CN115044498A - 一株适于发酵红枣饮料的植物乳杆菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株适于发酵红枣饮料的植物乳杆菌株及其应用，属于生物工程技术领域。本发明从水果自然发酵分离出的菌株中，通过产酸能力初筛，益生菌潜力复筛和发酵实验得到一株性能良好的植物乳杆菌MY‑12。该菌株能够适应红枣汁的发酵环境、发酵速度快，糖酸比适中，同时在保证活菌数的基础上所产的红枣乳酸菌饮料口感协调且红枣典型性明显，其优良的耐酸、耐胆盐的能力能够确保其顺利进入肠道内，实现益生作用。
Description
技术领域
本发明涉及一株适于发酵红枣饮料的植物乳杆菌株及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
红枣是鼠李科枣属植物果实，因同时拥有食用和药用价值而被誉为“水果之王”。中国红 枣产量一直在增加，但是红枣的价格却持续走低，这主要原因是我国红枣年产量的80％左右 是以鲜枣、干枣和枣汁的形式消费的，红枣过于甜腻而市场不大，且不易储存，附加值低。 红枣富含维生素、矿物质、生物碱、萜类、多酚等生物活性物质，具有减肥、抗癌、消炎、护 肝、抗氧化、免疫刺激、胃肠保护、延缓衰老和神经保护等功能，因其丰富的活性成分使得 红枣成为极佳的功能性食品原料，这些丰富的营养成分，使得红枣成为极佳的功能性食品原 料，但是由于红枣含糖量高，随着人们对健康饮食的需求的日益增长，对红枣产品的深加工 有着迫切需求。
功能性食品市场越来越受到人们的关注，水果发酵饮料是迄今为止最受关注的功能性食 品之一。益生菌被定义为“在适当的剂量下对宿主的健康有益的活微生物”，在过去的几十年 里，含有益生菌的食品消费逐渐增加，而选择益生菌的标准应区分为在消化系统中存活的能 力。乳酸菌传统上被广泛用作天然食品生物防腐剂，因为它们能通过快速产生合成有机酸进 行酸化，可防止有害微生物污染，从而延长食品的保质期，同时若耐受消化系统到达肠道， 对机体产生有益作用。
发明内容
红枣汁因过于甜腻而不被市场所接受，本发明提供了一株适于在红枣汁中发酵的植物乳 杆菌及其应用，以增加红枣汁特殊的风味与营养价值。使用本发明筛选的乳酸菌株作为红枣 饮料发酵的发酵剂，不仅可以保持食品质量，还可以增加感官属性的原位表达，并增强它们 的营养特性，以促进人类健康。
本发明的第一个目的是提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MY-12，已于2021 年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24097，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个目的是提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有所述植物乳杆菌MY- 12。
在一种实施方式中，所述微生物菌剂中所述植物乳杆菌MY-12的含量不低于106cfu/mL 或106cfu/g。
本发明的第三个目的是提供一种生产红枣乳酸菌饮料的方法，所述方法是以红枣汁为原 料，利用植物乳杆菌MY-12发酵生产红枣乳酸菌饮料。
在一种实施方式中，在生产红枣乳酸菌饮料的主发酵阶段接种植物乳杆菌MY-12。
在一种实施方式中，所述方法步骤为：
(1)以红枣汁为原料，调节红枣汁的含糖量为130～150g/L、可滴定酸为1～5g/L，并进 行灭菌；
(2)将步骤(1)灭菌后的红枣汁中加入植物乳杆菌MY-12，使其在红枣汁中的菌浓不 低于107CFU/mL，在35～40℃下发酵40～50h。
优选地，在37℃下发酵48h。
在一种实施方式中，所述红枣汁的制备方法为：
(1)将红枣破碎去核，按红枣与水的质量比为1:8混合，在100℃下煮12min后打成浆， 得到红枣果浆；
(2)将红枣果浆冷却后按0.3％的质量比加入果胶酶，在50℃下酶解3h；
(3)将步骤(2)酶解液经100目滤网过滤，得到红枣汁。
本发明的第四个目的是提供所述的生产红枣乳酸菌饮料的方法制备得到的红枣乳酸菌饮 料。
本发明的第五个目的是提供一种食品，食品中含有所述植物乳杆菌MY-12或所述微生物 菌剂。
在一种实施方式中，所述食品为利用权利要求1所述植物乳杆菌、或权利要求2或3所 述的微生物菌剂发酵得到的发酵乳、果汁饮料或果酒。
