CN110777097A - 一株强耐酸性乳酸杆菌菌株及其筛选、发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1‑039及其筛选、发酵工艺。所述乳酸杆菌菌株PBIL1‑039分离自甘肃定西市通渭县农家自发调味菜浆水，经鉴定分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019750，保藏时间为2019年9月25日。本发明提供的强耐酸性植物乳杆菌耐酸性强，在模拟胃肠道环境中能够耐受pH2.0酸度和0.3％胆盐浓度的影响，反应2h后发酵液存活率高达63.3％和20.1％，显著高于市售同类菌株产品的耐酸能力。菌粉在保持强耐酸特性的条件下，冻干粉活菌数可保持在2000亿/g。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制品制备技术领域，尤其涉及一株强耐酸性乳酸杆菌菌株及其筛选、发酵工艺。
背景技术
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效，从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性微生物的总称。人体肠道中栖息着数量巨大的微生物群，它们的构成和活动影响着宿主的免疫、黏膜的发育及营养与药物的代谢。目前，益生菌制剂在食品及保健品领域多以粉剂、片剂、硬胶囊、颗粒剂等形式存在。
我国卫生部公布的《可用于生产普通食品的菌种名单》中的菌种中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是其中最重要的种类之一。其作为人体胃肠道的正常菌群，在肠道中能调节微生态平衡，代谢过程中能产生多种抑菌物质，对增强人体免疫能力，缓解乳糖不耐症、降低胆固醇水平及抑制肿瘤细胞的形成等都极有一定的作用。但活性乳酸菌要进入肠道发挥作用，首先经受住人体胃肠道微环境的影响。活性乳酸菌能否顺利通过胃液，盐酸的耐受能力强弱是一个关键因素。胃液的pH因饮食结构的不同有很大的波动，通常情况下pH为3.0左右，但空腹或食用酸性食品时pH可达2.0，而食物的通过时间一般为1-2h。除胃酸影响菌体的存活外，肠道胆盐对活菌也有很强的抑制作用，胆盐可改变菌体外膜的通透性，对乳酸菌起到抑制杀菌作用，人体小肠内胆汁盐含量为0.3-3g/kg，尽管人体肠道胆盐浓度变化较大，但通常认为平均胆盐浓度为0.3％。因个人生活及饮食习惯的差异性，益生菌产品在实际应用中，难以保证人体胃酸pH均在3.0以上，因此筛选真正能够抵抗较强的酸性环境和人体胆盐浓度的益生菌菌株，并实现其工业化生产，是保证其在肠道中存活和发挥其功效的基本手段。除最基本的菌株筛选之外，诱导抗性菌株、保护剂处理、微胶囊包埋技术等都能提高菌粉在人体胃肠道环境中的耐受性。但研究发现，因工业化生产的原料、工艺、处理等的因素的影响，具有较强耐受性的菌株经工业化生产后所得成品很难保持其原有特性，导致乳酸菌成品在到达肠道之前失去活性，丧失其应有的益生效果。
基于目前益生菌的生产及使用现状，本专利从菌株来源出发，筛选能够抵御宿主胃液、胆盐胁迫的益生菌菌株，研究保持其特性的工业化发酵工艺及可操作的菌粉冻干包埋工艺，这对益生菌类在食品、保健品及医药用品的使用上具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种强耐酸性乳酸菌，在实验室筛选获得具有较强耐酸耐胆盐特性的乳酸菌菌株，通过抑菌活性检测，进一步筛选具有强耐酸特性的菌株，以满足实际引用的需求。同时根据目前工业和发酵的特点，提供一种直投式乳酸杆菌的工业化大生产发酵方法，以及一种含有所述强耐酸性乳酸菌的冻干粉以及冻干粉的冻干工艺。
作为本发明的目的之一，在于提供一株强耐酸性乳酸杆菌菌株，所述乳酸杆菌菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株PBIL1-039，保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2019750，保藏时间为2019年9月25日。
本发明提供的植物乳酸杆菌菌种PBIL1-039，分离自甘肃定西市通渭县农家自发调味菜浆水。
作为本发明的目的之二，在于提供一种强耐酸性乳酸杆菌菌株的筛选方法，包括如下步骤：
(1)菌株分离纯化：取-80℃菌种室保藏的菌株冻干管，进行斜面转接活化，镜检无杂菌后，备用；
(2)取步骤(1)所得的菌株用接种环挑取2-3环转接到pH值为6.5-7.0的液体MRS培养基中，37℃需氧培养24h后，按4％的比例分别接种于pH＝3.0的酸性的MRS液体培养基中进行需厌氧培养，初步筛选获得耐酸特性菌株；对筛选获得的菌株按上述步骤进行耐酸性pH＝2.0及0.3％胆盐能力检测；
(3)取步骤(2)检测所得优势菌株，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行体外抑菌活性检测，筛选对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有较强抑菌活性的乳酸杆菌；
