CN116769654A - 一株动物双歧杆菌乳亚种及其应用 - Google Patents

一株动物双歧杆菌乳亚种及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株动物双歧杆菌乳亚种及其应用，属于益生菌技术领域；所述动物双歧杆菌乳亚种BX‑245分离自婴儿肠道，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCCNo.26973。本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX‑245。

Description

一株动物双歧杆菌乳亚种及其应用
技术领域
本发明属于益生菌技术领域，具体涉及一株动物双歧杆菌乳亚种及其应用。
背景技术
随着益生菌研究的深入推进，越来越多的研究发现，灭活益生菌或其裂解物具有调节免疫、缓减过敏、调节肠胃功能、抗氧化、抗炎症，以及降血糖、预防龋齿、抗肿瘤、降血压等特性，如对肠易激综合征、过敏性疾病和牙周炎等具有显著改善作用。益生菌合成的活性产物具有安全、稳定、易于储运等优势，在食品和医药卫生领域具有广阔的应用前景。
双歧杆菌是人类肠道共生菌的一部分，许多源自人类肠道的分离株已显示出健康功效，如缓解乳糖不耐症、降低血清胆固醇水平、改善腹泻和便秘等胃肠道不适，甚至减轻与癌症等疾病相关的症状。
双歧杆菌在乳品领域规模化应用还面临一个主要的技术难题，由于发酵乳中加入双歧杆菌后风味不能有效保证，在实际生产应用中有很大的局限性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株动物双歧杆菌乳亚种及其应用，将本发明的动物双歧杆菌乳亚种用于制备得到的发酵乳感官得分较高，风味较好。
本发明提供了一株动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BX-245，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCC No.26973。
本发明还提供了一种菌剂，含有上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245。
优选的，所述菌剂中动物双歧杆菌乳亚种BX-245的有效活菌数≥1×106CFU/mL。
本发明还提供了上述方案所述的菌剂的制备方法，包括以下步骤：将上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245接种于培养基，于厌氧条件下进行培养，得到菌剂。
优选的，所述培养基包括RCM培养基或者TPY培养基。
本发明还提供了上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245或者所述的菌剂或者所述的制备方法制备得到的菌剂在制备益生菌乳制品和/或改善益生菌乳制品的品质中的应用；
所述改善益生菌乳制品的品质包括提高发酵乳中活性成分含量；所述活性成分包括短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物和脑肠轴调节物质中的一种或几种。
优选的，所述益生菌乳制品包括发酵乳或发酵乳饮料。
本发明还提供了一种发酵乳，含有上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245。
本发明还提供了上述方案所述的发酵乳的制备方法，包括以下步骤：
在奶原料中接种发酵剂和上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245得到发酵料，对所述发酵料进行厌氧发酵，得到发酵乳。
优选的，所述厌氧发酵的结束时间为厌氧发酵至物料的pH值为4.4～4.5时发酵结束。
本发明提供了一株动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BX-245，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCC No.26973。本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245具有良好的胃肠道消化液耐受性和胆盐耐受性，能够作为益生菌可以应用于发酵乳制品和活菌制剂，并且，将本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245用于制备得到的发酵乳感官得分较高，风味较好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为动物双歧杆菌乳亚种BX-24516S rDNA系统发育树；
图2为动物双歧杆菌乳亚种BX-245基因组圈图；
图3为动物双歧杆菌乳亚种BX-245在培养基上的菌落形态；
图4为动物双歧杆菌乳亚种BX-245革兰氏染色图；
图5为发酵乳发酵过程中弹性因子和粘度因子的变化，其中，A为发酵乳发酵过程中弹性因子的变化，B为发酵乳发酵过程中粘度因子的变化；
图6为发酵乳贮藏期间pH值和滴定酸度的变化。
生物保藏说明
动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245，于2023年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.26973。
具体实施方式
