CN101139557A - 一种干酪乳杆菌及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用，包括：收集菌株、培养菌株、接种菌落、实验筛选、菌液制备、发酵乳制备、实验菌死菌液制备和免疫测试；进一步测定在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆酸盐试验和降低胆固醇试验，并经过动物模型测定对胆固醇的含量上升的抑制作用以及对小鼠外周血T淋巴细胞亚群及其血清LgG水平及肠粘膜SigA水平的影响分析，证明了对细胞免疫、体液免疫和肠粘膜局部免疫功能的增加作用。

Description

一种干酪乳杆菌及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用
技术领域
本发明涉及一种分离自内蒙古民族传统乳制品——酸马奶中的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)菌株和以该菌株为发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用。
技术背景
乳杆菌与人类生活关系密切，是广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵及医疗保健领域中的有益微生物之一。现已认识的乳杆菌属和双歧杆菌属中的许多种和菌株，具有特定的优良性质和遗传性状，表现出极强的益生菌特性。诸如，耐酸性、耐受胆汁酸、在消化道中定殖生长和需氧生长发育以及缓解乳糖不忍耐症、抗变异突变、降低血清胆固醇、抗肿瘤、抑制肠道病原菌和抗Helicobacter pylori、改善肠道菌群和提高机体免疫功能等等。
发明内容
本发明针对上述课题，从内蒙古传统功能性发酵乳——酸马奶中分离乳杆菌，采用体外耐酸性试验、耐胆酸盐试验、降胆固醇试验等一系列试验筛选一株具有潜在益生作用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)，并通过动物实验证实了降低血清胆固醇含量及提高免疫力的功能，进一步应用于降血清胆固醇和调节免疫力方面。
本发明的目的是提供一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的新菌株及其制备方法。
本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)已于2006年4月21日，在地址为中国北京市海淀区中关村北一条13号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏，保藏号：CGMCC No.1697。
本发明的另一目的是公开该菌株在降低血清胆固醇含量和提高免疫力方面的应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种干酪乳杆菌，其特征在于：所述干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCCNo.1697。
所述干酪乳杆菌在改善血脂代谢和免疫调节中的应用。
所述干酪乳杆菌在发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用。
一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的制备方法，其特征在于：
a.以酸马奶为乳杆菌分离样品，取2mL所述酸马奶放入灭菌小试管中，再取1mL所述酸马奶放入装有灭菌CaCO3粉的无菌容积为2mL的采样瓶中，作为备用样品放在冰箱内，在4℃条件下冷藏；然后用灭菌吸管吸取1mL所述酸马奶样品并接种于10mL石蕊牛乳培养基中；
b.将所述接种的培养基置于30～37℃恒温箱中增菌培养至酸化凝固并呈现粉红色时取出，用灭菌接种环挑取划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基中；
c.将其放入BBL_gaspak厌氧培养罐中，置于30～37℃条件下培养48～72小时，形成菌落后，用接种环挑取菌落，接种于MRS培养液中，再置于30～37℃条件下培养24～48小时；
d.待菌株生长良好后，再次划线接种于BL琼脂培养基中，置于30～37℃条件下培养24～48小时，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验，分离出在所述试验中呈阴性的杆菌，所述杆菌为乳杆菌；
