责保卫身体的细胞，从面调节免疫系统，故此对各类型癌症都有显著效果。

嗜酸乳杆菌是人体肠道中的重要微生物，与人体健康息息相关，它能改善调节人体肠道微生物群的平衡，增强机体的免疫力，减低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞的形成等，起到健康促进效果。近年来，随着高新生物工程技术和食品科技的发展，一些含乳酸菌的保健食品相继出现，同时也出现了一些硒强化食品，但是把两者有机结合在一起的富硒活性乳酸菌功能性乳制品还未见报道，更未见有三者的结合本发明。通过研究开发富硒鍺活性乳酸菌功能性乳制品，将上述三者结合起来，更好发挥三者保健功能，从而推进乳业的发展，为人们预防疾病，提高健康水平起到积极的作用。

发明内容：

本发明的目的是在于提供一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺。

本发明的技术解决方案是：

1、一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：由富硒锗活性普通酸乳发酵剂工艺，其工艺方法是：

嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的相对比列在1∶1～2∶1之间，通常为1∶1保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌之间存在共生现象，保加利亚乳杆菌由于具有较强的蛋白水解活性可在发酵初期分解乳中酪蛋白而形成缬氨酸等氨基酸和多肽以促进嗜热链球菌的生长；在嗜热链球菌生长过程中产生的甲酸和乳脲活动产生的CO₂能够刺激保加利亚乳杆菌生长。

在发酵初期，嗜热链球菌生长快，发酵1h后与保加利亚乳杆菌的比例为(3～4)∶1.当pH值从6.5下降到5.5时，保加利亚乳杆菌的生长开始加快，而嗜热链球菌的生长由于乳酸的抑制作用逐渐减慢，这是因为保加利亚乳杆菌对酸的生长由于乳酸的抑制作用逐渐减慢，这是因为保加利亚乳杆菌对酸的敏感性较差，在介质pH值在4.4，这时其新陈代谢活动才受到抑制。当pH值下降到5.0左右时，保加利亚乳杆菌控制了酸乳的发酵。当pH值下降到4.6左右时，酪蛋白开始凝聚，乳开始凝结，此时保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的数量相近。而酸乳在冷藏等后酸化过程中，占优势的保加利亚乳杆菌继续发酵乳糖产酸，当酸乳的pH值下降到3.5时，保加利亚乳杆菌细胞壁或细胞膜丧失了调节作用，细胞内外pH值趋于一致，从而使乳糖酶活性受到抑制。

2、一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：由富硒锗活性益生菌的酸乳发酵剂工艺，其工艺特征是：

在发酵时间内酸乳的pH值低于4.4，嗜酸乳杆菌的菌数将下降2～4个数量级，而双歧杆菌的接种量控制在5％左右，乳酸菌接种量为0.5％，以便延缓乳酸菌在培养过程中的对数生长期，阻止产酸过快与凝乳形成过早，以利于嗜酸乳杆菌和双岐杆菌在混合培养中提前进入对数增殖过程。为了避免乳酸菌产酸过早对益生菌的生长产生不利影响，可采用两步发酵法生产酸乳，使产品中益生菌数量提高4～5倍，贮存6周后产品中益生菌的数量仍可达10⁷CFU/g。另外，提高酸乳中蛋白质，肽，氨基酸，抗坏血酸，半胱氨酸和β-半乳糖酶的含量，可明显提高酸乳中益生菌的活菌数。

3、一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：由富硒锗活性工艺直投是酸乳发酵剂工艺，其方法是：直投式酸乳发酵剂的生产过程，主要包括以下几个步骤：

(1)优良菌种的选育和保藏 生产优质的商品化发酵剂关键在于使用优良菌种。乳酸菌的筛选方向主要有：①筛选抗冷冻，抗干燥，抗剪切力等抗逆性强的菌株。②筛选乳糖和半乳糖利用率高的阳性菌株，以多产乳酸；③筛选黏性菌种以提高产胞外多糖等粘性物质，从而增加产品黏度，提高产品的浓厚质地，并减少凝胶断裂及乳清析出等质量缺陷的发生；④酸乳发酵过程中会经常由于噬菌体的污染而导致发酵迟缓甚至发酵失败，因此要求有相应的抗噬菌体菌株以备轮换⑤柠檬酸能够被分解成为二乙酰等酸乳特有风味物质，所以柠檬酸利用菌能够增强酸乳的特有风味；⑥筛选双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等益生菌时，菌株最好能耐受人的胆汁酸盐和酸性环境，以增强其有效性。

