CN102373173B

CN102373173B - 干酪乳杆菌n1115、其免疫调节作用及应用

Info

Publication number: CN102373173B
Application number: CN2011103570588A
Authority: CN
Inventors: 朱宏; 王世杰; 陆淳; 冯丽莉; 卢晓莉; 康志远; 崔树勇
Original assignee: Shijiazhuang Junlebao Dairy Co Ltd
Current assignee: Junlebao Dairy Group Co ltd
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2011-11-11
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-11-11
Also published as: CN102373173A

Abstract

本发明公开了一种干酪乳杆菌（ Lactobacilluscasei ）N1115、其免疫调节作用及应用。该干酪乳杆菌是从内蒙古传统的发酵乳制品中分离出的耐酸和耐胆盐的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCCNo.4691；本发明还提供了干酪乳杆菌N1115的分离纯化方法，分离出的菌株与已有乳酸菌相比，对低pH值和高胆汁酸盐具有更强的抗性，具有更好的耐受人消化道不良环境的能力，可以更好地发挥其益生作用；该菌株能够诱导巨噬细胞产生IL-12、IL-6，TNF-α，具有增强免疫调节作用，可用于制备功能性饮品和保健制剂。

Description

干酪乳杆菌N1115、其免疫调节作用及应用

技术领域

本发明属于微生物工程领域，涉及一种乳酸菌的新菌株，具体地说是一种干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）N1115、其免疫调节作用及应用。

背景技术

目前研究发现，含有乳酸菌（LAB）的产品具有保健作用。乳酸菌菌株有几千种，不同的菌株具有不同的保健作用，其中一些菌株具有增强免疫的保健作用。

乳酸菌对免疫功能的调节作用，与乳酸菌刺激免疫细胞产生细胞因子（例如IL-12、IL-6、TNF-α等）密切相关。

研究发现，乳酸菌具有抗过敏的作用，当它被巨噬细胞或树突状细胞等担任自然免疫的细胞吞噬时，会诱导产生IL-12，IL-12能够促进未分化T细胞向Ⅰ型的辅助T细胞（即Th1细胞）分化，从而使Th1/Th2平衡向Th1侧偏移。而向Ⅱ型的辅助T细胞（即Th2细胞）侧偏移的Th1/Th2平衡，诱导产生抗原特异性的IgE，是导致过敏反应发病的一个原因，因此诱导由自然免疫担任细胞产生IL-12、改善Th1/Th2平衡的活性，就成为评价菌株改善过敏反应效果的一个重要指标。另外，IL-12还是一种T细胞激活因子，可活化T细胞及NK细胞分泌干扰素-γ（INF-γ）和肿瘤坏死因-α（TNF-α）。

IL-6是一种具有促炎症反应和抗炎症反应的双重作用的细胞因子。通常，IL-6是由T细胞和巨噬细胞产生，以刺激免疫应答。IL-6作为抗炎性细胞因子，通过激活IL-1受体拮抗物和IL-10，介导实现对TNF-α和IL-1的抑制作用。IL-6与许多疾病过程有关，包括糖尿病、动脉粥样硬化、抑郁症、阿耳茨海默氏病（早老性痴呆病）、全身性红斑狼疮、前列腺癌等。

TNF-α是肿瘤坏死因子（TNF）的一种。TNF主要由巨噬细胞产生，也可以由淋巴细胞、肥大细胞、成纤维细胞、内皮细胞等其他细胞产生。TNF的主要作用是调节免疫细胞，TNF可以诱导细胞凋亡、诱导炎症，抑制肿瘤发生和病毒复制。TNF通常与IL-1和IL-6协同作用，在不同的组织发挥不同的功能。TNF产生失调与许多人类疾病相关，如阿耳茨海默氏病（早老性痴呆病）、癌症、成年人抑郁症、肠炎（IBD）等。

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）作为一种益生菌，存在于人类体内时能够耐受有机体的防御机制（包括口腔中的酶、胃液中低PH值环境和小肠的胆汁酸等）。

干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用，同时具有高效降血压、降胆固醇、促进细胞分裂、产生抗体免疫、增强人体免疫、预防癌症和抑制肿瘤生长等功能；还具有缓解乳糖不耐症、预防过敏等益生保健作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种新的微生物菌株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）N1115，它是从内蒙古传统的发酵乳制品中分离出来的。

本发明的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）N1115，已于2011年3月17日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）进行保藏，保藏编号：CGMCC No.4691。