e.将所述乳杆菌进一步纯化培养，并进行低温保存；将所述分离的乳杆菌菌株经过分析鉴定后制成乳杆菌菌液，吸取所述乳杆菌悬浮液10μL接种于5mL PH3.5的MRS液体培养基中，置于37℃条件下进行24小时培养，同时吸取乳杆菌悬浮液1.0mL与9.0mL PH3.0的人工胃液混合后，置于37℃条件下培养，分别在培养开始时间0小时和培养3小时后取样；
f.然后用BCP琼脂培养基测定活菌数，筛选出具有高耐酸性生长的乳杆菌菌株，并进一步测定所述乳杆菌菌株在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验，由此获得干酪乳杆菌。
所述干酪乳杆菌低温保存为低温真空冷冻保存。
所述干酪乳杆菌低温保存为-85℃冻结保存。
所述干酪乳杆菌低温保存为4℃条件下冷藏保存。
所述人工胃液的制备方法：NaCl 0.2％、胃蛋白酶0.35％，用1mol/L HCl调整pH值为3.0后，过滤除菌备用。
本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)具有较强的耐性和耐酸生长特性、能够耐受人工胃肠消化液，尤其在脱脂乳液中能够耐受pH2.0的人工胃液；能耐受的胆盐浓度达1.8％；具有良好的体外降胆固醇活性，并通过大鼠血清脂质含量的影响实验以证明具有抑制血清胆固醇上升作用。在对小鼠外周T淋巴细胞亚群和血清IgG和肠黏膜SIgA水平的影响研究也显示了良好的调节细胞免疫和体液免疫功能以及肠黏膜局部免疫的调节作用。因此，该菌株适用于功能性发酵乳制品的生产、也可作为功能性食品添加剂或保健制剂应用于降低人类血清胆固醇浓度或抑制胆固醇浓度的上升、调节免疫功能的各个方面。
附图说明
图1为本发明干酪乳酸菌的分离、纯化及保存操作流程图；
图2为本发明干酪乳酸菌L.casei Zhang对人工消化液的耐受性图；
图3为本发明发酵乳中L.casei Zhang对人工消化液的耐受性图；
图4为本发明干酪乳酸菌L.casei Zhang活细胞及灭活细胞体外降解胆固醇能力比较图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实例的限制。
本发明中干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的分离纯化过程如下：
以内蒙古传统功能性发酵乳——酸马奶为乳杆菌分离样品，将牧民家庭自然发酵制作的酸马奶，在其发酵容器中充分搅拌后，用带有灭菌吸头的移液器，吸取2mL放入带有胶塞的灭菌小试管(15mm×150mm)中封口，再吸取1mL于放入带螺旋帽装有灭菌CaCO3粉的无菌容积为2mL的采样瓶中，拧紧螺旋帽作为备用样品。
将收集的样品放入冰盒内冷却，间隔一定时间更换冰袋，保持较低温度状态下带回实验室转放4℃冰箱，尽快进行乳酸菌的分离。
乳杆菌分离时，用灭菌吸管吸取1mL酸马奶样品接种于10mL灭菌石蕊牛乳培养基中，置30℃恒温箱增菌培养至酸化凝固，培养基颜色变为粉红时取出，用灭菌接种环挑取划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基(日本荣研株式会社制品)上，放入BBL_gaspak厌氧培养罐中，置30℃，培养48h～72h。
待菌落形成后，用接种环或接种针挑取菌落，接种于MRS培养液中，置30℃，培养24h～48h。
待菌株生长良好后，再次划线接种于BL琼脂培养基，置30℃，培养24h～48h，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。
将革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的杆菌，暂定为乳杆菌并进一步纯化培养，并采用冷藏、-85℃冻结保存或低温真空冷冻保存。
将从酸马奶样品中分离的乳杆菌菌株，经生理生化学试验、乳酸旋光性测定等一系列试验分析鉴定。并将鉴定后菌株分别制成供试菌液，吸取菌悬液10μL接种于5mL pH3.5的MRS液体培养基，置37℃培养24h；同时吸取菌悬液1.0mL与9.0mL pH3.0的人工胃液(制备法：NaCl 0.2％、胃蛋白酶(pepsin，sigma)0.35％，用1mol/L HCl调整pH值为3.0后，过滤除菌备用)混合后，置37℃培养，分别在开始(0h)和3h后取样用BCP琼脂培养基(日本荣研株式会社制品)测定活菌数，并计算菌株存活率。
