CN115039885B - 一种具有抑制奇异变形杆菌生长作用的副干酪乳杆菌及其益生菌组合物、发酵液和应用 - Google Patents
一种具有抑制奇异变形杆菌生长作用的副干酪乳杆菌及其益生菌组合物、发酵液和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种具有抑制奇异变形杆菌生长作用的副干酪乳杆菌及其益生菌组合物、发酵液和应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一种具有抑制奇异变形杆菌生长的副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物。体外抑菌实验表明，所述副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物具有抑制奇异变形杆菌的特性，由于奇异变形杆菌是产生三甲胺的微生物，因此所述益生菌能够有效抑制三甲胺的生成，从而为预防和/或治疗因三甲胺代谢导致的动脉粥样硬化提供了新思路。该益生菌可广泛应用于抑制奇异变形杆菌生长或抑制三甲胺产生或代谢有关的药品、食品或保健品中。
Description
本申请是申请日为2021年05月14日、申请号为202110530026.7、发明名称为《一种具有抑制奇异变形杆菌生长作用的益生菌及其发酵液和应用》的分案申请，申请人为艾兰得生物科技研究泰州有限公司。
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有抑制奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)生长作用的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)及其益生菌组合物、发酵液和应用。
背景技术
益生菌在自然界中广泛存在，主要来源于人体和动物肠道，主要包括乳杆菌和双歧杆菌；益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。目前益生菌在食品加工和相关保健品领域应用广泛，被公认摄入一定数量的益生菌活菌产品具有肠道健康功能、促进肠道吸收、增强人体免疫力和缓解过敏反应等作用。
近年来，人们逐渐从人体中分离出益生菌菌株，从益生菌的菌种定位至菌株水平，开发安全菌株的功能方向，比如干酪乳杆菌、LGG和BB12这些明星菌株，在多种疾病(肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心脑血管等)中发挥了重要的作用，创造了巨大的经济价值。然而组合菌株的功能应用鲜有研究。
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是基础病变的多种疾病，包括脑卒中和冠心病，一直以来是我国疾病防治的重点和难点。近年来，相关团队报道，肠道菌群可通过其代谢产物三甲胺(Trimethylamine，TMA)和氧化三甲胺(Trimethylamine-N-oxide，TMAO)参与AS的发展。日常饮食中的磷脂酰胆碱和左旋肉碱进入肠道后在肠道菌群的作用下可代谢为TMA，在肠道吸收入血，在肝脏黄素单加氧酶(Flavin-containing Monooxygenase 3，FM03)的作用下氧化为TMAO，TMAO可进一步通过促进巨噬细胞转化为泡沫细胞等途径促进AS的发生发展，进而导致心脑血管疾病发生。另外，TMAO也已被多项研究证明，其血浆浓度升高与心衰、慢性肾脏疾病等的远期不良预后相关，血浆高水平的TMAO往往预示着预后不良。而其中奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)就是在促进胆碱、肉碱生成TMA的一种至关重要的菌群。奇异变形杆菌是一种革兰氏阴性菌，条件致病菌。但目前还未有关于益生菌抑制奇异变形杆菌生长的报道，因此，从微生物疗法角度降低TMA的生成，从而降低心血管疾病的发生风险存在一定的技术障碍。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有抑制奇异变形杆菌生长作用的副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌及其益生菌组合物、发酵液和应用，所述益生菌不仅能有效抑制奇异变形杆菌的生长，从而减少TMA的生成，降低心血管疾病的发生风险，而且对人体健康有益无害。
本发明提供了一种具有抑制奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)生长的副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)形成的益生菌组合物，所述副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物由所述副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌按菌种液的体积比为1：1的比例接种至MRS肉汤培养基中，在36～38℃下厌氧培养至平衡期制得。