(4)采用步骤(3)所获得具有耐酸特性的菌株，自制实验室冻干粉，对获得的冻干菌粉进行pH＝2.0耐酸特性检测，通过统计不同时间段内菌粉存活率，进一步筛选具有较强耐酸特性的乳酸菌菌株。
作为本发明的目的之三，在于提供一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039的工业化大生产发酵工艺，包括如下步骤：
步骤一、菌种活化培养：
将MRS斜面培养基pH值调节至6.5-7.0，在121℃下湿热灭菌15-30min后备用；在灭菌操作台中打开安瓿瓶，用灭菌接种环分别挑取2-3环所述步骤(4)获得的菌株，均匀划线，接种于MRS斜面培养基，在需氧条件下于30-37℃培养24-36h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后活化1次备用；
步骤二、一级菌种培养：
在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得活化后的乳酸杆菌菌种，接种于200ml的MRS培养液中，需氧条件下于30-37℃培养24-36h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
步骤三，二级种子液制备：
取步骤二制得乳酸杆菌MRS培养液接种到二级种子培养基ZW-1培养基中，接种体积比为3-4％；需氧条件下30-37℃培养18-24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
其中，步骤三中所述二级种子培养基ZW-1培养基各成分及质量分数如下：葡萄糖3-5％，玉米浆干粉0.3-1.0％，蛋白胨1.8-2.5％，酵母膏0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.0％，硫酸镁0.015-0.02％，醋酸钠0.3-0.6％，硫酸锰0.02-0.05％，吐温-80 0.3-0.6％。
步骤三中所述二级种子培养基中的玉米浆干粉采用玉米制备，所述玉米浆干粉的制备方法为：将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉，部分替代MRS配方中的氮源。
步骤四，车间200L小罐培养：
取步骤三制得的二级种子液，按2-6％的体积比接种到200L小罐培养基ZW-1培养基中，于30-37℃培养12-16h，终止培养，得小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐；
步骤五，车间1T大罐发酵培养：
按2-4％的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接ZW-2培养基，30-37℃培养12h；发酵过程中每2h镜检菌体形态；
所述1T大罐培养基ZW-2培养基各成分及质量分数如下：葡萄糖3-5％，玉米浆干粉0.3-1.0％，蛋白胨1.8-2.5％，酵母膏0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.0％，硫酸镁0.015-0.02％，醋酸钠0.3-0.6％，硫酸锰0.02-0.05％，吐温-80 0.3-0.6％，碳酸钙0.3-0.5％；
具体的，步骤五中于4h时补充发酵料一次，发酵料为发酵罐装液量重量的1-2％葡萄糖、0.5-1％蛋白胨、0.1-0.5％碳酸钙混合液，补料前121℃下湿热灭菌15-30min。
进一步的，为保存其发酵特性，发酵期间不控制pH值；发酵结束后停罐静置4h后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，设置离心机温度为0-8℃，转速8000-10000rpm离心2-2.5h，获取菌泥。
本发明还提供一种冻干粉，包含所述强耐酸性乳酸杆菌菌株和冻干保护剂，所述冻干保护剂成分及占菌泥重量百分比含量为蔗糖10-15％、奶粉15-20％、甘油1-3％、壳聚糖1-3％、谷氨酸钠2-4％。
所述冻干保护剂和强耐酸性乳酸杆菌菌株按质量比例1:(2-4)混合。
所述冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、制备菌泥混合液：
将冻干保护剂中各成分按照比例混合，而后与1T大罐发酵培养得到的菌泥按质量比例1:(2-4)混合，以500-800rpm速率进行搅拌混匀后得到菌泥混合液；
步骤二、菌粉包被和冻干：
将步骤一制得的菌泥混合液以1:(1-2)的质量比例加入到2-5％的变性淀粉溶液中，以500-800rpm速率进行搅拌混匀后，于冰箱中于-20℃预冻6h后，在-50℃、真空度30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h，而后进行高速粉碎获得冻干粉。
本发明还提供了冻干粉组合物，所述冻干粉组合物为所述冻干粉以粉剂、片剂、硬胶囊、颗粒剂形式存在的食品或保健食品。所述食品或保健食品以所述强耐酸性乳酸杆菌菌株制备的冻干粉为原料，采用常规的制备方法，制备成为食品或保健食品领域的粉剂、片剂、硬胶囊和颗粒剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)菌株来源安全：从库存50株乳酸杆菌中筛选出一株具有强耐酸特性的植物乳杆菌，该菌株自甘肃定西市通渭县农家自发特色调味菜发酵浆水中分离获得。
