CN111925961A - 一株植物乳杆菌Lp2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株植物乳杆菌Lp2，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2019935；一种益生菌固体饮料，它包括下列重量份数的组分：植物乳杆菌冻干粉10份，低聚异麦芽糖5~10份，大豆低聚糖5~10份，果味粉5~15份；所述的植物乳杆菌保藏编号为CCTCC NO：M 2019935；所述的一株植物乳杆菌Lp2在制备抗肠炎药物的应用；结果表明，植物乳杆菌Lp2具有良好的耐受酸胁迫、耐受胆盐胁迫、抗致病菌感染、较高的肠道定植能力，对LPS诱导的急性炎症具有保护作用；植物乳杆菌Lp2菌株在体外益生功能评价和小鼠体内的各项指标均优于其他菌株，表明植物乳杆菌Lp2在发挥抗炎方面表现出明显的菌株特异性。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌Lp2及其应用。
背景技术
在日常生活中，一些不良的饮食习惯，如高脂和酒精的过量摄入等，会导致体内脂多糖升高。当过量的脂多糖进入血液循环，与宿主接触时，能引发系统性炎症反应，导致多个器官的损伤，休克，甚至死亡。事实上，肥胖，糖尿病，心血管疾病和非酒精性脂肪肝疾病患者表现出血液中LPS水平的上升，这些重大疾病的发生都与炎症相关。研究证实这些疾病患者体内的大多数内毒素不是来源于感染本身，是由胃肠道内的内毒素转移引起。
革兰氏阴性菌产生的脂多糖(LPS)能直接激活哺乳动物的单核巨噬细胞产生大量炎症介质，如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)等，这些炎症介质能直接或间接地对细胞和组织产生损伤作用。在一些炎症机体内，肠道菌群紊乱和屏障功能失调的情况普遍存在，由此导致肠道来源的LPS移位进入肝脏等器官，进一步恶化脏器功能。
益生菌是一类能对机体产生有益作用的微生态制剂。益生菌作用于胃肠道具有改善肠道菌群、提高免疫、抗过敏、抗氧化、抗炎、降胆固醇、降压、减肥等功效。近年来研究发现一些乳酸菌发挥这些功效的作用机制主要包括：改善肠道粘膜屏障功能；增强免疫调节功能；修复机体氧化损伤、提高抗氧化能力等，在一些与LPS相关，并存在肠道屏障功能失调的试验小鼠模型中，益生菌被报道能抑制炎症反应。
目前，对于炎症性疾病的治疗手段还很局限，主要是临床上使用药物治疗的方法，但药物治疗会带来药物残留以及药物副作用等危害，益生菌作为一种辅助治疗的有效方式，而且与药物治疗相比较价格低廉、安全性高，具有极大的开发前景。
由于我国居民的饮食习惯及遗传因素等与国外人种存在差异，从国外引入的益生菌菌株可能不一定完全适合我国居民服用。我国长白山地区优越的地理环境造就了东北丰富的资源，形成了极具特色的发酵食品，例如东北酸菜、泡菜等，经过长期的自然驯化，乳酸菌形成优势菌株，也是益生菌的良好来源。目前，我国暂无自主知识产权的抗炎作用益生菌菌株或相关产品，因此从我国居民经常食用的自然发酵食品中经平板划线法分离纯化出植物乳杆菌Lp2并研究其抗炎效果，从而开发具有自主知识产权的、适合我国居民服用的益生菌菌株及其制品，对推进我国益生菌产业发展及促进国民身体健康具有重要意义。
发明内容
本发明目的是提供一种具有高肠道定植能力和抗炎作用的植物乳杆菌Lp2及应用。
一株植物乳杆菌Lp2，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2019935。
一种益生菌固体饮料，它包括下列重量份数的组分：植物乳杆菌冻干粉10份，低聚异麦芽糖5~10份，大豆低聚糖5~10份，果味粉5~15份；所述的植物乳杆菌，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2019935；
所述的果味粉为蓝莓粉、蔓越莓粉或山楂粉；
所述的植物乳杆菌冻干粉，是由下述方法制备的：将植物乳杆菌Lp2活化，扩大培养，在3000~5000r/min下离心8~15min、洗涤，离心弃上清，得到菌体；将菌体和冻干保护剂按体积比1~3:1混合，冷冻干燥，得到植物乳杆菌冻干粉；
所述的冻干保护剂，按质量百分比计算包括下列组分：脱脂奶粉10%-12%、纤维素7%-9%、海藻糖3%-5%、普兰多糖6%-8%，余量为水。
