CN116747245A - 动物双歧杆菌乳亚种bx-245在抑菌和/或生产功能活性物质中的应用 - Google Patents

动物双歧杆菌乳亚种bx-245在抑菌和/或生产功能活性物质中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了动物双歧杆菌乳亚种BX‑245在抑菌和/或生产功能活性物质中的应用，属于益生菌技术领域；所述动物双歧杆菌乳亚种BX‑245分离自婴儿肠道，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCCNo.26973。本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX‑245菌体胞内能够合成短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、生物胺类、脑肠轴调节产物等功能活性物质，菌体胞外合成产物具有广谱抑菌活性，能有效抑制致病菌和食源性腐败菌。本发明为开发具有功能活性物质的益生菌深入研究和利用提供了一种全新的思路，具有巨大的研究和应用价值。

Description

动物双歧杆菌乳亚种BX-245在抑菌和/或生产功能活性物质 中的应用
技术领域
本发明属于益生菌技术领域，具体涉及动物双歧杆菌乳亚种BX-245在抑菌和/或生产功能活性物质中的应用。
背景技术
随着益生菌研究的深入推进，越来越多的研究发现，灭活益生菌或其裂解物具有调节免疫、缓减过敏、调节肠胃功能、抗氧化、抗炎症，以及降血糖、预防龋齿、抗肿瘤、降血压等特性，如对肠易激综合征、过敏性疾病和牙周炎等具有显著改善作用。益生菌合成的活性产物具有安全、稳定、易于储运等优势，在食品和医药卫生领域具有广阔的应用前景。
双歧杆菌是人类肠道共生菌的一部分，许多源自人类肠道的分离株已显示出健康功效，如缓解乳糖不耐症、降低血清胆固醇水平、改善腹泻和便秘等胃肠道不适，甚至减轻与癌症等疾病相关的症状。因此，通过活性代谢产物的制备、评价和开发，可以更加精准的作用调控靶点，针对性的改益宿主健康，提升益生菌利用效果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株动物双歧杆菌乳亚种及其应用，本发明基于对动物双歧杆菌乳亚种BX-245细胞生物活性物质合成制备情况的研究，开发了动物双歧杆菌乳亚种BX-245在生产功能活性成分和抑菌领域的应用。
本发明提供了动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245或者动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物或者含有动物双歧杆菌乳亚种BX-245和/或动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物的菌剂在抑菌和/或制备抑菌产品中的应用；
所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCC No.26973。
本发明还提供了动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BX-245或者动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物或者含有动物双歧杆菌乳亚种BX-245和/或动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物的菌剂在生产功能活性物质和/或制备肠道调节制剂中的应用；
所述功能活性物质包括短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物和脑肠轴调节物质中的一种或几种；
所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCC No.26973。
优选的，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物由动物双歧杆菌乳亚种BX-245经发酵培养得到或经发酵培养、提取得到。
优选的，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物包括动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞外产物。
优选的，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物包括动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞内产物。
优选的，所述抑菌产品包括广谱抑菌剂、消毒剂、食品防腐剂和保鲜剂中的一种或几种。
优选的，所述抑菌或抑菌产品的抑菌对象包括致病菌和/或食源性腐败菌。
优选的，所述致病菌包括铜绿假单胞菌。
优选的，所述食源性腐败菌包括单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和荧光假单胞菌中的一种或几种。
本发明提供了动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245或者动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物或者含有动物双歧杆菌乳亚种BX-245和/或动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物的菌剂在抑菌和/或制备抑菌产品中的应用；所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCC No.26973。动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌体胞外合成产物具有广谱抑菌活性，能有效抑制致病菌和食源性腐败菌。