(2)目前相关乳酸菌耐酸性研究范围在pH2.4-3.0，但人体在空腹或食用酸性食品时胃酸pH可达2.0，本发明提供的强耐酸性植物乳酸杆菌耐酸性强，在模拟胃肠道环境中能够耐受酸度为pH2.0和0.3％胆盐浓度的影响，反应2h后发酵液存活率高达63.3％和20.1％，显著高于市售同类菌株产品的耐酸能力。
(3)菌株可实现规模化生产：通过筛选优化不同的培养基组方、控制发酵条件、菌粉冻干包埋，在保证所获得的菌粉具有强耐酸特性的条件下，实现冻干粉活菌数保持在2000亿/g以上，且能保持其较强的耐酸特性，能在人体强胃酸条件下保持较强的存活率。
(4)本专利中所筛选培养基与常规MRS培养基相比，成本降低40％左右，且该组方原料易于购买，成分简单，且操作方便，所述菌种包埋冻干技术简单，适合工业化生产的需求。通过处理后，菌粉的耐酸耐胆盐特性保持不变，并大大提高了其耐受外界温度环境的存活能力，具有较强的耐酸性及稳定性，在食品、医药、饲料、环保等领域有广阔的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明提供的强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039在油镜下的形态图；
图2为不同含量玉米浆干粉对菌株J-39活菌数影响趋势图；
图3为两种菌粉在pH＝2.0人工胃液中存活率变化图；
图4为两种菌粉在0.3％浓度胆盐的人工肠液中存活率变化图；
图5为两种菌粉加速条件下存活率变化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，应该指出，以下详细说明都是示例性的，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但本发明的内容并非仅限于所举实施例。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。所以，熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
在实施例中，OD值是optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。通过OD来测定微生物浓度或者数量等生长情况，也就是比浊法，根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，光密度OD值越大，表明微生物浓度越大，微生物数量越大。
通用MRS组方的成分及含量：葡萄糖2％、柠檬酸铵0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、，吐温-800.1％，调pH至6.5。
合成MRS培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
冻干菌泥采用上海富龙科技股份有限公司生产的真空冷冻干燥机。
变性淀粉：在天然淀粉所具有的固有特性的基础上，为改善淀粉的性能、扩大其应用范围，利用物理、化学或酶法处理，在淀粉分子上引入新的官能团或改变淀粉分子大小和淀粉颗粒性质，从而改变淀粉的天然特性(如：糊化温度、热粘度及其稳定性、冻融稳定性、凝胶力、成膜性、透明性等)，使其更适合于一定应用的要求。这种经过二次加工，改变性质的淀粉统称为变性淀粉。
pH＝3.0/2.0的酸性的MRS液体培养基为常规MRS培养基调整其相应的pH值，121℃下湿热灭菌15-30min。
pH2.0人工胃液的配制方法：取浓度为1mol/ml的稀盐酸，加水稀释，将pH调至2.0。每100ml液体中加入1g胃蛋白酶，混匀，用0.2μm的无菌滤头过滤待用。
0.3％胆盐溶液配制方法：将0.3％的胆盐按重量比加入0.9％的生理盐水中混匀，用0.2μm的无菌滤头过滤待用。
人工肠液配制方法：取KH2PO46.8g加水500ml溶解，用0.4％(w/w)的NaOH溶液回调pH至6.8。每100ml液体中加入1g胰蛋白酶，混匀，用0.2μm的无菌滤头过滤待用。
实施例1：强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039的分离和鉴定
将新鲜采集的自发调味菜浆水，采用无菌取样瓶封好后放入冰盒内带回实验室，取5ml浆水样品至100mL灭菌MRS液体培养基中，37℃厌氧富集培养20h，用无菌接种针蘸取培养液在含3％CaCO3的MRS固体培养基划线，37℃恒温静置厌氧培养48h后，挑取培养基上具有明显透明圈的单菌落，接种在斜面上培养，然后进行革兰氏染色、镜检。
根据分离菌的菌落和菌体形态，革兰氏染色以及生理生化反应，按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行初步归属。按照北京天根“细菌基因组DNA提取试剂盒”说明书提取菌体总DNA，采用16S通用引物扩增16S rDNA基因组序列。将PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定，将获得16S rDNA基因序列在NCBI进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对。
