CN101260377B - 一种动物双歧杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种菌类，更具体地涉及一种具有免疫刺激功能及调节肠道微生物菌群功能的动物双歧杆菌。属于微生物制品的技术领域。动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)的保藏号为：CGMCCNo.1904，保藏日期2006年12月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明产品来源健康人群肠道，对酸、胆盐、人工模拟消化液具有良好抗性，对肠道上皮细胞具有黏附能力，具有免疫刺激及调节肠道微生物菌群功能的双歧杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌类，更具体地涉及一种具有免疫刺激功能及调节肠道微生物菌群功能的动物双歧杆菌。属于微生物制品的技术领域。
背景技术
双歧杆菌是人类最早发现的生理性细菌，是能在健康人肠道内定植的益生菌。母乳喂养的婴儿肠道内该菌占总菌群的92％以上，现在已确认双歧杆菌的数量和品质是人体健康的重要标志之一。国内外研究报道双歧杆菌具有多种生理活性功能，可作为宿主氮的来源之一，同时，具有合成维生素、润肠通便、增强机体的免疫功能、降低胆固醇和甘油三酯、抑癌作用、抗衰老作用等功能。
人体和动物肠道内存在着大量的微生物菌群，菌种种类多，多少不一，这些微生物和宿主相互作用、相互影响，共同维持着肠道微生态的动态平衡。双歧杆菌是定居在肠道中的有益细菌，通过抑制病原菌和腐败菌的生长来维持人体微生态和肠管的平衡状态。许多研究报道，摄入外源的双歧杆菌发酵乳和制剂对正常小鼠的肠道菌群具有改善作用，并且对已失调的肠道菌群具有修复作用。
免疫功能是双歧杆菌发挥其它益生功能的基础。免疫可分为非特异性免疫和特异性免疫两大类，而特异性免疫又包括细胞免疫与体液免疫。许多研究证实双歧杆菌的活菌、死菌、裂解成分、可溶性提取物等均有免疫刺激作用。双歧杆菌菌体抗原及代谢物通过刺激肠粘膜淋巴结，刺激免疫活性细胞，产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，调节机体免疫应答。双歧杆菌具有激活巨噬细胞的β半乳糖苷酸活性，加强和促进其吞噬作用，还可促进淋巴细胞增殖，使NK细胞活性增强，单核巨噬细胞系统的吞噬作用增强，抗体产生细胞活化，各种细胞因子增多，提高机体局部和全身的免疫功能。
有效的益生菌应符合以下几条标准：必须来自于宿主；对宿主健康发挥有益作用；非致病菌且没有毒性作用；在生物学上应当具有活性，即包含大量活菌；可以在宿主肠道内存活及代谢；在储存和使用过程中保持活性。筛选具有优良性能的双歧杆菌菌株，开发益生菌产品将具有广阔的应用前景。本发明涉及的双歧杆菌菌株来源健康人群肠道，通过动物实验证实具有免疫刺激功能及调节肠道微生物菌群功能。
发明内容
本发明的目的是获得一种来源健康人群肠道，对酸、胆盐、人工模拟消化液具有良好抗性，对肠道上皮细胞具有黏附能力，具有免疫刺激及调节肠道微生物菌群功能的双歧杆菌BBMN01(Bifidobacteriumanimalis)。
本发明的另一个目的是本发明产品双歧杆菌BBMN01(Bifidobacteriumanimalis)的用途。
本发明的第一方面，提供了一种双歧杆菌。在另一优选例中，它是动物双歧杆菌BBMN01(Bifidobacteriumanimalis)，保藏号：CGMCCNo.1904。保藏日期2006年12月30日。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地点：中国，北京，中国科学院微生物研究所。
在另一优选例中，所述的动物双歧杆菌对酸、胆盐、人工模拟消化液具有良好抗性。
在另一优选例中，所述的动物双歧杆菌对肠道上皮细胞具有黏附能力。
本发明的第二方面，提供了本发明所述的动物双歧杆菌的用途，它被用于制备组合物，所述的组合物对实验动物具有免疫刺激功能。