本发明还提供了动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BX-245或者动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物或者含有动物双歧杆菌乳亚种BX-245和/或动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物的菌剂在生产功能活性物质和/或制备肠道调节制剂中的应用；所述功能活性物质包括短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物和脑肠轴调节物质中的一种或几种。本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌体胞内能够合成短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、生物胺类、脑肠轴调节产物等功能活性物质。本发明为开发具有功能活性物质的益生菌深入研究和利用提供了一种全新的思路，具有巨大的研究和应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为动物双歧杆菌乳亚种BX-24516S rDNA系统发育树；
图2为动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞内功能活性物质分类比重；
图3为动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞内短链脂肪相对含量；
图4为动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞内生物胺产物相对含量；
图5为动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞内吲哚类产物相对含量；
图6为动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞内脑肠轴调节产物相对含量。
生物保藏说明
动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245，于2023年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.26973。
具体实施方式
本发明提供了动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245或者动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物或者含有动物双歧杆菌乳亚种BX-245和/或动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物的菌剂在抑菌和/或制备抑菌产品中的应用；所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCC No.26973。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245分离自婴儿肠道。
本发明所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245通过以下方法分离得到：婴儿粪便样品经适度稀释并涂布于改良MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检挑选后，再划线于改良MRS固体培养基2～3次培养得到纯菌落。经生理生化鉴定结合16S rRNA分子鉴定为1株动物双歧杆菌乳亚种，命名为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245具有如下生物学特性：革兰氏阳性菌，无鞭毛、不运动，不形成芽孢，厌氧；菌体呈杆状且形态多样、多呈V型、Y型或棒球型，其菌落光滑且边缘完整，呈乳白色。最适生长温度为36～38℃；最适pH值为6.0～7.0。
在本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
gtggagggttcgattctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgggatccctggcagcttgctgtcggggtgagagtggcgaacgggtgagtaatgcgtgaccaacctgccctgtgcaccggaatagctcctggaaacgggtggtaataccggatgctccgctccatcgcatggtggggtgggaaatgcttttgcggcatgggatggggtcgcgtcctatcagcttgttggcggggtgatggcccaccaaggcgttgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacattgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgcgggatggaggccttcgggttgtaaaccgcttttgttcaagggcaaggcacggtttcggccgtgttgagtggattgttcgaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttatccggatttattgggcgtaaagggctcgtaggcggttcgtcgcgtccggtgtgaaagtccatcgcctaacggtggatctgcgccgggtacgggcgggctggagtgcggtaggggagactggaattcccggtgtaacggtggaatgtgtagatatcgggaagaacaccaatggcgaaggcaggtctctgggccgtcactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtggatgctggatgtggggccctttccacgggtccgtgtcggagccaacgcgttaagcatcccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctg