CN111484957A - 动物双歧杆菌乳亚种i797、其分离纯化方法及应用 - Google Patents

动物双歧杆菌乳亚种i797、其分离纯化方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种动物双歧杆菌乳亚种i797，其菌株于2019年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18403；本发明还公开了上述动物双歧杆菌乳亚种i797的分离纯化方法及应用。本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种i797能够调节肠道菌群平衡、改善粪便特性，具有更好的模拟消化液存活率；在37℃适于乳酸菌生长的温度较高的保存条件下能够良好的控制后酸。本发明属于生物工程技术领域，提供的动物双歧杆菌乳亚种i797具有调节肠道菌群平衡作用，可用于制作食品、药品或饮品的过程中。

Description

动物双歧杆菌乳亚种i797、其分离纯化方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种菌株、筛选方法及应用，具体地说，是动物双歧杆菌乳亚种i797、其分离纯化方法及应用。
背景技术
双歧杆菌(Bifidobacterium)的首次发现源于HenryTissier在1899年从母乳喂养的婴儿粪便中将其分离出来。双歧杆菌属于革兰氏阳性杆菌，对氧十分敏感，对低PH耐性差，在低PH环境下极易失活；其最适PH 为 6.5～7.0，最适生长温度37～42℃。双歧杆菌广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等生境中，是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一。已经发现，双歧杆菌有32个亚型，含有双歧杆菌的生物制剂多达70种。
双歧杆菌是既不产生内、外毒素，也不产生致病物质和有害气体的益生菌，这对维护机体的健康具有重要意义。双歧杆菌能有效地维持肠道正常菌群平衡，同时在抗腹泻、抗便秘、抗感染、抗肿瘤等方面也有独特的生理功能。双歧杆菌在维持机体肠道微生态平衡、抑制致病菌入侵和定植、调节机体免疫能力、降低胆固醇含量等机体健康方面发挥重要作用，因此拥有广泛的应用前景。此外，双歧杆菌在生长过程中产生的维生素、氨基酸类营养物质能改善牛奶的营养价值，因此在牛奶生产中被广泛应用。
新生儿出生后数小时，双歧杆菌便可在肠道中定植。双歧杆菌分布在胃肠的数量随年龄阶段的增长而减少，分布最多的是母乳营养儿。婴儿双歧杆菌占总肠道菌的百分之六十，60岁以上老人双歧杆菌只占百分之七点九，而产气荚梭菌、大肠杆菌等腐败细菌大量增加；到了老年肠道内充满腐败细菌，双歧杆菌几乎消失。研究表明，维持益生菌功能的最低活菌浓度应高于107cfu/m L。
因此，维持肠道内，双歧杆菌的数量对保持人体健康至关重要。对双岐杆菌在调节肠道菌群机理方面的研究有助于其产业化应用，如目前我国已有投入工业化使用的双歧杆菌菌种，以用于治疗腹泻、功能性便秘等因肠道菌群混乱引起的一类疾病，并起到显著效果。同时，有医学研究表明，如果长期使用人工合成的益生菌，可能发生肠道逐步丧失自身繁殖益生菌能力的现象，使人体肠道对人工益生菌产生依赖性，出现“益生菌依赖症”。
于是近年来人们对有关双歧杆菌调节肠道菌群机理方面的研究主要集中于其定植、特异性结合和所产代谢产物方面。不过如何充分发挥其调节肠道菌群功能还需进行深入研究，这就涉及到菌种的选育和培养问题。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种动物双歧杆菌乳亚种i797，它是从母乳喂养的婴儿或幼儿粪便中分离筛选出来的，该菌株能够调节肠道菌群平衡，促进身体健康；
本发明的另外一个目的，是要提供上述动物双歧杆菌乳亚种i797的分离纯化方法；
本发明还有一个目的，是要提供上述动物双歧杆菌乳亚种i797的应用。
本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：
一种动物双歧杆菌乳亚种i797，所述动物双歧杆菌乳亚种i797的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年8月20日，保藏编号为CGMCC NO.18403，拉丁文名称是Bifidobacterium animalis subsp. lactis。
作为限定，所述动物双歧杆菌乳亚种i797是从婴幼儿肠道菌群中筛选出来的。
作为第二种限定，其16SrRNA序列如下：
ACGGCTCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACTGCATGTGTAAG。
作为第三种限定，其tuf基因序列如下：
