CN102229902B

CN102229902B - 短小芽孢杆菌及其饲料添加剂、预混料和饲料防霉剂

Info

Publication number: CN102229902B
Application number: CN2011101409252A
Authority: CN
Inventors: 吴慧玲; 刘滢; 王安如; 庞洁; 闫轶洁; 周娜; 刘鹏; 汪攀
Original assignee: Zhangzhou Dabeinong Agriculture & Pasture Technology Co Ltd; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: Shenyang Yingda Technology Development Co Ltd; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2031-05-27
Also published as: CN102229902A

Abstract

本发明属于饲料科学与饲料添加剂技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌及其饲料添加剂、预混料和饲料防霉剂。本发明的短小芽孢杆菌作为一种饲料添加剂添加到饲料中，能够改善饲料品质，提高饲料中粗蛋白的含量，降低饲料中粗纤维的含量，是一种新型安全可靠、无污染的纯发酵多功能的新的微生态制剂产品。本发明的饲料防霉剂较常规防霉剂除了安全、无污染、直接制粒之外，不含化学药剂，不仅防霉效果好，抑菌力强，而且可以改善饲料品质，适口性强，同时具有用量少，可大大节约生产成本。

Description

短小芽孢杆菌及其饲料添加剂、预混料和饲料防霉剂

技术领域

本发明属于饲料科学与饲料添加剂技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌及其饲料添加剂、预混料和饲料防霉剂。

背景技术

饲料被霉菌及霉菌毒素污染是目前饲料业和畜牧业生产中不可忽视的一个问题。据联合国粮食组织估算全世界每年大约有5％～7％的粮食、饲料等农产品受霉菌的侵害，从而造成了巨大的经济损失。被霉菌污染的饲料，其营养物质被分解，适口性下降，并产生多种霉菌毒素，动物吃了发霉变质的饲料，会发生急性或慢性中毒症状，造成畜禽的生长速度缓慢，采食量下降，消化率降低，繁殖能力与免疫力下降，严重危害动物健康，甚至造成中毒死亡，给养殖业带来巨大的危害。

为了预防饲料霉变，经常采用控制饲料原料含水量和添加防霉剂的办法，防霉剂的作用在于能破坏霉菌细胞壁及细胞内的酶，使酶蛋白变性而无法参与催化作用，有效地防止霉变。常见的防霉剂有有机酸类、有机酸盐及有机酸酯类以及一些复合防霉剂，但是这些都是化学防霉剂，本身对饲料品质没有改善，同时在使用过程中对动物有刺激性，在适口性、安全性及抑菌方面存在不足。

另外，随着人们对抗生素饲料添加剂带来负面效应的意识不断提高，饲料微生态制剂是作为一种新型的抗生素替代品的添加剂，具有无毒副作用、无耐药性、无残留、效果显著等诸多优点，受到了养殖业的欢迎。但是，目前短小芽孢杆菌在中国还不是可作为直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌株，对其研究也较少。

目前国内关于短小芽孢杆菌的应用主要集中在其产碱性蛋白、脂肽及预防植物疾病方面，关于短小芽孢杆菌在动物饲料、预混料、饲料添加剂方面的应用未见报道，在饲料防霉剂的应用中也尚未有人提出。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种短小芽孢杆菌Bacillus pumilus。

本发明的另一目的是提供一种包含该短小芽孢杆菌Bacilluspumilus的饲料添加剂及包含该饲料添加剂的预混料。

本发明还提供一种包含该短小芽孢杆菌Bacillus pumilus的饲料防霉剂。

(二)技术方案

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，其保藏编号为CGMCC No.4756。

本发明还提供一种包含该短小芽孢杆菌Bacillus pumilusCGMCC No.4756的饲料添加剂，其特征在于短小芽孢杆菌Bacilluspumilus活菌数为1×10¹⁰cfu/g～1×10¹²cfu/g。

本发明提供包含上述饲料添加剂的预混料，其特征在于饲料添加剂的添加比例是2.5％，此比例为体积与质量比(体积/质量)。

本发明还提供包含上述短小芽孢杆菌Bacillus pumilus CGMCCNo.4756的饲料防霉剂，但所述饲料为包含玉米、麸皮或豆粕的动物饲料。

本发明的短小芽孢杆菌Bacillus pumilus为申请人首次在国内分离到的一株来源于动物消化道的新的短小芽孢杆菌，为申请人从牛的瘤胃中分离得到的一株芽孢杆菌优势菌株，经过生理生化及16s RNA分析鉴定，表明该菌属于短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，已于2011年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.4756。