ggcttgacatgtgccggatcgccgtggagacacggtttcccttcggggccggttcacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgccgcatgttgccagcgggtgatgccgggaactcatgtgggaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcagatcatcatgccccttacgtccagggcttcacgcatgctacaatggccggtacaacgcggtgcgacacggtgacgtggggcggatcgctgaaaaccggtctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaaggcggagtcgctagtaatcgcggatcagcaacgccgcggtgaatgcgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagtcatgaaagtgggtagcacccgaagccggtggcccgacccttgtggggggagccgtctaaggtgagactcgtgattgggactaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatcacctccttt；系统发育树见图1。
在本发明中，所述抑菌产品优选的包括广谱抑菌剂、消毒剂、食品防腐剂和保鲜剂中的一种或几种；所述抑菌产品由向基底中添加所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞外产物而得。
在本发明中，所述抑菌或抑菌产品的抑菌对象优选的包括致病菌和/或食源性腐败菌。
在本发明中，所述致病菌优选的包括铜绿假单胞菌。
在本发明中，所述食源性腐败菌优选的包括单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和荧光假单胞菌中的一种或几种。
在本发明中，当所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245用于抑菌和/或制备抑菌产品时，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物优选的包括动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞外产物。在本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞外产物包括广谱抑菌产物。动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌体胞外合成产物具有广谱抑菌活性，能有效抑制致病菌和食源性腐败菌。
本发明还提供了动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BX-245或者动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物或者含有动物双歧杆菌乳亚种BX-245和/或动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物的菌剂在生产功能活性物质和/或制备肠道调节制剂中的应用；所述功能活性物质包括短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物和脑肠轴调节物质中的一种或几种；所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCC No.26973。
在本发明中，当所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245用于生产功能活性物质和/或制备肠道调节制剂时，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物包括动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞内产物。在本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞内产物包括短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物和脑肠轴调节物质中的一种或几种。
在本发明中，所述短链脂肪酸优选的包括丁酸、丙酸、L-乳酸和乙酸中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中丁酸的含量优选为20.4～21.36mg/g，更优选为20.88mg/g；所述胞内产物中丙酸的含量优选为22.51～26.23mg/g，更优选为24.37mg/g；所述胞内产物中L-乳酸的含量优选为27.02～31.88mg/g，更优选为29.45mg/g；所述胞内产物中乙酸的含量优选为24.2～29.06mg/g，更优选为26.63mg/g。在本发明中，所述丁酸与脂质代谢相关；所述丙酸具有抗菌、抗炎、止痛和退热等功效；所述L-乳酸具有抑菌活性；所述乙酸具有改善人体肥胖、2型糖尿病和降血压等功效。
在本发明中，所述有机酸优选的包括3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸、香草酸、抗坏血酸、咖啡酸、辛酸、草酸和没食子酸中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸的含量优选为9.05～11.47mg/g，更优选为10.26mg/g；所述胞内产物中香草酸的含量优选为2.93～3.43mg/g，更优选为3.18mg/g；所述胞内产物中抗坏血酸的含量优选为4.36～5.4mg/g，更优选为4.88mg/g；所述胞内产物中咖啡酸的含量优选为0.32～0.36mg/g，更优选为0.34mg/g；所述胞内产物中辛酸的含量优选为2.1～2.34mg/g，更优选为2.22mg/g；所述胞内产物中草酸的含量优选为1.13～2.65mg/g，更优选为1.89mg/g；所述胞内产物中没食子酸的含量优选为0.43～0.47mg/g，更优选为0.45mg/g。在本发明中，所述3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸具有抗真菌活性；所述香草酸具有抗高血压和抗氧化功效；所述抗坏血酸具有抗氧化、抗衰老、预防肿瘤功效；所述咖啡酸具有抗氧化活性；所述辛酸具有抑菌活性；所述草酸具有抗氧化活性；所述没食子酸具有抗炎、抗氧化功效。
在本发明中，所述氨基酸及其衍生物优选的包括谷氨酸、亮氨酸、花生酸、N-乙酰-L-谷氨酸、缬氨酸和丙氨酸中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中谷氨酸的含量优选为21.95～23.97mg/g，更优选为22.96mg/g；所述胞内产物中亮氨酸的含量优选为18.84～20.6mg/g，更优选为19.72mg/g；所述胞内产物中花生酸的含量优选为2.43～3.33mg/g，更优选为2.88mg/g；所述胞内产物中N-乙酰-L-谷氨酸的含量优选为2.53～4.77mg/g，更优选为3.65mg/g；所述胞内产物中缬氨酸的含量优选为11.53～15.81mg/g，更优选为13.67mg/g；所述胞内产物中丙氨酸的含量优选为18.32～22.04mg/g，更优选为20.18mg/g。在本发明中，所述谷氨酸具有调节心力衰竭和代谢紊乱功效；所述谷氨酸具有改善心血管疾病功效；所述花生酸具有抗氧化活性；所述N-乙酰-L-谷氨酸具有改善患前列腺癌功效；所述缬氨酸有助于增强肌肉蛋白质合成；所述丙氨酸可以增加肌肉中肌肽的含量，减少运动员的疲劳。
在本发明中，所述哚吲类代谢物优选的包括吲哚、3-羟甲氧基吲哚和吲哚-3-丙酸中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中吲哚的含量优选为4.13～8.45mg/g，更优选为6.29mg/g；所述胞内产物中3-羟甲氧基吲哚的含量优选为10.22～12.72mg/g，更优选为11.47mg/g；所述胞内产物中吲哚-3-丙酸的含量优选为11.93～13.59mg/g，更优选为12.76mg/g。在本发明中，所述吲哚具有抗氧化、抑菌和杀虫功效；所述3-羟甲氧基吲哚可以预防癌症；所述吲哚-3-丙酸可以调节高脂饮食大鼠的肠道菌群。
在本发明中，所述黄酮类化合物优选的包括异黄酮；所述胞内产物中异黄酮的含量优选为2.79～2.97mg/g，更优选为2.88mg/g；所述异黄酮具有抗氧化、抗糖尿病功效。
在本发明中，所述葡萄糖衍生物优选的包括葡糖二酸；所述胞内产物中葡糖二酸的含量优选为0.56～0.58mg/g，更优选为0.57mg/g；所述葡糖二酸具有抗氧化活性。
在本发明中，所述糖类化合物及其衍生物优选的包括几丁质；所述胞内产物中几丁质的含量优选为0.99～1.05mg/g，更优选为1.02mg/g；所述几丁质具有抗菌性和止血功效。
在本发明中，所述胞内产物中鸟苷的含量优选为0.99～1.13mg/g，更优选为1.06mg/g；所述鸟苷具有神经保护作用。
在本发明中，所述胞内产物中异丁酮的含量优选为0.43～0.45mg/g，更优选为0.44mg/g；所述异丁酮具有抗炎功效。
在本发明中，所述生物胺类代谢物优选的包括烟酰胺、N-乙酰-L-天门冬酰胺、甲氧胺、组胺和5-甲氧基色胺中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中烟酰胺的含量优选为7.39～11.55mg/g，更优选为9.47mg/g；所述胞内产物中N-乙酰-L-天门冬酰胺的含量优选为1.75～4.69mg/g，更优选为3.22mg/g；所述胞内产物中甲氧胺的含量优选为8.61～10.11mg/g，更优选为9.36mg/g；所述胞内产物中组胺的含量优选为6.07～7.15mg/g，更优选为6.61mg/g；所述胞内产物中5-甲氧基色胺的含量优选为19.75～22.43mg/g，更优选为21.09mg/g。在本发明中，所述烟酰胺具有调节食欲、睡眠、情绪和降脂功效；所述N-乙酰-L-天门冬酰胺具有抗癌功效；所述甲氧胺具有缓解运动性哮喘功效；所述组胺介导过敏反应、炎症反应；所述5-甲氧基色胺具有改善睡眠功效。
在本发明中，所述脑肠轴调节物质优选的包括花生四烯酸、棕榈油酸、γ-氨基丁酸和去甲肾上腺素中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中花生四烯酸的含量优选为14.97～16.07mg/g，更优选为15.52mg/g；所述胞内产物中棕榈油酸的含量优选为0.53～0.55mg/g，更优选为0.54mg/g；所述胞内产物中γ-氨基丁酸的含量优选为9.85～10.93mg/g，更优选为10.39mg/g；所述胞内产物中去甲肾上腺素的含量优选为8.54～11.18mg/g，更优选为9.86mg/g。在本发明中，所述花生四烯酸具有调节心、肺脏功能和舒张血管功效；所述棕榈油酸可以调节人体血脂代谢；所述γ-氨基丁酸是一种抑制性神经传递，具有调控肌肉张力、诱导低血压，利尿和镇静作用；所述去甲肾上腺素是神经系统中重要的化学信使，可调节情绪状态、学习、记忆、内分泌等。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌体胞内能够合成短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物、脑肠轴调节产物等功能活性物质，具有肠道调节功效潜在价值。本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌株来源清晰，可应用于普通食品、保健食品和生物制药，便于工业化生产，具有广阔的应用前景。
在本发明中，所述肠道调节制剂的剂型优选的包括口服制剂；所述口服制剂优选的包括散剂、片剂、胶囊剂、口服液体剂型或颗粒剂。在本发明中，所述肠道调节制剂的给药方式优选的包括肠道给药。在本发明中，所述肠道调节制剂优选的还包括药学上可接受的其它辅料。
在本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物优选的由动物双歧杆菌乳亚种BX-245经发酵培养得到或经发酵培养、提取得到。
在本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞内产物和/或胞外产物可以以动物双歧杆菌乳亚种BX-245干燥粉末形式添加，也可以其它形式添加，例如，包括所动物双歧杆菌乳亚种BX-245的培养物的活性液体制剂。
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明的实施例中采用的方法和培养基如下所示：
