CN116240121A - 马克斯克鲁维酵母菌、发酵方法、组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及马克斯克鲁维酵母菌、发酵方法、组合物及其用途，具体而言，本申请提供一种马克斯克鲁维酵母菌，其分类命名为马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）CJA0004，其保藏编号为CCTCC No.M20211604。由该菌株发酵得到的产物具有更佳的风味和更高的胞内总细胞蛋白产量。
Description
技术领域
本申请属于生物发酵技术领域，具体而言，本申请涉及一种马克斯克鲁维酵母菌及其用途。
背景技术
马克斯克鲁维酵母菌(Kluyeromyces marxianus)是广泛存在于自然界的一种非致病性酵母菌，其具有降解酶种类多和分解能力强的良好生物特性，在乳制品中作为乳糖酶和菊粉酶的重要来源，其在农业生产中广泛使用，安全性也得到了欧洲食品安全委员会(EFSA)的认可。马克斯克鲁维酵母菌具有高的分泌蛋白的能力和高的生物量，可用于生产酶制剂，并且可以用来构建重组蛋白表达系统，并且，马克斯克鲁维酵母菌能提供蛋白、核酸、多糖、维生素等营养成分，补充人和动物生长过程中所需营养成分，能帮助抗氧化、代谢乳糖及脂质。
然而，现有的马克斯克鲁维酵母菌体添加量的增加以及酶解产物的产生，导致包含菌体或酶解产物的食品制剂口味比较差，因此，急需寻找新的马克斯克鲁维酵母菌以解决食品制剂风味不佳等问题。
发明内容
为了克服现有技术上的缺陷，本申请的目的在于提供一种新的马克斯克鲁维酵母菌，以至少改善包含其的食品制剂风味不佳的问题。
本申请第一方面提供了一种马克斯克鲁维酵母菌，其分类命名为马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）CJA0004，其保藏编号为CCTCC No. M 20211604。
本申请所述的马克斯克鲁维酵母菌，保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：武汉大学；保藏日期为2021年12月20日。
本申请第二方面提供了一种本申请第一方面所提供的马克斯克鲁维酵母菌的发酵方法，包括：所述马克斯克鲁维酵母菌在氮源和碳源存在下进行发酵，收集菌体；任选地，还包括分离纯化单细胞蛋白。
本申请第三方面提供了本申请第一方面所提供的马克斯克鲁维酵母菌在制备食物产品或饲料添加剂的用途。
本申请第四方面提供了一种食品组合物或饲料组合物，其包含本申请第一方面所提供的马克斯克鲁维酵母菌。
本申请提供的马克斯克鲁维酵母菌，其菌体干粉、低温及高温水溶解物的酵母味和苦味均明显降低，改善了产物的口味。进一步的，发明人发现，本申请的马克斯克鲁维酵母菌生产的单细胞蛋白产量高，胞内总蛋白的摇瓶发酵产量总和约为41%。
附图说明
图1为本申请的马克斯克鲁维酵母菌在KDM固体培养基中的形态；
图2为本申请的马克斯克鲁维酵母菌在YPD固体培养基中的形态；
图3为本申请的马克斯克鲁维酵母菌在YPD液体培养基中的细胞形态；
图4为本申请的扩增的马克斯克鲁维酵母菌的ITS、26S rRNA、18S rRNA基因片段的电泳图；
图5为本申请的马克斯克鲁维酵母菌的ITS、26S rRNA、18S rRNA基因片段TA克隆筛选结果电泳图。
具体实施方式
本申请第一方面提供了一种马克斯克鲁维酵母菌，其分类命名为马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）CJA0004，其保藏编号为CCTCC No. M20211604，本申请中，所述马克斯克鲁维酵母菌还可简称为CJA0004。
发明人在对马克斯克鲁维酵母菌进行筛选的时候，出人意料地发现，本申请的马克斯克鲁维酵母菌，其干粉、低温、高温水溶物具有较弱的酵母味和苦味，具有更良好的口味。不限于任何理论，发明人认为，本申请的马克斯克鲁维酵母菌会产生多种功能酶，包括蛋白酶、酯酶和自溶酶等，这些酶的种类、含量、比例可能不同于现有的马克斯克鲁维酵母菌，因此其发酵产物制备的菌制剂口感更佳。
本申请第二方面提供了一种本申请第一方面所提供的马克斯克鲁维酵母菌的发酵方法，包括：所述马克斯克鲁维酵母菌在氮源和碳源存在下进行发酵，收集菌体；任选地，还包括分离纯化单细胞蛋白。