菌株的鉴定：如图1所示，强耐酸性的植物乳杆菌PBIL1-039生物学特征如下：属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性，45℃能生长，兼性厌氧菌，在pH4.5-9.5生长，最适pH6.5左右。菌种呈短杆状，有时呈链状或者呈对状，两端钝圆，不产生芽孢；在MRS琼脂培养基中呈乳白色、圆形菌落、不透明、边缘光滑、具有一定的黏性；该该菌种属于同型发酵乳酸菌，能够发酵麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露糖、低聚木糖等；接触酶试验、淀粉水解试验、乙酸氧化试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、甲基红反应均为阴性。根据上述生理生化特性及形态特征，参考《常见细菌系统鉴定手册》，本试验中分离得到的菌株PBIL1-039与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)基本相同，因此将该菌株初步鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。采用16S通用引物扩增该菌株，将扩增后的16S rDNA序列在NCBI中进行BLAST比对分析，进一步证实该菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
实施例2：强耐酸性乳酸杆菌菌株的筛选
1、发酵液pH＝3.0耐酸特性检测
转接活化菌种室保存的生产特性较好，OD值均＞1.5的乳酸杆菌菌株共50株，其中植物乳杆菌15株，鼠李糖乳杆菌7株，罗伊氏乳杆菌7株、发酵乳杆菌5株、干酪乳杆菌6株、副干酪乳杆菌5株，嗜酸乳杆菌5株。活化后，将目的菌株接种于灭菌的液体MRS培养基中培养20h，按4％转接量接种pH＝3.0的MRS液体培养基，发酵16-20h后测定菌株吸光度，筛选吸光度＞1.0的菌株，结果如表1所示：
表1-50株菌在pH＝3.0的MRS液体培养基培养16h后OD值表
| 菌株 | OD值 | 菌株 | OD值 | 菌株 | OD值 |
| J-1 | 1.677 | J-18 | 1.157 | J-35 | 1.592 |
| J-2 | 1.737 | J-19 | 0.998 | J-36 | 0.823 |
| J-3 | 0.771 | J-20 | 1.711 | J-37 | 0.975 |
| J-4 | 1.741 | J-21 | 1.177 | J-38 | 1.832 |
| J-5 | 0.965 | J-22 | 1.302 | J-39 | 1.883 |
| J-6 | 1.635 | J-23 | 0.905 | J-40 | 1.653 |
| J-7 | 1.554 | J-24 | 1.708 | J-41 | 1.532 |
| J-8 | 1.801 | J-25 | 0.821 | J-42 | 0.721 |
| J-9 | 0.921 | J-26 | 1.645 | J-43 | 0.975 |
| J-10 | 0.815 | J-27 | 1.612 | J-44 | 1.753 |
| J-11 | 0.791 | J-28 | 1.718 | J-45 | 1.562 |
| J-12 | 1.635 | J-29 | 1.788 | J-46 | 1.322 |
| J-13 | 0.994 | J-30 | 0.702 | J-47 | 1.534 |
| J-14 | 1.721 | J-31 | 1.765 | J-48 | 0.765 |
| J-15 | 0.932 | J-32 | 1.812 | J-49 | 0.953 |
| J-16 | 0.894 | J-33 | 1.677 | J-50 | 1.545 |
| J-17 | 1.266 | J-34 | 1.465 |
通过测定50株乳酸杆菌在pH＝3.0的MRS液体培养基发酵16h后的吸光度，结果显示其中有18株菌发酵液OD值＜1.0，与对照OD值相比，数值下降较多，说明该18株乳酸杆菌在酸性条件下存活率较低，耐酸性较差。
将初步筛选获得的32株乳酸杆菌活化后，接种于灭菌的液体MRS培养基中培养20h，按4％转接量接种接种于pH＝2.0和0.3％浓度胆盐的灭菌MRS中37℃培养，分别于0min、10min、1h、2h取菌悬液，进行平板菌落计数，计算菌株耐酸耐胆盐能力，实验结果如表2所示：
表2-32株菌在pH＝2.0及0.3％浓度胆盐的MRS液体培养基不同时间段内存活率表
对32株乳酸杆菌在pH＝2.0的不同时间段及0.3％浓度胆盐不同时间段的耐受性检测，耐酸结果显示：32株菌在不用时间段内耐酸性差异很大，2h内存活率＞10％的菌株有J-18、J-21、J-27、J-34、J-39、J-40、J-44共7株；耐胆盐结果与耐酸结果相似，不同菌株间差异较大，7株耐酸性较强的菌株除J-44在2h内耐胆盐能力较弱外，仅3.1％，其余6株菌耐胆盐能力均较强，均高于16％。对筛选获得的7株耐酸性较强的菌株，检测其对3种致病菌的抑菌能力，结果如表3所示：
