CN115287202A - 一株马克斯克鲁维酵母菌及其在制备功能性饲料方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于畜禽饲料的发酵制备领域，具体涉及一株马克斯克鲁维酵母菌及其在制备功能性饲料方面的应用。该株马克斯克鲁维酵母菌分离自柴胡药渣，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24455，保藏日期：2022年3月1日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该株马克斯克鲁维酵母菌在制备中药渣发酵饲料时，可明显提高粗蛋白等营养指标；动物饲喂实验表明，可有效降低腹泻率。

Description

一株马克斯克鲁维酵母菌及其在制备功能性饲料方面的应用
技术领域
本发明属于畜禽饲料的发酵制备领域，具体涉及一株马克斯克鲁维酵母菌及其在制备功能性饲料方面的应用。
背景技术
抗生素在畜禽生产中的滥用造成其在畜禽产品中的残留和蓄积，并通过食物链危害人类健康。抗生素还诱导畜禽体内的细菌产生耐药性，导致畜禽抗生素依赖，自身免疫力下降。另外，畜禽体内未分解的抗生素可通过粪便污染环境，导致环境微生物产生耐药性，进而引起耐药菌和耐药基因在环境中的传播，严重危害生态安全。中草药具有抗应激作用，不但能促进动物生长、调节动物免疫力，还能改善畜禽产品质量，是“替抗产品”的首选。
近年来，中医药产业得到了快速发展，中药材的加工过程中产生了大量的药渣，中药渣一般为湿物料，长时间堆放极易腐坏变臭，对周围环境造成污染。中药生产企业对中药渣的处理多采用简单粗暴的手段如堆放、填埋或焚烧。如果这些药渣用作饲料，每年可节省大量的玉米，有助于解决“人畜争粮”问题。
中药渣含有大量有机营养物和微量元素，是一类非常重要的生物资源，对其进行充分的资源化利用，不仅能够延长中药产业链，提高经济效益，还能够有效解决药渣导致的环保问题。中药渣的资源化利用途径主要集中在食用菌栽培、有机肥料、畜禽饲料及添加剂及能源化利用等方面。直接用作肥料会导致农作物会发生病虫害；能源化需要设备投资较大。用作畜禽饲料或饲料添加可以有效促进动物生长，提高动物机体免疫力、降低腹泻率和死亡率，提高饲料转化率；还能调节代谢，促进生长、改善肉质。
公布号为CN112167435A的中国发明专利申请公开了一种利用酵母发酵的中药固态发酵产物，其是利用枯草芽孢杆菌、乳酸芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、米曲霉和酿酒酵母来发酵中药渣。常规菌种在发酵中药渣时的受限较大，发酵药渣的效果也有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的是提供一株马克斯克鲁维酵母菌，从而进一步改善其对中药渣的发酵效果。
本发明的第二个目的是提供上述马克斯克鲁维酵母菌在制备功能性饲料方面的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一株马克斯克鲁维酵母菌，其分类命名为马克斯克鲁维酵母JBH-BJM4(Kluyveromyces marxianus)，保藏编号为CGMCC NO.24455。
该株马克斯克鲁维酵母菌分离自柴胡药渣，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24455，保藏日期：2022年3月1日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该株马克斯克鲁维酵母菌在制备中药渣发酵饲料时，可明显提高粗蛋白等营养指标；动物饲喂实验表明，可有效降低腹泻率。
上述马克斯克鲁维酵母菌在制备功能性饲料方面的应用，所述功能性饲料为中药渣发酵饲料。
使用上述马克斯克鲁维酵母菌制备中药渣发酵饲料，可明显提高粗蛋白等指标，降低饲喂畜禽的腹泻，减轻粪便臭味。
优选地，所述中药渣发酵饲料由含马克斯克鲁维酵母菌的发酵菌剂对含有中药渣的固体发酵培养基进行固态发酵制得。
进一步优选地，所述中药渣为柴胡药渣。