本发明提供了一株动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BX-245，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCC No.26973。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245分离自中国内蒙古呼和浩特地区的婴儿肠道，具有益生特性。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245是从乳酸菌菌种资源库中125株动物双歧杆菌乳亚种中初步筛选出的具有耐酸能力的动物双歧杆菌乳亚种。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245在pH2.5的人工胃液中消化3h，存活率为73.54％，之后继续在pH8.0的人工消化液中消化8h，其存活率高达91.29％。具有良好的胃肠道消化液耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，发挥健康功效。上述特性是作为益生菌的基础。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245在不含胆盐的培养基中培养，OD620nm值增加0.3个单位所需的时间为4.7h，在含有胆盐的培养基中所需的时间为4.7h，延迟时间为0h，为抗性菌株。对于活细胞来说，胆盐能破坏细胞膜，且在小肠中对益生菌存活性影响最大的因素就是胆盐，所以对胆盐的耐受性是评价益生菌的重要指标之一。因此，本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245具有良好的益生特性。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245具有良好的胃肠道消化液耐受性和良好的胆盐耐受性，具备作为益生菌的基本条件。
本发明所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245通过以下方法分离得到：
将采集的婴儿粪便样品现场进行涂布分离菌株，首先将样品进行倍比稀释，吸取10-5和10-6稀释梯度样品200μL均匀涂布于RCM固体培养基平皿内，涂布均匀后与厌氧产气袋一同放置于厌氧罐带回实验室，于A35厌氧工作站(80％N2，10％H2，10％CO2)37℃进行厌氧培养72～96h。挑取形态、大小、颜色不同的单个菌落接种于RCM液体培养基中，于37℃恒温培养箱厌氧培养24～36h。待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检。保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245在RCM固体培养基上形成直径在1～2mm之间，圆形凸起、边缘不整齐，质地粗糙，呈乳白色的不透明菌落
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245具有如下生物学特性：菌体在显微镜下呈短杆状，细胞成单、成对或成链状，不具鞭毛或纤毛，不会移动。
在本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
gtggagggttcgattctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgggatccctggcagcttgctgtcggggtgagagtggcgaacgggtgagtaatgcgtgaccaacctgccctgtgcaccggaatagctcctggaaacgggtggtaataccggatgctccgctccatcgcatggtggggtgggaaatgcttttgcggcatgggatggggtcgcgtcctatcagcttgttggcggggtgatggcccaccaaggcgttgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacattgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgcgggatggaggccttcgggttgtaaaccgcttttgttcaagggcaaggcacggtttcggccgtgttgagtggattgttcgaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttatccggatttattgggcgtaaagggctcgtaggcggttcgtcgcgtccggtgtgaaagtccatcgcctaacggtggatctgcgccgggtacgggcgggctggagtgcggtaggggagactggaattcccggtgtaacggtggaatgtgtagatatcgggaagaacaccaatggcgaaggcaggtctctgggccgtcactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtggatgctggatgtggggccctttccacgggtccgtgtcggagccaacgcgttaagcatcccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatgtgccggatcgccgtggagacacggtttcccttcggggccggttcacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgccgcatgttgccagcgggtgatgccgggaactcatgtgggaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcagatcatcatgccccttacgtccagggcttcacgcatgctacaatggccggtacaacgcggtgcgacacggtgacgtggggcggatcgctgaaaaccggtctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaaggcggagtcgctagtaatcgcggatcagcaacgccgcggtgaatgcgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagtcatgaaagtgggtagcacccgaagccggtggcccgacccttgtggggggagccgtctaaggtgagactcgtgattgggactaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatcacctccttt；系统发育树见图1。