优选的，所述副干酪乳杆菌包括副干酪乳杆菌AI-62菌株，所述AI-62菌株的保藏编号为CGMCC No.21744；
所述婴儿双歧杆菌包括婴儿双歧杆菌AI-20菌株，所述AI-20菌株的保藏编号为CGMCC No.21779。
本发明提供了由所述副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物制备的发酵液，包括以下步骤：
将权利要求1所述副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物接种至发酵培养基中进行厌氧培养，得到发酵液。
优选的，所述发酵培养基包括MRS肉汤培养基；
所述厌氧培养的温度包括36～38℃，所述厌氧培养的时间包括20～24h。
本发明提供了所述副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物或所述发酵液在制备抑制奇异变形杆菌生长的试剂中的应用。
本发明提供了所述副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物或所述发酵液在制备抑制三甲胺生成的药物中的应用。
本发明提供了所述副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物或所述发酵液在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
本发明提供了一种具有抑制奇异变形杆菌生长功能的产品，包括所述副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物或所述发酵液。
本发明提供了一种具有抑制奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)生长的副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物，副干酪乳杆菌和/或婴儿双歧杆菌在体外条件下均具有抑制奇异变形杆菌的特性，由于奇异变形杆菌是产生三甲胺的代谢微生物，因此，本发明提供的益生菌能够有效抑制三甲胺的生成，从而为预防和/或治疗因三甲胺代谢导致的动脉粥样硬化提供了新思路。
同时，本发明提供的副干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物具有较高的安全性。因此，本发明提供的益生菌可广泛应用于抑制奇异变形杆菌生长或抑制三甲胺产生或代谢有关的药品、食品或保健品中。
附图说明
图1为婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62的革兰氏染色后菌体形态图；图1a为婴儿双歧杆菌AI-20，图1b：副干酪乳杆菌AI-62；
图2为共培养菌株及单菌株对奇异变形杆菌的抑菌实验；其中A：婴儿双歧杆菌AI-20抑菌圈；B：副干酪乳杆菌AI-62抑菌图；C：婴儿双歧杆菌AI-20※副干酪乳杆菌AI-62抑菌图；D：MRS空白对照；
图3为婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62形成的益生菌组合物发酵过程中抑菌活性的变化；
图4为热处理对样品抑菌活性的影响；
图5为pH对样品抑菌活性的影响；其中图5A：样品不同pH的上清抑菌效果；图5B：缓冲液对照不同pH缓冲液抑菌效果；
图6为蛋白酶预处理对样品抑菌活性的影响，图6a：胃蛋白酶处理；图6b：胰蛋白酶处理；图6c：木瓜蛋白酶处理；图6d：蛋白酶K处理；其中A：MRS空白对照；B：100U/ml蛋白酶处理；C：200U/ml蛋白酶处理。
生物保藏信息
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21745，菌株编号为AI-11；
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21746，菌株编号为AI-25；
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21741，菌株编号为AI-66；
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21742，菌株编号为AI-12；
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidopHilus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21743，菌株编号为AI-32；
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21744，菌株编号为AI-62；
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21748，菌株编号为AI-70；
