CN108707565B

CN108707565B - 一种两歧双歧杆菌及其应用

Info

Publication number: CN108707565B
Application number: CN201810574592.6A
Authority: CN
Inventors: 姜波; 刘英华; 邱金培; 马龙
Original assignee: Beijing Bojinyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Bojinyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-06-06
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2038-06-06
Also published as: CN108707565A

Abstract

本发明公开一种两歧双歧杆菌及其应用，两歧双歧杆菌B‑176，保藏号为：CGMCC No.15754，保藏日期为2018年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心。所述两歧双歧杆菌B‑176的培养基配方为培养基：胰蛋白胨1.2‑2％，大豆蛋白胨0.8‑1.5％，酪蛋白胨0.8‑1.6％，酵母浸粉0.5‑1％，牛肉膏1.0‑1.5％，葡糖糖1.5‑2％，乳糖1‑2％，无机盐溶液4‑4.5％。两歧双歧杆菌B‑176对胃酸和胆盐有耐受性。对大肠杆菌有较好的抑制作用。通过试验证明该菌株与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，这一发现扩大了两歧双歧杆菌B‑176的应用范围。含有两歧双歧杆菌B‑176的乳酸菌组合物在育肥猪中饲料中的应用，可在育肥猪的原基础日粮中添加乳酸菌组合物进行饲喂，以提高饲料利用率，降低死亡率，减少出栏天数。

Description

一种两歧双歧杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种两歧双歧杆菌及其应用。

背景技术

由于近二十年来微生态学的崛起和医学革命的进展，使双歧杆菌研究的重要性越来越被认识。双歧杆菌在维持机体肠道微生态平衡、抑制致病菌入侵和定植、调节机体免疫能力、降低胆固醇含量方面均有重要作用，而两歧双歧杆菌作为双歧杆菌的模式菌株必然也有着其重要的研究意义。但是，两歧双歧杆菌对培养环境的要求却极高，因此，如何改善其培养环境也就成为了至关重要的问题。

已知的乳酸杆菌(Lactobacillus spp .)是一群生活在机体内益于宿主健康的微生物，它维护人体健康和调节免疫功能的作用已被广泛认可。两歧双歧杆菌能促进机体微生物菌群和酶的平衡以及刺激特异性和非特异性的免疫机制，但当菌体耐酸，耐胆盐能力不足时进不到肠道，就会失去它的作用。

现在生活节奏较快，人们通常都会选择见效速度较快的抗生素来提高人体或者畜产品的免疫力。但是抗生素类的频繁使用使得人体或者动物体内的消化道环境发生的变化，自我调节能力差并且微生物菌群失衡，长时间使用只会出现感染和更多潜在危害。因此，在营养研究和畜类繁殖中，人们更希望大力发展对人类和畜类无害的微生物产品。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术存在的不足，提供了对酸、胆盐有较好的耐受性，对大肠菌群有较强的抑制效果的两歧双歧杆菌，同时提供了使两歧双歧杆菌具有更高存活菌数的优化培养基配方和含有两歧双歧杆菌的用于投放在饲料中的乳酸菌组合物。

本发明一方面提供一种两歧双歧杆菌，两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176，保藏号为：CGMCC No.15754，保藏日期为2018年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心。

进一步，rpoB基因序列如SEQ ID NO.1所示，16SrRNA序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述两歧双歧杆菌B-176的培养基配方为培养基：胰蛋白胨1.2-2%，大豆蛋白胨0.8-1.5%，酪蛋白胨0.8-1.6%，酵母浸粉0.5-1%，牛肉膏1.0-1.5%，葡萄糖1.5-2%，乳糖1-2%，无机盐溶液4-4.5%。

进一步，所述两歧双歧杆菌B-176的培养基配方为培养基：胰蛋白胨1.2%，大豆蛋白胨0.8%，酪蛋白胨0.8%，酵母浸粉0.5%，牛肉膏1.0%，葡萄糖1.5%，乳糖1.0%，无机盐溶液4.0%。