GGATCTCGATGAGAGCAGCGTGGTATCACCATCAACATTGCCCACATCGAGTACCAGACGGCCAAGCGTCACTACGCCCACGTCGACTGCCCGGGCCACGCCGACTTCGTGAAGAACATGATCACCGGCGCTGCCCAGATGGATGGCGCCATCCTCGTTGTGGCCGCCACCGACGGCCCGATGGCCCAGACCCGCGAGCACGTGCTGCTCGCCCGTCAGGTCGGCGTCCCGAAGATCCTCGTCGCTCTGAACAAGTGCGATATGGTCGATGACGAAGAGCTCATCGAGCTCGTCGAAGAAGAGGTCCGCGACCTCCTCGACGAGAACGGCTTCGACCGCGACTGCCCGGTCGTGCACACCTCCGCTTACGGCGCTCTGCATGACGACGCTCCCGGATCACGACAAGTGGGTTGCCACCATCAAGGAGCTCATGGACGACGTCGACGAGTACATCCCGACCCCGGTCCACGACCTCGACAAGCCGTTCCTGATGCCGATCGAGGACGTCTTCACCATCTCCGGCCGTGGCACCGTCGTCACCGGTCGTGTCGAGCGCGGCAAGCTGCCGATCAACACGAACGTCGAGATCGTCGGCATCCGCCCGACCCAGACCACCACCGTCACCTCCATCGAGACCTTCCACAAGCAGATGGATGAGTGCGAGGCCGGCGACAACACCGGTCTGCTGCTCCGCGGCATCAACCGCACCGACGTCGAGCGTGGCCAGGTCGTGGCTGCTCCGGGTTCGGTCACCCCGCACACCAAGTTCGAAGGCGAAGTCTACGTCCTTACCAAGGATGAGGGCGGCCGTCACTCGCCGTTCTTCTCGAACTACCGTCCGCAGTTCTACTTCCGCACCACCGACGTCACCGGCGTCATCACGCTGCCGGAAGGCGTCGAGATGGTTCAGCCTGGCGATCACGCGACCTTCACGGTTGAGCTGATCCAGCCGATCGCTATGGAAGAGGGCTTCACCTTCCCAGTGCTTGAAGGC。
本发明还提供了上述动物双歧杆菌乳亚种i797的分离纯化方法，按照以下步骤顺序进行：
一、采集样品
取婴儿或幼儿肠道粪便，然后加入到生理盐水中并充分混匀，得到样品A；
二、样品富集
取样品A，加入到改良MRS液体培养基中， 于35～40℃条件下厌氧培养62～82h，得到培养液B；
所述改良MRS液体培养基是添加有0.5‰质量份数半胱氨酸的MRS液体培养基；
样品A与所述改良MRS液体培养基的体积比为1:10～100；
三、菌株分离筛选
取培养液B，用浓度为0.9%的无菌生理盐水以10倍梯度倍增稀释，依次为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，对应得到菌悬液C1～C5；
取改良MRS固体培养基，融化后，分别倒入第一～第五培养皿种，待冷却、完全凝固后，得培养基D1～ D5，分别吸取菌悬液C1～C5各0.1mL并一一对应涂布到培养基D1～D5上，然后倒置平板，置于35～40℃环境下厌氧培养62～82h，观察菌落生长情况；
所述改良MRS固体培养基为每1000mL改良MRS液体培养基中添加15%质量份数的琼脂所得固体培养基；
待平板出现典型菌落后，挑选出相应的单菌落E；
四、菌株纯化
挑取选中的单菌落E，将单菌落E培养物划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得单菌落F；
将单菌落F继续划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得单菌落G；
再将单菌落G继续划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得纯培养物H，即为所述动物双歧杆菌乳亚种i797的菌株。
作为限定，所述动物双歧杆菌乳亚种i797菌株的保存方法如下：将纯培养物H与无菌的质量份数为50%的甘油按照1:1的比例混合，置于菌种保存管内，混匀后在-80～-70℃环境下保存，同时接种改良MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。
作为第二种限定，所述改良MRS液体培养基的组成成分包括：酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、半胱氨酸、蒸馏水；
其中酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、半胱氨酸、蒸馏水的用量比例关系为10g：10g：5g：20g：5g：2g：1g：2g：0.2g：0.05g：0.5g：1000mL。
本发明进一步提供了上述动物双歧杆菌乳亚种i797的应用，其用于制备饮品、食品或药品中的用途。
作为限定，所述饮品是饮料或发酵乳制饮品；
所述食品是谷类食物、谷类食物衍生物、发酵肉制品、益生菌或奶制食品；