优选地，所述固体发酵培养基由含有所述柴胡药渣的固体原料、氮源、磷源和硫酸镁组成，所述固体原料由以下重量份的原料组成：柴胡药渣100份～200份，麸皮100～150份，玉米粉20～30份；氮源相对于柴胡药渣的加入量为0.8～1.6g/Kg，磷源相对于柴胡药渣的加入量为0.8～1.6g/Kg，硫酸镁相对于柴胡药渣的加入量为1.2～2.4g/Kg，所述氮源为尿素或硫酸铵，所述磷源为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。
优选地，马克斯克鲁维酵母菌制成菌液形式，所述发酵菌剂还包括枯草芽孢杆菌菌液和乳酸菌菌液，马克斯克鲁维酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、乳酸菌菌液的活菌数分别为(3～4)×108cfu/mL、(8～9)×108cfu/mL、(2～3)×109cfu/mL，接种量分别为1～4％、1～5％、1～5％。上述菌种中，本发明利用的是枯草芽孢杆菌、乳酸菌的一般特性，利用常规枯草芽孢杆菌、乳酸菌即可达到相应效果。优选地，枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.15560；乳酸菌为凝结芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.22951。采用上述枯草芽孢杆菌、乳酸菌，在中药渣发酵过程中的适应性更好，有利于获得发酵效果更好的功能性饲料。
优选地，所述发酵菌剂还包括粗糙脉孢菌菌液，粗糙脉孢菌菌液的活菌数为(1～2)×109cfu/mL，接种量为2～8％。
进一步优选地，粗糙脉孢菌的保藏编号为CGMCC No.40085。进一步添加粗糙脉孢菌发酵后，可使发酵产品中粗纤维含量更低，粗蛋白蛋白质和有机酸含量更高。
优选地，所述固态发酵在带放气阀的发酵袋中进行，于25～30℃发酵3～15天。
附图说明
图1为本发明中马克斯克鲁维酵母JBH-BJM4的菌落图；
图2为本发明中马克斯克鲁维酵母JBH-BJM4的菌体图；
图3为本发明中马克斯克鲁维酵母JBH-BJM4的系统进化树；
图4为本发明中柴胡药渣发酵过程中的pH变化图。
具体实施方式
柴胡是我国重要的中草药，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等功能，这些效用均源于其次生代谢产物。柴胡皂苷是柴胡中最重要的药效物质，含量可高达柴胡根干重的7％。水煮法是我国目前常用的中药提取方法。研究发现柴胡经煎煮后的药渣中仍然含有大量的皂苷，具有较高的利用价值。柴胡中的柴胡多糖具有一定的免疫调节作用，是一种重要的免疫调节剂。
本发明以柴胡药渣为主要原料，添加复合菌种经过发酵后制得功能性蛋白饲料，其中既含有柴胡的有效成分，又含有益生菌，饲用效果良好。
益生菌可以调控肠道微生物菌群，帮助宿主恢复免疫系统。饲料中添加益生菌除具有抗毒素和减少腹泻作用外，还可改善肠道健康、提高营养物质消化率，从而提高畜禽的生产性能。枯草芽孢杆菌能够分泌蛋白酶和脂肪酶，帮助消化，有助于提高饲料利用率，是在饲料中应用最广泛的益生菌，而且分离自中药渣的原生菌种发酵药渣的效果更好；凝结芽孢杆菌产乳酸能力强、生长速度快，且能够在宿主肠道中定植，有助于调节肠道微生物菌群平衡，提高营养物质吸收和机体生长性能。将自柴胡药渣中分离得到的马克斯克鲁维酵母菌用于柴胡药渣发酵，发酵效果较常规酵母菌具有更好的发酵效果。
下面结合附图和具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。
实施例1马克斯克鲁维酵母菌的菌种筛选
本实施例对保藏编号为CGMCC No.24455的马克斯克鲁维酵母JBH-BJM4(Kluyveromyces marxianus)的筛选过程说明如下：
(1)菌种筛选
肉汤琼脂培养基(g/100mL)组成：蛋白胨1，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，琼脂1.5，溶剂为去离子水，pH值7.4。
将柴胡药渣用无菌水稀释不同倍数，稀释液分别涂布到肉汤琼脂培养基平板上，于37℃培养过夜，挑取肉汤琼脂培养基平板上长出的白色圆形菌落，用平板划线的方法接种到新鲜的肉汤PDA琼脂培养基平板上培养36h，按照以上方法分离纯化3次，得到纯菌株。
(2)菌种鉴定
1)形态学特征