动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21747，菌株编号为AI-01；
婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年02月01日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21779，菌株编号为AI-20；
两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年02月01日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21780，菌株编号为AI-91。
具体实施方式
本发明提供了一种具有抑制奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)生长的益生菌，包括以下微生物的一种或几种：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidopHilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。
在本发明中，当两种菌组合时，优选包括鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌形成的益生菌组合物、干酪乳杆菌和动物双歧杆菌乳亚种形成的益生菌组合物和副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的组合物。所述鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌形成的益生菌组合物由所述鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌按菌种液的体积比为1：1的比例接种至MRS肉汤培养基中，在36～38℃下厌氧培养至平衡期制得。所述干酪乳杆菌和动物双歧杆菌乳亚种形成的益生菌组合物中，所述干酪乳杆菌和动物双歧杆菌乳亚种按菌种液的体积比为1：1的比例接种至MRS肉汤培养基中，在36～38℃下厌氧培养至平衡期制得。所述副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的组合物由所述副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌按菌种液的体积比为1：1的比例接种至MRS肉汤培养基中，在36～38℃下厌氧培养至平衡期制得。所述益生菌组合物中，婴儿双歧杆菌和副干酪乳杆菌的菌落数比优选为1:19。本发明对鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌的培养方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌的培养方法即可。
本发明对所述益生菌的10种杆菌的菌株没有特殊限制，采用本领域所熟知的菌种菌株即可。在本发明实施例中，所述鼠李糖乳杆菌优选包括鼠李糖乳杆菌AI-11菌株，所述AI-11菌株的保藏编号为CGMCC No.21745；所述发酵乳杆菌优选包括发酵乳杆菌AI-25菌株，所述AI-25菌株的保藏编号为CGMCC No.21746；所述植物乳杆菌优选包括植物乳杆菌AI-66菌株，所述AI-66菌株的保藏编号为CGMCC No.21741；所述干酪乳杆菌优选包括干酪乳杆菌AI-12菌株，所述AI-12菌株的保藏编号为CGMCC No.21742；所述嗜酸乳杆菌优选包括嗜酸乳杆菌AI-32菌株，所述AI-32菌株的保藏编号为CGMCC No.21743；所述副干酪乳杆菌优选包括副干酪乳杆菌AI-62菌株，所述AI-62菌株的保藏编号为CGMCC No.21744；所述罗伊氏乳杆菌优选包括罗伊氏乳杆菌AI-70菌株，所述AI-70菌株的保藏编号为CGMCCNo.21748；所述动物双歧杆菌乳亚种优选包括动物双歧杆菌乳亚种AI-01菌株，所述AI-01菌株的保藏编号为CGMCC No.21747；所述婴儿双歧杆菌优选包括婴儿双歧杆菌AI-20菌株，所述AI-20菌株的保藏编号为CGMCC No.21779；所述两歧双歧杆菌优选包括两歧双歧杆菌AI-91菌株，所述AI-91菌株的保藏编号为CGMCC No.21780。
在本发明中，经体外抑菌实验证明，上述10种杆菌均具有抑制奇异变形杆菌生长的性能，因此，单独一株益生菌即可实现抑菌目的。实验表明，益生菌经过两株或两株以上益生菌组合形成的益生菌组合物比单株菌具有更高的抑制奇异变形杆菌生长的特性。
本发明提供了由所述具有抑制奇异变形杆菌生长作用的益生菌制备的发酵液，由包括以下步骤制备得到：
将所述益生菌接种至发酵培养基中进行厌氧培养，得到发酵液。
本发明对鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌的培养方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的培养方法制备菌种即可。
