CN101144064A - 一种具有抗致突变活性、产胞外多糖的短乳杆菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种具有抗致突变活性、产胞外多糖的短乳杆菌BT0898及其在发酵食品中的用途。

Description

一种具有抗致突变活性、产胞外多糖的短乳杆菌及其用途

【技术领域】

本发明涉及微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种具有抗致突变活性、产胞外多糖的短乳杆菌及其用途。

多糖是指由二十个以上单糖组成的糖类化合物。根据来源，多糖可以分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖。根据糖类组成不同，多糖又可分为同多糖和杂多糖。多糖的结构常因单糖的构型、糖基化方式、有无分支、糖中羟基、相邻单糖基糖苷的位置等的不同而不同，也使多糖成为具有不同功能活性的大分子物质。关于活性多糖的构效与功能性质已经成为相关领域的研究热点。

乳酸菌是一类发酵碳水化合物产生乳酸的细菌的统称，在食品、医药等领域应用广泛的有益细菌，包括乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属、明串珠菌属等微生物的一些菌种。乳酸菌是益生菌的主要来源。益生菌(Probiotic)起源自希腊语，指摄入之后对宿主产生促进健康效果的活的微生物，益生菌的功能主要有以下几个方面：1、增加肠道内益生菌数量，抑制有害菌，防止腹泻；2、提高机体免疫力、活化巨噬细胞以及促进机体产生肿瘤坏死因子、干扰素和IgA等免疫分子；3、吸附致癌物及减少粪便中致癌突变物的浓度和抑制某些酶的活性，这些酶与突变物或致癌物的激活有关；4、降低血清胆固醇等。此外益生菌还可通过结合或破坏抗原而减轻过敏反应症状，通过提高机体抗氧化能力而有助于延缓衰老。

人类对乳酸菌在发酵乳制品和微生态制剂中的应用已取得了显著的进展。目前研究的热点是如何通过新型微生物发酵剂的开发而赋予发酵乳特定的功能性质。已知的乳酸菌发挥主要功能特性的作用机理，除了定殖、通过主要代谢产物(乳酸等)改善肠道内环境等以外，一些次生代谢产物如细菌素、胞外多糖等也发挥着非常重要的作用。其中具有理论和实际应用价值的乳酸菌胞外多糖(EPS)引起了国外许多学者的研究兴趣。

乳酸菌胞外多糖具有重要的工艺学功能，对酸乳、干酪及绝大多数发酵乳制品的流变性质、质构、口感以及风味具有重要的影响。乳酸菌胞外多糖可以改善乳制品的流变学特性和质构特性。由于天然增稠作用由产粘乳杆菌与非产粘球菌混合发酵形成的酸乳与非产粘菌株形成的酸乳相比口感滑润、粘度增加；产胞外多糖乳酸菌能够赋予酸乳更强的持水力，从而避免乳清析出；此外，产胞外多糖而产生的持水性增强有助于提高干酪等产品的得率。

乳酸菌胞外多糖还具有多种生理学活性，包括调理肠道作用、抗肿瘤作用、增强免疫作用和降低血清胆固醇作用等几个方面。

综上所述，乳酸菌胞外多糖不仅具有优良的工艺功能，可以改善乳制品质量，此外乳酸菌胞外多糖还具有特定的生理功能。因此，开展产胞外多糖乳酸菌的研究，对于改善乳制品生产加工、开发具有特定功能性质的乳酸菌发酵乳制品，具有十分重要的研究意义和经济价值。

例如CN200510049188.X公开了一种产γ-氨基丁酸的短乳杆菌及其用途。该发明采用生物法合成γ-氨基丁酸是利用乳酸菌体内含有高活性的谷氨酸脱羧酶，此酶以L-谷氨酸钠(L-MSG)为底物，将L-谷氨酸钠(L-MSG)α-脱羧，产生γ-氨基丁酸和CO₂。因此，采用该法生产的γ-氨基丁酸不存在安全上的隐患，能达到食品安全级。CN 98114267.2提供了一种乳蛋白活性肽的制造方法。以鲜牛奶或脱脂奶粉为原料，先进行原料处理，再在35±1℃度下接入培养成熟的短乳杆菌液体菌种，进行灭酶分离、过滤，再浓缩至40BX，喷粉制成其产品。该方法将牛奶或脱脂奶粉中的酪蛋白转化成易于被吸收、营养价值高的活性肽。但是，这些专利或专利申请没有涉及具有抗致突变活性、产胞外多糖的微生物。因此，目前还需要有一种具有抗致突变活性、产胞外多糖的微生物及其含有它们的食品。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的在于提供一种具有抗致突变活性、产胞外多糖的短乳杆菌菌株。

本发明的另一个目的在于提供一种所述短乳杆菌在发酵食品中的用途。

[技术方案]