通过以上方法筛选出具有高耐酸性生长和耐胃酸的乳杆菌菌株。进一步测定在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验，获得了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)，并经动物模型测定对血清胆固醇含量上升的抑制作用以及对小鼠外周血T淋巴细胞亚群及其血清IgG水平和肠黏膜SIgA水平的影响分析，证明了对细胞免疫、体液免疫和肠黏膜局部免疫功能的增强作用。
实施例1：样品的采集和乳杆菌的分离鉴定。
样品为：传统方法制作的酸马奶，样品采集于中国内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗。
样品中乳杆菌的分离和纯化：其操作过程如图1所示。
乳杆菌的鉴定：分离纯化的乳杆菌，经生理生化学特性分析和16S rDNA序列分析的方法鉴定，该干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的生物学特性见表1。
表1 Lactobacillus casei Zhang的生物学特性
  实验项目   结果   实验项目   结果
  乳酸旋光性过氧化氢酶实验葡萄糖产气细胞壁中meso-DAP15℃20℃40℃45℃耐热性(60℃、30min)4％NaCl6.5％NaClpH3.5pH4.5pH9.0精氨酸产氨阿拉伯糖木糖鼠李糖核糖葡萄糖甘露糖果糖   L---+++++w+-++-----++++   半乳糖蔗糖麦芽糖纤维二糖乳糖蕈糖密二糖棉籽糖松三糖糊精淀粉糖原菊粉甘露醇山梨醇肌醇七叶苷水杨苷扁桃苷a-甲基葡萄糖苷葡萄糖酸盐   ++++-+--++w--++++w+w++-+w
实施例2：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的耐酸性及其人工胃肠液中的耐受性分析。
从酸马奶样品中分离鉴定的50株乳杆菌中，经过pH3.5的MRS液体培养基中生长试验及在pH3.0人工胃液中的存活率测定，筛选到1株耐酸性极强的乳杆菌，即干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)。
Lactobacillus casei Zhang，经过pH3.5的MRS液体培养基中生长试验及在pH3.0人工胃液中的存活率测定，结果见表2。
表2Lactobacillus casei Zhang在pH3.5及pH3.0人工胃液中生长情况
  菌株编号   pH3.5生长   pH3.0人工胃液(Igcfu/mL)   存活率(％)
  0h   3h
  L.casei.Zhang   +   7.48   7.48   100.00
注：表中菌数均为两次实验的平均值。
L.casei Zhang，经过pH2.0、pH3.0和pH4.0的人工胃液作用3h后，随即分别接入pH8.0的人工肠液，作用0h、3h、6h、24h后的活菌数变化结果，如图2所示。
将本发明的L.casei Zhang，接种到10％脱脂乳中，置37℃培养凝乳后，按比例与不同pH值人工胃液混合后于37℃处理3h，然后，转接到pH8.0的人工肠液中，随时间测定其活菌数变化，如图3所示。
结果显示，L.casei Zhang具有极强的耐酸特性和耐受人工胃肠液的能力，尤其在脱脂乳中时能够耐受pH2.0的人工胃酸而存活率未见降低。
实施例3：L.casei Zhang对胆盐的耐受性和体外降胆固醇能力分析
将本发明的L.casei Zhang，接种于含有0.3％胆盐的培养基中，厌氧培养观察分析了胆盐对其生长的影响，结果如表3所示。
表3L.casei Zhang对胆盐的耐受性(n＝3，x±sd)
菌株名称   0D620增加0.3个单位所需时间(h)
  不含胆盐   含0.3％胆盐   延迟时间
  L.casei Zhang   5.38±0.28   5.95±0.26   0.57±0.14
将本发明的L.casei Zhang接种于含不同浓度胆盐的TPY琼脂平板培养基和液体培养基中，通过对其生长情况的观察，分析了能够耐受胆盐的最高浓度，结果如表4所示。结果显示L.casei Zhang耐受的最高胆盐浓度达1.8％。
表4L.casei Zhang对不同浓度胆盐的耐受性
  胆盐浓度(％)   L.casei Zhang