在另一优选例中，所述的组合物是食品组合物。
本发明的第三方面，提供了本发明所述的动物双歧杆菌的用途，它被用于制备组合物，所述的组合物对实验动物具有调节肠道菌群功能。
在另一优选例中，所述的组合物是食品组合物。
本发明的第四方面，提供一种食品组合物，它的有效成分是本发明所述的动物双歧杆菌和食品上可接受的载体。在另一优选例中，所述组合物中含有的所述的动物双歧杆菌的绝对数量为1.0×105-1.0×1011CFU/mL。
本发明的动物双歧杆菌对酸、胆盐和人工模拟消化液具有良好的耐受性能。
本发明的动物双歧杆菌对人结肠癌细胞Caco-2具有黏附作用。
本发明的动物双歧杆菌菌株或组合物对试验动物具有调节肠道微生物功能。
本发明的动物双歧杆菌菌株对试验动物具有免疫刺激功能。
一种动物双歧杆菌，其特征在于：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)的保藏号为：CGMCC No.1904，保藏日期2006年12月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
上述动物双歧杆菌在培养基上制备得到的纯培养物。
上述的培养基为牛奶。
上述的培养基中还包括糖和稳定剂，其中，牛奶、糖、稳定剂和所述的动物双歧杆菌的添加方式为：50-10克糖，3-8克稳定剂(常规稳定剂即可定剂，冻干菌粉或新鲜培养液1.0×105-1.0×1011CFU/mL，混合后定容到1000毫升。
上述一种牛奶制品的制备方法，其制备的步骤为：1)配料；2)定容；3)均质；4)杀菌；5)冷却后接种发酵；6)测酸后打冷、检测；7)灌装；其中，步骤5)中用如权利要求1所述的菌种。
上述步骤1)中的配料方法如下：50-10克糖，3-8克稳定剂混合后用牛奶定容到1000毫升。
上述步骤5)中以冻干菌粉或新鲜培养液1.0×105-1.0×1011CFU/mL的活性接入到原料混合物，发酵温度为40-42摄氏度。
上述的步骤2)和3)之间还包括步骤2.1)水和20分钟；步骤2.2)60-65摄氏度下预热；步骤2.3)温度：60℃～65℃和压力：-90～-80Kpa下脱气。
上述的步骤6)为将发酵奶全部打入贮罐冷却至20±2℃，搅拌15～100秒后，及时灌装。
上述的方法制备的牛奶发酵制品。
具体实施方式
本发明人经多次筛选和培育，从长寿之乡巴马瑶族自治县的长寿老人粪便中分离得到一株动物双歧杆菌菌株BBMN01(Bifidobacteriumanimalis)，该菌株对酸、胆盐、人工模拟消化液具有良好的耐受性能，对肠道上皮细胞具有黏附能力，经动物实验证明，对试验小鼠具有免疫刺激作用和调节肠道微生物菌群功能。
动物双歧杆菌BBMN01于2006年12月30日，申请中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心菌种保藏号，CGMCCNo.1904。
如文中所用，“本发明双歧杆菌”“本发明动物双歧杆菌”或“本发明微生物”指动物双歧杆菌BBMN01株CGMCCNo.1904。应理解，这些术语还包括衍生自动物双歧杆菌BBMN01菌株，尤其是具有耐酸、耐胆盐及人工模拟消化液，且对肠上皮细胞具有黏附性能，对试验动物具有免疫刺激功能和调节肠道菌群功能等特性的衍生菌株。
动物双歧杆菌BBMN01的基本生物学特性与已知的该种属的典型微生物基本相同，不同点在于本方明微生物具有耐酸、耐胆盐及人工模拟消化液性能，且对肠上皮细胞具有黏附性能，对试验动物具有免疫刺激功能和调节肠道菌群功能。
具体而言，耐酸性能试验证明，本发明的双歧杆菌BBMN01在pH2.0-3.0的酸性溶液中培养2小时，仍存在大量的活菌数。
耐胆盐性能试验证明，本发明的双歧杆菌BBMN01在含0.05-0.1％胆盐浓度的培养液中生长性能良好。能耐受0.3-1.5％胆盐浓度，在1.5％胆盐浓度培养24小时，仍存在大量的活菌数。
体外黏附性能试验证明，本发明的双歧杆菌BBMN01对人结肠癌细胞株Caco-2具有黏附能力，平均黏附数为17±6.5黏附菌数/细胞。