所述药品的剂型是胶囊、片剂、丸剂或粉末。
作为进一步限定，所述益生菌是复合益生菌。
本发明由于采用了上述的技术方案，其与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
（1）本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种i797具有很好的调节肠道作用，能够调节肠道菌群平衡，改善粪便特性；
（2）实验表明，本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种i797 与双歧杆菌BB-12相比具有更好的模拟消化液存活率，存活率达到7.4%，明显优于BB-12，，因此可以更好地发挥其益生作用；
（3）本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种i797在37℃适于乳酸菌生长的温度较高的保存条件下能够良好的控制后酸；
（4）本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种i797应用范围广，不仅可以用于制备发酵乳制品，还可以用于其它益生菌制品。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种i797适用于调节肠道、平衡肠道菌群、改善粪便特性。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 一种动物双歧杆菌乳亚种i797
本实施例提供了一种动物双歧杆菌乳亚种i797，该菌从母乳喂养的婴儿或幼儿粪便中分离筛选出来的，其菌株于2019年08月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18403，拉丁文名称是Bifidobacterium animalis subsp. lactis。
上述动物双歧杆菌乳亚种i797菌株的16SrRNA序列如下：
ACGGCTCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACTGCATGTGTAAG。
其tuf基因序列如下：
GGATCTCGATGAGAGCAGCGTGGTATCACCATCAACATTGCCCACATCGAGTACCAGACGGCCAAGCGTCACTACGCCCACGTCGACTGCCCGGGCCACGCCGACTTCGTGAAGAACATGATCACCGGCGCTGCCCAGATGGATGGCGCCATCCTCGTTGTGGCCGCCACCGACGGCCCGATGGCCCAGACCCGCGAGCACGTGCTGCTCGCCCGTCAGGTCGGCGTCCCGAAGATCCTCGTCGCTCTGAACAAGTGCGATATGGTCGATGACGAAGAGCTCATCGAGCTCGTCGAAGAAGAGGTCCGCGACCTCCTCGACGAGAACGGCTTCGACCGCGACTGCCCGGTCGTGCACACCTCCGCTTACGGCGCTCTGCATGACGACGCTCCCGGATCACGACAAGTGGGTTGCCACCATCAAGGAGCTCATGGACGACGTCGACGAGTACATCCCGACCCCGGTCCACGACCTCGACAAGCCGTTCCTGATGCCGATCGAGGACGTCTTCACCATCTCCGGCCGTGGCACCGTCGTCACCGGTCGTGTCGAGCGCGGCAAGCTGCCGATCAACACGAACGTCGAGATCGTCGGCATCCGCCCGACCCAGACCACCACCGTCACCTCCATCGAGACCTTCCACAAGCAGATGGATGAGTGCGAGGCCGGCGACAACACCGGTCTGCTGCTCCGCGGCATCAACCGCACCGACGTCGAGCGTGGCCAGGTCGTGGCTGCTCCGGGTTCGGTCACCCCGCACACCAAGTTCGAAGGCGAAGTCTACGTCCTTACCAAGGATGAGGGCGGCCGTCACTCGCCGTTCTTCTCGAACTACCGTCCGCAGTTCTACTTCCGCACCACCGACGTCACCGGCGTCATCACGCTGCCGGAAGGCGTCGAGATGGTTCAGCCTGGCGATCACGCGACCTTCACGGTTGAGCTGATCCAGCCGATCGCTATGGAAGAGGGCTTCACCTTCCCAGTGCTTGAAGGC。
实施例2 一种动物双歧杆菌乳亚种i797的分离纯化方法
本实施例提供了实施例1的分离纯化方法，该方法按照以下步骤顺序进行：
一、采集样品
取1g婴儿或幼儿肠道粪便，然后加入到9ml生理盐水中并充分混匀，得到样品A；
二、样品富集
取V1=2ml样品A，加入到V2=100mL改良MRS液体培养基中，于T1=37℃条件下厌氧培养t1=72h，得到培养液B；
三、菌株分离筛选