筛选得到的纯培养物置于超低温冰箱或液氮罐中长期保藏，以保持其活性和稳定性。

(2)菌种的移植 在进行发酵剂的工厂化生产以前在实验室和菌种车间进行菌种的活化和移植，并进行种子液的扩大培养。

(3)培养基的配置和灭菌 制备直投是酸乳发酵剂，首先要对乳酸菌进行高浓度培养。在选择好基础培养基后，要找到合适的增强因子对培养基进行强化，得到优化培养基，一是乳酸菌的繁殖达到最大。

(4)接种培养 制备直投是酸乳发酵剂需要获得高浓度的细胞培养物。乳酸菌的高浓度培养方法通常如下：

①恒定pH值培养法 乳酸菌在发酵过程中，代谢产生的乳酸，醋酸等物质对其生长具有反馈抑制作用。发酵罐中培养液的pH值维持在5.8～6.0，已解除乳酸等物质对菌体生长的抑制作用，从而延长乳酸菌对数生长期，制备出含活菌数高的发酵液。

②膜渗析法 利用膜的选择性将培养液与营养液进行成分交换，使培养液中的乳酸部分渗出，营养液中成分渗入培养液中，以维持乳酸菌正常的生长繁殖。采用此法所达到的菌体浓度高于第一种培养法。

(5)细胞浓缩 浓缩倍数在20～50倍以上，操作过程应尽量柔和，尽量降低剪切力和空气的影响。

(6)真空冷冻干燥 现将细胞悬浮液冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空度下，使冰升华为水蒸气，再用真空系统的捕水器(水汽凝结器)将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品。实际上就是在减压环境下利用升华现象除去水分。当菌体中的大部分水分被去出后，细胞的生理活动就会停止，从而达到了长期保藏的目的。

4、一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：有发酵剂条件的确定，感官化学酸度测定。

(1)发酵剂发酵条件的确定 以酸度作为评定标准，通过Lg(3³)正交试验确定发酵剂的最佳发酵条件。

(2)发酵剂感官检验 按要求对所制备的发酵剂进行感观检验，评定其感官质量。

(3)发酵剂化学检验 槽用酸碱滴定法测定成品发酵剂的酸度。

(4)酸度的测定方法 培养5h后，采用酸碱滴定法。

5、一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是，由富硒锗能力的测定。

(1)富硒能力的测定 亚甲蓝还原法。

①原理：亚甲蓝被硫化物还原，硒对该反应应有催化作用，使反应速度加快，硒质量浓度与亚甲蓝还原速度呈相关的关系，从而得到硒的含量。

②硒标准储备溶液(100μg/mL)：溶液分析纯亚希酸钠0.2190g与蒸馏水中，小心转入1L容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，此溶液每毫升含稀100g。

③硒标准工作溶液(0.1μg/mL)：采用10倍稀释法将硒标准储备溶液(100g/mL)稀释成0.1g/mL备用。

④硒转化率测定结果

将4℃保藏3d后的发酵剂稀释10倍，吸收3mL发酵剂，定容至10mL，用亚甲蓝还原法，测得褪色时间为367.5s，由回归方程及转化率公式可得发酵剂的富硒率为50.38％。

⑤活菌数测定结果

测得发酵剂的活菌数为：7.2*10⁸cfu/ml。

⑥发酵剂感官检验及预示结果

按最佳条件制备A₂B₁C₃发酵剂，经感官检验符合感官质量要求，然后以市售鲜奶为原料乳，接种量7％，加糖量8％，39℃培养5h，成品酸奶硒转化率达89.90％。将此酸奶置于4℃的冰箱冷藏后熟12h后品尝坚定，此时酸奶风味良好，香味浓厚，酸甜柔和，甜酸比协调，酸奶组织均匀细腻。