  △A620   TPY平板
  0.30.40.60.81.01.21.41.61.8   0.2170.0690.0790.0020.0640.0090.0100.0100.010   +++++++++
注：△A620为0h和12h吸光值之差，结果为三次试验的平均值+表示有菌落生长，-表示无菌落生长，ND未测试。
将本发明的L.casei Zhang，接种于含有0.2％牛磺胆酸钠的MRS-THIO培养基中，37℃培养24h，测定上清液中游离胆酸含量，来判断乳杆菌对胆盐的分解作用，结果如表5所示。结果显示，本实验中L.casei Zhang有一定的胆盐脱结合活性，对牛磺胆酸钠解共轭所产生的游离胆酸量为2.28μmoL/mL。
表5L.casei Zhang对胆盐脱结合作用(n＝3，x±sd)
  菌株名称     游离胆酸量(μmoL/mL)
  L.casei Zhang     2.28±0.13
将本发明的L.casei Zhang，接种于含有150μg/mL胆固醇的MRS-THIO液体培养基中，置37℃厌氧培养24h后，检测了其培养液中残留的胆固醇含量，并计算了胆固醇减少量和降低率，结果如表6所示。L.casei Zhang的胆固醇降低率为49.61％。
表6 L.casei Zhang在培养液中对胆固醇的降低作用(n＝3，x±sd)
    菌种名称     胆固醇降低量(μg/mL)     胆固醇降低率(％)
    L.casei Zhang     74.41±5.31     49.61
根据以上实验，进一步将L.casei Zhang株菌，在150μg/mL胆固醇的MRS-THIO液体培养基中培养后，将培养液经离心分离获得上清液、菌体洗涤液以及其菌体细胞超声波破碎液，分别测定了其中胆固醇的含量，结果如表7所示。结果显示L.casei Zhang菌的培养上清液中胆固醇含量占原培养液中的50.39％，细胞洗涤液和细胞破碎液中的胆固醇含量分别占原培养液中的26.81％和29.01％。说明除了一部分胆固醇存在于培养液中外，近50％左右的胆固醇或吸附于菌体细胞或被吸收到细胞中，其中近30％的的胆固醇被菌体细胞所同化，近26％的的胆固醇被菌体细胞所吸附。
表7 L.casei Zhang培养液离心后上清液、菌体洗涤液、菌体破碎液胆固醇含量(n＝3，x±sd)
菌株     胆固醇分布(％)
    上清液     洗涤液     破碎液
    L.casei Zhang     50.10±3.15     26.81±4.37   29.01±6.66
从图4可知，L.casei Zhang活菌体细胞在生长过程中从介质中除去胆固醇的数量显著高于热灭活的菌体细胞。但是，并未因热处理导致降胆固醇作用的消失，而只是能力有所降低。
通过以上实施例证明，内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗酸马奶中分离的L.casei Zhang具有极强的耐酸性、耐受人工胃肠消化液、耐受1.8％的胆盐和胆盐脱结合活性以及体外降解胆固醇的作用，具有一定的潜在益生特性。应用实施例1：L.casei Zhang对大鼠血清脂质代谢的影响研究(体内实验，动物实验)。
将本发明的L.casei Zhang的热致死菌体脱脂乳制剂(其菌数为2.0×109cfu/mL)和活菌体脱脂乳制剂(其菌数为2.0×109cfu/mL)分别与高胆固醇饲料同时投喂wistar系大白鼠，并以高脂饲料组大鼠灌服灭菌脱脂乳液和基础饲料组大鼠灌服灭菌生理盐水作对照，进行了该菌株对大鼠脂质含量的影响效果分析，实验分组情况见表8所示。饲喂L.casei Zhang后的第14d时对大鼠血清总胆固醇(TC)、TG和HDL-C含量及动脉硬化指数(AI＝(CHO-HDL-C)/HDL-C，Kawase M，Hashimoto H，Hsoda M，et al.Effect ofadministration of fermented milk containing whey protein concentrateto rats and healthy men on serum lipids and blood pressure.J DairySci，2000，83：255-263)的影响和粪便中胆汁酸含量见表9和表10。
表8 实验分组及饲养方式
实验组别   大白鼠数量(只)   饲养方式