本发明人从传统发酵食品中分离筛选到一株具有抗致突变活性、产胞外多糖的乳酸菌(下面称之237号菌株)，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性对该乳酸菌鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)BT0898，于2007年7月29日保藏于中国典型物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号No M207106。

短乳杆菌BT0898 CCTCC M207106的形态学特征：

菌体特征：对本发明筛选的一株具有抗致突变活性、产胞外多糖的237号乳酸菌进行革兰氏染色后，用显微镜观察细胞形态，其观测结果如图1所示。237号菌株为革兰氏染色阳性细菌，细胞呈短杆状，单个或成对。

菌落特征：菌落圆形，边缘整齐，表面平滑，中度隆起，灰白色不透明。

本发明的短乳杆菌BT0898 CCTCC M207106的培养特征：短乳杆菌BT0898在MRS液体培养基中生长良好，6h左右培养液开始混浊，14h左右开始有菌体细胞沉淀，18h后有大量菌体沉淀，培养30h乳白色菌体沉淀明显增加。

本发明的短乳杆菌BT0898来源于传统发酵食品，属公认安全(Generally Recognized As Safe,GRAS)菌种，可用于乳酸菌食品中。

因此，本发明还涉及所述的短乳杆菌BT0898在发酵食品中的用途。

所述含有短乳杆菌BT0898的发酵食品是乳酸菌奶饮料、乳粉、胶囊制品或发酵乳。

下面分别描述所述发酵食品的制备方法。

所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备得到的：

首先，制备所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂。

所述的工作发酵剂可以采用两种方法进行制备：

第一种方法是将短乳杆菌BT0898原始菌种接种于12重量％在110℃灭菌10min的脱脂乳中，在37℃条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，作为母发酵剂使用；将母发酵剂按3-5体积％接种于上述的灭菌乳中，37℃培养14-16h至凝乳，此时凝乳中活菌数约在10⁹cfu/mL，得到所述的工作发酵剂。

第二种方法是将短乳杆菌BT0898原始菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4体积％接种于MRS培养基中，培养16-18h，在4℃条件下以4000r/min离心15min，去除上清夜，得到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂。

然后，原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到4℃，再加入所述短乳杆菌BT08 98工作发酵剂，使其浓度达到10⁶cfu/ml以上，在4℃冷藏保存即得到含短乳杆菌BT0898活菌的乳酸菌饮料。

在本发明中，所述的MRS液体培养基是本技术领域的技术人员熟知的，是BD Difco司以商品名

Lacobacilli MRS Broth销售的用于乳杆菌培养的培养基(参考文献：deMan，J.C.，M.Rogosa，and M.E.Sharpe.1960.A medium for the cultivation of lactobacilli.J.Appl.Bacteriol.23：130.)。

所述的加热杀菌是例如使用新加坡APV公司销售的145C型杀菌机进行的。

所述的高温热杀菌是例如使用日本Powerpoint International有限公司销售的PT-20C-R型管板式组合式超高温杀菌机进行的。

另外，所述的乳粉是按照下述步骤制备得到的：

首先，如前面所述方式制备所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂。

然后，原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再以原料乳体积的4％接菌量接种所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，再在37℃下发酵45h，得到短乳杆菌BT0898发酵乳，将所述的短乳杆菌BT0898发酵乳按照1∶3(V/V)加到上述灭菌原料乳中，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含有短乳杆菌BT0898的乳粉。

所述的均质是例如使用上海东华高压均质机厂销售的GYB40-10S型高压均质机进行的。

所述的真空浓缩是例如使用扬州市食品机械厂销售的真空浓缩锅进行的。

所述的喷雾干燥是例如使用上海沃迪科技有限公司销售的实验型喷雾干燥机进行的。

所述的胶囊制品是按照下述步骤制备得到的：

首先，如前面所述方式制备所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂。

然后，原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再以原料乳体积的4％接菌量接种所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，再在37℃下发酵45h，得到短乳杆菌BT0898发酵乳，将所述的短乳杆菌BT0898发酵乳按照1∶3(V/V)加到上述灭菌原料乳中，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含有短乳杆菌BT0898的乳粉，再把该乳粉装入胶囊，制成胶囊制品。

所述的发酵乳是按照下述步骤制备得到的：

首先，如前面所述方式制备所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂。

然后，原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再按照3-5体积％加入所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，再加入3-5体积％可共生的制备发酵乳商品发酵剂，混匀后在37℃下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0.6-0.7％，然后冷却至4℃，再进行冷藏保存得到含有短乳杆菌BT0898的发酵乳。

所述的商品发酵剂是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。

所述的原料乳是一种或多种选自脱脂奶、鲜奶、复原奶的原料乳。

[有益效果]