(2)富硒锗能力的测定。

①以灵芝锗为主要原料的基质中加入经特殊处理的1％水溶性锗，拌匀，装入培养瓶，灭菌后接种灵芝菌，25℃培养一个月，在28℃培养室内培养子实体。培养基加锗，1∶1000组比对照组增加4倍。

②菌丝体富集微量元素效果更佳，以菌丝体培养富锗灵芝菌丝体，培养液中加不同浓度的二氧化锗溶液，灭菌后于28℃，802pm培养，采用延期发酵法，结果丝菌体干粉锗达到497～3300ug/g(对照13.2ug/g)增加40～250倍，较子实体富集优越。

下面结合实施例对本发明进一步说明

具体实施方法：

实施例1：一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：由富硒锗活性普通酸乳发酵剂工艺，其工艺方法是：

嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的相对比列在1∶1～2∶1之间，通常为1∶1保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌之间存在共生现象，保加利亚乳杆菌由于具有较强的蛋白水解活性可在发酵初期分解乳中酪蛋白而形成缬氨酸等氨基酸和多肽以促进嗜热链球菌的生长；在嗜热链球菌生长过程中产生的甲酸和乳脲活动产生的CO₂能够刺激保加利亚乳杆菌生长。

在发酵初期，嗜热链球菌生长快，发酵1h后与保加利亚乳杆菌的比例为(3～4)∶1.当pH值从6.5下降到5.5时，保加利亚乳杆菌的生长开始加快，而嗜热链球菌的生长由于乳酸的抑制作用逐渐减慢，这是因为保加利亚乳杆菌对酸的生长由于乳酸的抑制作用逐渐减慢，这是因为保加利亚乳杆菌对酸的敏感性较差，在介质pH值在4.4，这时其新陈代谢活动才受到抑制。当pH值下降到5.0左右时，保加利亚乳杆菌控制了酸乳的发酵。当pH值下降到4.6左右时，酪蛋白开始凝聚，乳开始凝结，此时保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的数量相近。而酸乳在冷藏等后酸化过程中，占优势的保加利亚乳杆菌继续发酵乳糖产酸，当酸乳的pH值下降到3.5时，保加利亚乳杆菌细胞壁或细胞膜丧失了调节作用，细胞内外pH值趋于一致，从而使乳糖酶活性受到抑制。

实施例2：一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：由富硒锗活性益生菌的酸乳发酵剂工艺，其工艺特征是：

在发酵时间内酸乳的pH值低于4.4，嗜酸乳杆菌的菌数将下降2～4个数量级，而双歧杆菌的接种量控制在5％左右，乳酸菌接种量为0.5％，以便延缓乳酸菌在培养过程中的对数生长期，阻止产酸过快与凝乳形成过早，以利于嗜酸乳杆菌和双岐杆菌在混合培养中提前进入对数增殖过程。为了避免乳酸菌产酸过早对益生菌的生长产生不利影响，可采用两步发酵法生产酸乳，使产品中益生菌数量提高4～5倍，贮存6周后产品中益生菌的数量仍可达10⁷CFU/g。另外，提高酸乳中蛋白质，肽，氨基酸，抗坏血酸，半胱氨酸和β-半乳糖酶的含量，可明显提高酸乳中益生菌的活菌数。

实施例3：一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：由富硒锗活性工艺直投是酸乳发酵剂工艺，其方法是：直投式酸乳发酵剂的生产过程，主要包括以下几个步骤：

(1)优良菌种的选育和保藏生产优质的商品化发酵剂关键在于使用优良菌种。乳酸菌的筛选方向主要有：①筛选抗冷冻，抗干燥，抗剪切力等抗逆性强的菌株。②筛选乳糖和半乳糖利用率高的阳性菌株，以多产乳酸；③筛选黏性菌种以提高产胞外多糖等粘性物质，从而增加产品黏度，提高产品的浓厚质地，并减少凝胶断裂及乳清析出等质量缺陷的发生；④酸乳发酵过程中会经常由于噬菌体的污染而导致发酵迟缓甚至发酵失败，因此要求有相应的抗噬菌体菌株以备轮换⑤柠檬酸能够被分解成为二乙酰等酸乳特有风味物质，所以柠檬酸利用菌能够增强酸乳的特有风味；⑥筛选双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等益生菌时，菌株最好能耐受人的胆汁酸盐和酸性环境，以增强其有效性。