表3-7株菌对3种致病菌的抑制作用(mm)表
| 菌株 | 大肠杆菌 | 沙门氏菌 | 金黄色葡萄球菌 |
| J-18 | 10.96±0.22 | 10.3±0.22 | 11.5±0.11 |
| J-21 | 10.8±0.19 | 10.4±0.03 | 11.3±0.78 |
| J-27 | 12.4±0.14 | 15.4±0.74 | 12.9±0.72 |
| J-34 | 11.8±0.06 | 13.5±0.01 | 12.7±0.81 |
| J-39 | 12.4±0.09 | 14.2±0.04 | 13.0±0.65 |
| J-40 | 11.5±0.02 | 13.1±0.33 | 14.5±0.27 |
| J-44 | 11.8±0.02 | 15.2±0.62 | 13.8±0.13 |
抑菌结果显示：7菌株对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌3种指示菌抑菌圈直径均在10mm以上，说明该7株菌有较强的抑菌能力。进一步，因所筛选的益生菌最终以菌粉形式作为成品，故对初步筛选获得的该7株菌强耐酸菌株，实验室自制冻干粉，进行菌粉耐酸特性检测，结果如表4所示：
表4-7株菌冻干粉在pH＝2.0的MRS液体培养基不同时间段内存活率表
| 菌株 | 菌粉活菌数/cfu/g | 0h存活率/％ | 10min存活率/％ | 1h存活率/％ | 2h存活率/％ |
| J-18 | 1.2*10 | 72.4 | 5.3 | 0 | 0 |
| J-21 | 8.6*10 | 77.1 | 21.3 | 5.6 | 2.8 |
| J-27 | 9.5*10 | 60.5 | 98.2 | 27.3 | 0.02 |
| J-34 | 7.3*10 | 65.7 | 58.6 | 23.7 | 8.8 |
| J-39 | 9.7*10 | 94.6 | 73 | 22.2 | 15.7 |
| J-40 | 1.0*10 | 75.4 | 70 | 7.5 | 0.75 |
| J-44 | 6.5*10 | 80.2 | 68.1 | 18.1 | 12.2 |
由表4可知，在pH＝2.0环境下，与发酵液相比，菌粉存活率均有所下降，2h内存活＞10％的菌株仅有2株：J-39、J-44。通过比较该2株菌活菌数、抑菌能力、耐酸耐胆盐能力，择优选择特性较好的菌株J-39进行车间大生产发酵研究。
实施例3，实验室培养基筛选及优化
1、不同碳氮源对混合菌株发酵活菌数的影响：
根据目前车间、文献中涉及的乳酸杆菌的配方进行分析，对培养基主要成分C、N源：葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏进行4因素3水平正交试验，其他微量元素及无机盐配方不变，调pH6.5-7.0，配制出9种培养基于500mL盐水瓶中，按3-4％的体积比接种菌株发酵液，发酵结束，测定发酵液活菌数，结果如表5所示：
表5-不同碳氮源对混合菌株发酵活菌数的影响结果表
| 序号 | 葡萄糖 | 蛋白胨 | 酵母膏 | 牛肉膏 | 活菌数/亿/ml |
| 1 | 1(3％) | 1(1％) | 1(0％) | 1(0％) | 4.5/亿/ml |
| 2 | 1(3％) | 2(2％) | 2(0.75％) | 2(0.75％) | 12.2/亿/ml |
| 3 | 1(3％) | 3(3％) | 3(1.0％) | 3(1.0％) | 14.2/亿/ml |
| 4 | 2(4％) | 1(1％) | 2(0.75％) | 3(1.0％) | 12.5/亿/ml |
| 5 | 2(4％) | 2(2％) | 3(1.0％) | 1(0％) | 13.5/亿/ml |
| 6 | 2(4％) | 3(3％) | 1(0％) | 2(0.75％) | 10.4/亿/ml |
| 7 | 3(5％) | 1(1％) | 3(1.0％) | 2(0.75％) | 13.9/亿/ml |
| 8 | 3(5％) | 2(2％) | 1(0％) | 3(1.0％) | 9.8/亿/ml |
| 9 | 3(5％) | 3(3％) | 2(0.75％) | 1(0％) | 13.3/亿/ml |
通过正交实验结果显示，除方1外，其他组方活菌数均较高，综合各配方成分及价格，筛选方5为基础组方；在该组方下菌株活菌数较高，且成分相对简单，成本较低，将该组方命名为：ZW方。该ZW方成分为：葡萄糖4％，蛋白胨2％，酵母膏1.0％，磷酸氢二钾0.4％，硫酸镁0.02％，醋酸钠0.5％，硫酸锰0.05％，吐温-80 0.6％，pH6.5-7.0。
2、玉米浆干粉实验室对菌株发酵活菌数的影响
在ZW基础方上，分别添加0％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、1.5％玉米浆干粉，对各培养基发酵液的活菌数进行测定，检测玉米浆干粉添加量对菌株活菌数的影响，结果如图2所示。结果显示添加玉米浆干粉能很好的促进混合菌株活菌数的增加，随着玉米浆干粉添加量的增多，活菌数先增加后趋于稳定，玉米浆干粉添加量在0.5-1.0％时，活菌数稳定在23-25亿/ml左右，该组方命名为优化方ZW-1。