本发明的另外一个目的，是提供了干酪乳杆菌N1115的免疫调节作用，通过培养系统诱导产生了IL-12、IL-6，TNF-α。

本发明还有一个目的，即提供了上述干酪乳杆菌N1115免疫调节作用的应用，制备了含有干酪乳杆菌N1115的酸牛奶、乳酸菌饮料、菌粉制剂。与已有乳酸菌相比，干酪乳杆菌N1115对低pH值和高胆汁酸盐具有更强的抗性，具有更好的耐受人消化道不良环境的能力，可以更好地发挥其益生作用。

本发明为实现上述目的，所采用的技术方案是：

一种干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）N1115，是从内蒙古传统的发酵乳制品中分离出的耐酸和耐胆盐的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.4691。

上述干酪乳杆菌N1115的分离纯化方法，按照如下步骤顺序进行：

步骤1 样品采集

取25mL内蒙古传统的发酵乳制品，加入到250mL 生理盐水中，充分混匀，得到样品；

步骤2 样品的富集

取样品2mL，加入到100mL 的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；

步骤3 菌株分离

取培养液1mL，用0.9%（重量与体积的百分比）无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍，得到菌悬液；

取MRS琼脂培养基，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；

置35℃环境下厌氧培养72h（H₂：CO₂：N₂=5：10：85），观察菌落生长情况；

待平板出现典型菌落后，根据标准干酪乳杆菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化。

步骤4 菌株的纯化

挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；

最后，将挑取的单菌落，进行革兰氏染色，显微镜下观察为革兰氏阳性、短杆、无芽孢的纯化菌株，即为获得的纯培养物，然后，将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。

作为本发明的一种限定，上述分离纯化过程中使用的MRS培养基具有以下组成：酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸钠：5g；柠檬酸二胺：2g；吐温-80：1g；K₂HPO₄：2g；MgSO₄·7H₂O：0.2g；MnSO₄·7H₂O：0.05g；琼脂：15g；蒸馏水：1000mL；该培养基调节pH6.8±0.1。

作为本发明的另一种限定，上述分离纯化过程中使用的LC培养基具有以下组成：蛋白胨：10g；酵母膏：1g；牛肉膏：4g；K₂HPO₄：2g；乙酸钠：3g；柠檬酸铵：1g；MgSO₄·7H₂O：0.2g；MnSO₄·7H₂O：0.05g；干酪素酸性水解物：1g；吐温-80：1g；蒸馏水：1000mL；该培养基调节pH6.0±0.1。

本发明的干酪乳杆菌N1115的细菌学特征如下：

一、基本特征

干酪乳杆菌N1115的基本特性如表1所示。

表1. N1115基本特性

试验项目	结果	试验项目	结果	试验项目	结果
						革兰氏染色	＋	空气中生长	＋	10℃发酵	＋
细胞形态	短杆	6.5%NaCl生长	＋	15℃发酵	＋
						形成芽孢	－	pH9.6生长	－	45℃发酵	－
接触酶	－	pH4.5生长	＋	10%牛奶发酵	＋
						氧化酶	－	发酵葡萄糖产气	－

由表1可见，干酪乳杆菌N1115为革兰氏阳性、短杆、无芽胞、接触酶和氧化酶试验阴性菌株；该菌株可在空气、6.5%NaCl、pH9.6或pH4.5的条件下生长；该菌株发酵葡萄糖产气试验阴性，可在10%牛奶中发酵，可在10℃和15℃条件下发酵，但不能45℃条件下发酵。

二、生化特征

本发明的菌株干酪乳杆菌N1115是一种兼性厌氧菌，在35℃显示出最佳的生长能力。在牛乳培养基中（10%的脱脂乳），显示出了较好的产酸能力，可在48h内凝乳。本发明应用梅里埃公司生产的API 50CH 试剂条对所提供的菌株干酪乳杆菌N1115进行了糖发酵特性的检测，其原理是以基础培养基做基础，分别添加不同的碳水化合物，然后接种干酪乳杆菌N1115，观察其发酵产酸特性；其中，基础培养基由以下成分组成：硫酸铵：2g；酵母膏：0.5g；胰蛋白胨：1g；酚红：0.18g；无机盐基础：10mL，pH7.8的磷酸缓冲液：1000mL。

结果显示：干酪乳杆菌N1115可以很好地利用核糖、半乳糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、D-塔格糖、.D-松二糖、松三糖、N-乙酰-葡糖胺、葡萄糖酸盐作为碳源，应用柳醇、纤维二糖、蔗糖、拢牛儿糖的能力较弱，不能利用甘油、赤藓糖、D-阿拉伯糖、.L-阿拉伯糖等。具体检测结果如表2所示。