利用诱变剂吸附实验和艾姆斯(AMES)实验评价短乳杆菌BT0898的抗致突变性。

短乳杆菌BT0898活细胞对2-硝基芴(2-NF，购自德国Acros-Organics公司)和4-硝基喹啉N-氧化物(4NQNO，购自A JohnsonMatthey公司)的吸附率分别为38％和55％，短乳杆菌BT0898死细胞对2-NF和4NQNO的吸附分别为25％和50％。

短乳杆菌BT0898发酵牛乳能够显著抑制由于2-NF和4NQNO导致的鼠伤寒沙门氏菌的回复突变(P<0.05)，抑制率在38.5-54.3％之间，短乳杆菌BT0898发酵牛乳丙酮提取物对回复突变的抑制率在8.0-35.3％之间；短乳杆菌BT0898胞外多糖对2-NF和4NQNO导致的回复突变的抑制率分别为46.0％和12.8％。

【附图说明】

图1、237号菌株(短乳杆菌BT0898)的细胞形态(放大1000倍)

图2、短乳杆菌BT0898死/活细胞对化学诱变剂的吸附和释放

本发明的短乳杆菌BT0898于2007年7月29日保藏于中国典型物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No：M207106。

【具体实施方式】

实施例1短乳杆菌BT0898的采集、分离与鉴定

该实施例按照下述步骤进行：

1、样品采集

用无菌三角瓶采集自然发酵的发酵牛乳，发酵竹笋，采样后在48h内在0℃条件下送到实验室，立即进行样品分析和乳酸菌的分离，同时从实验室的发酵泡菜中分离乳酸菌。泡菜制作如下：从当地菜市场购买新鲜蔬菜洗净后切碎成小块，再加少量盐，密封于泡菜坛中，在室温下放置5-7天，然后进行样品分析和乳酸菌的分离。

将10g发酵牛乳样品同20ml蒸馏水混匀后，用pH计测定pH值。用O.1mol/L NaOH进行滴定，酚酞作为指示剂，测定发酵乳样品的滴定酸度。两个自然发酵牛乳样品的pH为4.36和4.37，两个样品的乳酸含量分别为0.89％和0.91％。

表1发酵牛乳的pH和酸度

NA表示未测定

自然发酵竹笋的pH为4.00，酸度为0.90％。自制泡菜的pH为3.77、酸度为1.O％，这些结果列于表2中。

表2.竹笋和泡菜中的pH和酸度

样品	pH	乳酸(％)
			自然发酵竹笋自制发酵泡菜	4.0±0.043.77±0.01	0.9±0.081.0±0.12

2、样品菌相组成的测定和比较

将10g自然发酵酸乳、发酵竹笋和自制发酵泡菜分别用90ml O.1％无菌蛋白胨水按照体积比1∶10进行连续稀释，分别在平板计数琼脂培养基(PCA，BD Difco公司以

Plate Count Agar商品名销售的细菌计数培养基，培养条件：有氧、30℃培养72h)、MRS固体培养基(BD Difco公司以商品名

Lactobacilli MRS Broth销售的用于乳杆菌培养的培养基，培养条件：厌氧、30℃和45℃分别培养72h)，结晶紫中性红琼脂培养基(VRBA，BD Difco公司以商品名

Violet Red Bile Agar销售的肠道细菌计数培养基，培养条件：有氧、37℃培养72h)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，BD Difco公司以商品名

Potato Dextrose Agar销售的用于霉菌和酵母菌计数的培养基，培养条件：有氧、25℃培养72h)中进行培养，然后分别进行计数，测定自然发酵酸乳和自制酸乳的菌相组成，并比较总细菌数、乳酸菌数、肠道细菌数、酵母和霉菌数等菌相组成的差别。

两个样品的总菌数、嗜温菌和嗜热菌计数相近。在所收集的样品中，肠道细菌、酵母以及霉菌数有些高。在自制样品中，没有肠道细菌。一般而言，肠道细菌、酵母和霉菌数随着贮藏时间的延长而增加。酸乳和发酵蔬菜的菌相研究表明，乳酸菌是优势菌。

3、筛选培养基的改进

MRS-蔗糖(MRS-S)培养基的配方：MRS培养基中的20.0g葡萄糖改为5.0g，并加5.0g蔗糖，其他组分不变。MRS培养基为BD Difco公司以商品名Lactobacilli MRS Broth销售的用于乳杆菌培养的培养基。

改良MRS筛选培养基(M-MRS)的配方：蛋白胨8.0g，肉浸膏8.0g，酵母抽提物4.0g，葡萄糖20.0g，三水醋酸钠晶体5.0g，吐温801ml，柠檬酸三铵2.0g，K₂HPO₄ 5.0g，琼脂15.0g，MgS0₄'7H₂O 0.5g，MnS0₄'2H₂O 0.2g，加蒸馏水定容至1000ml，并且调pH 6.4