进一步，所述的两歧双歧杆菌B-176对胃酸和胆盐有耐受性。

进一步，所述的两歧双歧杆菌B-176与嗜酸乳杆菌BJYL-192、嗜酸乳杆菌BJYL-137、嗜酸乳杆菌BJYL-200、嗜酸乳杆菌BJYL-249、动物双歧杆菌BJYB-174、干酪乳杆菌BJYL-126、干酪乳杆菌BJYL-197、干酪乳杆菌BJYLB-14、副干酪乳杆菌BJYL-359、德氏乳杆菌保加利亚亚种BJYL-162、德氏乳杆菌保加利亚亚种BJYL-184、嗜热链球菌BJYS-151、嗜热链球菌BJYS-170、嗜热链球菌BJYS-179、乳酸链球菌BJYS-125、乳酸链球菌乳酸亚种BJYS-011、布氏乳杆菌BJYL-261和约氏乳杆菌BJYL-1839中的一种或者几种协同生长。

进一步，所述的两歧双歧杆菌B-176对大肠杆菌菌群有抑制作用。

本发明一方面提供一种大肠杆菌抑菌液的制备方法，将置于低温冰柜的如权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.15754的两歧双歧杆菌B-176放到40～50℃水浴中解冻，在无菌条件下吸取0.2ml种子液接种到培养基中，37℃恒温厌氧培养15h，活化2～3代；将活化好的两歧双歧杆菌B-176发酵液采用低温离心的方法，制备上清液，得到大肠杆菌抑菌液。

本发明另一方面提供一种乳酸菌组合物，包含权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.15754的两歧双歧杆菌和可接受的辅料。

进一步，该乳酸菌组合物还包括植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌；各组分比例为：两歧双歧杆菌：植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌=2～5：1～2：1～3。

本发明还提供一种上述乳酸菌组合物在育肥猪用饲料中的应用。

本发明的有益效果体现在：

1，本发明提供的一种两歧双歧杆菌，两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176，保藏号为：CGMCC No.15754，从来自于婴儿粪便中提取，经鉴定为两歧双歧杆菌。

2，本发明为了提高发酵菌数及改善菌体形态，按照其营养需要，采用正交实验设计进行培养基优化。优化后的两歧双歧杆菌B-176的培养基配方为培养基：胰蛋白胨1.2-2%，大豆蛋白胨0.8-1.5%，酪蛋白胨0.8-1.6%，酵母浸粉0.5-1%，牛肉膏1.0-1.5%，葡萄糖1.5-2%，乳糖1-2%，无机盐溶液4-4.5%。

3，本发明提供的两歧双歧杆菌B-176通过耐氧驯化和培育，中途补料使该菌活菌数达到3.25×10¹¹cfu/g；并通过耐受性驯化，使其可在动物体对胃酸和胆盐有耐受性；更可调节免疫反应、适合用于食品、保健品、药品、食品补充剂等产品的制备。

4，本发明提供的两歧双歧杆菌B-176对大肠杆菌有较好的抑制作用。

5，本发明提供的两歧双歧杆菌B-176通过试验证明该菌株与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，这一发现扩大了两歧双歧杆菌B-176的应用范围。

6，本发明提供的一种乳酸菌组合物在育肥猪中饲料中的应用，可用其对育肥猪进行饲喂，以降低料肉比和死亡率，减少出栏天数，减少抗生素的使用。

生物保藏说明

分类命名：两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176，保藏号为：CGMCC No.15754，保藏日期为2018年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.15754。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步详细的说明。

图1是B-176在2号培养基中的生长状况。

图2是B-176在3号培养基中的生长状况。

图3是试验组5发酵液中的菌体形态。

图4是B-176在发酵过程中pH的变化。

图5是两歧双歧杆菌B-176的生理生化特性。

具体实施方式

本发明公开了一种两歧双歧杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述两歧双歧杆菌已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本实验室条件下，根据送检菌种的细胞形态、生理生化实验、16S rDNA和rpoB基因序列等实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》以及International Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176的鉴定结果具体参见：rpoB基因序列如SEQ ID NO.1所示，16SrRNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的一株两歧双歧杆菌B-176，来自于婴儿粪便中。两歧双歧杆菌B-176的生理生化特性参见图5所示。