L.casei Zhang热致死菌体组L.casei Zhang活菌组高脂饲料组基础饲料组   11111111   高脂饲料+Lb.Zhang热致死菌液高脂饲料+Lb.Zhang活菌液高脂饲料+灭菌10％脱脂乳液基础饲料+灭菌生理盐水
注：各组名称以下分别简称为L.casei Zhang热致死菌体组、L.casei Zhang活菌体组、高脂饲料组和基础饲料组。
表9灌服L.casei Zhang 14d时对大鼠血清脂质浓度(mmol/L)及动脉硬化指数AI的影响(n＝6)
项目   TC   TG     HDL-C     AI
Zhang热致死菌体Zhang活菌体组普通饲料对照组高脂饲料对照组   2.11±0.24aa2.40±0.281.54±0.18aa2.59±0.21   0.86±0.070.99±±0.150.85±0.201.03±0.13   0.56±0.08a0.49±0.050.49±0.020.47±0.02     2.63±0.51aa4.32±1.30a2.11±0.41aa4.51±0.45
注：与高脂饲料组比较：ap＜0.05，aap＜0.01。
表10灌服L.casei Zhang时对大鼠粪便中总胆汁酸含量的影响(mmol/3 day，n＝6)
    项  目     大鼠粪便中总胆汁酸含量
    Zhang热致死组Zhang活菌体组普通饲料对照组高脂饲料对照组     69.64±4.39a68.46±7.02a56.31±4.4653.58±1.01
注：与高脂饲料组比较：ap＜0.05，aap＜0.01；与正常对照组比较：bp＜0.05，bbp＜0.01。
结果显示，本发明的L.casei Zhang具有良好的抑制大鼠血清胆固醇浓度的上升及增加粪便中总胆汁酸含量的生理活性，具有一定的改善脂质代谢的活性。
应用实施例2：L.casei Zhang菌体对小鼠外周血CD4+、CD8+淋巴细胞含量及其比值分析结果。
将本发明的L.casei Zhang制备成含有2.0×1010cfu/mL的脱脂乳菌悬液，连续灌服小鼠10天及20天后，采集各实验组小鼠外周血样品，经处理后在流式细胞仪上检测其中CD4+、CD8+淋巴细胞含量。实验分组情况如表11所示。
表11实验分组及饲养方式
组  别     剂量(mL/kg.bw)   实验动物数量(只) 饲养方式
对照组L.casei Zhang低剂量组L.casei Zhang中剂量组L.casei Zhang高剂量组     1051020   10101010 灭菌水+营养饲料乳杆菌+营养饲料乳杆菌+营养饲料乳杆菌+营养饲料
注：小鼠的等效剂量相当于人体推荐量的10倍(以60kg体重成人为例)，卫生部卫生监督司(1996)。
将本发明的L.casei Zhang活菌悬液连续灌服给小鼠至第10天时，L.casei Zhang的低剂量组呈显著提高(p＜0.05)、其中剂量组和高剂量组测定值得到极显著性差异水平(p＜0.01)；各试验组CD4+淋巴细胞含量测定结果与对照组比较，L.casei Zhang低剂量组和中、高剂量组分别呈显著性(p＜0.05)和极显著性提高(p＜0.01)。各试验组CD8+淋巴细胞含量测定结果与对照组比较其测定值均低于对照组，但均未达到差异性水平；CD4+/CD8+比值各试验测定值均高于对照组，详见表12。
表12饲喂L.casei Zhang菌液10天时小鼠外周血液中CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞含量(％，X±SD，n＝10)
    测定项目   n  对照组  低剂量组   中剂量组  高剂量组
    CD3 +CD4 +CD8 +CD4 +/CD8 +   10101010  56.52±6.8033.43±6.5422.90±5.571.52±0.39 60.78±2.52a37.94±2.23a21.19±2.151.81±0.21 63.82±4.69aa41.70±3.14aa21.03±2.982.04±0.46 62.84±3.45aa41.82±2.98aa21.60±1.651.95±0.23
注：与对照组比较，ap＜0.05，aap＜0.01。
试验至第20天时，L.casei Zhang的低、中和高剂量组CD3+淋巴细胞百分含量测定值和CD4+淋巴细胞百分含量与对照组比较，均提高至达到了极显著性差异水平(p＜0.01)。各试验组CD8+淋巴细胞含量测定结果与对照组无显著性差异。各试验组CD4+/CD8+比值与对照组比较无显著性差异。如表13所示。