表2. Lactobacillus casei N1115的 Api50鉴定结果

注：“+”表示发酵；“－”表示不发酵。

三、基因特征

本发明所提供的菌株N1115菌株，应用PCR对其16SrDNA测序，结果如下：

应用PCR对其延长因子Tuf基因进行测序，结果如下：

根据本发明干酪乳杆菌N1115的上述16SrDNA序列和延长因子Tuf基因序列，可以确定：干酪乳杆菌N1115是一株新颖的干酪乳杆菌菌株。

本发明还提供了干酪乳杆菌N1115的免疫调节作用，该菌具有诱导巨噬细胞产生IL-12、IL-6，TNF-α的能力及用途。

本发明还提供了干酪乳杆菌N1115免疫调节作用的应用，用于生产益生菌饮品、菌粉制剂。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比所取得的技术进步是：本发明所提供的干酪乳杆菌N1115具有诱导巨噬细胞产生IL-12、IL-6、TNF-α的能力及用途，从而使其具有调节免疫功能的作用；本发明还提供了干酪乳杆菌N1115调节免疫功能的应用，用于生产益生菌制剂和含有这该乳酸菌的食品。实践证明，干酪乳杆菌N1115与已有乳酸菌相比，对低pH值和高胆汁酸盐具有更强的抗性，具有更好的耐受人消化道不良环境的能力，可以更好地发挥其益生作用。

本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。

附图说明

图1—图3分别是本发明干酪乳杆菌N1115刺激产生IL-12、IL-6、TNF-a浓度的检测图。

具体实施方式

以下实施例只用于说明本发明，而并不限定本发明。

实施例一样品的采集和分离

步骤1 样品采集

取25mL内蒙古传统的发酵乳制品，加入到250mL 生理盐水中，充分混匀，得到样品。

步骤2 样品的富集

取样品2mL，加入到100mL 的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液。

步骤3 菌株分离

取MRS琼脂培养基融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上。置35℃环境下厌氧培养72h（H₂：CO₂：N₂=5：10：85）。观察菌落生长情况，待平板出现典型菌落后，根据标准干酪乳杆菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化。

步骤4 菌株的纯化

挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h，重复三次；最后，将挑取的单菌落，进行革兰氏染色，显微镜下观察为革兰氏阳性、短杆、无芽孢的纯化菌株，即为获得的纯培养物，然后，将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。

上述分离纯化过程中使用的MRS培养基具有以下组成：

酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸钠：5g；柠檬酸二胺：2g；吐温-80：1g；K₂HPO₄：2g；MgSO₄·7H₂O：0.2g；MnSO₄·7H₂O：0.05g；琼脂：15g；蒸馏水：1000mL；该培养基调节pH6.8±0.1。

上述分离纯化过程中使用的LC培养基具有以下组成：

蛋白胨：10g；酵母膏：1g；牛肉膏：4g；K₂HPO₄：2g；乙酸钠：3g；柠檬酸铵：1g；MgSO₄·7H₂O：0.2g；MnSO₄·7H₂O：0.05g；干酪素酸性水解物：1g；吐温-80：1g；蒸馏水：1000mL；该培养基调节pH6.0±0.1。

实施例二细菌学特征

一、基本特征

本发明所提供的菌株干酪乳杆菌N1115的基本特性如表1所示。

表1.干酪乳杆菌N1115基本特性

由表1可见，干酪乳杆菌N1115为革兰氏阳性、短杆、无芽胞、接触酶和氧化酶试验阴性菌株；该菌株可在空气、6.5%NaCl、pH9.6或pH4.5的条件下生长；该菌株发酵葡萄糖产气试验阴性，可在10%牛奶中发酵，可在10℃和15℃条件下发酵，但不能在45℃条件下发酵。

二、生化特征

本发明的菌株干酪乳杆菌N1115是一种兼性厌氧菌，在35℃显示出最佳的生长能力。在牛乳培养基中（10%的脱脂乳），显示出了较好的产酸能力，可在48h内凝乳。本发明应用梅里埃公司生产的API 50CH 试剂条对所提供的菌株干酪乳杆菌N1115进行了糖发酵特性的检测，其原理是以基础培养基做基础，分别添加不同的碳水化合物，然后接种干酪乳杆菌N1115，观察其发酵产酸特性；其中基础培养基由以下成分组成：硫酸铵：2g；酵母膏：0.5g；胰蛋白胨：1g；酚红：0.18g；无机盐基础：10mL，pH7.8的磷酸缓冲液：1000mL。