取1ml培养液B1，用浓度为0.9%的无菌生理盐水以10倍梯度倍增稀释，依次为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，对应得到菌悬液C11～C15；
取改良MRS固体培养基，融化后，分别倒入第一～第五培养皿种，待冷却、完全凝固后，得培养基D1～ D5，分别吸取菌悬液C1～C5各0.1mL并一一对应涂布到培养基D1～D5上，然后倒置平板，置于T2=37℃环境下厌氧培养t2=72h，观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，根据标准双歧杆菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的单菌落E；
四、菌株纯化
挑取选中的单菌落E，将单菌落E培养物划线接种到改良MRS固体培养基上，T3=37℃环境下厌氧环境培养t3=72h，得单菌落F；
将单菌落F继续划线接种到改良MRS固体培养基上，T4=37℃环境下厌氧环境培养t4=72h，得单菌落G；
再将单菌落G继续划线接种到改良MRS固体培养基上，T5=37℃环境下厌氧环境培养t5=72h，得纯培养物H，即为所述动物双歧杆菌乳亚种i797的菌株；
五、保存
将纯培养物H与无菌的质量份数为50%的甘油按照1:1比例混合，置于菌种保存管内，混匀后在T6=-70℃环境下保存，同时接种改良MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。
本实施例中，改良MRS液体培养基原料包括：酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、半胱氨酸、蒸馏水；其中酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、半胱氨酸、蒸馏水的用量比例关系为10g：10g：5g：20g：5g：2g：1g：2g：0.2g：0.05g：0.5g：1000mL；改良MRS固体培养基为每1000mL改良MRS液体培养基中添加15%质量份数的琼脂。
实施例3-6 一种动物双歧杆菌乳亚种i797的分离纯化方法
实施例3-6分别为实施例1的分离纯化方法，与实施例2的方法基本相同，不同之处在于分离纯化过程的技术参数不同，具体参数如表1所示：
表1 实施例3-6分离纯化过程及参数
Figure 825970DEST_PATH_IMAGE001
实施例7 动物双歧杆菌乳亚种i797菌种的细菌学基本特征
本实施例为实施例1中动物双歧杆菌乳亚种i797的细菌学基本特征，其基本特征如表2所示：
表2 动物双歧杆菌乳亚种i797的基本特征
Figure 336586DEST_PATH_IMAGE002
实施例8 动物双歧杆菌乳亚种i797菌种的糖发酵特性
本实施例为实施例1中动物双歧杆菌乳亚种i797菌种的糖发酵特性。其糖发酵特性的实验方法为：将实施例3的分离纯化方法得到的动物双歧杆菌乳亚种i797菌株挑取单菌落接种至灭菌的改良MRS液体培养基内，于37℃条件下培养24h，取菌悬液接种至糖发酵管中，于37℃条件下厌氧培养48h，观察颜色变化。其糖发酵特性的鉴定结果如表3所示：
表3 动物双歧杆菌乳亚种i797糖发酵特性的鉴定结果
Figure 444219DEST_PATH_IMAGE003
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
本实施例采用的改良MRS液体培养基与实施例2的改良MRS液体培养基成分相同。
实施例9 动物双歧杆菌乳亚种i797的菌种的分子生物学鉴定
将采用实施例5的分离纯化方法得到的动物双歧杆菌乳亚种i797菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增、16SrRNA测序，NCBI网站blast最终确定为动物双歧杆菌乳亚种。
其16SrRNA测序结果如下：
ACGGCTCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACTGCATGTGTAAG。
其tuf基因测序结果如下：
GGATCTCGATGAGAGCAGCGTGGTATCACCATCAACATTGCCCACATCGAGTACCAGACGGCCAAGCGTCACTACGCCCACGTCGACTGCCCGGGCCACGCCGACTTCGTGAAGAACATGATCACCGGCGCTGCCCAGATGGATGGCGCCATCCTCGTTGTGGCCGCCACCGACGGCCCGATGGCCCAGACCCGCGAGCACGTGCTGCTCGCCCGTCAGGTCGGCGTCCCGAAGATCCTCGTCGCTCTGAACAAGTGCGATATGGTCGATGACGAAGAGCTCATCGAGCTCGTCGAAGAAGAGGTCCGCGACCTCCTCGACGAGAACGGCTTCGACCGCGACTGCCCGGTCGTGCACACCTCCGCTTACGGCGCTCTGCATGACGACGCTCCCGGATCACGACAAGTGGGTTGCCACCATCAAGGAGCTCATGGACGACGTCGACGAGTACATCCCGACCCCGGTCCACGACCTCGACAAGCCGTTCCTGATGCCGATCGAGGACGTCTTCACCATCTCCGGCCGTGGCACCGTCGTCACCGGTCGTGTCGAGCGCGGCAAGCTGCCGATCAACACGAACGTCGAGATCGTCGGCATCCGCCCGACCCAGACCACCACCGTCACCTCCATCGAGACCTTCCACAAGCAGATGGATGAGTGCGAGGCCGGCGACAACACCGGTCTGCTGCTCCGCGGCATCAACCGCACCGACGTCGAGCGTGGCCAGGTCGTGGCTGCTCCGGGTTCGGTCACCCCGCACACCAAGTTCGAAGGCGAAGTCTACGTCCTTACCAAGGATGAGGGCGGCCGTCACTCGCCGTTCTTCTCGAACTACCGTCCGCAGTTCTACTTCCGCACCACCGACGTCACCGGCGTCATCACGCTGCCGGAAGGCGTCGAGATGGTTCAGCCTGGCGATCACGCGACCTTCACGGTTGAGCTGATCCAGCCGATCGCTATGGAAGAGGGCTTCACCTTCCCAGTGCTTGAAGGC。
实施例10 动物双歧杆菌乳亚种i797菌种的胃酸及肠液耐受特性
将待测动物双歧杆菌乳亚种i797菌株活化3代后取1mL，分别置于含9 mL过滤除菌处理的pH值为3.0的人工胃液中，震荡均匀并在37 ℃条件下厌氧培养，在开始培养和培养2 h时分别取样，测定其活菌数。然后取在pH值3.0的人工胃液中消化2 h后的培养液1 mL，分别接种于9 mL过滤除菌的pH值为8.0的人工肠液中，继续置37 ℃下培养，并分别在0h，4 h，6h时测定活菌数。
以双歧杆菌BB-12作为标准菌株进行对照实验，实验参数与上述动物双歧杆菌乳亚种i797菌株的实验参数相同。
存活率（%）= （ cfu N1/cfu N0）×100%
式中，N1—经人工消化液处理6 h的活菌数，N0—经人工消化液处理0 h的活菌数。
b.肠液：Bile Salts （Difco）0.9 g/100 mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。
表4 动物双歧杆菌乳亚种i797模拟胃液肠液耐受结果
Figure 668789DEST_PATH_IMAGE004
经过实验发现，BB-12胃酸耐受能力较强，对肠液耐受较差，而动物双歧杆菌乳亚种i797对胃酸耐受较差、对肠液耐受能力较强。综合比较动物双歧杆菌乳亚种i797具有更好的模拟消化液存活率，达到7.4%优于BB-12。
实施例11 动物双歧杆菌乳亚种i797菌种的调节肠道情况研究
将含有动物双歧杆菌乳亚种i797菌种的饮品给试验人员饮用，对10名试验人员的饮用结果进行统计。
统计结果如表5所示：
表5 试饮动物双歧杆菌乳亚种i797后各指标差异分析
Figure 483161DEST_PATH_IMAGE005
备注：显著性变化（有统计意义P<0.05）即为有差异。
统计过程中：
（1）通过差异分析发现排便次数、排便困难程度、粪便硬度、粪便形状存在显著性差异；
（2）通过饮用者的交谈发现，饮用后粪便的次数增多、粪便颜色变黄、粪便变软指标变化明显。
从表5可以发现，在所有指标中，有四个指标（排便次数、排便困难程度、粪便硬度、粪便形状）出现了显著性变化（有统计意义P<0.05），说明动物双歧杆菌乳亚种i797对肠道有调节作用。
实施例12 动物双歧杆菌乳亚种i797的菌种的后酸情况分析
取鲜牛奶97-98份、白砂糖2-3份，将二者混合调配均匀后，于65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至37℃，得灭菌牛乳，接种动物双歧杆菌乳亚种i797至灭菌牛乳中，接种量为灭菌牛乳质量的3%，然后于36℃条件下进行发酵，检测其pH变化情况。
以标准菌株双歧杆菌BB-12作为对照菌株进行对照实验，试验参数与上述动物双歧杆菌乳亚种i797菌株的实验参数相同。
产酸情况分析结果如表6所示。
表6动物双歧杆菌乳亚种i797酸度变化情况
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE006
从表6可以看出，动物双歧杆菌乳亚种i797在37℃适于乳酸菌生长的较高保存条件下能够良好的控制后酸。
实施例13 动物双歧杆菌乳亚种i797的菌种的应用
本实施例提供了实施例1的应用，其可以用于制备饮品、食品或药品。如可以用于制备具有肠道调节功能的谷类食物及其衍生物、发酵肉制品、益生菌、配方奶粉；还可以用于制备具有肠道调节功能的饮料、发酵酸奶；也可以用于制备具有肠道调节功能的药品，制成胶囊、粉末、药丸、口服液或者喷雾均可。
实施例14 动物双歧杆菌乳亚种i797的菌种的应用