表13饲喂L.casei Zhang菌液20天时小鼠外周血液中CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞含量(％，X±SD，n＝10)
  测定项目   n   对组照   低剂量组     中剂量组     高剂量组
  CD3 +CD4 +CD8 +CD4 +/CD8 +   10101010   57.36±4.9537.01±4.6719.17±2.871.95±0.21 62.84±3.36aa42.83±4.75aa20.66±1.662.09±0.31 65.84±4.19aa45.12±3.25aa21.83±3.652.12±0.38 65.02±4.15aa44.77±3.93aa21.46±3.102.14±0.43
注：与对照组比较，ap＜0.05，aap＜0.01。
表14饲喂L.casei Zhang菌液30天后小鼠外周血液中CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞含量
  测定项目     n  对组照  低剂量组   中剂量组  高剂量组
  CD3 +CD4 +CD8 +CD4 +/CD8 +     10101010  58.92±2.4538.08±2.3519.25±1.781.98±0.14  61.38±2.65a41.10±3.49a20.44±1.062.02±0.27   63.98±2.71aa43.13±3.31aa20.56±1.172.10±0.20  63.48±2.60aa42.57±1.80aa21.39±1.46aa2.00±0.16
注：与对照组比较，ap＜0.05，aap＜0.01；X±SD，n＝10。
由此可见，将本发明的L.casei Zhang株菌菌悬液灌服给小鼠后，在第10天时CD3+淋巴细胞和CD4+淋巴细胞百分含量以及CD4+/CD8+比值均能有效提高，呈明显的量-效关系。试验进行至第20天时，这一免疫增强效果仍在持续，不同的是灌服菌液的各试验CD8+淋巴细胞百分含量及CD4+/CD8+比值与对照组的测定值间无显著性差异。在第30天时，其低剂量组CD3+和CD4+淋巴细胞百分含量与对照组比较呈显著性提高(p＜0.05)，中剂量组和高剂量组CD3+和CD4+淋巴细胞百分含量与对照组比较呈现了极显著提高(p＜0.01)；对照组和各剂量组CD8+淋巴细胞百分含量间无显著性差异；各剂量组CD4+/CD8+比值稍高于对照组，但未达到显著性差异水平。
应用实施例3：L.casei Zhang菌的发酵乳对小鼠外周血CD4+、CD8+淋巴细胞含量及其比值分析。
将本发明的L.casei Zhang，接种于脱脂乳中培养制备成发酵乳后，按照应用实施例2的分组方案实施灌服小鼠，并在第10天、第20天和30天分别测定了其外周血中CD4+和CD8+淋巴细胞百分含量，结果如表15、表16和表17所示。
第10天的检测结果显示，饲喂L.casei Zhang发酵乳的低剂量组测定值与未灌服的对照组比较其外周血中CD3+和CD4+淋巴细胞百分含量均显著性提高(p＜0.05)，中剂量组和高剂量组的测定值明显高于对照组，均达到极显著性差异水平(p＜0.01)；各试验组CD8+淋巴细胞百分含量测定值与对照组比较，未呈现显著性差异。L.casei Zhang的低剂量组的CD4+/CD8+比值显著高于对照组(p＜0.05)，L.casei Zhang的中、高剂量组的CD4+/CD8+比值均高于对照组，呈显著性差异(p＜0.01)。
试验进行至第20天时，L.casei Zhang的低、中和高剂量组CD3+和CD4+淋巴细胞百分含量均.极显著性高于对照组(p＜0.01)；与此同时，灌服L.casei Zhang发酵乳的低、中和高剂量组CD8+淋巴细胞百分含量测定值均极显著地高于对照组(p＜0.01)。
表15
饲喂L.casei Zhang发酵乳10天时小鼠外周血液中CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞含量(％，X±SD，n＝10)
  测定项目   n   对照组   低剂量组   中剂量组   高剂量组