本发明一方面提供一种两歧双歧杆菌，两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）B-176，保藏号为：CGMCC No.15754，保藏日期为2018年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心。

针对上述两歧双歧杆菌B-176的耐酸、耐胆盐、大肠杆菌的抑制实验以及育肥猪饲喂做了如下实验，并对两歧双歧杆菌B-176的培养基配方做了优化。

1培养基优化过程

两歧双歧杆菌B-176来自于婴儿粪便中，在双歧用TPY培养基中活菌数较低仅为1.03x10⁹cfu/ml，且革兰氏染色结果显示菌体形态差，着色效果差。为了提高发酵菌数及改善菌体形态，按照其营养需要，采用正交实验设计进行培养基优化。

1.1实验材料

1.1.1试验菌种为两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176，保藏号为：CGMCC No.15754。

1.1.2仪器耗材。

恒温培养箱、超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、分光光度计、厌氧管、1ml移液枪、1ml注射器、弯头滴管、5ml离心管、1ml枪头、石英比色皿、酒精灯等。

1.1.3试验用培养基

TPY培养基，实验室配制的1、2、3、4号试验用培养基。

1.2 试验方法

1.2.1培养基初步筛选

初步确定几种不同的两歧双歧培养基，然后接种本实验室保藏的菌种B-176，通过涂片观察B-176的菌体形态以及测定B-176在各发酵液中的活菌数来初步确定优化培养基。

1.2.2 培养基制备

表1 培养基编号、组分及条件

其中，新鲜西红柿浸出液的制备方法为：将新鲜西红柿洗净称重后切碎，加等量蒸馏水在100℃沸水浴中加热，时时搅拌，约90min，然后用绒布过滤，校正pH至7.0，分装三角瓶，115℃高压灭菌15－20min。

1.2.3 培养基分裝、灭菌

首先，将各组培养基分别分装到厌氧管中并标号，每管10ml，充入氮气，待厌氧管中的空气排净后加盖塞子。然后，调节灭菌温度及灭菌时间，将分装好的培养基分别进行灭菌。灭菌后，将1-4号培养基放入4℃冰箱中备用。

1.2.4 菌种活化

保藏的B-176菌种，在37℃温水中迅速化冻。在无菌操作台中，用1ml的注射器吸取0.2ml菌液注射到含有TPY培养基的厌氧试管中，放入37℃恒温箱中培养48h。

1.2.5 接种培养

将活化好的菌种按2%的接种量接种到4种试验培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养。

1.2.6 分离计数

每组取1ml菌液，注射到盐水管中进行稀释，取稀释10⁶、10⁷、10⁸倍的菌液1ml注射到4种试验固体培养基中进行滚管。在37℃恒温箱中培养48h-72h。

1.2.7 传代培养

1.2.7.1取几个5ml的离心管以及灭好菌的生理盐水，用1ml的枪吸取200ul生理盐水注入标记好的5ml离心管中，备用。

1.2.7.2用弯头滴管挑取长势好的菌落，在加有生理盐水的离心管中进行吹吸混匀。

1.2.7.3 用1ml的针管吸取混有菌液的生理盐水，注射到液体培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养。

1.2.8初步筛选试验结果

B-176在2号和3号培养基中生长较快，37℃恒温箱中培养18h后，试管浊度高，其余几组则生长慢，试管浊度低，故排除试验组1号和4号培养基。进一步进行涂片镜检，发现3号培养基中B-176菌体形态比2号培养基好，其菌体大、着色均一、部分菌体还出现分叉形态，通常认为：出现分叉形态说明生长环境适宜。镜检结果参见图1和图2所示。