在本发明中，所述发酵培养基优选包括MRS肉汤培养基。所述接种的接种量优选为0.5％～3％，更优选为1％。所述厌氧培养的温度优选包括36～38℃，更优选为37℃。所述厌氧培养的时间优选包括20～24h，更优选为21～23h，最优选为22h。在本发明实施例中，所述菌种的制备方法为将-20℃冻存得甘油管菌株接种复苏于正常MRS肉汤培养基中，进行2～3次转接活化培养，得到的菌种液按1％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，在37℃下厌氧培养至平衡期(20h～24h)。当所述益生菌为两种菌株组成时，将两种菌种液按照体积比1：1的比例接种至MRS肉汤培养基中，总接种量为1％。
在本发明中，所述发酵过程中，所述益生菌的抑菌活性物质在菌生长过程中被分泌至发酵液中，12～16h抑菌活性达到最高。发酵液中的抑菌活性成分可耐受高温，在100℃下保留较高的抑制奇异变形杆菌生长的活性。
鉴于所述益生菌及其发酵液均具有抑制奇异变形杆菌生长的活性，因此本发明提供了所述具有抑制奇异变形杆菌生长作用的益生菌或所述发酵液在制备抑制奇异变形杆菌生长的试剂中的应用。
鉴于所述益生菌及其发酵液均具有抑制奇异变形杆菌生长的活性，同时奇异变形杆菌是产生三甲胺的微生物，因此本发明提供了所述具有抑制奇异变形杆菌生长作用的益生菌或所述发酵液在制备抑制三甲胺生成的药物中的应用。
鉴于所述益生菌及其发酵液均具有抑制奇异变形杆菌生长的活性，同时奇异变形杆菌是产生三甲胺的微生物，而三甲胺的产生和代谢能导致动脉有样硬化发生，因此本发明提供了所述具有抑制奇异变形杆菌生长作用的益生菌或所述发酵液在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
鉴于所述益生菌及其发酵液均具有抑制奇异变形杆菌生长的活性，同时所述益生菌可耐受pH1.5～2.5和0.3％浓度的胆汁盐，本发明提供了一种具有抑制奇异变形杆菌生长功能，且通过口服进入体内的产品，所述产品包括所述具有抑制奇异变形杆菌生长作用的益生菌或所述发酵方法制备的发酵液。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有抑制奇异变形杆菌生长作用的副干酪乳杆菌及其益生菌组合物发酵液和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本发明提供了鼠李糖乳杆菌AI-11、发酵乳杆菌AI-25、嗜酸乳杆菌AI-32、干酪乳杆菌AI-12、植物乳杆菌AI-66、动物双岐杆菌乳亚种AI-01、罗伊氏乳杆菌AI-70、两歧双歧杆菌AI-91、婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62的菌种筛选和鉴定方法。
鼠李糖乳杆菌菌株AI-11单菌落形态为白色至半透明，表面凸起，边缘规则呈圆形；菌株形态为短直杆状，排列规则。
发酵乳杆菌菌株AI-25单菌落形态为透明色，表面凸起，边缘呈规则圆形；菌株形态为直杆，长短不一，排列规则。
嗜酸乳杆菌菌株AI-32的单菌落形态为透明色，菌落表面扁平凸起，边缘毛糙，不规则星状；菌株形态为直杆，长短不一，排列不规则。
干酪乳杆菌菌株AI-12的单菌落形态为白色至半透明，菌落表面扁平无凸起，边缘毛糙，呈不规则星状；菌株形态为直杆，长短不一，排列规则。
植物乳杆菌菌株AI-66单菌落形态为白色，表面凸起，边缘规则呈圆形；菌株形态为短直杆，排列规则。
动物双歧杆菌乳亚种菌株AI-01的单菌落形态为白色至半透明色，表面凸起，边缘规则，呈圆形；菌株形态为短直杆，一端有时呈分叉状，排列规则。
罗伊氏乳杆菌菌株AI-70单菌落形态为透明色，表面扁平无凸起，边缘毛糙不规则星状；菌株形态为直杆，长短不一，排列规则。
两歧双歧杆菌菌株AI-91单菌落形态为白色至半透明色，表面凸起，边缘规则，呈圆形；菌株形态为短细直杆，顶端有时呈分叉状，排列不规则。
婴儿双歧杆菌菌株AI-20的单菌落形态为白色至半透明、表面凸起、湿润、边缘规则、呈圆形；细胞形态为短棒状、长短不一、排列规则。
副干酪乳杆菌菌株AI-62的单菌落形态为白色至半透明、表面凸起、湿润、边缘规则、呈圆形；细胞形态为短直杆状、排列规则。