本申请中的“发酵”，指马克斯克鲁维酵母菌通过在有氧条件下的生命活动，来制备菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。
本申请中的“单细胞蛋白”具有其一般含义，在本申请中可指由本申请的马克斯克鲁维酵母菌发酵产生的蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。本申请中所述的术语“发酵产物”是指通过包括使用发酵生物进行的发酵步骤在内的方法生产的产物，可以包括本申请中的马克斯克鲁维酵母菌CJA0004的菌体和/或由其产生的单细胞蛋白。
本申请对收集菌体的方法不做限定，可采用本领域的常规的方法，例如离心、过滤，本申请对所述分离纯化的方法不做限定，可采用本领域的常规方法，例如沉淀法、膜分离法、过滤法、絮凝法等。
在一些实施方式中，所述碳源至少包括葡萄糖。在一些实施方式中，所述碳源还可以包括甘油、蔗糖、乳糖、木糖、糖蜜中的至少一种。
在一些实施方式中，所述氮源至少包括酵母提取物或酵母粉。在一些实施方式中，所述氮源还可以包括玉米浆、硫酸铵、乳清粉、胰蛋白胨中的至少一种。
在一些实施方式中，所述碳源与所述氮源的质量比为(1-5)︰1。发明人发现，在所述比例下，有利于菌体快速增殖，得到口味更佳的发酵产物。
在一些实施方式中，发酵时间为24-96小时。发明人发现，发酵时间过短，发酵产物产量较低，发酵时间过长，菌体发生老化，影响发酵产物的品质。
在一些实施方式中，发酵温度为25-45℃。发酵温度过低，发酵速度慢，发酵温度过高，影响菌体活性，发明人发现，当发酵温度在所述温度范围内时，有利于提高发酵速度和发酵产物的品质。
在一些实施方式中，所述马克斯克鲁维酵母菌的接种量为0.05％-5％，接种量过低，不利于菌体的快速增殖，接种量过高，增殖速率过快，菌体易发生老化，影响发酵产物的品质。
在一些实施方式中，所述马克斯克鲁维酵母菌在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD培养基）中进行发酵。发明人发现，所述马克斯克鲁维酵母菌在上述培养基中发酵有利于菌种生长、繁殖和合成产物。本申请中，采用的培养基的配方均为本领域的常规配方，以YPD培养基为例，其可以包含酵母粉1wt%、蛋白胨2 wt %、葡萄糖2 wt %，如为固体培养基，还可以包含琼脂2 wt %；所述培养基可以在121℃灭菌15 min获得。
本申请第三方面提供了本申请第一方面所提供的马克斯克鲁维酵母菌在制备食物产品或饲料添加剂的用途。
在本申请的一些实施方式中，可以通过所述CJA0004菌株对相应底物进行发酵，用于制备食物产品；在本申请的另一些实施方式中，还可以以所述CJA0004菌株或其生产的单细胞蛋白作为其他菌株，例如乳酸菌的发酵底物，从而制备食物产品；在本申请的另一些实施方式中，所述CJA0004菌株可以直接添加至食物产品中。
本申请第四方面提供了一种食品组合物或饲料组合物，其包含本申请第一方面所提供的马克斯克鲁维酵母菌。
下面详细描述本申请的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
菌株分离
（1）将2021年4月从内蒙古地区采集的样品（干奶豆腐）5 g加入45 mL无菌生理盐水，超声30 min，取溶液梯度稀释10-5、10-6、10-7、10-8倍，稀释液涂布至固体分离培养基KDM中，30℃培养48 h。
（2）将呈淡蓝色的类似酵母菌株的单菌落划线至固体培养基YDP中培养。挑选单菌落重复划线。
（3）将纯化后的单菌落接种至YPD液体培养基中，30℃恒温培养18-28 h，通过口味筛选（包括酵母味和苦味），获得口感最佳（酵母味和苦味最淡）的一株，命名为CJA0004，将获得的菌液保存至甘油管中。
上述分离步骤中，固体分离培养基KDM的成分为：酵母膏5 g/L；蛋白胨3 g/L；麦芽提取物3g/L；葡萄糖10 g/L；琼脂 20g /L，115℃高压灭菌，冷却至45 ~ 50℃，加入XGal0.08mg/L；IPTG 0.1 mg/L；氯霉素0.5 mg/L。YPD液体培养基为：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、121℃灭菌15min。