本发明的第六个目的是提供所述的植物乳杆菌MY-12或微生物菌剂在制备乳酸菌饮料、 发酵食品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的植物乳杆菌CGMCC No.24097用于红枣乳酸菌饮料的酿造，能够适应红 枣果汁的发酵环境、发酵速度快，发酵后糖酸比适中，口感柔和，并有典型红枣香气，且菌 本身具有耐酸耐胆盐的益生菌潜力，发酵后活菌数多且抗氧化力增强，使发酵后的红枣乳酸 菌饮料有更强的营养价值，可使益生菌进入人体肠道内发挥益生作用。
生物材料保藏
本发明提供的植物乳杆菌MY-12，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，已于2021年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.24097，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所。
附图说明
图1为菌株的菌落形态图。
图2为菌株产酸能力初筛的显色结果。
图3为菌株耐酸能力复筛的结果。
图4为基于16S rDNA测序构建细菌菌株系统发育树。
图5为乳酸生产曲线。
图6为菌株感官结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进 一步地详细描述。
本发明实施例中菌株筛选和性能测定中所用的培养基：YPD液体培养基(g/L)：葡萄糖 20.0g，蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g。
MRS培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，牛肉膏10，葡萄糖10，乙酸钠5，柠檬酸 氢二铵2，硫酸镁0.6，硫酸锰0.3，吐温-80 1。
MRS培养基平板(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，牛肉膏10，葡萄糖10，乙酸钠5，柠 檬酸氢二铵2，硫酸镁0.6，硫酸锰0.3，吐温-80 1，琼脂粉10。
产酸能力培养基平板(g/L)：溴甲基酚紫0.8，酵母粉5，蛋白胨10，牛肉膏10，葡萄糖 10，乙酸钠5，柠檬酸氢二铵2，硫酸镁0.6，硫酸锰0.3，吐温-80 1，琼脂粉10
耐酸能力培养基：酵母粉5，蛋白胨10，牛肉膏10，葡萄糖10，乙酸钠5，柠檬酸氢 二铵2，硫酸镁0.6，硫酸锰0.3，吐温-80 1，用1mol/L的HCl调节pH至2。
耐胆盐能力培养基：溴甲基酚紫0.8，酵母粉5，蛋白胨10，牛肉膏10，葡萄糖10，乙酸钠5，柠檬酸氢二铵2，硫酸镁0.6，硫酸锰0.3，吐温-80 1，硫基乙酸钠3。
发酵培养基：调整处理好的红枣汁含糖量为140g/L，于高压蒸汽灭菌锅105℃灭菌10min。
实施例1：红枣的原料处理与红枣汁的制备
(1)红枣前处理及预煮
挑选没有破损、果实饱满原料红枣，以清水洗去红枣表面的尘土沙粒，再用纯净水冲洗 后，将红枣破碎去核，以1：8的料液比(红枣与水的质量比)加入固定量水，在100℃预煮 温度下预煮12min后打浆。
(2)酶解与过滤
经预煮打浆后的红枣果浆冷却后进行酶解，经工艺优化后加总质量0.3％的果胶酶于50℃ 酶解3小时。酶解完成后由100目滤网进行过滤，得到红枣汁进行糖度的调节。
实施例2：乳酸菌的筛选与鉴定
(1)菌种分离
204株分离自其他水果，保存在实验室的潜在乳酸菌菌株。
购买不同的水果，到实验室后，分别取3-5个榨汁，调整糖度至14°Brix，倒入无菌三角 瓶中，置于37℃恒温培养箱中自然发酵。自然发酵48h，取2ml菌液用0.85％生理盐水连续 稀释7个浓度梯度，将稀释的菌液均匀涂布在含有25mg/L制霉菌素和10mg/L万古霉素的抗 菌MRS平板上，37℃厌氧培养2d，并观察菌落生长情况。每组三个平行。将培养后的平板 中具有典型的乳酸菌的特征的单菌落挑出，在YPD平板中进行二次划线分离。将分离到的单 菌落培养后接入甘油管在-80℃下保存，并编号。
(2)菌株的一级筛选
将甘油管保藏的菌株接种于MRS液体试管中37℃活化12-18h后，接种于含有溴甲基酚 紫的产酸能力平板上，37℃培养48h，保留使培养基变色的菌株进行下一级筛选。
(3)菌株的二级筛选
益生菌需要通过人体消化系统到肠道才能发挥作用。根据人体消化途径，是否有着耐强 酸能力和高胆盐浓度的适应力是优良益生菌的筛选标准。故具有产酸能力的菌株接种于MRS 液体试管中37℃活化12-18h后，稀释合适的倍数后涂布平板，同时将菌液接种于pH为2的 耐酸能力培养基，37℃培养3h，稀释合适的倍数后涂布平板，计算耐酸存活率，每组三个平 行，结果如表1所示。