(一)活菌计数的方法
采用倾注平板计数法，具体操作步骤为：依据GB 4789.35-2016方法检测。
(二)测定益生菌活菌数培养基
本申请实验例中测定益生菌活菌数所用的培养基为改良MRS培养基。所述改良MRS合成培养基购买自广东环凯微生物科技有限公司，微生物检测用。
实施例1动物双歧杆菌乳亚种BX-245的分离、筛选与鉴定
1材料与方法
1.1动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌株来源、分离与鉴定
取婴儿粪便样品，称取0.5mL样品用4.5mL无菌PBS稀释后，取0.1mL涂布于改良MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性菌株，再划线于改良MRS固体培养基培养得到纯菌落。本菌株显微镜下观察形态为革兰氏样性菌，菌体呈杆状且形态多样、多呈V型、Y型或棒球型；在改良MRS固体培养基上菌落直径菌落边缘整齐，呈奶油白色且不透明。
对分离到的菌株进行生理生化鉴定和16S rRNA分子鉴定，根据《伯杰细菌鉴定手册》，使用细菌API50CH(生物梅里埃公司)进行鉴定，结果见表1。提取该菌株的DNA样品，样品经上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA分子鉴定，分子序列经NCBI数据库blastn比对，确认BX-245为动物双歧杆菌乳亚种，其16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。
表1动物双歧杆菌乳亚种BX-245碳水化合物利用结果
1.2动物双歧杆菌乳亚种BX-245胃肠液耐受性能
1.2.1胃肠液耐受性试验方法：
1.2.1.1在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液。
1.2.1.2选择经耐酸性筛选后的菌株进行培养，培养两代后离心洗菌两次，收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃厌氧培养3h，于0h、3h用改良MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。
1.2.1.3在pH8.0(用0.1mol/LNaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液。
1.2.1.4将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃厌氧培养，于0h、4h、8h用改良MRS琼脂培养基倾注法测活菌数。
存活率＝[N1/N0]×100％
其中，N0表示0h活菌数；N1表示经模拟消化3h或8h后的活菌数。
耐受效果：动物双歧杆菌乳亚种BX-245经模拟胃液和模拟肠液处理后，结果如下表2所示：
表2动物双歧杆菌乳亚种BX-245模拟胃肠消化液存活情况
菌株 模拟胃液(pH2.5,3h)存活率(％) 模拟肠液(pH8.0,8h)存活率(％)
BX-245 78.86％ 75.77％
由表2可知，动物双歧杆菌乳亚种BX-245具有良好的耐受特性，在模拟肠液处理8h后存活率可达75.77％。
根据本实施例胃肠液耐受效果可知，动物双歧杆菌乳亚种BX-245在肠道中具有良好的耐受胃肠液的特点，具有益生特性。
实施例2动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞内外代谢产物制备及分析
1胞内活性产物制备方法
1.1菌种活化：将冷冻保存在-80℃的供试菌株接种于改良TPY液体培养基中，37℃恒温厌氧条件下进行活化培养，活化完成后用移液枪将供试菌以2％的接种量接种于种子培养基中，然后在37℃恒温厌氧下持续培养10～14h。为保证供试菌的纯度，对传代期间的微生物形态进行观察。
1.2扩大培养：将上述种子液以10％(V/V)的接种量进行扩大培养。接种结束后加入氨水或氢氧化钠调整发酵液初始pH至7.0±0.02，无菌氮气保压0.02～0.03MPa，设置搅拌速度80rpm/min，开始发酵。培养温度37±0.2℃，使用氨水作维持pH恒定(5.9～6.2)±0.02。
1.3菌体灭活：将发酵至终点的发酵液经90℃、15min进行杀菌灭活。
1.4离心洗涤：将灭活后的发酵液进入离心机进行离心分离(转速14000rpm/min)，并用无菌纯化水重复洗涤1～2次。
1.5脱水干燥：将洗涤后所得湿菌体进行真空冷冻干燥或热风喷雾干燥，制备胞内活性产物干粉。
1.6活性成分检测：称取样本50±2mg加入到2mL离心管中，加入-20℃预冷的500μL70％甲醇水。称量好的样本匀浆4次，每次30s，30HZ。匀浆完后振荡5min，冰上静置15min。在4℃，12000r/min下离心10min，吸取上清液400μL到另一个离心管中。在原离心管沉淀中加入500μL乙酸乙酯/甲醇(V/V，1:3)，振荡5min，冰上静置15min。在4℃、12000rmp下离心10min，取上清液400μL。合并两次上清液，浓缩。干燥物加入100μL 70％甲醇水，超声3min，在4℃，12000r/min下离心3min，吸取60μL上清液于对应内衬管中，用于代谢组检测及分析。
2胞外代谢产物制备方法
2.1菌种活化：将冷冻保存在-80℃的供试菌株接种于改良TPY液体培养基中，37℃恒温厌氧条件下进行活化培养，活化完成后用移液枪将供试菌以2％的接种量接种于种子培养基中，然后在37℃恒温厌氧下持续培养10～14h。为保证供试菌的纯度，对传代期间的微生物形态进行观察。
1.2扩大培养：将上述种子液以10％(V/V)的接种量进行扩大培养。接种结束后加入氨水或氢氧化钠调整发酵液初始pH至7.0±0.02，无菌氮气保压0.02～0.03MPa，设置搅拌速度80rpm/min，开始发酵。培养温度37±0.2℃，使用氨水作维持pH恒定(5.9～6.2)±0.02。
1.3代谢产物制备：将发酵至终点的发酵液高速离心去除菌体，收集到的无细胞提取液经脱盐、浓缩和喷雾干燥制备所得的粉剂以10倍稀释复溶(相当于约10％干物质)，将复溶液调pH值至7.0，通过测量抑菌圈直径大小，判断其分别对荧光假单胞菌、蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌的抑菌能力。