动物试验证明，本发明的双歧杆菌显著提高动物体淋巴细胞的转化能力、巨噬细胞的吞噬活性以及自然杀伤细胞(NK细胞)的活性，能提高动物血清对免疫刺激产生抗体的能力。表明本发明的双歧杆菌BBMN01对动物体具有显著的免疫刺激功能，发挥功能的活菌浓度为108-1010CFU./mL。
动物试验证明，实验动物灌胃本发明的双歧杆菌BBMN01菌株菌悬液后第7d，显著提高肠道中乳杆菌数量，对其他细菌指标无显著影响；实验后第14d，试验动物肠道内双歧杆菌、乳杆菌数量显著增加，肠杆菌数量显著降低，肠球菌和产气荚膜梭菌数量无显著影响。表明本发明的双歧杆菌具有调节肠道微生物功能。
本发明的动物双歧杆菌可作为有效成分，用于提高人体的免疫力和调节肠道菌群。
本发明还提供了一种含有本发明的动物双歧杆菌BBMN01作为有效成分的食品组合物。食品组合物可以为固态(如冻干粉、胶囊、颗粒剂、片剂、含片)或液体(如口服液、饮料)或其他合适的形状。本发明的微生物含量通常为组合物的1-99％，绝对数量为1.0×105-1.0×1011CFU/mL。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1从健康长寿老人粪便分离获得动物双歧杆菌BBMN01
中国广西巴马瑶族自治县是闻名于世的长寿之乡，1991年11月1日，在日本东京召开的国际自然医学会第13次会议上，正式确认为世界第五长寿之乡。巴马瑶族自治县甲篆乡是该县的长寿带，2005年人口普查甲篆乡全乡人口25115人，其中百岁老人21人。本发明人于2006年，以巴马县甲篆乡90岁以上的老人为对象，针对老人的身体健康状况、生活习惯、饮食卫生情况等进行问询，采集身体健康，1年以上不服用药物的健康长寿老人的粪便样品，用灭菌蛋白胨水保存新鲜粪便，4℃冷藏，在4小时之内运送至实验室，完成样品处理和培养。以无菌玻棒将粪便样品捣碎，震荡均匀，取1mL样品溶液，加入9ml灭菌稀释液，按十倍稀释法将样品稀释至10-8，取10-4-10-8稀释度溶液1ml于无菌培养皿中，倒入NPNL双歧杆菌选择性琼脂培养基，充分混匀后冷却凝固，放入厌氧袋中，37℃厌氧培养48-72小时。经多次筛选和培育，得到动物双歧杆菌BBMN01的纯培养物。
动物双歧杆菌BBMN01于2006年12月30日，申请中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心菌种保藏号，CGMCC No.1904。
动物双歧杆菌BBMN01的生理生化特性：
1、形态特征：革兰氏阳性，杆状、多形态，不形成芽孢。
2、生理生化特性：接触酶阴性，氧化酶阴性，果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶阳性，产生乳酸。碳水化合物产酸：
| 葡萄糖 | + | 葡萄糖酸钠 | - | 纤维二糖 | - |
| 木糖 | + | 果糖 | + | 核糖 | + |
| 淀粉 | - | 菊糖 | - | 棉子糖 | + |
| 乳糖 | + | 松三糖 | - | 水杨素 | + |
| 甘露糖 | - | 甘露醇 | - | 麦芽糖 | + |
| 山梨醇 | - | 蜜二糖 | + | 半乳糖 | + |
| 阿拉伯糖 | + | 蔗糖 | + | 海藻糖 | - |
3、16s DNA序列分析，鉴定结果为动物双歧杆菌
实施例2
动物双歧杆菌BBMN01对酸的耐受性
动物双歧杆菌BBMN01用无菌改良MRS培养液37℃厌氧培养18小时。以pH7.4的PBS缓冲液为基础，用37％的盐酸调节pH至2.0和3.0，121℃、15min灭菌。按10％的接种量接入已活化的液体菌种，37℃厌氧培养，分别于0、30min、60min、90min、120min时间点取样测定活菌数。