实施例13中的益生菌可以是只包含动物双歧杆菌乳亚种i797的益生菌；还可以是由动物双歧杆菌乳亚种i797、副干酪乳杆菌N1115、植物乳杆菌N3117、嗜热链球菌JMCC0003混合制备而成复合益生菌，该复合益生菌的剂型可以是复合益生菌微胶囊粉。
序列表
<110> 石家庄君乐宝乳业有限公司
<120> 动物双歧杆菌乳亚种i797、其分离纯化方法及应用
<130> 2020.04.02
<150> 2019112632931
<151> 2019-12-11
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1411
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis subsp lactis
<400> 1
acggctcccc cacaagggtc gggccaccgg cttcgggtgc tacccacttt catgacttga 60
cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgca ttcaccgcgg cgttgctgat ccgcgattac 120
tagcgactcc gccttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaccggtttt 180
cagcgatccg ccccacgtca ccgtgtcgca ccgcgttgta ccggccattg tagcatgcgt 240
gaagccctgg acgtaagggg catgatgatc tgacgtcatc cccaccttcc tccgagttga 300
ccccggcggt cccacatgag ttcccggcat cacccgctgg caacatgcgg cgagggttgc 360
gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacgac catgcaccac 420
ctgtgaaccg gccccgaagg gaaaccgtgt ctccacggcg atccggcaca tgtcaagccc 480
aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta atccgcatgc tccgccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattt ctttgagttt tagccttgcg gccgtactcc ccaggcggga tgcttaacgc 600
gttggctccg acacgggacc cgtggaaagg gccccacatc cagcatccac cgtttacggc 660
gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct cagcgtcagt 720
gacggcccag agacctgcct tcgccattgg tgttcttccc gatatctaca cattccaccg 780
ttacaccggg aattccagtc tcccctaccg cactccagcc cgcccgtacc cggcgcagat 840
ccaccgttag gcgatggact ttcacaccgg acgcgacgaa ccgcctacga gccctttacg 900
cccaataaat ccggataacg ctcgcaccct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960
agccggtgct tattcgaaca atccactcaa cacggccgaa accgtgcctt gcccttgaac 1020
aaaagcggtt tacaacccga aggcctccat cccgcacgcg gcgtcgctgc atcaggcttg 1080
cgcccattgt gcaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtatctcagt 1140
cccaatgtgg ccggtcaccc tctcaggccg gctacccgtc aacgccttgg tgggccatca 1200
ccccgccaac aagctgatag gacgcgaccc catcccatgc cgcaaaagca tttcccaccc 1260
caccatgcga tggagcggag catccggtat taccacccgt ttccaggagc tattccggtg 1320
cacagggcag gttggtcacg cattactcac ccgttcgcca ctctcacccg acagcaagct 1380
gccagggatc ccgttcgact gcatgtgtaa g 1411
<210> 2
<211> 994