表2. 干酪乳杆菌N1115的 Api50鉴定结果

注：“+”表示发酵；“－”表示不发酵。

三、基因特征

本实施例所提供的干酪乳杆菌N1115菌株，应用PCR对其16SrDNA测序，结果如下：

应用PCR对其延长因子Tuf基因进行测序，结果如下：

根据本实施例干酪乳杆菌N1115的上述16SrDNA序列和延长因子Tuf基因序列，可以确定：干酪乳杆菌N1115是一株新颖的干酪乳杆菌菌株。

实施例三急性毒理学试验

本实施例所提供的菌株N1115经急性毒性试验（GB15193.3—2003）检测无毒副作用，其中小鼠急性经口毒性试验结果如表3所示。实验采用的试验样品按所需剂量用牛奶配置，其中菌株N1115的浓度为7.0×10⁹cfu/mL；所用小鼠为河北省动物中心提供的清洁级昆明小鼠（试验动物许可证好：KM1107023）20只，体重18-22g，雌雄各半。

实验方法采用一次最大限量法，选用昆明种小鼠20只，剂量为10000mg/kg体重。动物实验前禁食过夜。染毒后，观察小鼠的一般情况，中毒症状和死亡情况，观察期限14天。根据试验结果计算LD₅₀，并确定急性毒性分级。

结果显示，染毒后，动物无不良反应、中毒表现和死亡情况出现。观察期满，处死所有动物，并进行解剖，经肉眼观察未发现异常的组织或脏器。雄性动物：LD₅₀＞10000mg/kg体重；雌性动物：LD₅₀＞10000mg/kg体重。按急性毒性分级LD₅₀＞10000mg/kg体重，该受试物属于无毒物。

表3.干酪乳杆菌N1115（7.0×10⁹cfu/mL）小鼠急性经口毒性试验

实施例四菌株的抗药性特征

本实施例对干酪乳杆菌N1115进行了耐药性试验（试验结果参考表4）干酪乳杆菌N1115耐药性检测：采用“抗生素类药敏纸片”（杭州天和微生物试剂有限公司）纸片方法，通过检测抑菌圈的大小检测菌株对抗生素的抗药性。

结果显示：干酪乳杆菌N1115对青霉素类、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物、头孢类、单环内酰胺类、等27种抗生素的检测结果均为阴性，表明干酪乳杆菌N1115对该27中抗生素没有抗药性。

表4.干酪乳杆菌N1115耐药性检测

实施例五干酪乳杆菌N1115耐酸耐胆盐特性

本实施例对所提供的菌株干酪乳杆菌N1115进行了耐酸耐胆盐实验。挑取1接种环菌株接种到MRS培养基中，培养35℃、72h，取出计数；同时，各取1mL该发酵液，分别加入到pH2.0磷酸盐缓冲液中（37℃孵育2h），和3‰的猪胆盐溶液（35℃孵育6h），取出后，立即进行梯度稀释（0.85%灭菌生理盐水），进行菌落培养计数，计算其存活率。

干酪乳杆菌N1115耐受酸和胆盐的特性参考表5。结果显示，干酪乳杆菌N1115具有同时耐酸和耐胆盐的特性，酸液处理后的存活率为22.92‰，胆盐溶液处理后的存活率为0.83‰。

表5.干酪乳杆菌N1115耐受酸和胆盐的特性

实施例六干酪乳杆菌N1115的API20结果

本实施例对所提供的菌株干酪乳杆菌N1115进行了酶活性研究。通过生物梅里埃公司（ApI bioMerieux ltd.）的半定量ApI Zym试纸条，共检测了19种酶的活性，分别是：Alkakin phosphatase（碱性磷酸酶）、Esterase（酯酶）、Esterase lipase（酯酶脂酶）、Lipase（脂肪酶）、Leucine arylamidase（亮氨酸氨基肽酶）、Valine arylamidase（缬氨酸芳基酰胺酶）、Cystine arylamidase（胱氨酸芳基酰胺酶）、Trypsin（胰蛋白酶）、Chymotrypsin（糜凝乳蛋白酶）、Acid phosphatase（酸性磷酸酯酶）、Phospho amidase（磷酰化酶）、ɑ-Galactosidase（ɑ-半乳糖苷酶）、?-Galactosidase（?-半乳糖苷酶）?-Glucuronidase（?-葡糖醛酸糖苷酶）ɑ-Glucosidase（ɑ-(葡萄)糖苷酶）、?-Glucosidase（?-(葡萄)糖苷酶）、N-acetyl-β-glucosaminidase（N -乙酰- β -葡萄糖苷酶）、ɑ-Mnnosidase（α-甘露糖苷酶）、ɑ-Fucosidase（ɑ-岩藻糖苷酶）。