4、从样品中分离乳酸菌

使用O.1％无菌蛋白胨水以体积计按照1∶10对上述样品进行连续稀释，在每个稀释度取1ml稀释样品，分别同熔化的MRS琼脂培养基混合，凝固后在30℃微氧条件下培养24-48h，用于乳杆菌的分离，或者分别同熔化的Elliker琼脂培养基(BD Difco公司以商品名

Elliker Medium销售的培养基)混合，凝固后在30℃与需氧条件下进行培养72h，用于乳酸菌的分离，或者分别同熔化的M17琼脂培养基(BDDifco公司以商品名

M17 Agar销售的培养基)混合，凝固后在45℃与需氧条件下培养72h，用于链球菌的分离。从长有30-300个菌落的平板上分离单个菌落，随机挑取其中的5-10个菌落在肉汤中进行培养，然后在琼脂板上划线。分离物连续划线三次得到纯的单菌落，进行革兰氏染色，接触酶实验。纯化菌株可在MRS斜面上4℃短期保存，长期保存需要放到30％的甘油溶液，-70℃冻存。

不同样品在MRS琼脂培养基、Elliker琼脂培养基和M17琼脂培养基上共分离出244个分离株。经过菌落形态、革兰氏染色、接触酶实验排除了3个革兰氏阴性，2个接触酶阳性和4个酵母。这样，得到了235个分离株。

在这235个菌株中，21.10％的菌株(50个菌株)在MRS-蔗糖培养基和改良MRS培养基(m-MRS)上有三个不同的表型，其结果列于下表3中。在MRS-蔗糖培养基上，28％(14个分离株)、26％(13个分离株)、40％(20个分离株)的菌株分别表现出粘丝状、粘稠状和粘液状，6％(3个分离株)的菌株在MRS-蔗糖培养基上不产胞外多糖，同时在改良MRS培养基上表现出粘液样的特性。在改良MRS培养基上，28％(14个分离株)、20％(7个分离株)和40％(20个分离株)的菌株分别表现粘丝状、粘稠状和粘液状。

表3产胞外多糖乳酸菌的初步分离(25℃，48h培养)

编号	来源	MRS-蔗糖培养基				改良MRS培养基
										粘丝状	粘稠状	粘液状	其他	粘丝状	粘稠状	粘液状	其他
		1	发酵酸乳	++				++
2	发酵酸乳									++							+
		3	发酵酸乳	+++				++
4	发酵蔬菜											+				+
		7	发酵酸乳	++				++
8	发酵酸乳										++					+
		13	发酵酸乳		+														+
14	发酵酸乳										+					+
		17	发酵酸乳				+											+
18	发酵蔬菜										+					+
		21	发酵酸乳				+											+
24	发酵酸乳											+				+
		26	发酵酸乳			+												+

30	发酵酸乳			+				+
										31	发酵酸乳		+					+
32	发酵蔬菜	+++				+++
										34	发酵酸乳		+				+
35	发酵酸乳	+				+
										36	发酵酸乳		+			+
39	发酵酸乳			+			+
										40	发酵酸乳		+				+
41	发酵蔬菜	+++				+++
										42	发酵酸乳	++				++
45	发酵酸乳			+				+
										49	发酵酸乳			+			+
51	发酵酸乳	+				+
										52	发酵酸乳			+				+
58	发酵蔬菜			+				+
										60	发酵酸乳		+				+
61	发酵酸乳			+				+
										63	发酵酸乳		+				+
71	发酵酸乳			+				+
										72	发酵酸乳			+				+
74	发酵蔬菜		+					+
										78	发酵酸乳		+				+
80	发酵酸乳		+						+
										82	发酵酸乳			+					+
98	发酵酸乳			++				++
										113	发酵酸乳			+				+
129	发酵酸乳	++				++
										160	发酵酸乳				+			+
179	发酵酸乳	++				+
										183	发酵酸乳	++				+
186	发酵酸乳			+					+
										187	发酵酸乳			+					+
200	发酵酸乳			+					+
										203	发酵酸乳	+++				+++
235	发酵蔬菜			+					+
										236	发酵蔬菜			+					+
237	发酵蔬菜	+++				+++

+，表示轻微；++表示中等；+++高度

5、平板菌落拉丝法筛选产胞外多糖乳酸菌

用接种环分离株在分别含有5％蔗糖与2％葡萄糖的MRS琼脂板上划线，在25℃与45℃下微厌氧培养48h，培养后可以观察到圆形、表面湿润光滑的菌落。用无菌牙签接触菌落，然后轻轻地向外拉以便于在培养基表面形成连续的丝线，重复操作5-6个菌落，每个实验平行进行三次，用尺子测量拉丝的长度，这些结果列于表4中。如果粘丝的长度能达到1.5mm，则认为该菌株是产生胞外多糖的。从这些结果可以看出，蔗糖或者葡萄糖作为唯一碳源的培养基，编号237菌株具有良好的拉丝性。