菌株的菌落(图1)表现为圆形、乳白色、凸起、透明、表面光滑、边缘整齐。菌体(图2)呈椭圆形，大小约为4-8mm，出芽生殖，单个、两个或多个形成串连状。
2)分子生物学方法鉴定
2.1、菌丝体的制备
将纯化后的菌种接种于普通肉汤培养基(除不加琼脂外，其他成分与肉汤琼脂培养基相同)中，于28℃培养36～48h，菌液于5000r/min离心20min，所得沉淀(菌丝体)于-20℃冷冻保存24h。
2.2、DNA的提纯
将冷冻菌丝体解冻后摇匀，超声震荡10min，然后于5000r/min离心10min。在沉淀中加入氯化苄提取缓冲液(pH＝9.0)后充分震荡摇匀，50℃水浴1～2h，每隔10min摇匀一次，待菌丝体完全溶解后加入0.1M乙酸钠溶液(pH＝5.2)，然后冰浴15min，冰浴后于5000r/min离心15min。在上清液中加入异丙醇混匀后室温沉淀20min，再于5000r/min离心10min，沉淀用80％乙醇洗涤两次，加入1×TE溶解得到DNA粗品。在DNA粗品中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，轻轻上下颠倒30次，于18℃、12000r/min离心5min，上清液即为纯DNA。
2.3、PCR扩增及电泳检测
以菌体DNA为模版，采用18S rRNA通用引物NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS2(5’-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3’)对菌株的18S rRNA基因片断进行PCR扩增。PCR扩增体系20μL包含上下游引物各0.5μL，提取的DNA模板0.5μL(10～100ng/μL)，无菌超纯水8.5μL，2×Ex Tap酶10μL。PCR扩增程序：(94℃，5min)+{(94℃，30s)+(55℃，30s)+(72℃，1min)}×30+(72℃，7min)。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳验证纯度后送北京擎科生物技术有限公司进行测序。
通过BioEdit 7.2.6查看测序结果的序列峰图，选取波峰波谷清晰连续可读的碱基序列，在NCBI数据库中通过BLAST系统，将目的序列与核酸序列库GenBank中的序列进行同源比对，确定该菌株为马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)。下载多个相似序列，使用MEGA8.5软件构建系统进化树，结果如图3。将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24455，株名：JBH-BJM4，保藏日期：2022年3月1日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
马克斯克鲁维酵母细胞壁中具有更多的α-1,3-甘露糖，具有更佳的提高动物自身免疫力的能力；能分泌更多的β-1,3-葡聚糖，从而更好地促进巨噬细胞功能，清除体内损伤、衰老的自身细胞及侵入体内的病原微生物。能快速消耗D-乳酸，保护动物免于乳酸中毒，可以减少仔猪存的乳糖不耐受症；能产生更多的单细胞蛋白。因此，更适合用作发酵饲料的菌种。
实施例2固态发酵种子液的制备
本实施例对固态发酵种子液的制备过程进行说明：
(1)菌种组成
本发明共涉及四种菌种的使用，马克斯克鲁维酵母已在实施例1中进行说明。粗糙脉孢菌、凝结芽孢杆菌(CN113652373A)和枯草芽孢杆菌(CN109022318A)为本试验室分离并进行了专利保藏的菌株，其保藏编号分别为CGMCC No.40085，CGMCC No.22951和CGMCCNo.15560。粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)JBH-BCZ1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.40085，保藏日期：2022年3月1日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