综上，得到ZW-1培养基，各成分及质量分数如下：葡萄糖4％，玉米浆干粉0.5-1.0％，蛋白胨2％，酵母膏1.0％，磷酸氢二钾0.4％，硫酸镁0.02％，醋酸钠0.5％，硫酸锰0.05％，吐温-80 0.6％。
实施例4，强耐酸乳酸杆菌车间高密度发酵工艺优化
1、车间发酵条件对菌粉耐酸特性影响
对车间大生产发酵过程中pH调控进行研究，检测其对菌体耐酸特性的影响。分别进行常规控pH和不控pH条件的大罐发酵，检测不同处理冻干菌粉耐酸特性，结果如表6所示：
表6-发酵过程pH控制对菌株J-39活菌数及耐酸特性影响表
| 发酵控制 | 原始活菌数/亿/g | 0.5h存活率/％ | 1h存活率/％ | 1h存活率/％ |
| 批次1-控pH | 3400 | 0.1 | 0 | 0 |
| 批次2-不控pH | 1840 | 33.5 | 20.7 | 14.3 |
检测结果显示：不控pH的批2，发酵结束后冻干菌粉耐酸性能比较稳定；控pH的批次1，冻干菌粉耐酸特性丧失，说明pH对菌体的耐酸特性影响很大，但在发酵过程中不调节pH，对菌提生长有一定抑制作用，导致菌粉活菌数有所下降。结合大生产情况，研究缓冲剂碳酸钙对菌体生长及耐酸特性的影响。
2、碳酸钙对发酵液耐酸特性影响
在车间大生产条件下，在ZW-1方基础上，分别添加0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％不同浓度的碳酸钙，研究碳酸钙添加量对菌粉活菌数及耐酸特性的影响，结果如表7所示：
表7-不同浓度碳酸钙含量对菌株J-39活菌数及耐酸特性的影响表
结果显示，随着碳酸钙添加量的增加，冻干菌粉的活菌数逐渐上升后趋于稳定，但耐酸特性逐步减弱，在0-0.4％的浓度下变化趋势不明显，但当浓度大于0.6％时，活菌数变化趋于稳定，但菌粉耐酸特性下降幅度较大。综合整个变化趋势，最终确定碳酸钙的添加量维持的0.5％以内。
综上，得到ZW-2培养基，各成分及质量分数如下：葡萄糖4％，玉米浆干粉0.5-1.0％，蛋白胨2％，酵母膏1.0％，磷酸氢二钾0.4％，硫酸镁0.02％，醋酸钠0.5％，硫酸锰0.05％，吐温-80 0.6％，碳酸钙0.5％，pH6.5-7.0。
实施例5，一种直投式乳酸杆菌的高密度发酵方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化培养：
将MRS斜面培养基pH值调至6.5-7.0，在121℃下湿热灭菌15-30min后备用；在灭菌操作台中打开安瓿瓶，用灭菌接种环分别挑取2-3环，均匀划线接种于MRS斜面培养基，在需氧条件下于30-37℃培养24-36h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后连续活化1次备用；
步骤二，一级菌种培养：
在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得活化后的乳酸杆菌菌种，接种于200ml的MRS培养液中，需氧条件下于30-37℃培养24-36h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
步骤三，二级种子液制备：
取步骤二制得乳酸杆菌MRS培养液接种到二级种子培养基ZW-1培养基中，接种体积比为3-4％；需氧条件下30-37℃培养18-24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
其中，所述二级种子培养基ZW-1培养基各成分及质量分数如下：葡萄糖3-5％，玉米浆干粉0.3-1.0％，蛋白胨1.8-2.5％，酵母膏0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.0％，硫酸镁0.015-0.02％，醋酸钠0.3-0.6％，硫酸锰0.02-0.05％，吐温-800.3-0.6％。
所述步骤中玉米浆干粉采用玉米浆制备，所述玉米浆干粉的制备方法为：将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉，部分替代MRS配方中的氮源。
步骤四，车间200L小罐培养：
取步骤三制得的二级种子液，按2-6％的体积比接种到200L小罐培养基ZW-1培养基中，于30-37℃培养12-16h，终止培养，得小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐；
步骤五，车间1T大罐发酵培养：
按2-4％的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接ZW-2培养基，30-37℃培养12h；发酵过程中每2h镜检菌体形态；
其中，所述1T大罐培养基ZW-2培养基各成分及质量分数如下：葡萄糖3-5％，玉米浆干粉0.3-1.0％，蛋白胨1.8-2.5％，酵母膏0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.0％，硫酸镁0.015-0.02％，醋酸钠0.3-0.6％，硫酸锰0.02-0.05％，吐温-800.3-0.6％，碳酸钙0.3-0.5％；
具体的，于4h时补充发酵料一次，发酵料为发酵罐装液量重量的1-2％葡萄糖、0.5-1％蛋白胨、0.1-0.5％碳酸钙混合液，补料前121℃下湿热灭菌15-30min。