表4粘液分离株在不同条件下产生的粘丝的长度(cm)

编号	25℃培养				45℃培养
									5％葡萄糖	2％葡萄糖	5％蔗糖	2％蔗糖	5％葡萄糖	2％葡萄糖	5％蔗糖	2％蔗糖
	1	2.22±0.15	1.64±0.32	3.38±0.29	3.17±0.91	G+R-	G+R-	G+R-									G+R-
2									0.74±0.05	1.51±0.31	2.76±0.24	3.28±0.51	G+R-	G+R-	G-	ND
	3	1.34±0.3	0.53±0.25	2.33±0.26	2.8±0.35	G-	G-	G+R-									G+R-
7									1.18±0.14	0.76±0.15	3.17±0.14	1.27±0.23	G+R-	G+R-	G+R-	ND
	32	1.13±0.1	1.3±0.18	4.21±0.29	3.57±1.07	G-	G-	G+R-									G+R-
35									ND	1.78±0.16	2.3±0.16	3.23±0.97	G+R-	G+R-	G+R-	ND
	36	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND									ND
41									1.06±0.17	1.24±0.26	4.3±0.62	2.57±0.06	G+R-	G+R-	G+R-	ND
	42	0.66±0.16	1.39±0.16	3.06±0.38	1.53±0.12	G+R-	G+R-	G+R-									ND
51									ND	ND	1.17±0.11	2.33±0.15	G+R-	G+R-	G+R-	ND
	129	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND									ND
179									ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
	183	1.41±0.18	1.28±0.24	4.3±0.1	4.03±0.68	G+R-	G+R-	ND									ND
203									4.64±0.26	4.59±0.39	4.04±0.22	4.1±1.32	G+R-	G+R-	3.5±0.3	0.3±0.14
	237	4.23±0.48	5.34±0.29	5.33±1.3	3.27±0.21	G+R-	G+R-	2.47±.42									0.47±.15

R^-，无拉丝；G⁺，有生长；G^-，无生长；ND，表示未测定。

6、硫酸-苯酚法测定分离菌株胞外多糖的产量

将从平板上得到的分离株接种到MRS液体培养基中培养18h，再以体积计按照1∶100的比例接种到含50g/L蔗糖的10ml MRS液体培养基中，在30℃发酵24h，提取胞外多糖EPS，并用硫酸-苯酚法[参考文献：Dubois M，Gilles KA,Hamilton JK，Pebers PA，Smith F.(1956).Colorimetric method of determination of sugars and related substances.Analytical chemistry.28(3)：350-356.]测定胞外多糖的含量。这些实验结果列于表5中。编号237的菌株产生189.95mg/L的胞外多糖，编号为24的菌株所产的EPS最少仅为1.22mg/L。胞外多糖产量高低与拉丝长度具有明显的相关性。

表5不同分离株在30℃，24h产生的胞外多糖(EPS)

编号	EPS(mg/L)	编号	EPS(mg/L)
				1	58.30±4.20	51	67.15±0.19
2	29.0±0.91	52	16.65±0.01
				3	35.80±1.74	58	24.83±1.01
4	6.01±4.2	60	5.67±0.35
				7	38.71±2.04	61	19.96±0.14
8	26.99±0.08	63	8.13±0.07
				13	16.10±2.07	71	34.25±3.45
14	93.33±2.01	72	23.61±2.27
				17	42.12±0.91	74	49.38±1.03
18	9.08±1.16	78	34.41±2.04
				21	30.94±0.30	80	71.31±0.07
24	1.22±0.22	82	0
				26	9.65±0.89	98	0
30	141.32±1.86	113	ND
				31	28.41±0.99	129	25.83±0.79
32	52.16±0.26	160	52.37±0.92
				34	21.71±0.03	179	87.36±0.88
35	18.62±2.13	183	49.50±0.37
				36	11.70±0.72	186	13.46±0.08
39	9.89±0.91	187	3.85±0.79
				40	27.19±0.27	200	ND
41	76.69±0.44	203	127.0±0.29
				42	80.02±0.34	235	46.23±0.09
45	7.77±0.61	236	96.63±0.37

49

8.574±0.08

237

189.954±0.89

ND表不未检测

7、显微镜观察产胞外多糖乳酸菌细菌形态

对编号237分离菌株进行革兰氏染色后，用显微镜观察细胞形态，如附图1所示。编号237菌株为革兰氏染色阳性细菌，细胞呈短杆状，单个或成对。

8、利用糖发酵实验对分离菌株进行鉴定

糖发酵实验依据生物梅里埃中国有限公司的操作说明进行，编号237纯菌株培养物在MRS琼脂培养基(BD Difco公司以商品名

Lactobacilli MRS Broth销售的用于乳杆菌培养的培养基)上，37℃微厌氧培养48h，用无菌的棉花拭子收获细菌，接种于加了API 50 CHL培养基(生物梅里埃中国有限公司，API 50 CHL Medium)的凹槽中，用石蜡油封好，37℃培养24-28h，记录菌株对49种碳水化合物的发酵结果，表6是编号237号菌株的发酵情况。