在本发明中，所述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的全基因组序列已上传至NCBI，Accession:PRJNA979971，ID:979971，Bifidobacterium animalis subsp.lactis strain:GG6C12，长度为1.94Mb，染色体基因组含有1633个编码基因。
本发明提供了一种菌剂，含有上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245。
在本发明中，所述菌剂优选为活菌制剂。
在本发明中，所述菌剂中动物双歧杆菌乳亚种BX-245的有效活菌数优选的≥1×106CFU/mL。
本发明还提供了上述方案所述的菌剂的制备方法，包括以下步骤：将上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245接种于培养基，于厌氧条件下进行培养，得到菌剂。
在本发明中，所述培养基优选的包括RCM培养基(强化梭菌培养基)或者TPY培养基。在本发明中，所述RCM培养基优选的包括RCM液体培养基或RCM固体培养基。采用RCM固体培养基进行培养用于获得单菌落，采用RCM液体培养基进行培养用于扩大培养。
在本发明中，所述RCM固体培养基以蒸馏水为溶剂，优选的由以下组分组成：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉10g/L、酵母粉3g/L、葡萄糖5g/L、可溶性淀粉1g/L、氯化钠5g/L、乙酸钠3g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L和琼脂15g/L；所述RCM固体培养基的pH值优选为6.8。
在本发明中，所述培养的温度优选为37℃；所述厌氧条件优选的包括由N2、H2和CO2组成的气体条件；所述N2、H2和CO2的体积比优选为8：1：1。采用RCM固体培养基进行培养用于获得单菌落时，所述培养的时间优选为72～96h。采用RCM液体培养基进行培养用于扩大培养时，所述培养的时间优选为24～36h。
本发明还提供了上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245或者所述的菌剂或者所述的制备方法制备得到的菌剂在制备食品、保健品、饲料、食品添加剂、饲料添加剂或者药品中的应用。
本发明还提供了上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245或者所述的菌剂或者所述的制备方法制备得到的菌剂在制备益生菌乳制品和/或改善益生菌乳制品的品质中的应用；
所述改善益生菌乳制品的品质包括提高发酵乳中活性成分含量；所述活性成分包括短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物和脑肠轴调节物质中的一种或几种。
在本发明中，所述短链脂肪酸优选的包括丁酸、丙酸、L-乳酸和乙酸中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中丁酸的含量优选为20.4～21.36mg/g，更优选为20.88mg/g；所述胞内产物中丙酸的含量优选为22.51～26.23mg/g，更优选为24.37mg/g；所述胞内产物中L-乳酸的含量优选为27.02～31.88mg/g，更优选为29.45mg/g；所述胞内产物中乙酸的含量优选为24.2～29.06mg/g，更优选为26.63mg/g。在本发明中，所述丁酸与脂质代谢相关；所述丙酸具有抗菌、抗炎、止痛和退热等功效；所述L-乳酸具有抑菌活性；所述乙酸具有改善人体肥胖、2型糖尿病和降血压等功效。
在本发明中，所述有机酸优选的包括3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸、香草酸、抗坏血酸、咖啡酸、辛酸、草酸和没食子酸中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸的含量优选为9.05～11.47mg/g，更优选为10.26mg/g；所述胞内产物中香草酸的含量优选为2.93～3.43mg/g，更优选为3.18mg/g；所述胞内产物中抗坏血酸的含量优选为4.36～5.4mg/g，更优选为4.88mg/g；所述胞内产物中咖啡酸的含量优选为0.32～0.36mg/g，更优选为0.34mg/g；所述胞内产物中辛酸的含量优选为2.1～2.34mg/g，更优选为2.22mg/g；所述胞内产物中草酸的含量优选为1.13～2.65mg/g，更优选为1.89mg/g；所述胞内产物中没食子酸的含量优选为0.43～0.47mg/g，更优选为0.45mg/g。在本发明中，所述3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸具有抗真菌活性；所述香草酸具有抗高血压和抗氧化功效；所述抗坏血酸具有抗氧化、抗衰老、预防肿瘤功效；所述咖啡酸具有抗氧化活性；所述辛酸具有抑菌活性；所述草酸具有抗氧化活性；所述没食子酸具有抗炎、抗氧化功效。