因此，初步筛选试验结果为：选取3号培养基，并对其进行进一步优化。

1.3 针对3号培养基进行优化

3号培养基初始配方，见1.2.2 培养基制备的表1所示。

1.3.1七因素三水平正交试验

以A胰蛋白胨、B大豆蛋白胨、C酪蛋白胨、D酵母浸粉、E牛肉膏、F葡萄糖及G乳糖为影响因素做七因素三水平正交试验。

1.3.1.1七因素三水平正交试验结果如下表2所示。

表2：七因素三水平正交试验结果

1.3.1.2七因素三水平正交试验极差分析结果如下表3所示。

表3：七因素三水平正交试验极差分析

通过上述正交试验，确定了因素的显著顺序为A>B>F>G>D>C>E，即：胰蛋白胨对试验结果影响最显著，大豆蛋白胨及葡萄糖的影响次之，牛肉膏的影响最小。综合各因素，确定最优组合为因素A的二水平，因素B的二水平，因素D的一水平，因素E的一水平，因素F的一水平及因素G的二水平。

1.3.1.3 测定表2中各试验组发酵液的活菌数，结果如下。

表4：七因素三水平正交试验各试验组活菌数测定结果

1.3.2培养基进一步正交优化

由1.3.1的测定结果得出了最优组合，选取影响较为显著的三个因素，即因素A胰蛋白胨，因素B大豆蛋白胨及因素F葡萄糖，在该基础上作进一步正交优化试验。

1.3.2.1三因素三水平正交试验结果如下所示：

表5：三因素三水平正交试验结果

1.3.2.2三因素三水平正交试验极差分析结果如下所示。

表6：三因素三水平正交试验极差分析

由上述的极差分析可以看出，影响因素的显著顺序为胰蛋白胨>大豆蛋白胨>葡萄糖，其结果对试验1.3.1的结论进行了佐证。综合各因素进行分析，确定了试验1.3.2的最优组合为因素A的三水平，因素B的二水平及因素C的二水平，也即为试验组5中的培养基配比，其优化增菌培养基为：胰蛋白胨1.2%，大豆蛋白胨0.8%，酪蛋白胨0.8%，酵母浸粉0.5%，牛肉膏1.0%，葡萄糖1.5%，乳糖1.0%，盐溶液4.0%。

1.3.3 测定表5中各试验组发酵液的活菌数，结果如下所示。

表7：三因素三水平正交试验各试验组活菌数测定结果

结果显示：试验组5的活菌数最高，达到3.77×10⁹ cfu/ml，试验组1的活菌数最低，为2.21×10⁹ cfu/ml。

1.3.4 上述1.3.2培养基优化试验的重复试验

按表5的培养基比例配制培养基，按相同的2%的接种量接入B-176种子后，放入恒温箱中37℃恒温培养。18h后取出，测定各组发酵液的活菌数，结果如下表所示。

表8：培养基优化试验重复试验各组发酵液中的活菌数

重复试验结果与表7一致，仍为试验组5的活菌数最高，活菌数为3.70×10⁹ cfu/ml。

镜检试验组5发酵液中的菌体形态发现，其菌体形态好，着色均一，可见分叉形态，详细结果参见图3所示。

小结，通过上述优化实验得到两歧双歧杆菌B-176的增菌培养基配方为：胰蛋白胨1.2-2%，大豆蛋白胨0.8-1.5%，酪蛋白胨0.8-1.6%，酵母浸粉0.5-1%，牛肉膏1.0-1.5%，葡萄糖1.5-2%，乳糖1-2%，无机盐溶液4-4.5%；进一步优选，胰蛋白胨1.2%，大豆蛋白胨0.8%，酪蛋白胨0.8%，酵母浸粉0.5%，牛肉膏1.0%，葡萄糖1.5%，乳糖1.0%，无机盐溶液4.0%，并将该培养基重新编号命名为8#培养基。

使用8#培养基培养发酵18h后，其活菌数可达3.77×10⁹cfu/ml，比未优化前的菌数提高了266.02%，且菌体较未优化前的菌体大，革兰氏染色着色均一，可常见分叉形态。