进一步的，为保存其发酵特性，发酵期间不控制pH值；发酵结束后停罐后静置4h后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，设置离心机温度为0-8℃，转速8000-10000rpm离心2-2.5h，获取菌泥。
实施例6，一种冻干粉，冻干保护剂如下：蔗糖10-15％、奶粉15-20％、甘油1-3％、壳聚糖1-3％、谷氨酸钠2-4％。
冻干粉的制备方法，其步骤如下：
步骤一，制备保护剂
保护剂配方：蔗糖10-15％、奶粉15-20％、甘油1-3％、壳聚糖1-3％、谷氨酸钠2-4％，将上述原料混合后与1T大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:(2-4)比例，按500-800rpm速率进行搅拌混匀后得到菌泥混合液；
步骤二，菌粉包被
将菌泥混合液按1:1-2的比列加入到2-5％的变性淀粉溶液中，按500-800rpm速率进行搅拌混匀后，于冰箱中于-20℃预冻6h后，在-50℃、真空度30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后，进行高速粉碎获得。
实施例7，菌粉耐酸特性、稳定性性检测
1、耐胃酸性性能检测
将实施例4制得的冻干菌粉1g置于9mL的人工胃液中，人工胃液pH值为2.0，于37℃厌氧处理，分别于0、0.5、1、2h采用梯度稀释法进行活菌计数，以实施例4制得的常规工艺冻干菌粉进行对照，分析两种菌粉对人工胃液的耐受性差异。实验结果如图3所示。可见，当处于pH＝2.0的人工胃液中时，工艺优化后获得的冻干粉和常规生产获得的冻干粉，随时间的延长，活菌数逐渐下降；常规生产菌粉反应0.5h后活菌数降至0.15％，1h后存活率降至0；而工艺优化后生产菌粉反应0.5h时存活率在32％左右，反应至2h后，存活率依旧高于10％，说明优化后获得的冻干菌粉存活率显著高于常规生产菌粉的存活率。
2、耐胆盐性
配制质量分数0.3％的胆盐溶液模拟人工胆盐，将实施例4制得的1g冻干菌粉置于9mL的胆盐溶液中，37℃需氧处理，分别于0、0.5、1、2h采用梯度稀释法进行活菌计数，以实施例4制得的常规工艺冻干菌粉进行对照，分析两者对人工胆盐的耐受性差异。实验结果如图4所示。可见，当胆盐浓度为0.3％时，两种菌粉在处理期间菌粉的耐胆盐能力变化趋势基本一致，处理2h后菌粉的存活率均高于25％，说明经工艺优化后菌粉的耐胆盐能力未发生改变；与原始菌株发酵液相比，菌粉的耐胆盐能力有所提高，说明本发明中所用菌粉冻干包埋工艺对菌粉的耐胆盐能力有一定的提高。
4、常温贮藏特性：
将实施例4制备的冻干菌粉在恒温37℃、相对湿度为5-10％的条件下储存8W，每1W取样一次进行梯度计数，研究菌粉在此过程中的存活情况，实验结果如图5所示。冻干粉在8W内变化规律基本一致，前期存活率下降较快，6W时活菌数下降1个数量级，但8W后活菌数依旧大于109cfu/g，说明发酵工艺优化前后，菌粉的稳定性未受影响，适合在相应功能性产品中应用。由于存放温度较高，对菌粉的损失率影响较大，在低温条件下菌粉更为稳定。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株强耐酸性乳酸杆菌菌株，其特征在于，所述乳酸杆菌菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株PBIL1-039，保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2019750，保藏时间为2019年9月25日。
2.根据权利要求1所述一株强耐酸性乳酸杆菌菌株，其特征在于，其筛选方法包括如下步骤：
(1)菌株分离纯化：取-80℃菌种室保藏的菌株冻干管，进行斜面转接活化，镜检无杂菌后，备用；
(2)取步骤(1)所得纯化菌株用接种环挑取2-3环转接到pH值为6.5-7.0的液体MRS培养基中，37℃需氧培养24h后，按4％的比例分别接种于pH＝3.0的酸性的MRS液体培养基中进行需氧培养，初步筛选获得耐酸特性菌株；对筛选获得的菌株按上述步骤进行耐pH＝2.0及0.3％胆盐能力检测；
(3)取步骤(2)检测所得优势菌株，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行体外抑菌活性检测，筛选对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有较强抑菌活性的乳酸杆菌；
(4)采用步骤(3)所获得具有耐酸特性的菌株，自制实验室冻干粉，对获得的冻干菌粉进行pH＝2.0耐酸特性检测，进一步筛选获得具有较强耐酸特性的乳酸菌菌株。
3.一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039工业化大生产发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、菌种活化培养：