在本发明中，所述氨基酸及其衍生物优选的包括谷氨酸、亮氨酸、花生酸、N-乙酰-L-谷氨酸、缬氨酸和丙氨酸中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中谷氨酸的含量优选为21.95～23.97mg/g，更优选为22.96mg/g；所述胞内产物中亮氨酸的含量优选为18.84～20.6mg/g，更优选为19.72mg/g；所述胞内产物中花生酸的含量优选为2.43～3.33mg/g，更优选为2.88mg/g；所述胞内产物中N-乙酰-L-谷氨酸的含量优选为2.53～4.77mg/g，更优选为3.65mg/g；所述胞内产物中缬氨酸的含量优选为11.53～15.81mg/g，更优选为13.67mg/g；所述胞内产物中丙氨酸的含量优选为18.32～22.04mg/g，更优选为20.18mg/g。在本发明中，所述谷氨酸具有调节心力衰竭和代谢紊乱功效；所述谷氨酸具有改善心血管疾病功效；所述花生酸具有抗氧化活性；所述N-乙酰-L-谷氨酸具有改善患前列腺癌功效；所述缬氨酸有助于增强肌肉蛋白质合成；所述丙氨酸可以增加肌肉中肌肽的含量，减少运动员的疲劳。
在本发明中，所述哚吲类代谢物优选的包括吲哚、3-羟甲氧基吲哚和吲哚-3-丙酸中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中吲哚的含量优选为4.13～8.45mg/g，更优选为6.29mg/g；所述胞内产物中3-羟甲氧基吲哚的含量优选为10.22～12.72mg/g，更优选为11.47mg/g；所述胞内产物中吲哚-3-丙酸的含量优选为11.93～13.59mg/g，更优选为12.76mg/g。在本发明中，所述吲哚具有抗氧化、抑菌和杀虫功效；所述3-羟甲氧基吲哚可以预防癌症；所述吲哚-3-丙酸可以调节高脂饮食大鼠的肠道菌群。
在本发明中，所述黄酮类化合物优选的包括异黄酮；所述胞内产物中异黄酮的含量优选为2.79～2.97mg/g，更优选为2.88mg/g；所述异黄酮具有抗氧化、抗糖尿病功效。
在本发明中，所述葡萄糖衍生物优选的包括葡糖二酸；所述胞内产物中葡糖二酸的含量优选为0.56～0.58mg/g，更优选为0.57mg/g；所述葡糖二酸具有抗氧化活性。
在本发明中，所述糖类化合物及其衍生物优选的包括几丁质；所述胞内产物中几丁质的含量优选为0.99～1.05mg/g，更优选为1.02mg/g；所述几丁质具有抗菌性和止血功效。
在本发明中，所述胞内产物中鸟苷的含量优选为0.99～1.13mg/g，更优选为1.06mg/g；所述鸟苷具有神经保护作用。
在本发明中，所述胞内产物中异丁酮的含量优选为0.43～0.45mg/g，更优选为0.44mg/g；所述异丁酮具有抗炎功效。
在本发明中，所述生物胺类代谢物优选的包括烟酰胺、N-乙酰-L-天门冬酰胺、甲氧胺、组胺和5-甲氧基色胺中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中烟酰胺的含量优选为7.39～11.55mg/g，更优选为9.47mg/g；所述胞内产物中N-乙酰-L-天门冬酰胺的含量优选为1.75～4.69mg/g，更优选为3.22mg/g；所述胞内产物中甲氧胺的含量优选为8.61～10.11mg/g，更优选为9.36mg/g；所述胞内产物中组胺的含量优选为6.07～7.15mg/g，更优选为6.61mg/g；所述胞内产物中5-甲氧基色胺的含量优选为19.75～22.43mg/g，更优选为21.09mg/g。在本发明中，所述烟酰胺具有调节食欲、睡眠、情绪和降脂功效；所述N-乙酰-L-天门冬酰胺具有抗癌功效；所述甲氧胺具有缓解运动性哮喘功效；所述组胺介导过敏反应、炎症反应；所述5-甲氧基色胺具有改善睡眠功效。
在本发明中，所述脑肠轴调节物质优选的包括花生四烯酸、棕榈油酸、γ-氨基丁酸和去甲肾上腺素中的一种或几种。在本发明中，所述胞内产物中花生四烯酸的含量优选为14.97～16.07mg/g，更优选为15.52mg/g；所述胞内产物中棕榈油酸的含量优选为0.53～0.55mg/g，更优选为0.54mg/g；所述胞内产物中γ-氨基丁酸的含量优选为9.85～10.93mg/g，更优选为10.39mg/g；所述胞内产物中去甲肾上腺素的含量优选为8.54～11.18mg/g，更优选为9.86mg/g。在本发明中，所述花生四烯酸具有调节心、肺脏功能和舒张血管功效；所述棕榈油酸可以调节人体血脂代谢；所述γ-氨基丁酸是一种抑制性神经传递，具有调控肌肉张力、诱导低血压，利尿和镇静作用；所述去甲肾上腺素是神经系统中重要的化学信使，可调节情绪状态、学习、记忆、内分泌等。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌体胞内能够合成短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物、脑肠轴调节产物等功能活性物质，具有肠道调节功效潜在价值。本发明的动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌株来源清晰，可应用于普通食品、保健食品和生物制药，便于工业化生产，具有广阔的应用前景。
在本发明中，所述益生菌乳制品优选的包括发酵乳或发酵乳饮料；所述发酵乳优选的包括发酵酸奶或发酵豆乳。
本发明还提供了一种发酵乳，含有上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245。
本发明还提供了上述方案所述的发酵乳的制备方法，包括以下步骤：
在奶原料中接种发酵剂和上述方案所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245得到发酵料，对所述发酵料进行厌氧发酵，得到发酵乳。
在本发明中，所述奶原料的制备用原料优选的包括纯牛奶和白砂糖；所述纯牛奶和白砂糖的质量比预选为93.5：6.5。在本发明中，所述纯牛奶优选为商业化市售纯牛奶。