CJA0004菌的鉴定
（1）CJA0004菌的形态
图1为CJA0004菌在KDM固体培养基中的形态，其菌落呈圆形，淡蓝色，中间凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐；图2为CJA0004菌在YPD固体培养基中的形态，其菌落呈白色，圆形，中间凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。这些表现与马克斯克鲁维酵母的细胞形态基本一致。图3为CJA0004菌在YPD液体培养基中的显微放大图（40倍）。
（2）CJA0004菌的测序分析
a. ITS、26S和18S序列扩增
在对CJA0004菌株进行测序和构建系统发育树之前，需先提取该CJA0004菌的基因组DNA。本申请使用酵母基因组DNA提取试剂盒（索莱宝，货号D1900）提取DNA。为了对未知酵母菌株的分类学进行研究，通过扩增ITS、26S rRNA、18S rRNA基因片段以及构建系统发育树，上述方法通常被用于酵母的检测和鉴定。
以CJA0004菌株的基因组DNA为模板，通过PCR扩增ITS、26S rRNA、18S rRNA基因片段，采用的引物如表1所示。PCR反应体系包括10 × buffer 2.5 μL，Mg2+ (25 mmol/L) 1.5μL，Taq酶0.25 μL，dNTP (25 mmol/L) 0.3 μL，正向引物(10 mmol/L) 0.5 μL，反向引物(10 mmol/L) 0.5 μL，模板DNA 0.1 μL，去离子水19.35 μL。PCR扩增条件为：95℃条件下变性，55℃条件下退火，72℃条件下延伸，该过程循环30次，之后72℃条件下延伸10 min，PCR反应结束后将产物放置4℃条件下保存。用1％的琼脂糖并加入适量核酸染色剂GelRed配制凝胶块，在凝胶块中加入适量PCR产物和包含各种长度片段的DNA标记物(DNA Maker)后，放置于装有TBE(Tris硼酸)缓冲液的电泳仪内，在一定电压下工作20 min后取出，放置于凝胶成像系统中进行观察以检验PCR扩增反应是否成功，扩增结果电泳图如图4所示。然后将PCR产物送往测序公司测序，测序所需要的引物与扩增所用引物相同。
表1
图4结果表明从CJA0004染色体扩增获得ITS、26S和18S序列，可用于后续TA克隆实验。b. ITS、26S和18S序列的TA克隆
为了得到更准确的序列结果，将ITS、26S rRNA、18S rRNA基因片段进行TA克隆，得到重组T质粒，筛选阳性克隆进行测序。
从平板筛选出多个阳性克隆子，提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，其中将ITS-1、ITS-3、ITS-8、26S-1、26S-4、26S-12、18S-2、18S-5、18S-14的菌液送华大基因测序。
c. 系统发育树分析
ITS一共测了三个TA克隆子，测序都测通了全长，长度均为721 bp，但是两两比对发现有少量个碱基不一致，但其测序峰图，显示不一致的碱基的图都是正常的，因此有可能ITS同时扩增了不同的拷贝，发育树表明，与CJA0004菌株最相似的菌株均为马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus) CCT 7735。
26S一共测了三个TA克隆子，单端引物测通，但是只有选取的1和4测序长度正常，但是比对也有碱基不一致，其测序峰图正常的，发育树表明，与CJA0004菌株最相似的菌株也为KluyveromycesmarxianusCCT 7735。
18S比对结果显示，与CJA0004菌株最相似的菌株为KluyveromycesmarxianusCCT7735，但是发育树表明最相似的菌株为KluyveromycesmarxianusDMKU3-1042。
综合上述鉴定结果，本申请CJA0004酵母菌株为马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)。