<212> DNA
<213> Bifidobacterium animalis subsp lactis
<400> 2
ggatctcgat gagagcagcg tggtatcacc atcaacattg cccacatcga gtaccagacg 60
gccaagcgtc actacgccca cgtcgactgc ccgggccacg ccgacttcgt gaagaacatg 120
atcaccggcg ctgcccagat ggatggcgcc atcctcgttg tggccgccac cgacggcccg 180
atggcccaga cccgcgagca cgtgctgctc gcccgtcagg tcggcgtccc gaagatcctc 240
gtcgctctga acaagtgcga tatggtcgat gacgaagagc tcatcgagct cgtcgaagaa 300
gaggtccgcg acctcctcga cgagaacggc ttcgaccgcg actgcccggt cgtgcacacc 360
tccgcttacg gcgctctgca tgacgacgct cccggatcac gacaagtggg ttgccaccat 420
caaggagctc atggacgacg tcgacgagta catcccgacc ccggtccacg acctcgacaa 480
gccgttcctg atgccgatcg aggacgtctt caccatctcc ggccgtggca ccgtcgtcac 540
cggtcgtgtc gagcgcggca agctgccgat caacacgaac gtcgagatcg tcggcatccg 600
cccgacccag accaccaccg tcacctccat cgagaccttc cacaagcaga tggatgagtg 660
cgaggccggc gacaacaccg gtctgctgct ccgcggcatc aaccgcaccg acgtcgagcg 720
tggccaggtc gtggctgctc cgggttcggt caccccgcac accaagttcg aaggcgaagt 780
ctacgtcctt accaaggatg agggcggccg tcactcgccg ttcttctcga actaccgtcc 840
gcagttctac ttccgcacca ccgacgtcac cggcgtcatc acgctgccgg aaggcgtcga 900
gatggttcag cctggcgatc acgcgacctt cacggttgag ctgatccagc cgatcgctat 960
ggaagagggc ttcaccttcc cagtgcttga aggc 994

Claims (10)

1.一种动物双歧杆菌乳亚种i797，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种i797的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年8月20日，保藏编号为CGMCC NO.18403，拉丁文名称是Bifidobacterium animalis subsp. lactis。
2.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种i797，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种i797是从婴儿或幼儿肠道菌群中筛选出来的。
3.根据权利要求1或2所述的动物双歧杆菌乳亚种i797，其特征在于，其16SrRNA序列如下：
ACGGCTCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACTGCATGTGTAAG。
4.根据权利要求1或2所述的动物双歧杆菌乳亚种i797，其特征在于，其tuf基因序列如下：
GGATCTCGATGAGAGCAGCGTGGTATCACCATCAACATTGCCCACATCGAGTACCAGACGGCCAAGCGTCACTACGCCCACGTCGACTGCCCGGGCCACGCCGACTTCGTGAAGAACATGATCACCGGCGCTGCCCAGATGGATGGCGCCATCCTCGTTGTGGCCGCCACCGACGGCCCGATGGCCCAGACCCGCGAGCACGTGCTGCTCGCCCGTCAGGTCGGCGTCCCGAAGATCCTCGTCGCTCTGAACAAGTGCGATATGGTCGATGACGAAGAGCTCATCGAGCTCGTCGAAGAAGAGGTCCGCGACCTCCTCGACGAGAACGGCTTCGACCGCGACTGCCCGGTCGTGCACACCTCCGCTTACGGCGCTCTGCATGACGACGCTCCCGGATCACGACAAGTGGGTTGCCACCATCAAGGAGCTCATGGACGACGTCGACGAGTACATCCCGACCCCGGTCCACGACCTCGACAAGCCGTTCCTGATGCCGATCGAGGACGTCTTCACCATCTCCGGCCGTGGCACCGTCGTCACCGGTCGTGTCGAGCGCGGCAAGCTGCCGATCAACACGAACGTCGAGATCGTCGGCATCCGCCCGACCCAGACCACCACCGTCACCTCCATCGAGACCTTCCACAAGCAGATGGATGAGTGCGAGGCCGGCGACAACACCGGTCTGCTGCTCCGCGGCATCAACCGCACCGACGTCGAGCGTGGCCAGGTCGTGGCTGCTCCGGGTTCGGTCACCCCGCACACCAAGTTCGAAGGCGAAGTCTACGTCCTTACCAAGGATGAGGGCGGCCGTCACTCGCCGTTCTTCTCGAACTACCGTCCGCAGTTCTACTTCCGCACCACCGACGTCACCGGCGTCATCACGCTGCCGGAAGGCGTCGAGATGGTTCAGCCTGGCGATCACGCGACCTTCACGGTTGAGCTGATCCAGCCGATCGCTATGGAAGAGGGCTTCACCTTCCCAGTGCTTGAAGGC。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的动物双歧杆菌乳亚种i797的一种分离纯化方法，其特征在于，按照以下步骤顺序进行：
一、采集样品
取婴儿或幼儿肠道粪便，然后加入到生理盐水中并充分混匀，得到样品A；
二、样品富集
取样品A，加入到改良MRS液体培养基中， 于35～40℃条件下厌氧培养62～82h，得到培养液B；
所述改良MRS液体培养基是添加有0.5‰质量份数半胱氨酸的MRS液体培养基；
样品A与所述改良MRS液体培养基的体积比为1:10～100；
三、菌株分离筛选
取培养液B，用浓度为0.9%的无菌生理盐水以10倍梯度倍增稀释，依次为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，对应得到菌悬液C1～C5；
取改良MRS固体培养基，融化后，分别倒入第一～第五培养皿种，待冷却、完全凝固后，得培养基D1～ D5，分别吸取菌悬液C1～C5各0.1mL并一一对应涂布到培养基D1～D5上，然后倒置平板，置于35～40℃环境下厌氧培养62～82h，观察菌落生长情况；
所述改良MRS固体培养基为每1000mL改良MRS液体培养基中添加15%质量份数的琼脂所得固体培养基；
待平板出现典型菌落后，挑选出相应的单菌落E；
四、菌株纯化
挑取选中的单菌落E，将单菌落E培养物划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得单菌落F；
将单菌落F继续划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得单菌落G；
再将单菌落G继续划线接种到改良MRS固体培养基上，35～40℃环境下厌氧环境培养62～82h，得纯培养物H，即为所述动物双歧杆菌乳亚种i797的菌株。
6.根据权利要求5所述的动物双歧杆菌乳亚种i797的分离纯化方法，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种i797菌株的保存方法如下：将纯培养物H与无菌的质量份数为50%的甘油按照1:1的比例混合，置于菌种保存管内，混匀后在-80～-70℃环境下保存，同时接种改良MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。
7.根据权利要求4或5所述的动物双歧杆菌乳亚种i797的分离纯化方法，其特征在于，所述改良MRS液体培养基的组成成分包括：酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、半胱氨酸、蒸馏水；
其中酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、半胱氨酸、蒸馏水的用量比例关系为10g：10g：5g：20g：5g：2g：1g：2g：0.2g：0.05g：0.5g：1000mL。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的动物双歧杆菌乳亚种i797的应用，其特征在于，用于制备饮品、食品或药品中的用途。
9.根据权利要求8所述的动物双歧杆菌乳亚种i797的应用，其特征在于，所述饮品是饮料或发酵乳制饮品；
所述食品是谷类食物、谷类食物衍生物、发酵肉制品、益生菌或奶制食品；
所述药品的剂型是胶囊、片剂、丸剂或粉末。
10.根据权利要求9所述的动物双歧杆菌乳亚种i797的应用，其特征在于，所述益生菌是复合益生菌。
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