在本发明中，所述奶原料的制备方法优选的包括：将出牛奶和白砂糖混合，得到混合料；对所述混合料依次进行均质和灭菌，得到奶原料。在本发明中，所述混合的温度优选为65℃；在本发明具体实施过程中，所述纯牛奶在混合前优选的预热升温至65℃；所述均质的时间优选为15min；所述均质的压强优选为20mbar；所述灭菌优选为加热灭菌；所述加热灭菌的温度优选为95℃；所述加热灭菌的时间优选为5min。
本发明对所述发酵剂的组成没有特殊限制，采用本领域常规发酵剂即可。在本发明具体实施过程中，所述发酵剂购于科汉森(中国)有限公司，型号：YF-L922，含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
在本发明中，述动物双歧杆菌乳亚种BX-245的初始有效活菌数优选为5×106CFU/mL。
在所述厌氧发酵前，本发明优选的还包括将发酵料置于37℃水浴条件下10min进行回温。
在本发明中，所述厌氧发酵的结束时间优选为厌氧发酵至物料的pH值为4.4～4.5时发酵结束。
在所述厌氧发酵后，本发明优选的还包括对所述厌氧发酵后的产物进行后熟处理。本发明对所述后熟处理的具体操作没有特殊限制，采用本领域的常规后熟手段即可。
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245的分离和鉴定
本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245是通过如下方法分离得到的。
a.动物双歧杆菌乳亚种BX-245的分离
将采集的婴儿粪便样品现场进行涂布分离菌株，首先将样品进行倍比稀释，
吸取10-5和10-6稀释梯度样品200μL均匀涂布于RCM固体培养基平皿内，涂布均匀后与厌氧产气袋一同放置于厌氧罐带回实验室，于A35厌氧工作站(80％N2，10％H2，10％CO2)37℃进行厌氧培养72～96h。挑取形态、大小、颜色不同的单个菌落接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24～36h。待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检。保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析。
其中RCM培养基的组成是：蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、乙酸钠3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1L，调节pH至6.8左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌。
b.生理生化鉴定、16S rRNA分子鉴定和全基因组测序进行菌株鉴定
将冷冻保存的供试菌株接种于RCM液体培养基中，37℃恒温培养24～36h，并传代培养2～3代后，取30mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌管内离心，经8000×g离心5min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
对分离到的菌株进行生理生化鉴定和16S rRNA分子鉴定，根据《伯杰细菌鉴定手册》，使用细菌API50CH(生物梅里埃公司)进行鉴定，结果见表1。提取该菌株的DNA样品，样品经上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA分子鉴定，分子序列经NCBI数据库blastn比对，确认BX-245为动物双歧杆菌乳亚种，其16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。
表1动物双歧杆菌乳亚种BX-245碳水化合物利用结果
1、动物双歧杆菌乳亚种BX-245胃肠液耐受性能
1.1胃肠液耐受性试验方法：
1.1.1在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液。
1.1.2选择经耐酸性筛选后的菌株进行培养，培养两代后离心洗菌两次，收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃厌氧培养3h，于0h、3h用改良MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。
1.1.3在pH8.0(用0.1mol/LNaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液。
1.1.4将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃厌氧培养，于0h、4h、8h用改良MRS琼脂培养基倾注法测活菌数。
存活率＝[N1/N0]×100％
其中，N0表示0h活菌数；N1表示经模拟消化3h或8h后的活菌数。
耐受效果：动物双歧杆菌乳亚种BX-245经模拟胃液和模拟肠液处理后，结果如下表2所示：
表2动物双歧杆菌乳亚种BX-245模拟胃肠消化液存活情况
菌株 模拟胃液(pH2.5,3h)存活率(％) 模拟肠液(pH8.0,8h)存活率(％)
BX-245 78.86％ 75.77％
由表2可知，动物双歧杆菌乳亚种BX-245具有良好的耐受特性，在模拟肠液处理8h后存活率可达75.77％。
根据本实施例胃肠液耐受效果可知，动物双歧杆菌乳亚种BX-245在肠道中具有良好的耐受胃肠液的特点，具有益生特性。
采用Illumina HiSeq测序平台进行对动物双歧杆菌乳亚种BX-245全基因组进行测定，基因组圈图见图2。经组装比对后，其基因组长度为1.94Mb，染色体基因组含有1633个编码基因。
c.菌落形态特性
本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245在RCM固体培养基上形成直径在1～2mm之间，圆形凸起、边缘不整齐，质地粗糙，呈乳白色的不透明菌落(见图3)。