干酪乳杆菌N1115在琼脂MRS培养基斜面上35℃培养72h；用液体MRS培养基将其冲洗下来，调节干酪乳杆菌N1115浓度为10⁹CFU/mL，得菌悬液；根据操作手册，取65μl干酪乳杆菌N1115菌悬液分别加入到试剂孔中，所有试剂条放置到35℃条件孵育24h；接着加入API试剂ZyM 1和ZyM 2，然后，通过试剂盒厂家提供的比色表，进行酶活性的读数（样品中酶的浓度以纳摩尔来表示），结果如表6所示。

表6.干酪乳杆菌N1115的酶活性测定

由表6可见，干酪乳杆菌N1115具有较高的Leucine arylamidase（亮氨酸氨基肽酶）、Valine arylamidase（缬氨酸芳基酰胺酶）、ɑ-Glucosidase（ɑ-(葡萄)糖苷酶）活性，其次为Esterase（酯酶）、Esterase lipase（酯酶脂酶）?-Galactosidase（?-半乳糖苷酶）、Acid phosphatase（酸性磷酸酯酶）的活性。

实施例七干酪乳杆菌N1115刺激产生IL-12、IL-6、TNF-a的能力

本实施例所提供干酪乳杆菌N1115可以同时刺激小鼠巨噬细胞株(J774.1)产生IL-12、IL-6、TNF-a。干酪乳杆菌N1115首先在MRS培养基中培养，35℃，培养72h；然后将其用磷酸盐缓冲液（pH7.1）洗脱下来，离心清洗2-3次。最后将离心下来的N1115悬浮于RPMI 1640培养基(Sigma公司，St Louis，MO，美国)中，菌悬液浓度为10⁸CFU/mL。

细胞株J744.1分别加入到24孔圆底的细胞培养板中，使每孔中的细胞浓度为5×10⁵细胞/2mL；在每孔中添加100μl灭活的干酪乳杆菌N1115菌悬液，放置到37℃，5%CO₂的二氧化碳培养箱，孵育4h；收集上层液体，放置于-70℃的冰箱中用于分析。L-12、IL-6、TNF-a浓度（单位为pg/mL）的检测应用商业ELISA检测试剂盒来进行，检测结果参考图1—图3。

实施例八具有免疫调节作用、含干酪乳杆菌N1115菌株的酸牛奶的制备

其制备方法如下：

将鲜牛奶加热到50-60℃，加入白砂糖（与牛奶的重体积比为6%~8%，单位g/ml），搅拌至完全溶解，预热至60℃左右，20Mpa压力下均质，95℃杀菌5分钟，冷却至35℃~40℃，接种干酪乳杆菌N1115，接种量1×10⁶cfu/mL以上。35℃~40℃发酵（发酵的同时加搅拌），至pH值为4.0~4.5即得含有活性干酪乳杆菌N1115的酸奶（存放条件：需于4℃冷藏）。

实施例九具有免疫调节作用、含干酪乳杆菌N1115菌株乳酸菌饮料的制备

取实施例八制备好的酸奶，用制备好的稀释液稀释2-3倍，混合均匀，即可制成可直接饮用的乳酸菌饮料，4℃保存。

稀释液制备方法如下：95℃热水895g，加入糖浆100g，CMC（羧甲基纤维素钠）：5g，搅拌混匀，在90℃以上的条件下，保持20分钟，然后将温至40℃，即可作为可使用的稀释液。

实施例十具有免疫调节作用、含干酪乳杆菌N1115菌株制剂的制备方法

干酪乳杆菌N1115首先在MRS培养基中培养，35℃，培养48h~72h；取发酵液1000mL，用冷冻离心机离心（温度：4℃，离心时间：10min，离心力：3000g），获得浓缩的干酪乳杆菌N1115发酵液，然后将其冷冻至-40℃~-60℃放置24h，经冷冻干燥机干燥，至含水量为3%~5%，压碎成粉末状；将上述粉末加入到奶粉、豆粉等产品中制成粉末状或片、块状产品。

此外，根据本实施例，该乳酸菌可添加到人们常用的药物组合物、营养补充品、食品、保健食品、医疗食品或其组分中。

Claims

1.一种干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）N1115，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.4691。

2.根据权利要求1所述的干酪乳杆菌N1115的应用，其特征在于：该干酪乳杆菌应用于制备酸牛奶及乳酸菌饮料。