本申请的CJA0004菌株已于2021年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为中国，武汉，武汉大学），保藏号为CCTCC No. M20211604，分类命名为马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus) CJA0004。
实施例2：CJA0004菌株的发酵
采用YPD固体培养基平板培养实施例1获得的CJA0004菌株，30℃培养48小时；
挑取步骤1）获得的单菌落，用5 mL YPD液体培养基活化培养，30℃培养15-18小时；
将步骤2）得到的菌液，采用50 mL YPD液体培养基扩大培养，30℃培养15-18小时，以OD=1时终止培养；
将步骤3）获得的菌液接种于新的YPD培养基中，进行摇瓶发酵，接种量2%，装液量200 mL/L；30℃，220 rpm摇床培养36小时；
5）监控发酵液指标，于平台期收集菌体；
6）凯氏定氮法检测CJA0004发酵后的菌体蛋白含量，约为菌体质量的41%。该结果说明，本申请的CJA0004菌株具有更高的胞内总蛋白产量。
实施例3：CAJ0004菌株单细胞蛋白风味评价
将本申请实施例2获得的菌体，以及市售的马克斯克鲁维酵母菌（购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号为CICC NO. 1953）的冻干粉各1 g，分别溶于4 g常温水中，随机选取10名志愿者品尝，并对其口味进行了打分，结果如表2所示。其中酵母味1-5分，苦味1-5分，分数越低，品质越高，口味越好。
表2
结果表明，本申请的CJA0004菌种的口味明显优于其他马克斯克鲁维酵母菌，实现了口味的改善。不限于任何理论，发明人认为，本申请的马克斯克鲁维酵母菌会产生多种功能酶，包括蛋白酶、酯酶和自溶酶等，这些酶的种类、含量、比例可能不同于现有的马克斯克鲁维酵母菌，因此其发酵产物制备的菌制剂口感更佳；另一方面，本申请的马克斯克鲁维酵母菌CJA0004在发酵过程中，胞外蛋白分泌减少，从而引起胞内蛋白产量增加；进一步的，胞内蛋白产量增加可能使胞内蛋白比例发生变化，从而也引起产物的口味发生了改变。
尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种马克斯克鲁维酵母菌，其特征在于，分类命名为马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus） CJA0004，其保藏编号为CCTCC No. M20211604。
2.一种权利要求1的马克斯克鲁维酵母菌的发酵方法，其特征在于，包括：所述马克斯克鲁维酵母菌在氮源和碳源存在下进行发酵，收集菌体；分离纯化单细胞蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碳源至少包括葡萄糖。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮源至少包括酵母提取物或酵母粉。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碳源与所述氮源的质量比为(1-5)︰1。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵时间为24-96小时。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵温度为25-45℃。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌的接种量为0.05％-5％。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、玉米浆培养基进行发酵。
10.权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母菌在制备食物产品或饲料添加剂中的用途。
11.一种食品组合物或饲料组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母菌。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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