经过16S rDNA分子鉴定，AI-11(16S rDNA序列为SEQ ID NO:1)、AI-25(16S rDNA序列为SEQ ID NO:2)、AI-32(16S rDNA序列为SEQ ID NO:3)、AI-12(16S rDNA序列为SEQID NO:4)、AI-66(16S rDNA序列为SEQ ID NO:5)、AI-01(16S rDNA序列为SEQ ID NO:6)、AI-70(16S rDNA序列为SEQ ID NO:7)、AI-91(16S rDNA序列为SEQ ID NO:8)、AI-20(16SrDNA序列为SEQ ID NO:9)和AI-62(16S rDNA序列为SEQ ID NO:10)菌株的16S rDNA序列同源性最高的菌种依次为鼠李糖乳杆菌属(Lactobacillus rhamnosus)、发酵乳杆菌属(Lactobacillus fermentum)、嗜酸乳杆菌属(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌属(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌属(Lactobacillus plantarum)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、罗伊氏乳杆菌属(Lactobacillusreuteri)、两歧双歧杆菌属(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌属(Bifidobacterium infants)和副干酪乳杆菌属(Lactobacillus paracasei)，序列相似性高达100％。因此，结合形态和分子鉴定结果，确定AI-11、AI-25、AI-32、AI-12、AI-66、AI-01、AI-70、AI-91、AI-20和AI-62菌株分别属于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfants)和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
将上述十株菌进行保藏，所述鼠李糖乳杆菌菌株AI-11保藏编号为CGMCCNo.21745，发酵乳杆菌菌株AI-25保藏编号为CGMCC No.21746，嗜酸乳杆菌菌株AI-32的保藏编号为CGMCC No.21743，干酪乳杆菌菌株AI-12的保藏编号为CGMCC No.21742，植物乳杆菌菌株AI-66的保藏编号为CGMCC No.21741，动物双歧杆菌乳亚种AI-01的保藏编号为CGMCC No.21747，罗伊氏乳杆菌菌株AI-70的保藏编号为CGMCC No.21748，两歧双歧杆菌菌株AI-91的保藏编号为CGMCC No.21780，婴儿双歧杆菌菌株AI-20的保藏编号为CGMCCNo.21779，副干酪乳杆菌菌株AI-62的保藏编号为CGMCC No.21744。
实施例2
菌株的安全性评价
将-20℃冻存得甘油管菌株，婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62分别接种复苏于正常MRS肉汤培养基中，进行2～3次转接活化培养，活化后的婴儿双歧杆菌AI-20菌种液和副干酪乳杆菌AI-62菌种液按照体积比1:1的量接种至MRS肉汤培养基中(总接种量为1％)，在37℃下厌氧培养至平衡期，得到婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62组成的益生菌组合物。采用同样的方法制备鼠李糖乳杆菌AI-11和发酵乳杆菌AI-25组成的益生菌组合物(鼠李糖乳杆菌AI-11※发酵乳杆菌AI-25)和干酪乳杆菌AI-12※动物双歧杆菌乳亚种AI-01组成的益生菌组合物(干酪乳杆菌AI-12※动物双歧杆菌乳亚种AI-01)。
将制备的3组益生菌组合物(鼠李糖乳杆菌AI-11※发酵乳杆菌AI-25、干酪乳杆菌AI-12※动物双歧杆菌乳亚种AI-01、婴儿双歧杆菌AI-20※副干酪乳杆菌AI-62)分别取0.5mL，均匀涂布于MRS琼脂平皿表面，待吹干，将庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、克林霉素、链霉素、氨苄西林、青霉素、红霉素、氯霉素的药敏纸片贴在琼脂表面，置于37℃培养箱培养24～48h，观察琼脂表面菌株的生长情况。若抗生素纸片周围出现明显的透明圈，则用直尺测量透明圈的直径以判断供试菌株是否具有药敏性。同时选用金黄色葡萄球菌作为药敏实验的质控菌株。供试菌株是否具有对各种抗生素的抗性依据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的相关标准(见表1)判断。
表1药敏纸片含量及抗药性判断标准
表2 K-B纸片扩散的实验结果
注：表中“S”表示益生菌对抗生素表现出敏感S效果，“I”表示益生菌对抗生素表现出中介I效果，“R”表示益生菌对抗生素表现出耐药R效果，“/”表示益生菌无需进行此抗生素的安全性评估。
K-B纸片扩散实验结果如表2所示，鼠李糖乳杆菌AI-11和发酵乳杆菌AI-25形成的益生菌组合物、动物双歧杆菌乳亚种AI-01和干酪乳杆菌AI-12形成的益生菌组合物以及婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62形成的益生菌组合物对以上九种抗生素的敏感性都很高，因此，具有较高的安全性。
实施例3
共培养菌株生长至平衡期的比例