筛选得到的纯培养物置于超低温冰箱或液氮罐中长期保藏，以保持其活性和稳定性。

(2)菌种的移植 在进行发酵剂的工厂化生产以前在实验室和菌种车间进行菌种的活化和移植，并进行种子液的扩大培养。

(3)培养基的配置和灭菌 制备直投是酸乳发酵剂，首先要对乳酸菌进行高浓度培养。在选择好基础培养基后，要找到合适的增强因子对培养基进行强化，得到优化培养基，一是乳酸菌的繁殖达到最大。

(4)接种培养 制备直投是酸乳发酵剂需要获得高浓度的细胞培养物。乳酸菌的高浓度培养方法通常如下：

①恒定pH值培养法 乳酸菌在发酵过程中，代谢产生的乳酸，醋酸等物质对其生长具有反馈抑制作用。发酵罐中培养液的pH值维持在5.8～6.0，已解除乳酸等物质对菌体生长的抑制作用，从而延长乳酸菌对数生长期，制备出含活菌数高的发酵液。

②膜渗析法 利用膜的选择性将培养液与营养液进行成分交换，使培养液中的乳酸部分渗出，营养液中成分渗入培养液中，以维持乳酸菌正常的生长繁殖。采用此法所达到的菌体浓度高于第一种培养法。

(6)细胞浓缩 浓缩倍数在20～50倍以上，操作过程应尽量柔和，尽量降低剪切力和空气的影响。

(6)真空冷冻干燥 现将细胞悬浮液冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空度下，使冰升华为水蒸气，再用真空系统的捕水器(水汽凝结器)将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品。实际上就是在减压环境下利用升华现象除去水分。当菌体中的大部分水分被去出后，细胞的生理活动就会停止，从而达到了长期保藏的目的。

实施例4：一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：有发酵剂条件的确定，感官化学酸度测定。

(1)发酵剂发酵条件的确定 以酸度作为评定标准，通过Lg(3³)正交试验确定发酵剂的最佳发酵条件。

(2)发酵剂感官检验 按要求对所制备的发酵剂进行感观检验，评定其感官质量。

(3)发酵剂化学检验 槽用酸碱滴定法测定成品发酵剂的酸度。

(4)酸度的测定方法 培养5h后，采用酸碱滴定法。

实施例5：一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是，由富硒锗能力的测定。

(1)富硒能力的测定 亚甲蓝还原法。

①原理：亚甲蓝被硫化物还原，硒对该反应应有催化作用，使反应速度加快，硒质量浓度与亚甲蓝还原速度呈相关的关系，从而得到硒的含量。

②硒标准储备溶液(100μg/mL)：溶液分析纯亚希酸钠0.2190g与蒸馏水中，小心转入1L容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，此溶液每毫升含稀100g。

③硒标准工作溶液(0.1μg/mL)：采用10倍稀释法将硒标准储备溶液(100g/mL)稀释成0.1g/mL备用。

④硒转化率测定结果

将4℃保藏3d后的发酵剂稀释10倍，吸收3mL发酵剂，定容至10mL，用亚甲蓝还原法，测得褪色时间为367.5s，由回归方程及转化率公式可得发酵剂的富硒率为50.38％。

⑤活菌数测定结果

测得发酵剂的活菌数为：7.2*10⁸cfu/ml。

⑥发酵剂感官检验及预示结果

按最佳条件制备A₂B₁C₃发酵剂，经感官检验符合感官质量要求，然后以市售鲜奶为原料乳，接种量7％，加糖量8％，39℃培养5h，成品酸奶硒转化率达89.90％。将此酸奶置于4℃的冰箱冷藏后熟12h后品尝坚定，此时酸奶风味良好，香味浓厚，酸甜柔和，甜酸比协调，酸奶组织均匀细腻。

(2)富硒锗能力的测定。

①以灵芝锗为主要原料的基质中加入经特殊处理的1％水溶性锗，拌匀，装入培养瓶，灭菌后接种灵芝菌，25℃培养一个月，在28℃培养室内培养子实体。培养基加锗，1∶1000组比对照组增加4倍。