  CD3 +CD4 +CD8 +CD4 +/CD8 +   10101010   56.52±6.8033.43±6.5422.90±5.571.46±0.39   61.02±3.97a37.42±1.70a20.75±1.921.80±0.22a   63.09±1.84aa42.38±2.44aa20.81±2.002.04±0.21aa   62.45±2.3aa41.85±2.31aa21.03±1.942.01±0.25aa
注：与对照组比较，ap＜0.05，aap＜0.01。
当将L，casei Zhang菌制备成发酵乳后灌服小鼠至第30天时，各剂量组CD3+和CD4+淋巴细胞百分含量以及CD8+淋巴细胞百分含量均极显著性地高于对照组(p＜0.01)，但CD4+/CD8+比值稍高于对照组，均未达到显著性差异水平，如表16所示。
表16
饲喂L.casei Zhang发酵乳20天时小鼠外周血液中CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞含量(％，X±SD，n＝10)
  测定项目   n   对照组   低剂量组   中剂量组   高剂量组
  CD3 +CD4 +CD8 +CD4 +/CD8 +   10101010   57.36±4.9537.01±4.6719.17±2.871.93±0.21   65.99±2.59aa43.62±2.05aa21.91±1.39aa1.99±0.16   71.39±3.61aa48.60±3.16aa23.81±1.70aa2.04±0.24   69.95±2.76aa46.45±1.98aa22.43±1.45aa2.07±0.18
注：与对照组比较，ap＜0.05，aap＜0.01。
表17饲喂L.casei Zhang发酵乳30天后小鼠外周血液中CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞含量
  测定项目   n   对照组   低剂量组   中剂量组   高剂量组
  CD3 +CD4 +CD8 +CD4 +/CD8 +   10101010   58.92±2.4538.08±2.3519.25±1.781.98±0.14   66.67±2.49aa43.80±2.52aa21.84±1.35aa2.01±0.09   70.75±2.54aa46.46±1.81aa22.48±1.66aa2.07±0.14   67.31±2.19aa45.37±3.13aa21.95±1.44aa2.07±0.13
注：与对照组比较，ap＜0.05，aap＜0.01；X±SD，n＝10。
由此可见，本发明的L.casei Zhang的菌体悬液及其发酵乳对小鼠细胞免疫功能的改善具有一定的功效。
应用实施例4：对小鼠血清IgG和肠粘膜SIgA含量的影响分析
将本发明的L.casei Zhang制备成2.0×1010cfu/mL的菌悬液，按照应用实施例2的分组方案实施饲喂小鼠。L.casei Zhang的各剂量组中，其血清IgG含量在低剂量组、中剂量组和各剂量组分别在第5、10、15、25和30天时均极显著地高于对照组(p＜0.01)；其中测定值在第5天为最高。结果见表18。
饲喂L.casei Zhang菌悬液后的第5、10、15、25和30天的测定值显示，在其同一时间段各剂量组小鼠肠粘膜SIgA含量均比未灌服菌液的对照组高，并几乎都达到极显著差异水平(p＜0.01)，如表19所示。
表18灌服L.casei Zhang菌液后各试验组小鼠在不同时间血清IgG含量测定结果(ng/mL，X±SD，n＝4)
  日期(天)   对照组   低剂量组   中剂量组   高剂量组
51015202530 41.58±1.0645.72±1.3441.71±1.2845.64±1.8445.88±1.5146.88±2.06 101.55±0.97aa77.98±3.33aa70.39±8.72aa93.02±6.30aa81.43±2.50aa86.08±1.68aa 107.25±1.92aa81.20±0.77aa73.18±5.50aa87.47±6.37aa74.08±2.79aa76.22±1.00aa 128.72±0.30aa87.22±4.92aa82.61±5.68aa84.71±7.28aa66.46±2.40aa71.13±2.52aa
注：与对照组比较，ap＜0.05，aap＜0.01。
表19灌服L.casei Zhang菌悬液后各试验组小鼠在不同时间段肠粘膜SIgA含量测定结果(ng/mL，X±SD，n＝4)
  日期(天)     对照组     低剂量组   中剂量组     高剂量组