马克斯克鲁维酵母菌具有很强的酶生产能力，可以分泌菊粉酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶、羧肽酶、等十多种水解酶类；枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶和脂肪酶等，帮助消化，有助于提高饲料利用率，是在饲料中应用最广泛的益生菌；凝结芽孢杆菌生乳酸能力强、生长速度快，且能够在宿主肠道定植，调节肠道微生物菌群平衡，提高营养物质吸收和机体生长性能。
(2)发酵培养基
马克斯克鲁维酵母菌活化培养基(肉汤培养基)组成为：胰蛋白胨2g、Nacl 2g、酵母膏1g，纯净水100mL，pH 6.8。扩大培养培养基组成为：葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母膏1g，纯净水100mL，pH 6.8。
枯草芽孢杆菌活化和扩大培养均用肉汤培养基。
凝结芽孢杆菌活化培养基(YPD培养基)组成为：葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母膏1g，纯净水100mL，pH 6.8。扩大培养基用MRS培养基，其组成为：蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母粉0.5g，K2HPO4 0.2g，柠檬酸二铵0.2g，乙酸钠0.5g，葡萄糖2g，吐温80 0.1mL，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4 4H2O 0.025g，蒸馏水100mL，自然6.3。
真菌(粗糙脉孢菌)活化培养基为肉汤培养基。扩大培养基组成为：为马铃薯20g、葡萄糖2.5g、去离子水100mL，自然pH。
(3)菌种培养方法
酵母菌培养方法：将马克斯克鲁维酵母斜面菌种接入100mL活化培养基中加，于30℃，150r/min培养48h。然后在200mL扩大培养基中加入8mL种子液，于30℃，150r/min培养48h得酵母发酵液，其活菌数为3.3×108cfu/mL。
芽孢杆菌培养方法：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入100mL活化培养基中，于37℃，180r/min培养24h。然后在200mL扩大培养基中加入8mL种子液，于37℃，180r/min培养48h得芽孢杆菌发酵液，其活菌数为8.5×108cfu/mL。
乳酸菌培养方法：将凝结芽孢杆菌斜面菌种接入100mL活化培养基中，于37℃培养24h。然后在200mL扩大培养基中加入8mL种子液，于37℃静置培养24h得乳酸菌发酵液，其活菌数为2.1×109cfu/mL。
真菌培养方法：在100mL活化培养基中接入菌种的孢子，于28℃，200r/min培养48h。然后在200mL扩大培养基中加入8mL种子液，于28℃静置培养48h得真菌菌发酵液，其活菌数为1.9×109cfu/mL。
实施例3制备功能性饲料一
本实施例说明马克斯克鲁维酵母菌在制备功能性饲料方面的应用，具体过程如下：
(1)发酵饲料的制备
取粉粹后的柴胡药渣0.75kg(柴胡药渣原料含水量30～40％，粉碎时用绞肉机粉碎4次，每次30秒)、麸皮0.375kg、玉米粉0.075kg混合均匀，在121℃灭菌20min，待其冷却后加入硫酸铵1.2g、磷酸二氢钾1.2g和硫酸镁1.8g混合均匀制得固体发酵培养基。取固体发酵培养基1.2kg，装于带单向放气阀的发酵袋，每袋200g，将菌液按照不同比例加入袋中，搅拌均匀后封口，置于培养箱中于30℃培养7天，期间每天通过抖动使物料混合均匀。
菌液的接种量“％”为每100g固态发酵培养基加入的菌液体积(mL)。固体发酵培养基中菌液(组成见表1)的总量为10mL，药渣加菌液后含水量为46.75％，发酵结果见表1。
表1发酵剂菌种组成及发酵结果
Figure BDA0003789880710000061
Figure BDA0003789880710000071
表1中，芽孢杆菌即实施例2涉及的枯草芽孢杆菌，乳酸菌即实施例2涉及的凝结芽孢杆菌，酵母菌即实施例2涉及的马克斯克鲁维酵母菌。