所述的一株植物乳杆菌Lp2在制备抗肠炎药物的应用。
本发明提供了一株植物乳杆菌Lp2，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2019935；一种益生菌固体饮料，它包括下列重量份数的组分：植物乳杆菌冻干粉10份，低聚异麦芽糖5~10份，大豆低聚糖5~10份，果味粉5~15份；所述的植物乳杆菌，它的保藏编号为CCTCC NO：M2019935；所述的一株植物乳杆菌Lp2在制备抗肠炎药物的应用；结果表明，植物乳杆菌Lp2具有良好的耐受酸胁迫、耐受胆盐胁迫、抗致病菌感染、较高的肠道定植能力，对LPS诱导的急性炎症具有保护作用；植物乳杆菌Lp2菌株在体外益生功能评价和小鼠体内的各项指标均优于其他菌株，表明植物乳杆菌Lp2在发挥抗炎方面表现出明显的菌株特异性。
附图说明
图1 植物乳杆菌Lp2光学显微镜下的照片；
图2 菌株的16S rRNA基因序列测定结果；（A）16srDNA测序结果，（B）系统发育树；
图3 菌株的生长曲线和产酸能力结果；
图4 菌株对低聚异麦芽糖耐受能力结果；
图5 小鼠的脏器系数测定结果；A：肝脏系数；B: 胸腺系数；C: 脾脏系数；
图6 小鼠血清和肝脏的AST测定结果；A:血清；B:肝脏；
图7 小鼠血清和肝脏的ALT测定结果；A:血清；B:肝脏；
图8 小鼠血清和肝脏的TNF-α测定结果；A:血清；B:肝脏。
具体实施方式
实施例1 植物乳杆菌Lp2的筛选和鉴定
1、菌株的筛选
将市售东北酸菜，在实验室进行乳酸菌分离；将酸菜发酵液以10-1的梯度稀释，涂布于MRS琼脂平板上，厌氧培养24 h，挑取单菌落，在平板上划线分离，反复进行纯化培养，用革兰氏染色法观察菌落形态挑选革兰氏阳性菌株；将挑选的多株菌株，再在液体MRS培养基中37℃培养24h，按照培养液3%的接种量进行接菌，连续活化传代三次，以保证菌体旺盛的生长活力。
所述的液体MRS培养基含有蛋白胨10.0g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.58g，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g。
2、菌悬液的制备
将上述活化并扩大培养的菌液4000 r/min离心10 min,用0.85%的生理盐水洗涤2遍，离心弃上清，得到菌体沉淀，悬浮于等体积的生理盐水中，得到菌悬液。
3、菌种鉴定
将经平板划线法分离出的生长活力较好的革兰氏阳性菌株送到上海生工公司进行测序，经过16SrDNA鉴定；结果为，与植物乳杆菌显示出最高的分子系统学上的亲缘关系（图1）；因此命名为植物乳杆菌Lp2，拉丁文学名Lactobacillus plantarum Lp2，现保存于武汉市中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学)，保藏时间为2019年11月15日，编号：CCTCCNO：M 2019935。
实施例2 植物乳杆菌Lp2耐受性试验
1、植物乳杆菌Lp2生长曲线和产酸能力的测定
植物乳杆菌Lp2在培养过程中，每2 h一次取样，对培养液进行以下分析：总菌数用分光光度法(波长600 nm)测吸光度值(OD)；pH值用酸度计测定。该菌株生长曲线和pH值曲线见图3；由图3可知，0~2 h为该菌株的迟滞期，菌株的数目和pH值无变化，2 h后进入对数期，菌数目呈直线快速增长，随着菌数的增多，产代谢物乳酸也越多，pH值随之迅速下降；当pH值降低至2左右时，乳酸菌的生长由于酸抑制而停滞，在18 h后逐渐稳定，到达稳定期。
2、耐酸性评价
分别将菌株（植物乳杆菌Lp2、植物乳杆菌Lp3、短乳杆菌Lb1）按照2%接种量接种于液体MRS培养基，在37℃培养18h；培养液于4℃在4000 rpm离心10 min，得到菌泥用0.85%的生理盐水洗涤两次，用无菌生理盐水将菌泥悬浮，保证活化的菌株约为108 CFU/mL，然后按照2%的接种量将菌悬液接种于pH为2.0，3.0的MRS培养基中，分别在0 h、2 h、4 h取样，用生理盐水进行10倍稀释，稀释适当浓度后涂布于MRS固体培养基中，37℃恒温培养48 h，菌落记数，每个浓度作三个平行，求其平均值，计算活菌数；
结果见表1，从表中看出在低pH条件下，植物乳杆菌Lp2菌株的存活率仍能达到90%以上，说明其具有良好的耐酸能力。