  51015202530     20.97±1.0224.60±2.7521.10±2.1025.60±3.6824.59±2.2226.35±2.92     58.83±1.13aa39.33±0.34aa21.19±2.00aa31.95±1.6037.77±2.12aa46.17±1.85aa   69.74±2.79aa44.73±2.84aa40.90±1.44aa33.63±3.64a48.54±3.67aa53.04±4.17aa     88.40±0.57aa57.22±2.66aa57.76±2.99aa55.77±8.26aa65.64±2.26aa70.39±4.03aa
注：与对照组比较，ap＜0.05，aap＜0.01。
由此可见，本发明的L.casei Zhang对小鼠体液免疫及肠黏膜局部免疫具有一定的功效，为进一步益生菌及益生发酵乳的开发奠定了基础。

Claims (8)

1.一种干酪乳杆菌，其特征在于：所述干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCCNo.1697。
2.一种如权利要求1所述的干酪乳杆菌的应用，其特征在于：所述干酪乳杆菌在改善血脂代谢和免疫调节中的应用。
3.根据权利要求2所述的干酪乳杆菌的应用，其特征在于：所述干酪乳杆菌在发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用。
4.一种如权利要求1所述的干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于：
a.以酸马奶为乳杆菌分离样品，取2mL所述酸马奶放入灭菌小试管中，再取1mL所述酸马奶放入装有灭菌CaCO3粉的无菌容积为2mL的采样瓶中，作为备用样品放在冰箱内，在4℃条件下冷藏；然后用灭菌吸管吸取1mL所述酸马奶样品并接种于10mL石蕊牛乳培养基中；
b.将所述接种的培养基置于30～37℃恒温箱中增菌培养至酸化凝固并呈现粉红色时取出，用灭菌接种环挑取划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基中；
c.将其放入BBL_gaspak厌氧培养罐中，置于30～37℃条件下培养48～72小时，形成菌落后，用接种环挑取菌落，接种于MRS培养液中，再置于30～37℃条件下培养24～48小时；
d.待菌株生长良好后，再次划线接种于BL琼脂培养基中，置于30～37℃条件下培养24～48小时，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验，分离出在所述试验中呈阴性的杆菌，所述杆菌为乳杆菌；
e.将所述乳杆菌进一步纯化培养，并进行低温保存；将所述分离的乳杆菌菌株经过分析鉴定后制成乳杆菌菌液，吸取所述乳杆菌悬浮液10μL接种于5mL PH3.5的MRS液体培养基中，置于37℃条件下进行24小时培养，同时吸取乳杆菌悬浮液1.0mL与9.0mL PH3.0的人工胃液混合后，置于37℃条件下培养，分别在培养开始时间0小时和培养3小时后取样；
f.然后用BCP琼脂培养基测定活菌数，筛选出具有高耐酸性生长的乳杆菌菌株，并进一步测定所述乳杆菌菌株在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验，由此获得干酪乳杆菌。
5.根据权利要求4所述的干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于：所述干酪乳杆菌低温保存为低温真空冷冻保存。
6.根据权利要求4所述的干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于：所述干酪乳杆菌低温保存为-85℃冻结保存。
7.根据权利要求4所述的干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于：所述干酪乳杆菌低温保存为4℃条件下冷藏保存。
8.根据权利要求4所述的干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于：所述人工胃液的制备方法：NaCl 0.2％、胃蛋白酶0.35％，用1mol/L HCl调整pH值为3.0后，过滤除菌备用。
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