②菌丝体富集微量元素效果更佳，以菌丝体培养富锗灵芝菌丝体，培养液中加不同浓度的二氧化锗溶液，灭菌后于28℃，802pm培养，采用延期发酵法，结果丝菌体干粉锗达到497～3300ug/g(对照13.2ug/g)增加40～250倍，较子实体富集优越。

Claims (5)

1.一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：由富硒锗活性普通酸乳发酵剂工艺，其工艺方法是：

嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的相对比列在1∶1～2∶1之间，通常为1∶1保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌之间存在共生现象，保加利亚乳杆菌由于具有较强的蛋白水解活性可在发酵初期分解乳中酪蛋白而形成缬氨酸等氨基酸和多肽以促进嗜热链球菌的生长；在嗜热链球菌生长过程中产生的甲酸和乳脲活动产生的CO₂能够刺激保加利亚乳杆菌生长，

在发酵初期，嗜热链球菌生长快，发酵1h后与保加利亚乳杆菌的比例为(3～4)∶1.当pH值从6.5下降到5.5时，保加利亚乳杆菌的生长开始加快，而嗜热链球菌的生长由于乳酸的抑制作用逐渐减慢，这是因为保加利亚乳杆菌对酸的生长由于乳酸的抑制作用逐渐减慢，这是因为保加利亚乳杆菌对酸的敏感性较差，在介质pH值在4.4，这时其新陈代谢活动才受到抑制，当pH值下降到5.0左右时，保加利亚乳杆菌控制了酸乳的发酵，当pH值下降到4.6左右时，酪蛋白开始凝聚，乳开始凝结，此时保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的数量相近，而酸乳在冷藏等后酸化过程中，占优势的保加利亚乳杆菌继续发酵乳糖产酸，当酸乳的pH值下降到3.5时，保加利亚乳杆菌细胞壁或细胞膜丧失了调节作用，细胞内外pH值趋于一致，从而使乳糖酶活性受到抑制。

2.一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：由富硒锗活性益生菌的酸乳发酵剂工艺，其工艺特征是：

在发酵时间内酸乳的pH值低于4.4，嗜酸乳杆菌的菌数将下降2～4个数量级，而双歧杆菌的接种量控制在5％左右，乳酸菌接种量为0.5％，以便延缓乳酸菌在培养过程中的对数生长期，阻止产酸过快与凝乳形成过早，以利于嗜酸乳杆菌和双岐杆菌在混合培养中提前进入对数增殖过程，为了避免乳酸菌产酸过早对益生菌的生长产生不利影响，可采用两步发酵法生产酸乳，使产品中益生菌数量提高4～5倍，贮存6周后产品中益生菌的数量仍可达10⁷CFU/g，另外，提高酸乳中蛋白质，肽，氨基酸，抗坏血酸，半胱氨酸和β-半乳糖酶的含量，可明显提高酸乳中益生菌的活菌数。

3.一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：由富硒锗活性工艺直投是酸乳发酵剂工艺，其方法是：直投式酸乳发酵剂的生产过程，主要包括以下几个步骤：

(1)优良菌种的选育和保藏 生产优质的商品化发酵剂关键在于使用优良菌种，乳酸菌的筛选方向主要有：①筛选抗冷冻，抗干燥，抗剪切力等抗逆性强的菌株，②筛选乳糖和半乳糖利用率高的阳性菌株，以多产乳酸；③筛选黏性菌种以提高产胞外多糖等粘性物质，从而增加产品黏度，提高产品的浓厚质地，并减少凝胶断裂及乳清析出等质量缺陷的发生；④酸乳发酵过程中会经常由于噬菌体的污染而导致发酵迟缓甚至发酵失败，因此要求有相应的抗噬菌体菌株以备轮换⑤柠檬酸能够被分解成为二乙酰等酸乳特有风味物质，所以柠檬酸利用菌能够增强酸乳的特有风味；⑥筛选双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等益生菌时，菌株最好能耐受人的胆汁酸盐和酸性环境，以增强其有效性，

