CN115851535A - 具有调节免疫力作用的鼠李糖乳酪杆菌wfp52及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有调节免疫力作用的鼠李糖乳酪杆菌WFP52及其应用，属于微生物技术领域。该鼠李糖乳酪杆菌WFP52的分类命名为Lacticaseibacillusrhamnosus，保藏于广州省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62580。该菌株具有优良的低后酸特性和常温储存稳定性，既有利于改善酸乳制品的发酵特性，又能够适应常温条件下较长时间的存储，从而对生产、储存、运输、消费等环节带来诸多便利。该菌株还对肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有很好抑制作用。同时，该菌株可显著提高细胞因子IL‑8、IL‑10和IL‑12分泌水平，具备免疫调节能力。因此，其在食品、药品和保健品产业拥有广泛地应用前景。

Description

具有调节免疫力作用的鼠李糖乳酪杆菌WFP52及应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株具有调节免疫力作用的鼠李糖乳酪杆菌WFP52及其应用。

背景技术

益生菌在摄入后可通过多种作用方式调节肠道健康，如靶位聚集抑制病原体、产生细菌素等抑菌分子直接杀灭致病菌、增强上皮细胞功能、调节菌群和免疫系统等。其中，益生菌对宿主免疫反应的作用效果最为复杂。有研究表明某些菌株能够影响宿主免疫系统应答并通过降低炎症因子来调节宿主健康，如人支气管上皮细胞分泌的白细胞介素8与唾液链球菌BLIS K12共培养可降低IL-8数量，双歧杆菌能刺激小鼠巨噬细胞中炎症细胞因子IL-8和TNF水平等。摄入益生菌已经被证实能提高宿主免疫力，对预防病毒感染，降低儿童感冒及流感发生率、成人呼吸道病毒感染持续时间和严重程度效果显著。而且，研究发现益生菌能刺激外周血免疫细胞产生系统免疫应答，如外周血单核细胞（PBMCs）与灭活的干酪乳杆菌代田株培养可提高自然杀伤细胞活性，对比PBMCs在无刺激条件下，显著提高IL-12分泌水平。

此外，益生菌在肠道上皮细胞代谢产生有机酸、多糖、抗菌肽和细菌素等蛋白抑菌物质，可降低肠道pH值，抑制致病菌生长或直接杀灭致病菌，预防致病菌引起的肠道疾病，对促进宿主健康有重要作用。同时，在益生菌生产中，各阶段工艺需保证较高活菌收率，才可具备成本优势，而在益生菌产品流通中则需保证有效菌数，拥有较好储存稳定性才能发挥益生菌的健康功效和产品优势。此外，乳品作为益生菌消费最大载体，益生菌能否适应风味发酵乳和酸乳饮料的生产，是评价其产业化规模和消费市场潜在经济效益的关键因素，而目前市场上多数益生菌并不具备以上全部条件或多数条件。

因此，提供一株具有调节免疫力功效，且兼具满足在生产、流通和消费多环节应用便利性的优秀性状的益生菌菌株，对于在市场竞争中获取竞争优势意义重大。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对上述现有技术中，现有具有免疫调节功能的益生菌菌株在功能特性，以及在适应生产、流通和消费多环节的特性上存在的不足，本发明提供一株鼠李糖乳杆菌WFP52，以利用该菌株实现在保证具备免疫调节功能的前提下，适应生产、流通和消费等环节的应用需求。

（二）技术方案

为实现上述发明目的，本发明所提供的技术方案如下：

一株鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillusrhamnosus）WFP52，该菌株2022年6月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No. 62580。

优选地，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52可提高细胞因子IL-8、IL-10和IL-12的分泌水平。

优选地，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52发酵蛋白含量为4.0%的脱脂复原乳72h酸度不超过95°T。

优选地，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52冻干粉在30℃、湿度43%RH的条件下储存90d的存活率不低于67%。

本发明的另一目的在于提供所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52在食品、药品或保健品中的应用。