2高密度发酵

2.1实验材料

两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176，保藏号为：CGMCC No.15754，经过优化实验最终确定的8#增菌培养基。

2.2 试验方法

2.2.1 培养方法

2.2.1.1甘油种子活化：取甘油保藏菌种接种于装有8#液体培养基的试管中，37℃厌氧培养。

2.2.1.2 种子培养：按 2%的接种量，从活化菌液取适当量，接入装有150ml 8#液体培养基的250ml的三角瓶中，37℃厌氧培养。

2.2.1.3 发酵培养：按2%的接种量，接入装有7L 8#液体培养基的10L的发酵罐中，37℃、转速50r/min 厌氧培养。

2.2.1.4补料调酸：在一定的发酵培养时间时，通常为pH低于最适值时；补料可以为800ml 20%葡萄糖、500ml 10%大豆蛋白胨，并将pH值调到7 ，继续培养。

2.2.1.5发酵终止：当菌株生长到对数期后期或平衡期前期时，降温到20℃左右，并将pH值调到7。

2.2.1.6 冷冻干燥：经 4000r/min离心10min，弃上清，将收集的菌泥与保护剂充分混匀置冷冻干燥机进行中进行冷冻干燥。

2.2.2 冷冻干燥菌种的测试活菌数：采用稀释滚管计数法测定活菌数。

实验中，不补料作为对照组。

2.3 结果与分析

2.3.1培养过程 pH值变化情况如下表所示：

表9 B-176在发酵过程中pH的变化

上表9是 B-176在发酵过程中pH的响应情况，具体可以参见图4。

2.3.2活菌数

表10冷冻干燥前后活菌数对照

如上表10所示，发酵后菌体通过离心收集，冷冻干燥前后补料与不补料相比，活菌数有所提高；通过镜检补料后菌体形态较好，着色均匀。

3对酸和胆盐的耐受

3.1实验材料同2.1

3.2 试验方法

3.2.1 胆盐耐受实验

3.2.1.1 菌种培养：将菌种于灭菌的8#液体培养基中37℃厌氧培养15h。

3.2.1.2 胆盐耐受性：将活化菌株培养液以2％接种量接入含不同胆盐浓度的8#液体培养基中，其中，胆盐浓度分别为0.2％、0.3％、0.5％、1.0％、1.6％，同时以不含胆盐的8#培养液为对照。在37℃厌氧培养0 h、2h、4h、6h、24h。采用稀释滚管计数法检测菌体浓度。

3.2.2 酸耐受实验

3.2.2.1 菌种培养：将菌种于灭菌的8#液体培养基中37℃厌氧培养15h。

3.2.2.2 酸耐受：将活化菌株培养液以2％接种量接入含不同pH值的8#液体培养基中，其中pH值分别为1.3、2.0、3.0，同时以pH值为6.5的8#培养液为对照。在37℃厌氧培养0min、30min、60min、90min、120min。采用稀释滚管计数法检测菌体浓度。

3.3结果与分析

3.3.1耐胆盐结果

两歧双歧杆菌B-176对不同胆盐浓度的耐受性见下表所示：

表11 B-176对不同胆盐浓度的耐受性

可以看出胆盐浓度小于等于0.3％时对其无抑制作用，活菌数不断增加，在0.5％-1.6％的胆盐浓度中生长具有一定的耐受性。

3.3.2耐酸结果

两歧双歧杆菌B-176在不同的酸性培养液中活菌数变化见下表所示：

表12 B-176在不同的酸性培养液中活菌数变化表

可以看出，在pH=2.0条件下，培养2小时仍有大量活菌存在，说明该菌株对酸有很强的耐受性。

4对大肠杆菌的抑制

4.1实验材料：

两歧双歧杆菌B-176，保藏号为：CGMCC No.15754。

大肠杆菌(Escherichia coli)，来自于本实验室。

4.2实验方法

4.2.1菌种活化：将置于低温冰柜的两歧双歧杆菌B-176放到40℃-50℃水浴中解冻，在无菌条件下，吸取0.2ml种子液接种到8#液体培养基中，37℃恒温厌氧培养15h，活化2-3代。