改良MRS培养液配方：胰蛋白胨10.0g，牛膏粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，K2HPO4 2.0g，乙酸钠3H20 5.0g，柠檬酸二铵2.0g，MgSO4 7H2O 0.58g，MnSO4 4H200.25g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000mL。
表1动物双歧杆菌在不同酸性PBS溶液中的活菌数(CFU/mL)
| 时间(min) | 0 | 30 | 60 | 90 | 120 |
| pH6.8pH3.0pH2.0 | 2.4×1092.4×1092.4×109 | 2.1×1091.7×1091.6×109 | 2.1×1091.5×1082.2×108 | 1.5×1095.3×1081.7×108 | 2.7×1092.2×1082.4×107 |
动物双歧杆菌在不同酸性溶液中活菌数见表1，动物双歧杆菌经酸处理后仍存在大量的活菌数，表明该菌株对酸有良好的耐受性。
实施例3
动物双歧杆菌BBMN01对胆盐的耐受性
动物双歧杆菌BBMN01用灭菌改良MRS培养液37℃厌氧培养18小时。将活化菌株培养物按2％接种量接入含不同胆盐浓度的无菌MRS液体培养基中(胆盐浓度0.05％、0.1％、0.3％、0.5％、1％、1.5％)，同时以不含胆盐的MRS培养基作为对照。在37℃厌氧培养3、6、24h后取样测定活菌数。
表2动物双歧杆菌在不同胆盐浓度中的活菌数(CFU/mL)
| 培养时间 | 0 | 3h | 6h | 24h |
| 00.05％0.1％0.3％0.5％1.0％1.5％ | 2.3×1072.3×1072.3×1072.3×1072.3×1072.3×1072.3×107 | 1.07×1099.0×1084.4×1088.0×1061.1×1064.0×1065.2×106 | 1.3×1091.3×1092.3×1092.0×1074.0×1073.0×1063.1×106 | 1.2×1093.0×1093.0×1086.3×1064.0×1066.0×1052.1×105 |
0.05-0.1％浓度的胆盐对BBMN01菌株的生长没有抑制作用，24小时后菌株在0.05％胆盐培养液中活菌数与对照组在同一数量级，菌株在0.3-1.5％胆盐浓度中生长性能不佳，但均具有一定的耐受性能。小肠正常胆盐浓度在0.03-0.3％，食物通过小肠时间短，可以说，菌株具有较强的抗胆汁酸能力，可以通过小肠达到大肠。
实施例4
动物双歧杆菌BBMN01对人工模拟消化液的耐受性
(a)试验材料
人工胃液：NaCl 0.2g/100mL、胃蛋白酶(pepsin)0.32g/100mL，用浓度为1mol/L的HCl调整pH值为2.0，3.0，过滤除菌备用。
人工肠液：kH2PO4 0.68g/100mL、胰蛋白酶(Trypsin)1g/100mL，pH 7.5
(b)试验方法
动物双歧杆菌BBMN01用灭菌改良MRS培养液37℃厌氧培养18小时。将培养液经离心(4000r/min，10min)收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤2次，将菌体悬浮于5mL灭菌生理盐水中制成菌悬液。1mL菌悬液分别接种于含9mL过滤除菌处理的pH值为2.0，3.0的人工胃液中，37℃厌氧培养，分别于0h、0.5h、1h、1.5h、2h时间点取样，测定活菌数。取不同pH值的人工胃液中消化2h后的培养液0.1mL，分别接种于9.9mL过滤除菌的pH值为7.5的人工肠液中，37℃厌氧培养，并分别在0h，3h和6h测定活菌数。
表3动物双歧杆菌经人工消化液处理后的活菌数(CFU/mL)
| 胃液 | pH2.0 | pH3.0 | |
| 处理时间(h)肠液处理时间(h) | 00.511.52036 | 1.3×1082.04×1082.39×1083.68×1083.8×1073.97×1063×1063.8×106 | 4×1082.6×1082.2×1082.35×1082.82×1084.8×1063.95×1063.07×106 |