(4)菌株的三级筛选
由以上筛选，选择耐酸存活率在95％以上的乳酸菌菌株，将每个菌株在MRS液体试管 中37℃活化12-18h后，将菌液分别接种于加胆盐的耐胆盐能力培养基和普通MRS培养基中， 在620nm吸光度下，菌液在有无添加胆盐的培养基中增加0.3单位的时间之差被认为是细胞 适应含胆汁培养基的适应时间(AT)，结果如表1所示：
表1菌株耐酸耐胆盐能力结果
(5)菌株的四级筛选
在红枣汁发酵培养基中接种以上6株能够耐酸和胆盐的潜在益生菌菌株，进行发酵能力 实验，根据产乳酸效率和感官品评，最终保留菌株MY-12。MY-12菌株，发酵的红枣乳酸饮 料感官上显著优于其他菌株，其发酵后总糖和可溶性固形物相较原枣汁均下降，总酸提高。
(6)菌株鉴定
挑取斜面保藏的菌株于10ml MRS培养基中，37℃，150rpm培养16h。取适量培养液离 心1min，弃上清，采用细菌DNA提取试剂盒提取菌体DNA，用细菌16s通用引物扩增基因组DNA，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序。采用BLAST方式将测定的 16srDNA序列与GenBank中酵母菌的序列进行比对，结果如图6所示。
实施例3：植物乳杆菌在红枣汁中发酵中的应用
以红枣汁为原料，调整含糖量至140g/L，可滴定酸2g/L，发酵规模为500mL，装液量为 60％，于高压蒸汽灭菌锅中105℃灭菌10min，接种植物乳杆菌MY-12使其在红枣汁中的菌 浓达到107CFU/mL，37℃发酵48小时后结束发酵，发酵结束后测定其基本指标及感官品评。 筛选菌株MY-12与商品菌299V相比，有更高的活菌数和更合适的糖酸比(在前期试验与感 官品评中，糖酸比在20左右为最适)，结果如表2所示。感官品评结果显示植物乳杆菌MY-12发酵的乳酸菌饮料酸甜平衡，口感协调，香气优雅且红、枣典型性明显。
表2红枣乳酸菌饮料基本理化指标
表3红枣乳酸菌饮料感官评定表
实施例4：含有植物乳杆菌MY-12的微生物菌剂的制备
取400μL的植物乳杆菌MY-12接种于20mL MRS液体培养基中，37℃下活化2至3代，待植物乳杆菌MY-12达到108cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冻干保护剂，待细胞浓度不低于106cfu/mL时， 真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，已于2021年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24097。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的植物乳杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，微生物菌剂中权利要求1所述的植物乳杆菌的含量不低于106cfu/mL或106cfu/g。
4.一种生产红枣乳酸菌饮料的方法，其特征在于，以红枣汁为原料，利用权利要求1所述植物乳杆菌发酵生产红枣乳酸菌饮料。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在生产红枣乳酸菌饮料的主发酵阶段接种权利要求1所述的植物乳杆菌。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法步骤为：
(1)以红枣汁为原料，调节红枣汁的含糖量为130～150g/L、可滴定酸为1～5g/L，并进行灭菌；
(2)将步骤(1)灭菌后的红枣汁中加入权利要求1所述的植物乳杆菌，使其在红枣汁中的菌浓不低于107CFU/mL，在35～40℃下发酵40～50h。
7.权利要求4～6任一所述的方法制备的红枣乳酸菌饮料。
8.一种食品，其特征在于，所述食品含有权利要求1所述的植物乳杆菌、或权利要求2或3所述的微生物菌剂。
9.根据权利要求9所述的食品，其特征在于，所述食品为利用权利要求1所述植物乳杆菌、或权利要求2或3所述的微生物菌剂发酵得到的发酵乳、果汁饮料或果酒。
10.权利要求1所述植物乳杆菌或权利要求2或3所述的微生物菌剂在制备乳酸菌饮料、发酵食品中的应用。
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