表6 237号菌株的发酵情况

编号	测试底物	237号菌株	编号	测试底物	237号菌株
						0	对照物	-	25	七叶灵柠檬酸铁	+
1	甘油	-	26	水杨苷	V
						2	赤藓糖醇	-	27	D-纤维二糖	+
3	D-阿拉伯糖	-	28	D-麦芽糖	+
						4	L-阿拉伯糖	+	29	D-乳糖	+
5	D-核糖	+	30	D-蜜二糖	+
						6	D-木糖	+	31	D-蔗糖	+
7	L-木糖	-	32	D-海藻糖	+
						8	D-核糖醇	-	33	菊粉	-
9	甲基-βD-木吡喃糖苷	-	34	D-松三糖	-
						10	D-半乳糖	+	35	D-棉子糖	+
11	D-葡萄糖	+	36	淀粉	-
						12	D-果糖	+	37	糖原	-
13	D-甘露糖	+	38	木糖醇	-
						14	L-山梨糖	-	39	D-龙胆二糖	+
15	L-鼠李糖	-	40	D-土伦糖	+
						16	卫茅醇	-	41	D-来苏糖	-
17	肌醇	-	42	D-塔格糖	-

18	甘露醇	V	43	D-岩藻糖	-
						19	山梨醇	-	44	L-岩藻糖	-
20	甲基-αD-比喃甘露糖苷	-	45	D-阿拉伯醇	-
						21	甲基-αD-吡喃葡萄糖苷	+	46	L-阿拉伯醇	-
22	N-乙酰葡萄胺	+	47	葡萄糖酸钾	+
						23	苦杏仁苷	V	48	2-酮基葡萄糖酸钾	-
24	ARBULIN	V	49	5-酮基葡萄糖酸钾	+

+阳性，变色；-阴性，培养基不变色；V不确定

将实验结果输入梅里埃公司的APl鉴定软件APl LAB PLUS进行分析，编号237分离株鉴定为短乳杆菌Lactobacillus brevis，命名为Lactobacillus brevis BT0898，于2007年7月29日保藏于中国典型物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M207106。

实施例2、短乳杆菌BT0898细胞悬浮液的制备

短乳杆菌BT0898在MRS液体培养基中于37℃培养18h，在4℃以5000r/min离心10min收集细胞。这些细胞沉淀用冷无菌PBS缓冲液(例如上海水源生物科技有限公司生产的GNB10010 PBS缓冲液，每升含O.144g KH₂PO₄、9.0g NaCl、0.795g Na₂HPO₄7H₂O，pH7.4)洗涤两遍，然后重新悬浮于PBS缓冲液中，调整在620nm下光密度为1.0。标准细胞悬液于4℃贮存备用(24h之内)。将标准细胞悬浮液置于100℃下加热15min，然后涡漩分散5min打散絮凝细胞团，制备得死细胞悬浮液。

实施例3、短乳杆菌BT0898细胞对诱变剂的吸附和释放试验

将两种化学诱变剂4-硝基喹啉-N-氧化物(4-Nitroquinoline-N-oxide.4NQNO，购自A Johnson Matthey公司)、2-硝基芴(2-Nitrofluorine.2NF，购自德国Acros-Organics公司)分别溶于二甲基亚砜(DMSO)，诱变剂浓度为1mg/mL。将lmL乳酸菌细胞悬浮液置于小无菌瓶中，向其中加入诱变剂溶液，最终浓度为10μg/ml。对照样品为不含乳酸菌的PBS缓冲液。于37℃在摇床上孵育3h，然后以5000r/min 4℃离心10min，上清液用0.45μm Millipore滤膜(密理博中国有限公司)过滤，根据Lankaputhra和Shah等人(Antimutagenic properties of probiotic bacteriaand of organic acids.Mutation Research-Fundamental and MolecularMechanisms of Mutagenesis 1998；397：169-182)的方法测定上清液中未被乳酸菌吸附的诱变剂的浓度。离心沉淀下来的细胞用PBS缓冲液洗涤，悬浮于DMSO中，涡漩分散5min，然后离心，测定上清液中从细胞中释放出来的诱变剂的含量。结果列于图2中。

由该图可以看出，短乳杆菌BT0898死/活细胞对两种化学诱变剂2-硝基芴(2-NF)和4-硝基喹啉-N-氧化物(4NQNO)都有较高的吸附率，死细胞与活细胞对诱变剂的吸附模式也类似。