2结果与分析
2.1动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞内活性产物通过代谢组学检测技术，共鉴定到功能代谢物55种(相对含量＞0.01mg/g)，胞内功能活性物质的鉴定结果及功能分析如表3所示。其中，功能代谢物含量较高的主要集中在短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、生物胺类代谢物以及与脑肠轴相关的代谢物上，具体占比如图2所示。本申请重点列举以上几种化合物分类中含量较高的物质进行说明，短链脂肪酸含量较高的见图3、生物胺类代谢物见图4、哚吲类代谢物见图5、脑肠轴相关的代谢物见图6，所有功能性活性物质具体含量见表3。
表3动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞内活性产物鉴定结果
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2.2动物双歧杆菌乳亚种BX-245共对5种菌有抑菌作用，结果如表4所示。
表4动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞外代谢产物的抑菌测试
单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌是常见的食源性病原菌，可以通过各种途径和方式污染食品，成为细菌性食物中毒的一种重要病原菌之一，严重威胁人类和动物健康。蜡样芽孢杆菌是引起食物中毒的常见细菌，蜡样芽孢杆菌比其它细菌更耐热，常常在加热的条件下也不会死亡。动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞外活性产物对金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌有较强的抑菌作用。
荧光假单胞菌是奶类、蛋类在低温条件下保存导致腐败变质的主要细菌之一。动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞外活性产物对荧光假单胞菌具有显著抑菌作用。
铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一，动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞外活性产物对病原菌具有抑制作用
根据本实施例抑菌测试效果可知，动物双歧杆菌乳亚种BX-245胞外活性产物对食源性致病菌、腐败菌具有抑制作用，具有作为食品防腐剂和保鲜剂的潜在应用价值。
3结论
动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌体胞内能够合成短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、生物胺类、脑肠轴调节产物等功能活性物质，菌体胞外合成产物具有广谱抑菌活性，能有效抑制致病菌和食源性腐败菌。本发明为开发具有功能活性物质的益生菌深入研究和利用提供了一种全新的思路，具有巨大的研究和应用价值。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)BX-245或者动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物或者含有动物双歧杆菌乳亚种BX-245和/或动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物的菌剂在抑菌和/或制备抑菌产品中的应用；
所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCCNo.26973。
2.动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)BX-245或者动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物或者含有动物双歧杆菌乳亚种BX-245和/或动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物的菌剂在生产功能活性物质和/或制备肠道调节制剂中的应用；
所述功能活性物质包括短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物和脑肠轴调节物质中的一种或几种；
所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCCNo.26973。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物由动物双歧杆菌乳亚种BX-245经发酵培养得到或经发酵培养、提取得到。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物包括动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞外产物。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的发酵物包括动物双歧杆菌乳亚种BX-245的胞内产物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑菌产品包括广谱抑菌剂、消毒剂、食品防腐剂和保鲜剂中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑菌或抑菌产品的抑菌对象包括致病菌和/或食源性腐败菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述致病菌包括铜绿假单胞菌。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述食源性腐败菌包括单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和荧光假单胞菌中的一种或几种。
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