3、耐胆盐评价
将筛选菌株植物乳杆菌Lp2和植物乳杆菌Lp3、短乳杆菌Lb1对比，分别以2%接种量接种于胆盐浓度分别为0.2%，0.3%，0.5%的MRS培养基中，37℃恒温培养，采用平板计数法，进行稀释涂布，每个浓度作三个平行，求其平均值，计算活菌数；结果见表2，从表中看出随着胆盐浓度的升高，植物乳杆菌Lp2菌株活菌数增加，存活率能达到90%以上，说明其具有良好的耐胆盐能力。
4、代谢产物抑菌性评价
利用滤纸片法进行菌株代谢产物的抑菌实验。将活化好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌菌液稀释至105 CFU/mL，取0.1 mL涂布到LB平板上，将已灭菌的滤纸片放于平板中，平行放置三个，取已活化好的筛选菌株发酵上清液，分别吸取0.3 mL放入滤纸片上，然后将平板静止20 min后慢慢放于37℃恒温培养箱，培养24 h，观察并测量抑菌圈直径大小，平行实验三次；
结果见表3，从表中看出植物乳杆菌Lp2对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌直径分别为22.90 mm、17.43 mm、30.07 mm，表明其良好的抑菌特性。
5、耐药性评价
将筛选菌株按2%的接种量接入MRS液体培养基，37℃培养至对数生长期，无菌吸取0.1mL至MRS琼脂平板，涂布均匀，选取5种常用的药敏纸片：红霉素、卡那霉素、氯霉素、链霉素、四环素，无菌镊子夹取放至已涂布菌液的MRS平板上，每个平板放置3种不同药敏纸片，37℃培养24 h, 并用游标卡尺准确称量抑制圈直径。
结果见表4，从表中看出植物乳杆菌Lp2对链霉素和卡那霉素不敏感，氯霉素、红霉素、四环素敏感，但仍在安全浓度的范围内。
将筛选菌株以2%接种量接种于256 μg/mL，128 μg/mL，64 μg/mL，32 μg/mL，16 μg/mL，8 μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL浓度抗生素的MRS液体培养基中（抗生素粉购自北京Sorlabio公司），与等量MRS正常培养基对照相比，观察筛选菌株对抗生素最低浓度耐受能力。
结果见表5，筛选菌株对卡那霉素和链霉素的最低抑制浓度分别为256和128 μg/mL，对氯霉素和四环素较敏感，最低抑制浓度分别为4和8 μg/mL，对青霉素耐受能力极其敏感。
6、植物乳杆菌Lp2的低聚异麦芽糖耐受能力
将筛选菌株以2%接种量接种于添加低聚异麦芽糖的MRS培养基中，37℃恒温培养，每2h取样测定其OD600(nm)值，绘制生长曲线，做三组平行，观察低聚异麦芽糖对Lp2菌株生长的影响。
培养基配方：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0g，低聚异麦芽糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0g，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.58g，硫酸锰（MnSO4·H2O） 0.25g。
结果见图4，从图中看出随着培养时间增加，菌株OD值增加，说明其具有良好的耐受能力，与正常MRS培养基比较且具有增殖菌株生长能力。
7、植物乳杆菌Lp2对模拟人工胃肠液耐受能力
将筛选菌株按2%的接种量接入到MRS液体培养基，37℃培养24 h，取10 mL菌液在3000g条件下离心10 min下，弃上清，用无菌PBS溶液洗涤两次，收集菌体沉淀加入10mL PBS混匀，取1 mL菌液加入9mL模拟人工胃液(购自 Beijing Biotechnology Co.,Ltd)，37℃培养4 h后，再从模拟胃液中取1 mL菌液加入9mL模拟人工肠液(购自 Beijing BiotechnologyCo.,Ltd)，37℃培养4h。每2h分别取样平板涂布计数；
结果见表6，从表中看出植物乳杆菌Lp2依次经过pH2.0人工胃液环境中细菌存活力上升，培养4h活菌数略微降低但影响不大，经pH 8.0人工肠液环境后细菌存活率显著增加，可以说明该菌株具有良好的适应体内胃肠液环境的能力。
实施例3. 植物乳杆菌Lp-2对Caco-2 细胞粘附能力试验