(三)有益效果

(1)本发明的保藏编号为CGMCC No.4756的短小芽孢杆菌Bacillus pumilus为申请人首次在国内分离到的一株来源于动物消化道的新的短小芽孢杆菌，并将其作为饲料添加剂应用于动物预混料中，同时首次应用于饲料防霉剂方面；且此菌株具有耐高温的特点，因而具有不需要包被，可直接制粒的优点；

(2)本发明的短小芽孢杆菌Bacillus pumilus作为一种饲料添加剂添加到预混料中，能够改善饲料品质，提高饲料中粗蛋白的含量，降低饲料中粗纤维的含量，是一种新型安全可靠、无污染的纯发酵多功能的新的微生态制剂产品；

(3)本发明的饲料防霉剂较常规防霉剂除了安全、无污染、直接制粒之外，不含化学药剂，不仅防霉效果好，抑菌力强，而且可以改善饲料品质，适口性强，同时具有用量少，可大大节约生产成本；

(4)本发明的饲料防霉剂和添加剂的制备方法简单，操作容易。

附图说明

图1.菌株WL86的细胞形态及菌落形态

图2.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No.4756营养琼脂平板(37℃，培养2天菌落形态)

图3.PCR扩增16s rRNA序列分琼脂糖凝胶电泳分析(M.Marker；1，2.短小芽孢杆菌CGMCC No.4756)

图4.短小芽孢杆菌CGMCC No.4756抑制发酵饲料中霉菌的生长(1为对照，2为地衣芽孢杆菌，3为枯草芽孢杆菌，4为短小芽孢杆菌)A.接种短小芽孢杆菌与空白对照12天的发酵饲料；B.接种45天的发酵饲料

图5.短小芽孢杆菌CGMCC No.4756的生化反应(API 50CHB试验条生化谱)

具体实施方式

通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

实施例1短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No.4756的分离及鉴定

1、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No.4756的分离

(1)取少量采自北京市昌平牛场牛的瘤胃样本，加入无菌水稀释到一定浓度，沸水中煮10min，再用LB培养基进行芽孢杆菌的分离，共分离到89株芽孢杆菌。

(2)将分离到的89株芽孢杆菌进行耐酸实验

将LB液体培养基培养12h的短小芽胞杆菌制成浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液，分别加入1mL pH为2.5、3.0、3.5的无菌生理盐水溶液，37℃静止培养4h收集菌体并用1mL无菌生理盐水重新悬浮，使用梯度稀释法进行活菌计数，测其存活率，共挑选出耐受pH值为2.5的11株芽孢杆菌。

(3)将从步骤(2)中筛选出的11株芽孢杆菌进行耐胆盐实验

将LB液体培养基培养12h的芽胞杆菌制成浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液，分别加入1mL浓度为0％，0.1％，0.5％，0.8％，1.0％，1.2％，1.5％的无菌猪胆盐溶液，37℃静止培养6h。收集菌体用无菌生理盐水重新悬浮，使用梯度稀释法进行活菌计数，测其存活率，挑选出其中耐受胆盐浓度为1.5％的2株芽孢杆菌。

(4)将从步骤(3)中筛选出的2株芽孢杆菌进行耐蛋白酶实验

a.制备终浓度为3g/L胃蛋白酶溶液，并且调pH值到2.0，取0.5mL菌悬液加入到4.5mL模拟胃液中(10倍稀释)，置于培养箱中培养，计算存活率。

b.将浓度约10⁶cfu/mL的菌液按2％的接种量接种于含有胰蛋白酶的液体培养基中，胰蛋白酶浓度分别为(W/V％)0.8，1.2，1.6，37℃培养16h，平板计数法进行菌落计数，并计算菌株的存活率。

共筛选出1株性能耐胃蛋白酶0.4％和胰蛋白酶0.8％的性能较好的菌株，编号为WL86。

2、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No.4756的鉴定

(1)菌株WL86的细胞形态及菌落形态(图1，2)。

营养琼脂平板，37℃，培养2天细胞形态及菌落形态：菌体呈杆状，0.47μm×1.86～2.67μm，单个、成对排列；芽孢次端生，柱状，孢囊不膨大；革兰氏染色阳性。菌落微黄色、圆形、扁平、蜡状、不透明、边缘不整齐。

(2)生化反应采用法国梅里埃生物公司API50细菌鉴定系统，鉴定结果表明WL86菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，其生化反应结果如图5所示。

(3)16s rRNA序列分析显示该菌株为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，琼脂糖凝胶电泳如图3，其保藏编号为：CGMCC No.4756。