BBMN01菌株在不同pH值胃液中耐受性能良好，与前述的耐酸性能试验结果相似。菌株在肠液中培养6小时，菌株活菌数无明显变化。表明菌株对人工胃液酸性条件及消化液中的酶具有良好的耐受性能。
实施例5
动物双歧杆菌BBMN01对人结肠癌细胞的黏附作用
(a)试验材料
细菌：双歧杆菌菌株BBMN01、对照菌株
细胞：人结肠癌细胞系Caco-2细胞购至协和医科大学细胞保藏库。
细胞培养液：DEME培养液，含10％小牛血清，1％非必需氨基酸，0.2％青霉素和链霉素双抗溶液。
PBS溶液：NaCl 8g，KCl 0.2g，NaHPO4。7H2O 1.14g，KH2PO40.24g，加水定容至1000mL。pH7.2。
(b)试验方法
动物双歧杆菌用改良MRS培养基37℃厌氧培养18h，将培养液离心4000r/min，10min，PBS重悬细菌调整菌悬液浓度为1×108CFU/ml。
Caco-2细胞按常规传代培养于DEME培养基，5％CO2、37℃恒温培养。隔3日换液，细胞在培养瓶底部形成单细胞层后，用0.25％胰蛋白酶消化，悬浮成单个细胞后于6孔板培养，孔中加入灭菌的盖玻片，于5％CO2、37℃恒温培养培养3天，细胞黏附于盖玻片并形成单层细胞，各孔用PBS清洗两次后，分别加入配制好的各组菌悬液，37℃温育3h。取出后用PBS洗3次，除去未黏附细菌，盖玻片自然干燥，乙醇固定，革兰染色，镜下(×1000)随机计数50个细胞粘附的细菌数，计算平均数及标准差。
表1菌株对人结肠癌细胞Caco-2的黏附
| 菌株 | 黏附菌数/细胞 |
| BBMN01商业双歧杆菌商业乳酸菌 | 17±6.511±5.54.6±2.8 |
双歧杆菌均有一定的黏附能力，从长寿老人粪便中分离得到的菌株BBMN01对细胞的黏附能力优于其它菌株。
实施例6
动物双歧杆菌BBMN01对实验小鼠的免疫刺激作用
(a)试验材料
实验动物：Balb/c雌性小鼠：6-8周龄，体重18-22g，购自中科院遗传所实验动物中心
试剂：RPMI1640培养基干粉Gibco公司产品；青霉素(Penicillin G Sodiun Salt)、链霉素(Streptomycin Sulfate)、Hepes、PMS、硝基氯化四氮唑(INT)等Amresco公司产品；DL-乳酸锂Sigma公司产品；氧化型辅酶I(NAD)Roche公司产品；胎牛血清(FBS)购于天津川贝生物制品公司；绵羊红细胞(SRBC)购自北京大学医学部动物中心；鸡红细胞(CRBC)中国农业大学动医学院赠；K562细胞中国协和医科大学赠；补体、都氏试剂、Giemsa染料购自中国医学科学院药用植物研究所；贞芪扶正胶囊(甘肃扶正药业科技股份有限公司，国药准字Z62020414，约2g/粒)；其余试剂均为分析纯。
(b)试验方法
实验动物分组及处理：
6周龄的Bal/C雌性小鼠随机分为6组，空白组每只灌服生理盐水0.4ml/天；阳性对照组每只灌服贞芪扶正胶囊药液(0.1g/ml)0.4ml/天；低剂量、中剂量、高剂量组每天分别灌服1×106CFU/ml，1×108CFU/ml和1×1010CFU/ml的双歧杆菌。灌胃3周，25℃饲养，自由饮水采食，每周换两次垫料。在处死前4天腹腔注射0.5ml 2％的绵羊红细胞(SRBC)致敏。
绵羊红细胞(SRBC)诱导的迟发型变态反应(DTH)：
实验动物处死前一天用游标卡尺测量左后足趾部厚度，在测量部位皮下注射20％的SRBC每只20μl，24h后再次测量左后足趾部厚度，同一部位测量3次，取平均值。以攻击前后的足趾厚度差值来表示DTH的厚度。
半数溶血值(HC50)测定：
小鼠摘除眼球取血收集血清，血清临用前用生理盐水稀释300倍，补体稀释9倍。将稀释后的血清1ml至于试管内，依次加入10％SRBC 0.5ml，补体1ml，空白对照管用生理盐水1ml代替血清。置37℃恒温水浴中保温30min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1ml，加入都氏试剂3ml；同时取10％SRBC 0.25ml，加都氏试剂至4ml作为半数溶血对照，充分混匀。放置10min后，以空白对照管作为空白，于540nm处测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下列公式计算：HC50＝样品OD540/SRBC半数溶血时OD540×稀释倍数。
腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞(滴片法)：
常规分离小鼠腹腔细胞液，细胞液与1％鸡红细胞等体积混和，滴加到用3％琼脂封闭边缘的玻片封闭圈内，37℃培养20min，结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa液染色15min，脱色液(甲醇20ml，蒸馏水80ml，2mol/LHCL 2滴)脱色，蒸馏水冲洗干净，晾干。用40×显微镜计数吞噬率(每100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分比)。
乳酸脱氢酶(LDH)法测定自然杀伤细胞(NK细胞)活性：
靶细胞(K562)传代培养，使用前洗涤、调整细胞浓度为4×105个/ml。制备小鼠脾细胞，用无菌水轻晃20s以裂解红细胞，立即加入2×hank’s液恢复原液压，再次洗涤后调整细胞浓度为2×107个/ml。反应孔取靶细胞(K562)和效应细胞(脾细胞)各100μl加入96孔板中；靶细胞自然释放孔加入靶细胞和培养基各100μl；靶细胞最大释放孔加入靶细胞和2.5％Triton各100μl。上述各项均设3个平行孔，于37℃培养4h后吸取上清100μl于新的培养板中，加入LDH基质液(DL-乳酸锂5×10-2mol/L，硝基氯化四氮唑(INT)6.6×10-4mol/L，PMS 2.8×10-4mol/L，氧化型辅酶I(NAD)1.3×10-3mol/L，溶于Tris-HCL(0.2mol/L，pH8.2)，需现用现配)100μl/孔，室温反应10min后每孔加入1mol/l HCL30μl，在酶标仪490nm处测OD值，按下式计算NK细胞活性：NK细胞活性＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％
(c)实验数据统计
实验数据结果采用x±s表示，SPSS 13.0统计软件做方差分析和T-检验。
表2不同处理对小鼠DTH，HC50，巨噬细胞吞噬活性，NK细胞活性，淋巴细胞增殖以及细胞因子增长的影响
| 组别 | DTH(mm) | HC50 | 吞噬率(％) | NK活性 |
| 空白对照组阳性对照组双歧杆菌低剂量组双歧杆菌中剂量组双歧杆菌高剂量组 | 0.032±0.0020.055±0.013*0.062±0.002*0.101±0.019*0.063±0.011* | 0.688±0.0520.760±0.019*0.732±0.0310.741±0.015*0.749±0.017* | 28±339±4*48±8*44±6*49±6* | 0.0675±0.01420.0911±0.00470.1235±0.0251*0.2709±0.0192*0.2604±0.0479* |
*与空白对照组比较，p＜0.05
将不同浓度动物双歧杆菌的活菌灌胃给正常Bal/C小鼠，三周后测定了小鼠迟发型变态反应(DTH)，巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力，自然杀伤细胞的杀伤能力，以及血清产溶血素(抗体)的能力，来验证双歧杆菌BBMN01的体内免疫调节功能。结果表明各个剂量的双歧杆菌都可以显著提高动物体淋巴细胞的转化能力、巨噬细胞的吞噬活性以及自然杀伤细胞(NK细胞)的活性，其中，中、高剂量的活菌能提高动物血清对免疫刺激产生抗体的能力。表明双歧杆菌BBMN01对动物体具有显著的免疫刺激功能，发挥功能的活菌浓度为108-1010CFU./ml。
实施例7
动物双歧杆菌BBMN01对实验小鼠肠道微生物的调节作用
(a)试验材料
实验动物：BALB/C小鼠20只，雄性，18-22g，购自中科院遗传所实验动物中心。