将-20℃冻存得甘油管菌株婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62接种至正常MRS肉汤培养基中，在37℃下活化培养，进行2～3次转接活化培养，活化后的婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62菌种液按照体积比1:1的比例混合，按照总接种量为1％接种至一个试管中。在37℃培养24～48h，进行活菌计数，将进行活菌计数的平皿，一半37℃厌氧培养，一半37℃需氧培养，48h后观察活菌比例情况。
结果显示，在婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62按照1：1(体积比)的接种比例的情况下，最终共培养菌株的单菌株比例为1：19。
实施例4
按照实施例2的方法制备婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62益生菌组合物(婴儿双歧杆菌AI-20※副干酪乳杆菌AI-62)、鼠李糖乳杆菌AI-11和发酵乳杆菌AI-25组成的益生菌组合物(鼠李糖乳杆菌AI-11※发酵乳杆菌AI-25)和干酪乳杆菌AI-12※动物双歧杆菌乳亚种AI-01组成的益生菌组合物(干酪乳杆菌AI-12※动物双歧杆菌乳亚种AI-01)，用于体外抑制奇异变形杆菌的实验。同时将培养的鼠李糖乳杆菌AI-11、发酵乳杆菌AI-25、植物乳杆菌AI-66、干酪乳杆菌AI-12、嗜酸乳杆菌AI-32、副干酪乳杆菌AI-62、罗伊氏乳杆菌AI-70、动物双歧杆菌乳亚种AI-01、婴儿双歧杆菌AI-20和两歧双歧杆菌AI-91这10株单菌分别采用通用牛津杯法抑制奇异变形杆菌的实验。
表3单菌株抑制奇异变形杆菌的实验结果
表4共培养菌株在抑制奇异变形杆菌中的优势
结果显示，以上6株单菌株均可抑制奇异变形杆菌，但共培养菌株鼠李糖乳杆菌AI-11※发酵乳杆菌AI-25、干酪乳杆菌AI-12※动物双歧杆菌乳亚种AI-01、婴儿双歧杆菌AI-20※副干酪乳杆菌AI-62对奇异变形杆菌的抑制效果优于单个菌株。
实施例5
共培养菌株在发酵过程中抑菌活性的变化
将-20℃冻存得甘油管菌株，婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62分别接种于正常MRS肉汤培养基中，进行2～3次转接活化培养，活化后的婴儿双歧杆菌AI-20菌种液和活化后的副干酪乳杆菌AI-62菌种液按照体积比1：1的比例接种于6个MRS肉汤培养基中(1％接种量)，在37℃下厌氧培养，每隔4h取出一管，测定pH值，并离心取上清后做对奇异变形杆菌的抑菌活性测定。
结果见图3，可发现发酵过程中抑菌物质在12～16h分泌达到最大且随着发酵时间延长抑菌效果趋于稳定，同时发酵过程中前16h上清的pH变化幅度较大后随着发酵时间的延长变化幅度较小并逐渐趋于稳定。
实施例6
热处理对样品抑菌活性的影响
按照实施例2的方法制备婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62形成的益生菌组合物(菌种液体积比1:1，数量比1:19)，鼠李糖乳杆菌AI-11和发酵乳杆菌AI-25形成的益生菌组合物(菌种液体积比1:1)，动物双歧杆菌乳亚种AI-01和干酪乳杆菌AI-12形成的益生菌组合物(菌种液体积比1:1)。
将上述制备的三种益生菌组合物分别按1％接种量接种于6个MRS肉汤培养基中，在37℃下厌氧培养24h左右至平衡期，得到的发酵液离心取上清，分别置于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴处理20min，处理后的上清液采用通用牛津杯法抑制奇异变形杆菌的实验。
表5热处理对样品抑菌活性的影响(抑菌圈直径的单位mm)
结果见表5和图4，50～100℃处理前后，发酵液对奇异变形杆菌的抑菌活性无明显差异。说明抑菌物质对热不敏感，可以排除大分子蛋白质作为抑菌物质的可能。
实施例7
pH对样品抑菌活性的影响。
按照实施例2的方法制备三组益生菌组合物(见表6)，经离心后取上清，用浓盐酸和浓氢氧化钠调节上清的pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；同时设置磷酸缓冲液对照，将处理后的上清液采用通用牛津杯法抑制奇异变形杆菌的实验。
表6pH对样品抑菌活性的影响(抑菌圈直径的单位mm)
结果见表6和图5，当上清的pH低于4.0～5.0有抑菌活性且随pH的降低抑菌圈直径逐渐增大，当上清的pH高于5.0时均无抑菌活性。对照组磷酸-盐酸缓冲液仅当pH达到2.0时才出现较弱的抑菌作用。说明低pH是产生抑菌效果的一个必要调节，在低pH下，某些抑菌物质的效果增强。
实施例8
蛋白酶预处理对样品抑菌活性的影响
按照实施例2的方法制备婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62组成的益生菌组合物，离心，取上清液，分别调节pH值至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶最适处理pH(2.0、8.0、8.0、7.0)，加入相应酶调节酶浓度至0U/ml、100U/ml、200U/ml，过滤后放置于胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶最适处理温度(37℃、37℃、37℃、50℃)，过夜，将上清置100℃沸水浴5～10min，水浴冷却3min，采用通用牛津杯法抑制奇异变形杆菌的实验。