优选地，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52在抑制致病菌的产品中应用。

更优选地，所述致病菌包括肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

优选地，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52在发酵乳制品中应用。

本发明的第三个目的在于提供含有所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52的组合物。

优选地，在组合物中所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52为粉状存在时，活菌数≥1×10⁶CFU/g。

优选地，在组合物中包括食品、药品或保健品中可接受的载体或辅料。

所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52菌落为乳白色，中间凸起呈圆形或类圆形，直径1-2mm，边缘光滑；菌体呈短杆或棒杆状，少弯曲，呈单或呈对存在。

所述的鼠李糖乳酪杆菌WFP52可显著提高细胞因子IL-8、IL-10和IL-12含量，具有调节机体免疫力的作用。

（三）有益效果

与现有技术相比，本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WFP52具有以下有益效果：

1、本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WFP52筛选自西藏自然发酵的酸奶，其来源安全、天然，并且具有极好的低后酸特性，用于制备风味发酵乳或饮料，有利于生产调配过程和货架期口感的稳定。利用该菌种发酵生产产品，一方面能够保证成品在储存、流通和消费等环节产品的酸度保持较低水平，防止产品pH降低从而影响到成品的口感。另一方面，该菌株的低酸度特性还能够使发酵生产过程在时间上保持更好的宽松度。

2、本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WFP52对肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较好抑制性，有利于预防致病菌引起的肠道疾病。该菌株的冻干粉在常温储存有较高存活率，并能提高细胞因子IL-8、IL-10和IL-12含量，具有调节免疫作用，可用于制备膳食补充剂、保健品或药品，具有极好的应用价值。

附图说明

图1为鼠李糖乳酪杆菌WFP52平板菌落形态图。

图2为鼠李糖乳酪杆菌WFP52菌体镜检图。

图3为鼠李糖乳酪杆菌WFP52产酸特性效果图。

图4为鼠李糖乳酪杆菌WFP52抑制致病菌效果图；

其中，a为抑制肠炎沙门氏菌图，b为抑制单核细胞增生李斯特氏菌图，c为抑制金黄色葡萄球菌图，d为抑制大肠杆菌图。

图5为鼠李糖乳酪杆菌WFP52在30℃、湿度43%RH储存90d存活率效果图。

图6为利用鼠李糖乳酪杆菌WFP52发酵获得的风味发酵乳在4℃下保存21d的实际产品图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、鼠李糖乳酪杆菌WFP52的分离鉴定

1、菌株的分离筛选

以来源于西藏日喀则地区藏民家中自然发酵酸奶为样品，称取1g样品溶解到9mL0.85%无菌生理盐水中，震荡使其充分混匀，吸取200μL混合液分别涂布于商业MRS（杆菌分离）和M17（球菌分离）固体培养基，于37℃恒温培养箱中培养72h，挑取不同菌落形态的单菌再分别在对应固体培养基上划线分纯，此步骤重复2-3次，直至菌落特征一致。再将已纯化单菌接种于相应液体培养基中于37℃培养18h，用60%甘油保存，于-80℃冰箱冻存备用。

以2%接种量将菌冻存管接种于质量浓度12g/100mL灭菌脱脂乳中，于37℃培养48h进行活化，再连续传代3次，初步筛选每代均能凝乳且凝乳状态好的菌株。将初筛菌株接种于蛋白含量4.0%（m/v）脱脂乳中发酵72h，测得pH和酸度如表1所示。从表1可知，杆菌1后酸化最好，滴定酸度仅为93°T，因此将筛选的杆菌1重新标记为WFP52。

表1. 初筛的三株菌发酵72h后的酸度和pH值

2、形态学特征

经过镜检，菌株WFP52形态学特征如图1和图2所示。从图中可知，菌株WFP52在固体培养基上菌落为乳白色，中间凸起呈圆形或类圆形，直径1-2mm，边缘光滑；菌体呈短杆或棒杆状，少弯曲，呈单或呈对存在。