1、Caco-2 细胞的培养
将Caco-2细胞接种到细胞培养瓶中，使用含有10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素双抗液的DMEM (Dulbecco's modified eagle medium）培养基于37℃、5% CO2条件下培养5~6d细胞聚合度可达到90%~100%；将生长状态良好的Caco-2细胞接种于24孔板上(孔径16 mm，有效膜面积1.9 cm2)，接种密度为0.5×105/孔，37℃、5% CO2条件下培养21 d，隔天换液，倒置显微镜下观察细胞生长情况约21 d后细胞形成紧密单层。
2、植物乳杆菌Lp2菌悬液的制备
菌株按2%的接种量接入到MRS液体培养基，37℃培养24 h，然后在3000 g条件下离心5min下，弃上清，收集菌体沉淀于（不含青霉素和链霉素）DMEM溶液中，并调整菌体浓度至109CFU/mL，待用；
3、涂板计数法
培养至21 d的Caco-2细胞，小心吸去24孔板中的培养液，用无菌PBS溶液洗涤两次，每孔加入1 mL制备好的菌悬液或等量DMEM溶液作为空白对照，37℃、5% CO2条件下共孵育2h。2 h后吸走培养液，并用PBS溶液洗两次，以除去过量的未黏附于细胞的植物乳杆菌Lp2。每孔加入0.5 mL胰酶消化1~2 min，再加入0.5 mL DEME培养基并用移液枪小心吹打均匀，取0.1 mL菌悬液连续稀释到合适的浓度梯度，涂布于MRS琼脂培养基，37℃培养24 h，采用平板计数计算结果。黏附率按如下公式计算：
黏附率
（%）
结果表明植物乳杆菌Lp2对Caco-2细胞的黏附率为30.56%，具有较好的黏附肠道细胞的能力，有利于植物乳杆菌Lp2在肠道的定植。
实施例4 动物试验
1、动物的选择
选择健康成年的雄性昆明小鼠30只，将小鼠随机分配为3组，每组10只，饲喂不同饮食，分别为：
A组：正常对照组（Control）：普通饲料；
B组：模型对照组（LPS）：普通饲料+注射脂多糖；
C组：干预组（Lp2+LPS）；普通饲料+注射脂多糖+植物乳杆菌Lp2菌液；
小鼠造模前各组给予基础饲料适应性喂养1周，待其代谢状态稳定后随机分三组，给予普通饲料和饮用水，其中一组额外摄入1mL/天的植物乳杆菌Lp2菌液进行喂养，作为干预组，其他两组作为正常对照组和模型对照组，每10只分笼。每天光照时间12 h，温度控制在20±2℃，湿度50±5%。在小鼠喂养四周后，对模型对照组和Lp2+LPS组腹腔注射脂多糖LPS，正常对照组注射等量的无菌生理盐水，6 h后眼球取血处死。处死前进行称重，麻醉后打开小鼠腹腔和胸腔，立即分离肝脏、脾、肾和盲肠，分别称重。
脏器指数（mg/g）=各脏器重量/小鼠处死前的最终体重。
2、小鼠样本的制备
血液样本制备：将小鼠血液收集在1.5 mL离心管内，常温静置一段时间后低温（4℃）离心，条件为3000 rpm离心10 min，取上清液置于干净离心管中，保存于-80℃，待用。
肝匀浆液的制备：准确称取0.1g小鼠肝脏组织置于1.5 mL离心管中，用手术剪在离心管内剪碎，并加入900 μL生理盐水缓冲液将肝脏组织进行充分匀浆。匀浆结束后，置于冷冻高速离心机内，在4℃条件下离心10 min，转速为3000 rpm，取上清液即得肝脏组织匀浆液，置于-80℃冰箱保存，待用。
3、生化指标的检测
小鼠血清及肝脏中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)等指标均严格按照试剂盒说明书进行操作；TNF-α用ELISA方法进行检测。
结果及分析：试验结果显示，与模型对照组相比，正常对照组与干预组小鼠肝脏重量均显著低于模型对照组，表明肝脏的病理症状得到了缓解；与模型对照组相比，正常对照组的胸腺系数显著降低，说明LPS诱导的炎症反应对胸腺有很大影响，干预组显著升高，伴随LPS急性炎症的发生免疫器官胸腺的也产生急性反应；与模型对照组相比，正常对照组的脾脏系数显著降低，说明LPS诱导的炎症反应对脾脏有一定的影响，但植物乳杆菌Lp2干预后的LPS小鼠脾脏系数并没有明显变化，说明植物乳杆菌Lp2对LPS诱导过炎症反应的免疫器官脾脏影响不大，但免疫器官胸腺对急性炎症反应影响较大，且差异性显著。实验组血清中与肝脏中AST与ALT的表达量也都显著降低，植物乳杆菌Lp2有效的抑制了血清和肝脏中AST和ALT表达量的升高，分别降低了11.69%、18.92%和13.66%、6.55%，说明植物乳杆菌Lp2对急性肝损伤和急性炎症反应有一定的缓解和改善作用。血清和肝脏中TNF-α表达量存在差异，与模型组相比,肝脏中TNF-α的表达量显著降低，血清中的TNF-α的表达量几乎没有变化。