实施例4、短乳杆菌BT0898发酵酸乳及其丙酮提取物的制备和抗致突变效果试验

市售脱脂乳经过在121℃灭菌10min，冷却，接种2.5体积％短乳杆菌BT0898，再在30℃培养24h左右至凝乳，即得到发酵酸乳，将25mL发酵酸乳破碎并冻干，冻干粉用10倍体积的丙酮提取，提取后在40℃真空蒸干丙酮，然后将丙酮提取物粉溶解于4ml的DMSO溶液中。

按照Maron和Bodana等人(Mutation Research/EnvironmentalMutagenesis and Related Subjects 1983；113：173-215)的方法进行抗致突变艾姆斯实验。艾姆斯实验中所采用的菌种为Salmonella typhimuriumTA 98(移码突变型)、Salmonella typhimurium TA 100(碱基置换型)于营养肉汤培养基中37℃培养12-16h至1-2×10⁸cfu/ml，置于4℃备用。取100μl的S.typhimurium TA 100和S.typhimurium TA 98的12h培养物、75μl的提取物DMSO溶液、0.5μg 4NQNO或者0.5μg 2NFDMSO溶液，加入到2ml上层琼脂(45℃水浴)中，涡漩分散，然后迅速倒在底层琼脂上并让其凝固。将平板置于37℃培养48h，对回复突变菌落进行计数。从计数结果中减去自发回复突变的菌落数，报告结果为每皿回复突变数，按照下式计算抗致突变率。

％抗致突变率=[(P-T)/(P-S)]×100

P=存在诱变剂时产生的回复突变菌落数(阳性对照)；

T=存在发酵酸乳或丙酮提取物时产生的回复突变菌落数；

S=自发回复突变菌落数。

用75μl发酵酸乳代替发酵酸乳提取物，测定方法同上，测定乳酸菌发酵酸乳的抗突变效果，以等量的未发酵酸化凝乳为对照。实验结果列于表7和表8中。由表7的数据可以看出，短乳杆菌BT0898发酵酸乳能够显著减少两种诱变剂导致的回复突变数量(P<0.05)。根据中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》，短乳杆菌BT0898发酵酸乳的抗致突变性程度为明显抑制，其丙酮提取物有类似的抗致突变活性。由表8可以看出，短乳杆菌BT0898发酵酸乳的抗致突变活性是38.5-54.3％，而短乳杆菌BT0898发酵酸乳丙酮提取物的抗突变活性变化很大，从8.O％至35-3％(视测试菌株而定)。

表7短乳杆菌BT0898发酵酸乳对沙门氏菌回复突变的影响

^*P<0.05

表8短乳杆菌BT0898发酵酸乳丙酮提取物

对沙门氏菌回复突变的影响

诱变剂

回复突变数cfu/皿

抗致突变率％

		自发突变组S	阳性对照组P	丙酮提取物组
						4NQNO	TA 98	93±11.3	1125±7.1	879±14.1*	23.8
	TA100	203±7.1	1033±19.8	772±5.7*	27.8
						2NF	TA 98	93±11.3	982±14.1	911±11.3	8.0
	TA100	203±7.1	1412±4.2	985±33.9*	35.3

^*P<0.05

实施例5、短乳杆菌BT0898胞外多糖产物的抗致突变效果试验

将如实施例1(6)制备得到的胞外多糖溶解于DMSO溶液，取75μl(约含EPS300μg)。将100μg粗EPS溶解于5ml DMSO制备得到EPS工作储液。对照为不含EPS的DMSO溶液。所有数据均测定三次，并计算平均值和标准偏差。采用SAS 5.1.2600软件进行方差分析(ANOVA)。采用Duncan多变域检验测定不同组别的差异性，P<0.05时，认为其差异显著。这些结果列于表9中。

表9短乳杆菌BT0898胞外多糖的抗致突变效果

诱变剂	沙门氏菌	回复突变数cfu/皿			抗致突变率％
						自发突变组S	阳性对照组P	胞外多糖组
		4NQNO	TA100	203±7.1					1033±14.3	927±12.7	12.8
2NF	TA100				203±7.1	1412±13.0	856±24*	46.0

^*P<0.05

短乳杆菌BT0898产生的胞外多糖对4NQNO导致的诱变性的抑制效果不明显，抗致突变率为12.8％。而对2NF的抗突变效果比较明显，抗致突变率达到46.0％。

应用实施例1：含有短乳杆菌BT0898的乳酸菌饮料制备

将原料乳脱脂奶在95℃加热灭菌20min，然后冷却至4℃，加入本发明的短乳杆菌BT0898工作发酵剂，使其浓度达到10⁶cfu/ml以上，4℃冷藏保存即得到含有短乳杆菌BT0898的乳酸菌饮料。