3、菌株16S rDNA鉴定

将获得的菌株WFP52冻存管低温送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定，菌株WFP52的16s rDNA核苷酸序列如的序列1所示。BLAST比对结果表明，菌株WFP52与Lacticaseibacillusrhamnosus同源性超过99.9%，因此鉴定其为鼠李糖乳酪杆菌，命名为鼠李糖乳酪杆菌WFP52。

将筛选得到菌株WFP52进行菌种保藏，该鼠李糖乳酪杆菌WFP52的保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）；地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号；保藏日期：2022年6月30日；鼠李糖乳酪杆菌WFP52保藏编号为GDMCC No. 62580。

实施例2、鼠李糖乳酪杆菌WFP52生理生化特征

1、产酸特性

将鼠李糖乳酪杆菌WFP52冻存管按2%接种量接种于质量浓度12g/100mL脱脂乳中，37℃恒温培养16h，连续活化3代，以4%接种量接种于蛋白含量4.0%（m/v）的脱脂乳进行发酵。采用法国iCinac乳发酵监测仪测试其在发酵48h过程中每2h的产酸性能，评价产酸特性（包括产酸速度和后酸化）。

结果如图3所示，鼠李糖乳酪杆菌WFP52在前6h产酸速度较慢，pH仅降低0.4，随后进入快速产酸期，发酵乳pH在10h从5.9降至4.3左右，从20-48h产酸速度趋缓，在28h内使发酵乳pH从4.17降至3.86，仅降低0.31，说明该菌株发酵的后酸化水平较好。

2、抑制致病性细菌

将肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌稀释至10⁷CFU/mL，取0.1mL菌悬液接种到LB商业培养基中（单核细胞增生李斯特氏菌接于TSA-YE商业培养基），混匀后用无菌涂布器涂至均匀。将3个牛津杯均匀放置培养皿中，取鼠李糖乳酪杆菌WFP52无菌上清液注入牛津杯中，置于37℃培养24h，用游标卡上测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径评价抑菌能力。

结果如图4所示，鼠李糖乳酪杆菌对肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有明显抑制作用，抑菌圈直径分别为12.41mm、13.05mm、11.26mm和14.49mm。

实施例3、鼠李糖乳酪杆菌WFP52菌粉生产及储存稳定性

1.鼠李糖乳酪杆菌WFP52菌粉生产

将鼠李糖乳酪杆菌WFP52冻存管按2%接种量接种于商业MRS液体培养基中活化传代3次，再以4%接种量接种于改良MRS液体培养基（配方为葡萄糖30.0g/L，酵母浸粉30.0g/L，蛋白胨10.0g/L，乳糖10.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温80 1.0g/L）进行扩大培养，以氨水作为中和液，恒定pH5.7，39℃培养15h得到发酵液。在4-10℃离心20min收获菌泥，将菌泥与冻干保护剂（脱脂乳粉150.0g/L，蔗糖200.0g/L，甘油30g/L，菊粉10g/L，异抗坏血酸钠1.0g/L）以1:1质量比充分混匀，制成乳化液，经真空冷冻干燥后获得鼠李糖乳酪杆菌WFP52冻干菌粉，菌粉生产结果如表2所示，各工艺阶段指标表明鼠李糖乳酪杆菌WFP52具有极好生产经济效益。

表2. 鼠李糖乳酪杆菌WFP52菌粉的生产结果

2、菌粉储存稳定性

取鼠李糖乳酪杆菌WFP52冻干菌粉1g装入双层铝箔袋，真空密封，放置于30℃、湿度43%RH环境储存，分别于0、15、30、45、60、75和90d取样，参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》测定活菌数，菌粉存活率如图5所示，鼠李糖乳酪杆菌WFP52储存稳定性较好，在90d菌粉存活率为67.58%，效果明显优于科汉森市售鼠李糖乳杆菌LGG的储存稳定性接近（90d存活率为57.65%），具有较好产品应用潜力。