将MRS斜面培养基pH值调节至6.5-7.0，在121℃下湿热灭菌15-30min后备用；在灭菌操作台中打开安瓿瓶，用灭菌接种环分别挑取2-3环权利要求1或2所述强耐酸性乳酸杆菌菌株，均匀划线，接种于MRS斜面培养基，在需氧条件下于30-37℃培养24-36h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后活化1次备用；
步骤二、一级菌种培养：
在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得活化后的乳酸杆菌菌种，接种于200ml的MRS培养液中，需氧条件下于30-37℃培养24-36h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
步骤三，二级种子液制备：
取步骤二制得乳酸杆菌MRS培养液接种到二级种子培养基中，接种体积比为3-4％；需氧条件下30-37℃培养18-24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
步骤四，车间200L小罐培养：
取步骤三制得的二级种子液，按2-6％的体积比接种到200L小罐培养基中，于30-37℃培养12-16h，终止培养，得小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐；
步骤五，车间1T大罐发酵培养：
按2-4％的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接1T大罐发酵培养基，30-37℃培养12h；发酵过程中每2h镜检菌体形态；发酵结束停罐静置4h后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，设置离心机温度为0-8℃，转速8000-10000rpm离心2-2.5h，获取菌泥。
4.根据权利要求3所述一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039的工业化大生产发酵工艺，其特征在于，步骤三中所述二级种子培养基以及步骤四中所述200L小罐培养基为ZW-1培养基，各成分及质量分数如下：葡萄糖3-5％，玉米浆干粉0.3-1.0％，蛋白胨1.8-2.5％，酵母膏0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.0％，硫酸镁0.015-0.02％，醋酸钠0.3-0.6％，硫酸锰0.02-0.05％，吐温-80 0.3-0.6％；
所述二级种子培养基中的玉米浆干粉采用玉米制备，其制备方法为：将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉，部分替代MRS配方中的氮源。
5.根据权利要求3所述一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039的工业化大生产发酵工艺，其特征在于，步骤五中所述1T大罐发酵培养基为ZW-2培养基，各成分及质量分数如下：葡萄糖3-5％，玉米浆干粉0.3-1.0％，蛋白胨1.8-2.5％，酵母膏0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.0％，硫酸镁0.015-0.02％，醋酸钠0.3-0.6％，硫酸锰0.02-0.05％，吐温-80 0.3-0.6％，碳酸钙0.3-0.5％。
6.根据权利要求3所述一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039的工业化大生产发酵工艺，其特征在于，步骤五中于4h时补充发酵料一次，发酵料为发酵罐装液量重量的1-2％葡萄糖、0.5-1％蛋白胨、0.1-0.5％碳酸钙混合液，补料前121℃下湿热灭菌15-30min。
7.根据权利要求3所述一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039的工业化大生产发酵工艺，其特征在于，发酵期间不控制pH值。
8.一种冻干粉，包含权利要求1～2任一项所述强耐酸性乳酸杆菌菌株和冻干保护剂，所述冻干保护剂成分及占菌泥重量百分比含量为蔗糖10-15％、奶粉15-20％、甘油1-3％、壳聚糖1-3％、谷氨酸钠2-4％。
9.一种冻干粉的冻干包埋工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、制备菌泥混合液：
将权利要求8所述冻干保护剂中各成分按照比例混合，而后与权利要求3中所述1T大罐发酵培养得到的菌泥按质量比例1:(2-4)混合，以500-800rpm速率进行搅拌混匀后得到菌泥混合液；
步骤二、菌粉包被和冻干：
将本权利要求步骤一制得的菌泥混合液以1:(1-2)的质量比例加入到2-5％的变性淀粉溶液中，以500-800rpm速率进行搅拌混匀后，于冰箱中-20℃预冻6h后，在-50℃、真空度30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h，而后进行高速粉碎获得冻干粉。
10.一种冻干粉组合物，其特征在于，所述冻干粉组合物为包括权利要求8或9所述冻干粉以粉剂、片剂、硬胶囊、颗粒剂形式存在的食品或保健食品。
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