d.形态学特性
取婴儿粪便样品，称取0.5mL样品用4.5mL无菌PBS稀释后，取0.1mL涂布于改良MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性菌株，再划线于改良MRS固体培养基培养得到纯菌落。本菌株显微镜下观察形态为革兰氏样性菌，菌体呈杆状且形态多样、多呈V型、Y型或棒球型；在改良MRS固体培养基上菌落直径菌落边缘整齐，呈奶油白色且不透明。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245具有如下形态学特征：菌体在显微镜下呈短杆状，细胞成单、成对或成链状(见图4)，不具鞭毛或纤毛，不会移动。
e.动物双歧杆菌乳亚种BX-245功能基因特征
本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245中基因组中参与氨基酸转运和代谢的基因数量最多，为256个；其次是参与翻译，核糖体结构和生物合成及碳水化合物转运和代谢基因。通过CAZy注释到四大类碳水化合物活性酶的43个小类基因家族，主要以糖苷水解酶(GHs)和糖基转移酶(GTs)酶类的含量最为丰富。其中包含26个GH家族、10个GT家族、4个CE家族和3个CBM家族。并且GH家族中的GH13_11和GH3酶类(与α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶等的生物合成相关)，GT家族中GT2和GT4酶类(与蔗糖等二糖以及低聚糖和多糖的生物合成相关)含量较丰富，表明该菌株具有较强的糖合成能力。
将动物双歧杆菌乳亚种BX-245与VFDB数据库(Virulence Factors ofPathogenic Bacteria)和VirulenceFinder数据库(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder)进行比对，以序列相似性>90％，序列覆盖度>60％作为筛选标准。结果显示，动物双歧杆菌乳亚种BX-245基因组中均未检测到潜在毒力相关基因。
并在BX-245基因组中检测到与益生功能相关基因进行注释，得到与核黄素、乳酸、胞外多糖的产生、生物活性肽合成以及耐酸耐胆盐相关的功能基因，具体基因见表3。
表3益生相关基因
f.动物双歧杆菌乳亚种BX-245的初步筛选
将冷冻保存的98株动物双歧杆菌乳亚种接种于RCM液体培养基中，37℃恒温培养24～36h，并传代培养2～3代后，接种于pH为4.0的培养基中，测定其起始OD值，37℃恒温培养72h后，再测定OD值，通过计算OD差值初步筛选具有耐酸能力的菌株。动物双歧杆菌乳亚种BX-245于pH为4.0的培养基中培养72h后，OD差值为0.33，大于其他动物双歧杆菌乳亚种菌株，因此初步判定该菌株具有耐酸能力。
g.动物双歧杆菌乳亚种BX-245胃肠液耐受性
模拟胃肠液的制备方法：将PBS灭菌后，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，加入3.0mg/ml胃蛋白酶，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液；将PBS灭菌后，用0.1mol/LNaOH调节pH值至8.0，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟胰液。
胃肠液耐受性：将分离纯化得到的菌株活化培养两代，离心洗菌两次，收集菌体，取0.5mL复筛菌体悬液加入到4.5mL pH2.5模拟人工胃液中，37℃消化3h，同时分别于0h和3h用RCM琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。之后，取0.5mL已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5mL的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数，每个样品做4个平行。
菌株存活率计算公式参见式1。
式1中N1表示菌株处理后活菌数，N0表示菌株初始活菌数。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245在pH2.5的人工胃液中消化3h，存活率为73.54％，之后继续在pH8.0的人工消化液中消化8h，其存活率高达91.29％。具有良好的胃肠道消化液耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，发挥健康功效。上述特性是作为益生菌的基础。
h.动物双歧杆菌乳亚种胆盐耐受性
分离纯化得到的菌株活化培养三代后，以1％的接种量分别接种到含0.3％牛胆盐(培养基中添加0.2g/100mL巯基乙酸钠，0.3g/100mL牛胆盐)和不含牛胆盐的MRS培养基中，后者作为空白对照，置于37℃恒温培养。培养期间，每隔一h取样于620nm测定OD值，每组测定三个平行，直到OD值增加0.3个单位及以上时停止培养。并计算菌株在含有胆盐和不含胆盐的MRS培养基中OD值增加0.3个单位所需的时间，二者之差被称为延迟时间(LT)。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245在不含胆盐的培养基中培养，OD620nm值增加0.3个单位所需的时间为4.7h，在含有胆盐的培养基中所需的时间为4.7h，延迟时间为0h。根据Gilliland等人的胆盐耐受性实验结论，抗性菌株(延迟时间≤0.25h)，耐受性菌株(0.25h＜延迟时间≤0.67h)，弱耐受性菌株(0.67h＜延迟时间＜1.00h)，敏感菌株(延迟菌株≥1.00h)。因此，动物双歧杆菌乳亚种BX-245的延迟时间为0h，为抗性菌株。