筛选得到的纯培养物置于超低温冰箱或液氮罐中长期保藏，以保持其活性和稳定性，

(2)菌种的移植 在进行发酵剂的工厂化生产以前在实验室和菌种车间进行菌种的活化和移植，并进行种子液的扩大培养，

(3)培养基的配置和灭菌 制备直投是酸乳发酵剂，首先要对乳酸菌进行高浓度培养，在选择好基础培养基后，要找到合适的增强因子对培养基进行强化，得到优化培养基，一是乳酸菌的繁殖达到最大，

(4)接种培养 制备直投是酸乳发酵剂需要获得高浓度的细胞培养物，乳酸菌的高浓度培养方法通常如下：

①恒定pH值培养法 乳酸菌在发酵过程中，代谢产生的乳酸，醋酸等物质对其生长具有反馈抑制作用，发酵罐中培养液的pH值维持在5.8～6.0，已解除乳酸等物质对菌体生长的抑制作用，从而延长乳酸菌对数生长期，制备出含活菌数高的发酵液，②膜渗析法 利用膜的选择性将培养液与营养液进行成分交换，使培养液中的乳酸部分渗出，营养液中成分渗入培养液中，以维持乳酸菌正常的生长繁殖，采用此法所达到的菌体浓度高于第一种培养法，

(5)细胞浓缩 浓缩倍数在20～50倍以上，操作过程应尽量柔和，尽量降低剪切力和空气的影响，

(6)真空冷冻干燥 现将细胞悬浮液冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空度下，使冰升华为水蒸气，再用真空系统的捕水器(水汽凝结器)将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品，实际上就是在减压环境下利用升华现象除去水分，当菌体中的大部分水分被去出后，细胞的生理活动就会停止，从而达到了长期保藏的目的。

4.一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是：有发酵剂条件的确定，感官化学酸度测定，

(1)发酵剂发酵条件的确定以酸度作为评定标准，通过Lg(3³)正交试验确定发酵剂的最佳发酵条件，

(2)发酵剂感官检验 按要求对所制备的发酵剂进行感观检验，评定其感官质量，

(3)发酵剂化学检验 槽用酸碱滴定法测定成品发酵剂的酸度，

(4)酸度的测定方法 培养5h后，采用酸碱滴定法。

5.一种富硒锗活性乳酸菌发酵剂工艺，其特征是，由富硒锗能力的测定，

(1)富硒能力的测定 亚甲蓝还原法，

①原理：亚甲蓝被硫化物还原，硒对该反应应有催化作用，使反应速度加快，硒质量浓度与亚甲蓝还原速度呈相关的关系，从而得到硒的含量，

②硒标准储备溶液(100μg/mL)：溶液分析纯亚希酸钠0.2190g与蒸馏水中，小心转入1L容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，此溶液每毫升含稀100g，

③硒标准工作溶液(0.1μg/mL)：采用10倍稀释法将硒标准储备溶液(100g/mL)稀释成0.1g/mL备用，

④硒转化率测定结果

将4℃保藏3d后的发酵剂稀释10倍，吸收3mL发酵剂，定容至10mL，用亚甲蓝还原法，测得褪色时间为367.5s，由回归方程及转化率公式可得发酵剂的富硒率为50.38％，

⑤活菌数测定结果

测得发酵剂的活菌数为：7.2*10⁸cfu/ml，

⑥发酵剂感官检验及预示结果

按最佳条件制备A₂B₁C₃发酵剂，经感官检验符合感官质量要求，然后以市售鲜奶为原料乳，接种量7％，加糖量8％，39℃培养5h，成品酸奶硒转化率达89.90％，将此酸奶置于4℃的冰箱冷藏后熟12h后品尝坚定，此时酸奶风味良好，香味浓厚，酸甜柔和，甜酸比协调，酸奶组织均匀细腻，

(2)富硒锗能力的测定

①以灵芝锗为主要原料的基质中加入经特殊处理的1％水溶性锗，拌匀，装入培养瓶，灭菌后接种灵芝菌，25℃培养一个月，在28℃培养室内培养子实体，培养基加锗，1∶1000组比对照组增加4倍，

②菌丝体富集微量元素效果更佳，以菌丝体培养富锗灵芝菌丝体，培养液中加不同浓度的二氧化锗溶液，灭菌后于28℃，802pm培养，采用延期发酵法，结果丝菌体干粉锗达到497～3300ug/g(对照13.2ug/g)增加40～250倍，较子实体富集优越。