4.2.2 大肠杆菌的活化：将置于冰箱内的大肠杆菌按照2％的接种量转接到液体营养肉汤培养基中，37℃培养12h，活化两代。

4.2.3 涂布营养琼脂平皿：将活化好的大肠杆菌用涂布法均匀的涂布到营养琼脂平板上，要求涂布时的活菌量在10⁶cfu/ml。

4.2.4 牛津杯法：将铺好的指示菌的营养琼脂平板自然干燥30min，再在无菌条件下将牛津杯，内径可以为6mm，均匀放置于平板上，稍微下压，使其与平板培养基接触面无空隙，然后吸取0.2ml发酵上清液于杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯中添加8#液体培养基0.2ml，培养条件相同。

4.3实验结果

两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176、乳酸菌与大肠杆菌的拮抗试验结果见下表。

表13 B-176、乳酸菌与大肠杆菌的拮抗试验结果

可以看出，两歧双歧杆菌B-176对大肠杆菌的抑制尤为明显，抑菌圈达到20mm以上。

5与其他乳酸菌的拮抗实验

5.1实验材料

两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176，保藏号为：CGMCC No.15754。

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidopHilus），干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），乳酸链球菌（Lactococcus lactis），德氏乳杆菌保加利亚种（Lactobacillus bulgaricus），短双歧杆菌（Bifidobacterium breve），青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）均来自于本实验室。

5.2实验方法

5.2.1 菌种活化：将置于低温冰柜的B-176放到40-50℃水浴中解冻，在无菌条件下，吸取0.2ml接种到8#液体培养基中，37℃恒温厌氧培养15h，活化2-3代。

5.2.2 其它乳酸菌活化：乳酸杆菌采用MRS液体培养基进行活化，乳酸链球菌采用M17肉汤培养基进行活化。

5.2.3倾注法培养乳酸菌：将活化好的乳酸杆菌和乳酸链球菌分别用倾注法均匀的铺在8#平板上和2#固体平板上，要求涂布时的活菌量在10⁶cfu/ml。

5.2.4两歧双歧杆菌B-176发酵液的制备：将活化好的两歧双歧杆菌B-176发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，离心条件为：4℃，7500rpm，5min。

5.2.5牛津杯法：将铺好的指示菌的8#平板和2#平板自然干燥30min，再在无菌条件下将内径为6mm的牛津杯均匀放置于平板上，稍微下压，使其与平板培养基接触面无空隙，然后吸取0.2ml发酵上清液于杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯中添加8#液体培养基0.2ml，培养条件相同。

5.3实验结果

具体结果见下表：

表14 B-176的协同生长

实验表明，本发明提供的两歧双歧杆菌B-176与嗜酸乳杆菌BJYL-192、嗜酸乳杆菌BJYL-137、嗜酸乳杆菌BJYL-200、嗜酸乳杆菌BJYL-249、动物双歧杆菌BJYB-174、干酪乳杆菌BJYL-126、干酪乳杆菌BJYL-197、干酪乳杆菌BJYLB-14、副干酪乳杆菌BJYL-359、德氏乳杆菌保加利亚亚种BJYL-162、德氏乳杆菌保加利亚亚种BJYL-184、嗜热链球菌BJYS-151、嗜热链球菌BJYS-170、嗜热链球菌BJYS-179、乳酸链球菌BJYS-125、乳酸链球菌乳酸亚种BJYS-011、布氏乳杆菌BJYL-261和约氏乳杆菌BJYL-1839中的一种或者几种能够协同生长。这一结果将直接扩大两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176的应用范围。

6.在育肥猪饲喂中的应用以本实验室分离的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176为主，和其他益生菌按一定比例进行组配后，加入到育肥猪饲料中。其中，各益生菌之间的组配比例为：两歧双歧杆菌B-176：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidopHilus）=（2～5）:（1～2）:（1～3）。