应用实施例2：含有短乳杆菌BT0898的乳粉制备

将原料乳鲜奶在140℃高温热杀菌2s后，再冷却至37℃，以原料乳体积的4％接菌量加入本发明的短乳杆菌BT0898工作发酵剂，在37℃发酵45h，得到短乳杆菌BT0898发酵乳，将所述的短乳杆菌BT0898发酵乳以体积计按照1∶3加入灭菌后的原料乳中进行均质，经真空浓缩、喷雾干燥处理后得到含有短乳杆菌BT0898的乳粉。

应用实施例3：含有短乳杆菌BT0898的胶囊制品制备

将原料乳鲜奶在140℃高温热杀菌2s后，再冷却至37℃，以原料乳体积的4％接菌量加入本发明的短乳杆菌BT0898工作发酵剂，在37℃发酵45h，得到短乳杆菌BT0898发酵乳，将所述的短乳杆菌BT0898发酵乳以体积计按照1∶3加入灭菌后的原料乳中进行均质，经真空浓缩、喷雾干燥处理后得到含有短乳杆菌BT0898的乳粉，将得到的乳粉装到胶囊中制成胶囊制品。

应用实施例4：含有短乳杆菌BT0898的发酵酸乳制备

将原料乳鲜奶在95℃加热灭菌20min后，再冷却至37℃，以3-5体积％的量加入本发明的短乳杆菌BT0898工作发酵剂，以及加入可共生的制备发酵酸乳的商业发酵剂保加利亚乳杆菌，该混菌在37℃发酵至滴定酸度为0.6％(以乳酸计)，冷藏至4℃并冷藏保存即得到含有短乳杆菌BT0898的发酵酸乳。

Claims (10)

1.一种具有抗致突变活性、产胞外多糖的短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)BT0898，其保藏编号CCTCC NO：M207106。

2.根据权利要求1所述短乳杆菌BT0898在含有短乳杆菌BT0898的发酵食品中的用途。

3.根据权利要求2所述短乳杆菌BT0898的用途，其特征在于所述含有短乳杆菌BT0898的发酵食品是乳酸菌奶饮料、乳粉、胶囊制品或发酵乳。

4.根据权利要求3所述短乳杆菌BT0898的用途，其特征在于所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备得到的：

首先，制备所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，

然后，原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到4℃，再加入所述短乳杆菌BT08 98工作发酵剂，使其浓度达到10⁶cfu/ml以上，在4℃冷藏保存即得到含有短乳杆菌BT0898的乳酸菌饮料。

5.根据权利要求3所述短乳杆菌BT0898的用途，其特征在于所述的乳粉是按照下述步骤制备得到的：

首先，制备所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，

然后，原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再以原料乳体积的4％接菌量接种所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，再在37℃下发酵45h，得到短乳杆菌BT0898发酵乳，将所述的短乳杆菌BT0898发酵乳按照1∶3(V/V)加到上述灭菌原料乳中，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含有短乳杆菌BT0898的乳粉。

6.根据权利要求3所述短乳杆菌BT0898的用途，其特征在于所述的胶囊制品是按照下述步骤制备得到的：

首先，制备所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，

然后，原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再以原料乳体积的4％接菌量接种所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，再在37℃下发酵45h，得到短乳杆菌BT0898发酵乳，将所述的短乳杆菌BT0898发酵乳按照1∶3(V/V)加到上述灭菌原料乳中，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含有短乳杆菌BT0898的乳粉，再把该乳粉装入胶囊，制成胶囊制品。

7.根据权利要求3所述短乳杆菌BT0898的用途，其特征在于所述的发酵乳是按照下述步骤制备得到的：

首先，制备所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，

然后，原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再按照3-5体积％加入所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂，再加入3-5体积％可共生的制备发酵乳商品发酵剂，混匀后在37℃下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0.6-0.7％，然后冷却至4℃，再进行冷藏保存得到含有短乳杆菌BT0898的发酵乳。

8.根据权利要求7所述短乳杆菌BT0898的用途，其特征在于所述的商品发酵剂是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。

9.根据权利要求4、5、6、7所述的短乳杆菌BT0898的用途，其特征在于所述短乳杆菌BT0898工作发酵剂是采用下述制备方法制备的：

将短乳杆菌BT0898原始菌种接种于12重量％在110℃灭菌10min的脱脂乳中，在37℃条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，作为母发酵剂使用；将母发酵剂按3-5体积％接种于上述的灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，此时凝乳中活菌数约在10⁹cfu/mL，得到所述的工作发酵剂；或者

将短乳杆菌BT0898原始菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4体积％接种于MRS培养基中，培养16-18h，在4℃条件下4000r/min离心15min，去除上清夜，得到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂。

10.根据权利要求4、5、6、7中任一项权利要求所述的用途，其特征在于所述的原料乳是一种或多种选自脱脂奶、鲜奶、复原奶的原料乳。

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