培养基：LBS培养基，MRS基础培养基，肠球菌琼脂(胆盐-七叶苷-叠氮钠琼脂)培养基，VRBDA培养基，胰眎-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础等购自海博生物技术有限公司
(b)试验方法
受试物的准备：
动物双歧杆菌BBMN01用改良MRS液体培养基37℃厌氧培养18h，4000r/min离心10min，菌体沉淀重悬于10％脱脂乳中，配制108CFU/ml浓度菌悬液。
实验动物分组及处理：
实验小鼠随机分成2组，分别为对照组(灌胃10％脱脂乳)、实验组(灌胃108CFU/ml菌悬液)，试验动物每日灌胃0.2ml样品，连续14d，分别于实验第0日、7日、14日和实验结束后第7日采集实验动物粪便样品，测定肠道主要菌群。
粪便样品处理方法：
无菌采集小鼠粪便约0.1g，低温厌氧条件运送，4小时内完成样品稀释处理，样品呈10倍系列稀释至10-7，取合适的稀释度，分别倾注于各培养基中培养，测定肠道主要菌群(培养条件及方法见表3)。经菌落特征、革兰氏染色、镜检等初步鉴定后计数，并计算出每克湿粪便中的菌数。
表3肠道主要菌群的培养计数方法
| 肠道菌 | 培养基 | 培养条件 | 计数 |
| 双歧杆菌乳杆菌肠杆菌肠球菌产气荚膜梭菌 | MRS+0.05％cystein-HCL培养基，添加硫酸新霉素100μg/ml，丙酸钠15mg/ml，氯化锂3mg/mlLBS培养基VRBDA培养基肠球菌琼脂TSC培养基+添加剂 | 厌氧，37℃，48h厌氧，37℃，48h好氧，37℃，24h好氧，37℃，24h厌氧，37℃，48h | 计数白色或乳白色菌落白色或乳白色菌落红色菌落明显黑色晕圈，革兰氏阳性球菌黑色菌落 |
(c)实验数据统计与评判标准
实验数据结果采用x±s表示，SPSS 13.0统计软件做T-检验。受试样品是否具有调节肠道菌群作用的判断，标准1：双歧杆菌或乳杆菌增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，拟杆菌、肠杆菌或肠球菌增加，但增加幅度小于双岐和/或乳杆菌；标准2：双歧杆菌或乳杆菌增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，拟杆菌、肠杆菌或肠球菌减少或无明显变化。符合以上两项标准之一的，经统计学处理有差异显著性，可判定受试物具有调节肠道菌群平衡的作用。
表4动物双歧杆菌BBMN01对正常小鼠肠道菌群的影响
| 组别 | 双歧杆菌 | 乳杆菌 | 肠杆菌 | 肠球菌 | 产气荚膜梭菌 | |
| 对照组 | 灌胃前灌胃7日14日结束7日 | 7.15±0.247.34±0.437.37±0.147.34±0.61 | 8.04±0.148.12±0.237.97±0.268.03±0.32 | 7.22±0.577.15±0.447.13±0.147.31±0.75 | 6.67±0.206.45±0.556.49±0.216.45±0.35 | 4.51±0.244.75±0.124.66±0.424.79±0.36 |
| 双歧杆菌 | 灌胃7日14日结束7日 | 7.98±0.07**△7.98±0.37**△7.13±0.40 | 8.46±0.13*△8.42±0.31*△8.10±0.29 | 6.78±0.39*6.06±0.29**△7.14±0.48 | 6.31±0.595.24±0.48**△△6.34±0.31 | 4.59±0.144.61±0.184.66±0.64 |
注：*指灌胃前后自身相比差异显著(p＜0.05)，**指差异极显著(p＜0.01)；
△指与对照组相比差异显著(p＜0.05)，△△指差异极显著(p＜0.01)。