6.1实验方法

选择体重40kg左右的育肥猪100头，随机分成对照组和实验组，每组各50头，进行饲喂实验。其中对照组饲喂基础日粮；试验组饲喂基础日粮+1‰乳酸菌组合物。

6.2 实验结果

具体结果见下表所示。

表15 育肥猪饲喂试验结果

试验结果表明，在育肥猪的原基础日粮中添加1‰含有两歧双歧杆菌B-176的乳酸菌组合物进行饲喂，饲料的利用率得到提高，试验组比对照组的料重比降低了16.33%；死亡率降低，试验组比对照组的死亡率降低了75%；出栏时间提前，试验组比对照组出栏天数提前了13天。可降低育肥猪的料肉比和降低80%左右死亡率，同等重量可以提前出栏15天左右，无病不再使用抗生素。

综上，两歧双歧杆菌B-176对胃酸和胆盐有耐受性。对大肠杆菌菌群有抑制作用。与大部分乳酸菌都能协同生长。本发明提供的乳酸菌组合物可在育肥猪的原基础日粮中添加乳酸菌组合物进行饲喂，以提高饲料利用率，降低死亡率，减少出栏天数。

SEQUENCE LISTING 1

<110> 北京博锦元生物科技有限公司

<120> 一种两歧双歧杆菌及其应用

<130> 20180601

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 479

<212> DNA

<213> rpoB基因序列

<400> 1

catcgatgcg cggtcgcgcg acaggccgcc ggggcccagg gcggacagac ggcgcttgtt 60

ggtcacgccg gccagcgggt tgttctggtc catgaactgg gacagctggg aggttccgaa 120

gaactccttg atggtcgcgt tcacggggcg gatgttgatc agggactgcg gggtgatggc 180

ctcggcgtcc tgcgtggtca tgcgctcgcg cacgacgcgc tccatacggc tcaggccggt 240

gcgcagctgg ttctggatca gctcgccgac ctggcggata cgacggtttc cgaagtgatc 300

gatatcgtcc acgtccacgt gcaggtcgac atcctcgccg ttgcgcttgc ccgggaaggt 360

cttgccgccg tcgtgcaggg tgaccaggta cttcagggtg gcgatgatgt cgtcgcggct 420

cagggagcgg tcgttaatct cgtgctccag gccaagcttg cggttggaat cttgtaaag 479

SEQUENCE LISTING 2

<110> 北京博锦元生物科技有限公司

<120> 一种两歧双歧杆菌及其应用

<130> 20180601

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1357

<212> DNA

<213> 16SrDNA序列

<400> 1

ggttaggccc cggcttcggg tgctgcccac tttcatgact tgacgggcgg tgtgtacaag 60

gcccgggaac gcattcaccg cggcgttgct gatccgcgat tactagcgac tccgccttca 120

cggagccggg ttgcaggctc cgatccgaac tgagaccggt tttcagggat ccgctccatg 180

tcgccatgtc gcatcccgct gtaccggcca ttgtagcatg cgtgaagccc tggacgtaag 240

gggcatgatg atctgacgtc atccccacct tcctccgagt taaccccggc ggtcccccgt 300

gagttcccac cataacgtgc tggcaacacg gggcgagggt tgcgctcgtt gcgggactta 360

acccaacatc tcacgacacg agctgacgac gaccatgcac cacctgtgaa cccgccccga 420

agggaaacgc catctctggc gtcgtcggga acatgtcaag cccaggtaag gttcttcgcg 480

ttgcatcgaa ttaatccgca tgctccgccg cttgtgcggg cccccgtcaa tttctttgag 540

ttttagcctt gcggccgtac tccccaggcg ggacgcttaa cgcgttagct ccgacacgga 600

acacgtggaa cgtgccccac atccagcgtc caccgtttac ggcgtggact accagggtat 660

ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc agtgacggcc cagagacctg 720

ccttcgccat cggtgttctt cccgatatct acacattcca ccgttacacc gggaattcca 780

gtctccccta ccgcactcca gcccgcccgt acccggcgca gatccaccgt taagcgatgg 840

actttcacac cggacgcgac gagccgccta cgagcccttt acgcccaata aatccggata 900

acgcttgcgc cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggc gcttattcga 960