实施例2：防霉剂的制备及应用

(1)短小芽孢杆菌CGMCC No.4756与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌各自于LB液体培养基37℃好氧培养12h，调整菌体浓度达到1×10⁸，将各菌液按照10％的接种量接种于未经灭菌的玉米渣中进行发酵12天；以接种量相同的无菌水接种到发酵饲料中作为空白对照。

结果表明，短小芽孢杆菌CGMCC No.4756与枯草芽孢杆菌对于饲料发酵过程中霉菌的生长有显著的抑制作用，地衣芽孢杆菌的效果差一些，对照瓶中都长了大量的霉菌(图4-A)

(2)继续发酵45天之后，出现与步骤1同样的实验效果(图4-B)。

(3)短小芽孢杆菌CGMCC No.4756与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌各自于LB液体培养基37℃有氧培养12h，调整其菌体浓度达到1×10⁸，将上述菌液按照10％的接种量各自接种于未经灭菌的含玉米、麸皮及豆粕的发酵饲料原料中进行发酵12天。

结果表明，短小芽孢杆菌CGMCC No.4756与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌对于饲料发酵过程中霉菌的生长有显著的抑制作用，空白对照瓶中都长了大量的霉菌。

实施例3：饲料添加剂的制备及其特性

(1)短小芽孢杆菌CGMCC No.4756与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌各自于LB液体培养基37℃好氧培养12h，调整其菌体浓度达到1×10⁸，将上述菌液按照5％的接种量各自接种于未经灭菌的玉米渣中进行发酵3天，以接种量相同的无菌水接种到发酵饲料中作为空白对照。取一定量样品烘干，用无菌水溶解，进行稀释平板菌落计数分析。

结果表明，短小芽孢杆菌CGMCC No.4756与枯草、地衣芽孢杆菌活菌数没有显著差异，达到1×10¹⁰-1×10¹²cfu/g，但短小芽孢杆菌发酵饲料瓶中散发出对照瓶及枯草、地衣芽孢杆菌发酵饲料瓶中所不具有的发酵饲料的香味。

(2)将步骤(1)中发酵三天的饲料烘干进行粗蛋白、粗纤维素含量检测，粗蛋白检测方法依据GB/T 6432-1994，粗纤维检测方法依据GB/T 6434-2006。

结果表明，与对照相比，接种短小芽孢杆菌的发酵饲料中蛋白含量显著增加，粗纤维含量显著下降，蛋白含量由原来的43％增加到50％，粗纤维含量由6.21％降至5.32％；枯草芽孢杆菌发酵饲料中，蛋白含量由原来的43％增加到47.51％，粗纤维含量由6.21％降至5.84％；地衣芽孢杆菌发酵饲料中，蛋白含量由原来的43％增加到50.13％，粗纤维含量由6.21％降至5.72％。因此，接种短小芽孢杆菌的发酵饲料中蛋白含量高于对照发酵饲料以及接种枯草芽孢杆菌的发酵饲料，而接种短小芽孢杆菌的发酵饲料中粗纤维含量显著低于对照及接种枯草、地衣芽孢杆菌的发酵饲料。因此。在总体改善饲料品质方面，优于枯草、地衣芽孢杆菌。

(4)将步骤(3)中发酵72h的饲料烘干进行粗蛋白、粗纤维素含量检测，粗蛋白检测方法依据GB/T 6432-1994，粗纤维检测方法依据GB/T 6434-2006。

结果显示，与对照相比，接种短小芽孢杆菌的发酵饲料中蛋白含量显著增加，粗纤维含量显著下降，蛋白含量由原来的43％增加到50.13％，粗纤维含量由6.21％降至5.13％；枯草芽孢杆菌发酵饲料中，蛋白含量由原来的43％增加到50.12％，粗纤维含量由6.21％降至5.55％；地衣芽孢杆菌发酵饲料中，蛋白含量由原来的43％增加到49.32％，粗纤维含量由6.21％降至5.65％。因此，在改善饲料品质方面，短小芽孢杆菌优于枯草、地衣芽孢杆菌。

Claims

1.一种短小芽孢杆菌WL-86，其已于2011年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.4756。

2.一种包含权利要求1所述的短小芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于短小芽孢杆菌的活菌数为1×10¹⁰cfu/g~1×10¹²cfu/g。

3.一种包含权利要求2所述的饲料添加剂的预混料，其特征在于饲料添加剂的添加比例是体积质量比的2.5%。

4.一种包含权利要求1所述的短小芽孢杆菌的饲料防霉剂，其特征在于所述饲料为包含玉米、麸皮或豆粕的动物饲料。