综上结果表明，植物乳杆菌Lp2同时具有良好的耐受酸胁迫、耐受胆盐胁迫、抗致病菌感染、较高的肠道定植能力，同时，作为具有益生潜能的乳酸菌对LPS诱导的急性炎症具有保护作用；同时，比较了分离自东北酸菜样品的多株乳酸菌，植物乳杆菌Lp2菌株在体外益生功能评价和小鼠体内的各项指标均优于其他菌株，表明植物乳杆菌Lp2在发挥抗炎方面表现出明显的菌株特异性。
实施例5 益生菌食品的制备
1、益生菌发酵豆乳
(1)豆乳的制备：挑选颗粒饱满的大豆，按照大豆：纯水=1:12 加水浸泡8 h。用豆浆机在8000 r/min，1 min的条件下进行磨浆，磨浆过滤之后进行煮浆，100℃ 温度下煮沸 5min，使用150目滤布滤去豆渣；完成豆乳的制备，冷却待用；
(2)菌株的活化：将植物乳杆菌Lp2和嗜热链球菌的冻干菌粉接种于无菌脱脂乳培养基中，分别按最适温度进行培养，充分凝乳后进行传代，传代2~3次，每次接种量3%，活菌数达到109CFU/mL以上；
(3)发酵豆乳的制备：分别将植物乳杆菌Lp2和嗜热链球菌按1：1的比例混合菌株，按照3%-5%的接种量接种至已经冷却好的豆乳中，混合均匀，在 37℃ 条件下发酵4 h后凝乳，放入4℃保存；
2、植物乳杆菌冻干粉
(1)植物乳杆菌Lp2菌体制备：将植物乳杆菌Lp2在37℃条件下培养18 h，按照培养液3%的量进行接种，连续活化三代；将上述活化并扩大培养的种子液4000 r/min离心10 min，用无菌水洗涤2遍，离心后，弃上清，得到菌体沉淀，悬浮于等体积的冻干保护剂中，得到1010CFU/mL的菌悬液；
(2)保护剂制备：在水溶液中分别添加脱脂奶粉10%-12%，纤维素7%-9%，海藻糖3%-5%，普兰多糖6%-8%，在80℃，20 min的条件下灭菌，制成冻干保护剂；
(3)冷冻干燥制备植物乳杆菌冻干粉；
3、益生菌固体饮料
系列益生菌固体饮料（3g）配方：
1）蓝莓风味固体饮料：植物乳杆菌冻干粉1 g，低聚异麦芽糖0.5~1.0 g，大豆低聚糖0.5~1.0 g，蓝莓粉0.5~1.5 g；
2）蔓越莓风味固体饮料：植物乳杆菌冻干粉1 g，低聚异麦芽糖0.5~1.0 g，大豆低聚糖0.5~1.0g，蔓越莓粉0.5~1.5 g；
3）山楂风味固体饮料：植物乳杆菌冻干粉1 g，低聚异麦芽糖0.5~1.0 g，大豆低聚糖0.5~1.0 g，山楂粉0.5~1.5 g；
4）产品规格：上述的几种固体饮料，均采用3 g为1包，添加的植物乳杆菌Lp2的活菌数为1010 CFU/mL。
Claims (6)
1. 一株植物乳杆菌Lp2，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2019935。
2.一种益生菌固体饮料，它包括下列重量份数的组分：植物乳杆菌冻干粉5-10份，低聚异麦芽糖5~10份，大豆低聚糖5~10份，果味粉5~15份；所述的植物乳杆菌，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2019935。
3.根据权利要求2所述的一种益生菌固体饮料，其特征在于：所述的果味粉为蓝莓粉、蔓越莓粉或山楂粉。
4.根据权利要求3所述的一种益生菌固体饮料，其特征在于：所述的植物乳杆菌冻干粉，是由下述方法制备的：将植物乳杆菌Lp2活化，扩大培养，在3000~5000r/min下离心8~15min、洗涤，离心弃上清，得到菌体；将菌体和冻干保护剂按体积比1~3:1混合，冷冻干燥，得到植物乳杆菌冻干粉。
5.根据权利要求4所述的一种益生菌固体饮料，其特征在于：所述的冻干保护剂，按质量百分比计包括下列组分：脱脂奶粉10%-12%、纤维素7%-9%、海藻糖3%-5%、普兰多糖6%-8%，余量为水。
6.权利要求1所述的一株植物乳杆菌Lp2在制备抗肠炎药物的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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