由表1可以看出第2种配方(第2组)发酵后，气味较好，有甜味，放置30天后无发霉现象。其他配方发酵后产品，酸味较重且没有甜味，气味一般。放置30天后，有轻微发霉现象，自行长出的真菌有可能是有害菌。选第2种配方深入研究，并进行批量培养和饲喂试验。
(2)中药渣发酵过程中pH变化
药渣固态发酵过程中pH变化趋势如图4所示，发酵前2天pH迅速降低到5.2，然后稳定了2天，第4天又开始缓慢降低，第7天降低到5.0。可能原因是前两天酵母菌和枯草芽孢杆菌生长迅速，酵母菌和乳酸菌产生的酸性物质使pH迅速降低，2天后枯草芽孢杆菌降解培养原料中的蛋白质产生的碱性物质和酵母菌产生的酸性物质中和，使pH稳定一定时间，随后乳酸菌成为优势菌种，使pH值进一步降低。
(3)发酵前后饲料成分变化
本实验例比较市售饲料用啤酒酵母(第1组)和实施例2涉及的马克斯克鲁维酵母(第2组)按以上第2种配方进行发酵。啤酒酵母、马克斯克鲁维酵母的菌液形式及活菌数一致，其他菌种和发酵方法相同。
发酵产品的指标评价结果如下表2所示。多糖含量用3,5-二硝基水杨酸法测定，粗纤维用酸碱洗涤法，粗蛋白用凯氏定氮法，有机酸含量用酸碱滴定法。
采用SAS(Statistical Analysis)7.2版本进行统计分析和方差分析，结果以P＜0.05为显著。显著性差异用字母标记法表示：首先将全部平均数从大到小依次排列，然后在最大的平均数上标字母a；并将该平均数与以下各平均数相比，凡相差不显著的，都标上字母a，直至某一个与之相差显著的平均数，标记字母b；再以该标有b的平均数为标准，与上方各个比它大的平均数比较，凡不显著的也一律标以字母b；再以标有b的最大平均数为标准，与以下各未标记的平均数比，凡不显著的继续标以字母b，直至遇到某一个与其差异显著的平均数标记c。药渣发酵前后的指标见表2。
表2发酵对药渣主要成分的影响
Figure BDA0003789880710000072
Figure BDA0003789880710000081
(a、b、c：凡有一个相同标记字母的即为显著不差异；凡具不同标记字母的即为显著差异(P＜0.05))
由表2的结果可以看出，经由酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌组成的复合菌种发酵后药渣中粗纤维含量降低，多糖、粗蛋白和有机酸增加。马克斯克鲁维酵母组和啤酒酵母组相比，粗蛋白质含量明显增加。
(4)喂养试验结果
喂养方法如下：
于夏天进行本试验，以便充分发挥柴胡的疏散、退热作用。选用300头体重相近的育肥猪(87.5±1.0kg)，采用单因子完全随机试验设计，分为对照组和两个处理组(第1组用啤酒酵母，第2组马克思克鲁维酵母，其他菌种和发酵方法相同)，每组10个重复，每个重复10头，试验期30天。
处理组饲料中含有20％的本实施例的发酵饲料和80％的市售育肥料，对照组饲养100％市售育肥料，其余饲养条件相同。在试验开始前和试验结束时分别测算各组猪的平均采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料肉比(F/G)。以考察本发明发酵饲料对育肥猪猪生长性能的影响。同时考察腹泻率和粪便的臭味。数据分析方法同(3)，试验结果如表3：
表3不同发酵饲料对育肥猪生长性能的影响
Figure BDA0003789880710000082
(a、b、c：凡有一个相同标记字母的即为显著不差异；凡具不同标记字母的即为显著差异(P＜0.05))
从表3中结果可以看出，添加发酵药渣制备的饲料以后，育肥猪的平均采食量和平均日增重(ADG)增加，料肉比降低，试验组的腹泻率显著降低、粪便臭味明显减轻，使用马克思克鲁维酵母为菌种的实验组腹泻率降低更明显。
实施例4制备功能性饲料二
本实施例说明马克斯克鲁维酵母菌在制备功能性饲料方面的应用，具体过程如下：
(1)发酵饲料的制备
取粉粹后的柴胡湿药渣0.75kg、麸皮0.375kg、玉米粉0.075kg混合均匀，在121℃灭菌20min，待其冷却后加入硫酸铵1.2g、磷酸二氢钾1.2g和硫酸镁1.8g，混合均匀后制得固体发酵培养基。取固体发酵培养基1.2kg，装入带单向放气阀的发酵袋。将菌液(真菌液除外)按照不同比例加入袋中，每袋200g，搅拌均匀后封口，于30℃培养7天后pH降低为5.2左右时，加入真菌培养液，继续发酵7天。