aaggtacact cacccgaagg cttgctccca aacaaaagag gtttacaacc cgaaggcctc 1020

catccctcac gcggcgtcgc tgcatcaggc ttgcgcccat tgtgcaatat tccccactgc 1080

tgcctcccgt aggagtctgg gccgtatctc agtcccaatg tggccggtcg ccctctcagg 1140

ccggctaccc gtcgaagcct tggtgagccg ttacctcacc aacaagctga taggacgcga 1200

ccccatccca cgccgataga atctttccca caatcacatg cgatcatgtg gaacatccgg 1260

cattaccacc cgtttccagg agctattccg gagcatgggg caggtcggtc acgcattact 1320

cacccgttcg ccactctcac caccaagcaa agcccga 1357

Claims

1.一种两歧双歧杆菌，其特征在于：两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B-176，保藏号为：CGMCC No.15754，保藏日期为2018年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心。

2.如权利要求1所述的两歧双歧杆菌，其特征在于：所述两歧双歧杆菌B-176的培养基配方为：胰蛋白胨1.2-2%，大豆蛋白胨0.8-1.5%，酪蛋白胨0.8-1.6%，酵母浸粉0.5-1%，牛肉膏1.0-1.5%，葡萄糖1.5-2%，乳糖1-2%，无机盐溶液4-4.5%。

3.如权利要求2所述的两歧双歧杆菌，其特征在于：所述两歧双歧杆菌B-176的培养基配方为：胰蛋白胨1.2%，大豆蛋白胨0.8%，酪蛋白胨0.8%，酵母浸粉0.5%，牛肉膏1.0%，葡萄糖1.5%，乳糖1.0%，无机盐溶液4.0%。

4.如权利要求1所述的两歧双歧杆菌，其特征在于：所述的两歧双歧杆菌B-176对胃酸和胆盐有耐受性。

5.如权利要求1所述的两歧双歧杆菌，其特征在于：所述的两歧双歧杆菌B-176与嗜酸乳杆菌BJYL-192、嗜酸乳杆菌BJYL-137、嗜酸乳杆菌BJYL-200、嗜酸乳杆菌BJYL-249、动物双歧杆菌BJYB-174、干酪乳杆菌BJYL-126、干酪乳杆菌BJYL-197、干酪乳杆菌BJYLB-14、副干酪乳杆菌BJYL-359、德氏乳杆菌保加利亚亚种BJYL-162、德氏乳杆菌保加利亚亚种BJYL-184、嗜热链球菌BJYS-151、嗜热链球菌BJYS-170、嗜热链球菌BJYS-179、乳酸链球菌BJYS-125、乳酸链球菌乳酸亚种BJYS-011、布氏乳杆菌BJYL-261和约氏乳杆菌BJYL-1839中的一种或者几种协同生长。

6.如权利要求1所述的两歧双歧杆菌，其特征在于：所述的两歧双歧杆菌B-176对大肠杆菌菌群有抑制作用。

7.一种大肠杆菌抑菌液的制备方法，其特征在于：将置于低温冰柜的如权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.15754的两歧双歧杆菌B-176放到40～50℃水浴中解冻，在无菌条件下吸取0.2ml种子液接种到培养基中，37℃恒温厌氧培养15h，活化2～3代；将活化好的两歧双歧杆菌B-176发酵液采用低温离心的方法，制备上清液，得到大肠杆菌抑菌液。

8.一种乳酸菌组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.15754的两歧双歧杆菌和可接受的辅料。

9.如权利要求8所述的乳酸菌组合物，其特征在于，该乳酸菌组合物还包括植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌；各组分比例为：两歧双歧杆菌：植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌=2～5：1～2：1～3。

10.一种如权利要求9所述的乳酸菌组合物在育肥猪用饲料中的应用。