表7蛋白酶预处理对样品抑菌活性的影响(抑菌圈直径的单位mm)
结果见表7和图6，益生菌组合物(由婴儿双歧杆菌AI-20和副干酪乳杆菌AI-62组成)制备的发酵液在胰蛋白酶、木瓜蛋白酶处理后抑菌活性无明显变化，胃蛋白酶、蛋白酶K处理后抑菌活性稍有不同，表现为酶作用量越大，抑菌活性下降越多。说明抑菌成分中含有某些对蛋白酶敏感的物质，可能是小分子多肽或细菌素等。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 艾兰得生物科技研究泰州有限公司
<120> 一种具有抑制奇异变形杆菌生长作用的副干酪乳杆菌及其益生菌组合物、发酵液和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtatacatgc aagtcgaacg agttctgatt attgaaaggt gcttgcatct tgatttaatt 60
ttgaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag tgggggataa 120
catttggaaa cagatgctaa taccgcataa atccaagaac cgcatggttc ttggctgaaa 180
gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa 240
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gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa 360
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cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta 540
ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc tcggcttaac 600
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<210> 2
<211> 1459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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gggggacaac atttggaaac agatgctaat accgcataac aacgttgttc gcatgaacaa 180
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Claims (3)
1.一种具有抑制奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)生长的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)形成的益生菌组合物在制备抑制奇异变形杆菌生长的试剂中的应用，所述副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物由所述副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌按菌种液的体积比为1：1的比例接种至MRS肉汤培养基中，在36～38℃下厌氧培养至平衡期制得；
所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌AI-62菌株，所述AI-62菌株的保藏编号为CGMCCNo.21744；
所述婴儿双歧杆菌为婴儿双歧杆菌AI-20菌株，所述AI-20菌株的保藏编号为CGMCCNo.21779。
2.由权利要求1所述应用中副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物制备的发酵液在制备抑制奇异变形杆菌生长的试剂中的应用，其特征在于，包括以下步骤：将所述副干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌形成的益生菌组合物接种至发酵培养基中进行厌氧培养，得到发酵液。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述发酵培养基包括MRS肉汤培养基；所述厌氧培养的温度包括36～38℃，所述厌氧培养的时间包括20～24h。
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