固体发酵培养基中菌液(组成见表4)的总量为10mL，加菌液后的药渣含水量为46.75％。发酵后气味、活菌数、pH值和颜色如表4。
表4发酵剂菌种组成
Figure BDA0003789880710000091
表4中，芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、真菌分别为本发明实施例2涉及的菌种。
第3种(组)配方发酵后，味道较好，有甜味，有大量的黄色的真菌丝。其他配方发酵后产品味道一般，没有甜味。黄色可能具有诱食作用，所以选第3种配方深入研究，并进行批量培养和饲喂试验。
(2)发酵前后饲料成分变化
发酵前后主要指标多糖、粗纤维、粗蛋白和有机酸含量见表5。各指标检测以及统计方法同实施例3。
表5发酵对药渣主要成分的影响
Figure BDA0003789880710000092
与实施例3的结果对比，发酵剂中加入真菌后发酵产品中粗纤维含量更低，粗蛋白蛋白质和有机酸含量更高。
(3)喂养试验结果
喂养方法与实施例3相同。试验结果如表6所示：
表6不同发酵饲料对育肥猪生长性能的影响
Figure BDA0003789880710000101
由表6的结果可知，与对照组相比，实验组饲料利用率增加、料肉比降低，育肥猪的粪便臭味降低。真菌组与无真菌组(实施例3实验组2)相比，无真菌组粪便臭味更小，真菌组的料肉比指标更为优异。

Claims (10)

1.一株马克斯克鲁维酵母菌，其特征在于，其分类命名为马克斯克鲁维酵母JBH-BJM4(Kluyveromyces marxianus)，保藏编号为CGMCC NO.24455。
2.一种如权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母菌在制备功能性饲料方面的应用，其特征在于，所述功能性饲料为中药渣发酵饲料。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述中药渣发酵饲料由含马克斯克鲁维酵母菌的发酵菌剂对含有中药渣的固体发酵培养基进行固态发酵制得。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述中药渣为柴胡药渣。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述固体发酵培养基由含有所述柴胡药渣的固体原料、氮源、磷源和硫酸镁组成，所述固体原料由以下重量份的原料组成：柴胡药渣100份～200份，麸皮100～150份，玉米粉20～30份；氮源相对于柴胡药渣的加入量为0.8～1.6g/Kg，磷源相对于柴胡药渣的加入量为0.8～1.6g/Kg，硫酸镁相对于柴胡药渣的加入量为1.2～2.4g/Kg，所述氮源为尿素或硫酸铵，所述磷源为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，马克斯克鲁维酵母菌制成菌液形式，所述发酵菌剂还包括枯草芽孢杆菌菌液和乳酸菌菌液，马克斯克鲁维酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、乳酸菌菌液的活菌数分别为(3～4)×108cfu/mL、(8～9)×108cfu/mL、(2～3)×109cfu/mL，接种量分别为1～4％、1～5％、1～5％。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.15560；乳酸菌为凝结芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.22951。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵菌剂还包括粗糙脉孢菌菌液，粗糙脉孢菌菌液的活菌数为(1～2)×109cfu/mL，接种量为2～8％。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，粗糙脉孢菌的保藏编号为CGMCC No.40085。
10.如权利要求3、5、6、7、8或9所述的应用，其特征在于，所述固态发酵在带放气阀的发酵袋中进行，于25～30℃发酵3～15天。
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