实施例4、鼠李糖乳酪杆菌WFP20生产风味发酵乳

称取全脂奶粉90g、葡萄糖30g、浓缩乳清蛋白3.5g、淀粉12g加水至700g溶解（50℃，15min），均质（57~60℃，25Mpa）待用；称取白砂糖88g、果胶0.3g、琼脂1.5g、柠檬酸钠0.5g加水溶解（85℃，40min），与上述待用料液混合均匀后杀菌（95℃，200min），冷却至37℃按2×10⁶CFU/g接种鼠李糖乳酪杆菌WFP52，发酵至65°T破乳，无菌灌装制成风味发酵乳。

为验证利用鼠李糖乳酪杆菌WFP52发酵制备的风味发酵乳的存储稳定性。选用市售杜邦公司优秀的低后酸性能发酵剂883作为对照，在4℃下保存了21d。利用李糖乳酪杆菌WFP52生产的风味发酵乳的时间产品效果如图6所示。在存储完毕后，利用鼠李糖乳酪杆菌WFP52制备的风味发酵乳口感细腻，风味浓郁，经测定酸度为88°T，显著低于杜邦公司发酵剂883的123°T（，产品口感更加稳定，在储存期内两产品酸度的变化如表3所示。

表3. 不同鼠李糖乳酪杆菌发酵的风味发酵乳在4℃保存21天后的酸度

菌株	0d（°T）	7d（°T）	14d（°T）	21d（°T）
					杜邦低后酸883	67	88	101	123
鼠李糖乳酪杆菌WFP52	65	72	80	88

实施例5、鼠李糖乳酪杆菌WFP52调节免疫力体外实验

采用鼠李糖乳酪杆菌WFP52菌株刺激脾细胞分泌细胞因子IL-8、IL-10和IL-12，并对分泌的细胞因子浓度进行测定，具体方法如下：

无菌条件取小鼠脾脏，将脾脏碾碎，加入10%胎牛血清无菌Hanks缓冲液，4℃、1000×g离心10min收获细胞，加入裂解液裂解5min，再加入含10%胎牛血清无菌Hanks缓冲液终止裂解，按上述条件离心去上清液。沉淀用含10%胎牛血清RPMI培养基洗涤两次，按相同离心条件将沉淀重悬于10%胎牛血清RPMI培养基，调整细胞浓度为10⁶cells/mL。鼠李糖乳酪杆菌WFP52、阳性对照菌株为鼠李糖乳杆菌LGG分别在4℃、3000×g离心5min去上清液，用PBS缓冲液洗涤两次，加入10%胎牛血清RPMI培养基调整细胞在600nm波长光密度为0.4-0.6。将细胞悬液加入96孔板，分为调零组（细胞培养基100μL），空白对照组（1×10⁷cells/mL细胞悬液100μL，细胞培养基100μL），益生菌组（1×10⁷cells/mL细胞悬液100μL，1×10⁸cfu/mL菌悬液100μL），37℃培养24h，1000×g离心10min，用相应ELISA试剂盒测定IL-8，IL-10和IL-12含量。结果如表4所示，鼠李糖乳酪杆菌WFP52 IL-12/IL-10比值显著高于鼠李糖乳杆菌LGG，并刺激脾淋巴细胞分泌更高水平IL-8，因此鼠李糖乳酪杆菌WFP52在体外实验表现为更好的免疫调节作用。

表4. 不同鼠李糖乳酪杆菌刺激脾细胞分泌细胞因子的浓度

注：调零组各细胞因子浓度均为0.

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillusrhamnosus）WFP52，其特征在于，2022年6月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No. 62580。

2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌WFP52，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52可提高细胞因子IL-8、IL-10和IL-12的分泌水平。

3.根据权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌WFP52，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52发酵蛋白含量为4.0%的脱脂复原乳72h酸度不超过95°T。

4.根据权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌WFP52，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52冻干粉在30℃、湿度43%RH的条件下储存90d的存活率不低于67%。

5.权利要求1-4任一所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52在食品、药品或保健品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52在抑制致病菌的产品中应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述致病菌包括肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52在发酵乳制品中应用。

9.含有权利要求1-4任一所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52的组合物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌WFP52为粉状存在时，活菌数≥1×10⁶CFU/g。

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