对于活细胞来说，胆盐能破坏细胞膜，且在小肠中对益生菌存活性影响最大的因素就是胆盐，所以对胆盐的耐受性是评价益生菌的重要指标之一。因此，分离自婴儿肠道动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245具有良好的益生特性。
I.动物双歧杆菌乳亚种表面疏水性和自凝聚性
采用碳氢吸附法对上述筛选菌株进行细胞表面疏水性测定。将菌株接种于RCM液体培养基中，37℃厌氧培养24h后，4000rpm/min离心5min，收集菌体，用灭菌PBS洗涤两次后调整菌液浓度至1×108CFU/mL，在600nm处测量初始吸光度Ao。取2mL菌悬液，加入2mL二甲苯，漩涡振荡10min混匀，室温放置30min使之分层，取下层水相测定吸光度A。计算公式参见式2：
疏水率(％)＝(Ao-A)/Ao×100％ 式2；
式2中：Ao-初始吸光度；A-与二甲苯混合后菌液的吸光度。
如表4所示，本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BX-245显示出较高表面疏水性为91.03％，较对照菌株BB12和Probio-M8有显著性差异(P<0.05)。
表4表面疏水性能力评价
将上述菌液(1×108CFU/mL)置于37℃下培养。在培养第0、3、6和24h时，取菌悬液上层，于600nm处测定吸光度A；并记录四。计算公式如式3：
自凝聚率(％)＝(A0-At)/A0×100％ 式3；
式3中：Ao：0h吸光度；At：t时刻菌悬液上层的吸光度。
如表5所示，本发明的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BX-245显示出较高的自凝聚能力，特别在静置24h后，BX-245的自凝聚力为83.50±0.42％，较对照菌株BB12和Probio-M8有显著性差异(P<0.05)。
表5表面自凝集率评价
实施例2：高活性、高活菌数动物双歧杆菌乳亚种BX-245制剂的制备
为了将动物双歧杆菌乳亚种产业化并应用于食品、医药和动物养殖行业，通常采用高密度培养方式提高菌体活菌数，获得尽可能高的体积生产率，降低菌株培养成本和缩短生产周期，进而提高产品的市场竞争力。另外，双歧杆菌对氧气、高温等环境因素非常敏感，为了最大程度保证菌的活力和数量，且便于运输、保藏和后期产品的加工利用,大多以菌粉形式被开发，因此双歧杆菌活菌制剂的制备并提高其贮藏稳定性十分必要。
为实现动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BX-245的高活菌数培养，获得其生长的最适发酵条件，对发酵培养基和发酵条件分别进行优化。以发酵液OD值和活菌数为测定指标，通过单因素试验和Box-Behnken试验优化高密度发酵培养基。结果表明，动物双歧杆菌乳亚种的最优培养基组成为：蛋白胨7g/L；酵母粉23g/L；牛肝浸粉5g/L；乳糖60g/L；Tween-800.25g/L；醋酸钠5g/L；磷酸氢二钾2g/L；柠檬酸钠2g/L；碳酸钠0.2g/L；硫酸镁0.2g/L；硫酸锰0.05g/L；半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。调节pH值至6.5(25℃)，121℃灭菌15min。BX-245最佳发酵条件为：培养温度38℃、接种量5％、恒控pH6.0；在此优化条件下，活菌数可达(3.25±0.31)×1010CFU/mL。
进一步通过单因素实验和正交实验优化动物双歧杆菌乳亚种BX-245菌粉制剂制备过程中保护剂配方和真空低温喷雾干燥工艺，以期获得高存活率的菌粉。最佳复配保护剂配方：海藻糖为8％，乳清蛋白为11％、谷氨酸钠8％。动物双歧杆菌乳亚种BX-245真空低温喷雾干燥的最佳工艺条件为：进风温度78℃，进料速度8mL/min，喷头直径为1.5mm。在最优配方和最佳干燥工艺条件下生产的BX-245菌粉的活菌数为(8.02±0.31)×1010CFU/g，存活率为75.33％，且其结构完整，菌体细胞膜的完整性良好。
采用动态体外仿生消化系统(DHSI-IV，晓东宜健苏州仪器设备有限公司)比较分析不同的动物双歧杆菌乳亚种制剂在不同消化时间段的存活率，实验采用的SGF(胃消化液)和SIF(肠消化液)均为仪器配套试剂，以BB12和Probio-M8为对照，调整所有菌粉的初始活菌数1×109CFU/g，进样体积为50g，胃液分泌速率为，时间：0-1min，段速：20mL/min；1-10min：1.2mL/min；10-20min：1.6mL/min：20-30min：1.8mL/min；30-40min：2.2mL/min；40-50min：1.8mL/min；50-60min：1.6mL/min；60-120min：1.3mL/min，肠液分泌速率为：时间：1-120min；段速：1.6mL/min。体外测试时间设置为120min，每个样品共取样四次，每次准确取样4mL，活菌计数后计算不同菌种的存活率。由表6可知，动态体外仿生消化模拟初期，各菌株的存活率差异不明显，可能是初期保护剂等载体对益生菌具有一定的保护作用；胃液120min、肠液60min和120min时BX-245存活率显著高于其他菌株。表明动物双歧杆菌乳亚种BX-245制剂具有较强的胃肠液耐受能力。
表6动态体外仿生动物双歧杆菌乳亚种存活率
实施例3：动物双歧杆菌乳亚种BX-245在发酵乳的应用
发酵乳因营养丰富、风味独特而广受消费者的青睐。发酵乳作为益生菌的重要载体，不仅含有大量益生菌，还含有多种生物活性代谢物，兼具益生菌和发酵乳的双重功能的益生菌发酵乳，已被证实具有诸多益生功能，因此具有广泛的市场需求。