实验动物灌胃双歧杆菌BBMN01菌株菌悬液后第7d，显著提高肠道中乳杆菌数量，对其他细菌指标无显著影响；实验后第14d，试验动物肠道内双歧杆菌、乳杆菌数量显著增加，肠杆菌数量显著降低，双歧杆菌BBMN01对实验小鼠肠道肠球菌和产气荚膜梭菌数量无显著影响。根据评判标准可知，每日灌胃108CFU/m1双歧杆菌BBMN01菌悬液0.2mL，对实验小鼠具有调节肠道菌群作用，多次摄入双歧杆菌对实验小鼠肠道菌群调节作用效果更强。灌胃结束7d时，试验组小鼠各指标菌数量基本回复到实验前水平，即其作用持续时间小于7d，这与众多关于其他菌株的报道结果呈现一致性，需要不断的摄入才能实现长时间的更好的微生态平衡。
实施例8
含动物双歧杆菌BBMN01的食品组合物
配方
| 原料 | 原料要求 | 填加量 |
| 白砂糖 | 50-100克 | |
| 稳定剂 | 原料来自丹尼斯克(中国)有限公司 | 3-8克 |
| 动物双歧杆菌BBMN01 | 冻干菌粉或新鲜培养液 | 1.0×105-1.0×1011CFU/mL |
| 鲜牛奶 | 符合国家≤生鲜牛乳收购标准≥ | 定容至1000克 |
1.工艺流程
鲜牛奶——净乳——配料——定容——水合——预热——脱气——均质——杀菌——冷却——接种——发酵——冷却——灌装——包装——入库——出库。
2.工艺要点说明
2.1配料
2.1.1在配料罐中调入适量牛奶，牛奶的量淹没搅拌叶，调奶过程搅拌不可开启，调奶结束后开启搅拌，原奶温度小于10℃。
2.1.2牛奶不用升温，将白砂糖、稳定剂、胶原蛋白和抗氧化物的原料混合均匀后，加入循环的牛奶中，配料时搅拌开启。
2.1.3配料完成后，停止循环，直接进行顶管操作.
2.2定容
2.2.1按配方进行定容，定容结束后搅拌15min，取样检测。
2.2.2水合20min，检测合格后进行下一步工序。定容后料液酸度小于180T，巴杀过程中开启定容罐的搅拌。
2.3预热
温度：60℃～65℃。
2.4脱气
温度：60℃～65℃；压力：-90～-80KPa。
2.5均质
压力：150～170bar。
2.6杀菌
温度：95±3℃；时间：300秒。
2.7冷却
冷却至42±1℃。
2.8接种、发酵：当料液进入发酵罐1/3时，启动搅拌，待进料结束后继续搅拌10～15分钟；停止搅拌，开始计时发酵。
要求：①对操作工的要求，剪短指甲，戴口罩；
②接种时先将手，菌种袋以及菌种添加系统口周围用75％的酒精喷雾消毒，再用明火消毒；
2.9发酵酸度测定：发酵4.0小时后，开始测酸，到达终点后及时破乳、打冷。
2.10打冷、检测：将发酵奶全部打入贮罐冷却至20±2℃，搅拌15～100秒后，及时灌装。
2.11灌装：酸奶贮罐中的料液12小时内(自冷却完毕开始计时)灌完。
2.12入库：产品在2小时内入库，并在2～6℃的冷库中放置12小时以上。
2.13出库：检测合格后出库。
2.14在运输和销售过程中必须确保冷链配置(2～6℃)。
备注：所有的温度指料液温度而非设定温度。
Claims (2)
1.一种牛奶制品的制备方法，其特征在于：其制备的步骤为：1)配料；2)定容；3)均质；4)杀菌；5)冷却后接种发酵；6)测酸后打冷、检测；7)灌装；其中，步骤5)中用动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)的保藏号为：CGMCC No.1904，保藏日期2006年12月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；步骤1)中的配料方法如下：50-10克糖，3-8克稳定剂混合后用牛奶定容到1000毫升；步骤5)中以冻干菌粉或新鲜培养液1.0×105-1.0×1011CFU/mL的活性接入到原料混合物，发酵温度为40-42摄氏度；其中，
上述的步骤2)和3)之间还包括步骤2.1)水和20分钟；步骤2.2)60-65摄氏度下预热；步骤2.3)温度：60℃～65℃和压力：-90～-80Kpa下脱气。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤6)为将发酵奶全部打入贮罐冷却至20±2℃，搅拌15～100秒后，及时灌装。
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