将商业化市售纯牛奶(93.5％)预热升温至65℃，添加6.5％白砂糖进行化料15min，20mbar均质，95℃、5min灭菌，迅速冷却，接种市售发酵剂(购于科汉森(中国)有限公司，YF-L922，含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)和益生菌动物双歧杆菌乳亚种BX-245(5×106CFU/mL)，搅拌均匀并分装，放置37℃水浴回温10min，放置37℃厌氧发酵至pH 4.4～4.5即发酵结束，发酵期间采用微流变分析仪(Rheolaser Master型，法国Formu-laction仪器公司)动态监测发酵乳的弹性系数和粘度系数。后熟完成后进行感官评定，每间隔7天测定货架期内酸度和益生菌活菌数变化。采用高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行有机酸和脂肪酸的测定。
发酵期间的弹性因子变化如图5中的A所示，在4h时，BX-245组首先出现了凝胶点，在30min后，对照组才出现拐点，说明添加动物双歧杆菌乳亚种BX-245与商业发酵剂复配可缩短发酵时间，加快凝乳速率。凝胶化结束后，两组乳样弹性因子迅速上升，BX-245与商业发酵剂组发酵至4.5h左右，对照组发酵至5h左右，形成了三维网状结构，各组样品表现出较高的EI值，进入高弹性阶段，凝胶结构更强。发酵期间的粘度系数变化如图5中的B所示，在发酵前至4h期间，两组样品处于同一水平，且粘度系数值最小，此时样品处于低粘度状态，4h时BX-245组开始凝胶化，30min后对照组出现凝胶点，同时两组样品粘度系数值迅速上升，此时酪蛋白胶束开始发生聚集，相互作用后形成三维结构，从而形成稳定的凝胶体系。
贮藏21天内，发酵乳pH值和滴定酸度的变化如图6所示，随着时间的延长，两组发酵乳样品pH值均为下降趋势，对照组和BX-245组在1d时的pH分别为4.41和4.47，至第21d分别降低至4.22和4.30。贮藏期间，对照组的酸度上升很快，明显高于BX-245组，两个组的酸度与pH曲线相吻合。
表7益生菌发酵乳在活菌数的变化
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由表7的测定结果可知，BX-245发酵乳在贮藏期间活菌数缓慢减少，21天时活菌数为1.63×108CFU/g，满足益生菌发酵乳的活菌数要求。
表8感官评定得分表
由表8结果表明，本发明动物双歧杆菌乳亚种BX-245添加后发酵乳具有明显发酵乳的香气，质地均匀，表面光滑，在贮藏中后期酸甜适中，没有乳清析出，发酵乳粘稠度适中，色泽呈现乳白色。
通过对2组发酵乳中的常见的45种代谢物进行靶向检测(表9)，其中包括短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物等功能活性物在添加动物双歧杆菌乳亚种BX-245发酵乳中显著高于对照组，特别是亚油酸、α-亚麻酸、花生酸、双高-γ-亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸(DHA)等不饱和脂肪酸含量显著增加，因此动物双歧杆菌乳亚种BX-245能够改善发酵乳品质，其中，改善发酵乳品质包括提高发酵乳中活性成分含量。
表9发酵乳中代谢产物含量
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添加动物双歧杆菌乳亚种BX-245后缩短发酵时间，感官得分较高，滋气味口感较好，本发明动物双歧杆菌乳亚种BX-245可应用在益生菌发酵乳产品中，具有潜在改善心脑血管的作用。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一株动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)BX-245，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCCNo.26973。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中动物双歧杆菌乳亚种BX-245的有效活菌数≥1×106CFU/mL。
4.权利要求2或3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245接种于培养基，于厌氧条件下进行培养，得到菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养基包括RCM培养基或者TPY培养基。
6.权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245或者权利要求2或3所述的菌剂或者权利要求4或5所述的制备方法制备得到的菌剂在制备益生菌乳制品和/或改善益生菌乳制品的品质中的应用；
所述改善益生菌乳制品的品质包括提高发酵乳中活性成分含量；所述活性成分包括短链脂肪酸、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、哚吲类代谢物、黄酮类化合物、葡萄糖衍生物、糖类化合物及其衍生物、鸟苷、异丁酮、生物胺类代谢物和脑肠轴调节物质中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述益生菌乳制品包括发酵乳或发酵乳饮料。
8.一种发酵乳，其特征在于，含有权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245。
9.权利要求8所述的发酵乳的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在奶原料中接种发酵剂和权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BX-245得到发酵料，对所述发酵料进行厌氧发酵，得到发酵乳。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述厌氧发酵的结束时间为厌氧发酵至物料的pH值为4.4～4.5时发酵结束。
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