CN113151074A

CN113151074A - 一株高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌诱变菌株及其应用

Info

Publication number: CN113151074A
Application number: CN202110380171.1A
Authority: CN
Inventors: 杨瑞金; 仝艳军; 王玉雪
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明公开了一株高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用，属于微生物技术领域。所述枯草芽孢杆菌，于2020年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.20479。该菌株具有遗传稳定性好，营养条件简单，易培养等特点。用于发酵生产纳豆激酶时，其产纳豆激酶水平显著提高，所得纳豆激酶的酶活为13000IU/mL。应用到大豆和小米混合发酵豆乳中，在保留纳豆激酶的活性下同时挥发性盐基氮明显减少，气味较好。

Description

一株高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌诱变菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

在我国血栓性疾病对人们的生命健康的威胁极为严重，尤其是人们生活水平和生活方式的改变，导致了膳食中高脂肪、高蛋白的过量摄取，以及老龄化社会的到来，血栓性疾病已超过癌症和糖尿病成为第一大健康杀手，每年有多万人因此死亡。

纳豆激酶(nattokinase，NK)是一种丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸残基组成，经大量文献证实纳豆激酶具有多种功能，其溶栓及抑制血栓形成效果较为突出。

综观纳豆激酶的研究、生产现状可知，纳豆激酶的生产普遍采用的是液体发酵工艺，且发酵液酶活一般在600～900IU/mL之间，利用基因工程技术对纳豆激酶的生产菌进行改造虽然能够提高纳豆激酶的产量，但由于利用转基因技术生产蛋白质还有一些有待解决的问题，因此进一步提高NK酶活的研究依然集中在优良生产菌种的分离、筛选和发酵条件的优化这两个方面。如何通过菌株选育和发酵条件的优化最大限度地提高纳豆激酶的活力是众多科技工作者研究的焦点。

为了使纳豆激酶能够工业化生产并可以药用，其纳豆激酶的酶活和产量尤为关键。由于使用不同的纳豆菌发酵产生的纳豆激酶的量和活性有很大的差别，因此，选择合适的菌株对大规模生产是至关重要的。以经过优化筛选获得纳豆激酶菌株Bacililussubtilis natto生产纳豆激酶，其酶活为2100IU/mL。另外有研究对Bacillus subtilisA10-5进行诱变和发酵优化，菌株产纳豆激酶酶活为1768IU/mL。从目前的纳豆激酶分泌菌株的研究情况来看，纳豆激酶的产量和活力还不高，难以达到工业化功能性食品和药物的标准，急需改造获得高产纳豆激酶酶活的菌株。

发明内容

[技术问题]

现有的纳豆激酶生产菌株的纳豆激酶活力不够高。

[技术方案]

本发明提供一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisJNFE1126，于2020年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.20479。所述枯草芽孢杆菌CGMCCNo.20479是对枯草芽孢杆菌原始菌株进行复合诱变并筛选得到的诱变菌株，该菌株能稳定传代，相比原始菌株，能大大提高纳豆激酶的生产水平。

本发明还提供利用所述枯草芽孢诱变菌株CGMCC No.20479发酵生产纳豆激酶的方法，包括先培养得到种子液，再将种子液转接到发酵培养基中进行发酵；所述发酵培养基按重量百分比计，配方为：大豆蛋白胨0.8-1.5％，葡萄糖1.5-3％，CaCl₂ 0.01-0.03％，MgSO₄ 0.03-0.06％，Na₂HPO₄ 0.1-0.3％，NaH₂PO₄ 0.05-0.2％，其余为纯净水，pH在6.5-7.0；发酵条件是150-250rpm、37-41℃，发酵60-72小时。

培养得到种子液时，可以采用的种子培养基的配方按重量百分比计，为大豆蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，NaCl 0.5％，其余为纯净水，pH在6.5-7.0。

本发明的另一目的是提供一种利用该诱变菌对大豆，或大豆与小米的混合物进行发酵得到豆乳的应用。

以大豆为原料时，将大豆与水按照1：5～1：15比例混合，打浆，然后接种所述枯草芽孢诱变菌株CGMCC No.20479，于150-250rpm、37-41℃，发酵10-14小时。

以大豆和小米为原料时，将大豆/小米与水按照1：5～1：15比例混合，打浆，然后接种所述枯草芽孢诱变菌株CGMCC No.20479，于150-250rpm、37-41℃，发酵10-14小时。

本发明所述枯草芽孢诱变菌株CGMCC No.20479还可以用于制备用于治疗溶栓药物或抑制血栓形成的药物。

[有益效果]

1、本发明以实验室现有菌株枯草芽孢杆菌为出发菌，经过复合诱变筛选得到诱变菌株(CGMCC No.20479)，诱变菌株具有一些特定的突变基因序列。

2、诱变菌株CGMCC No.20479在摇瓶水平发酵纳豆激酶最高可达到13000IU/mL，较出发菌株提高约一倍，生产能力更高；与现有Bacillus subtilis菌株相比，提高了接近两倍。

3、该诱变菌株CGMCC No.20479在斜面培养传代至10代以后，菌株具有较好的遗传稳定性。

4、利用该菌株CGMCC No.20479可与大豆小米混合发酵得到气味较好的豆乳，挥发性盐基氮明显减少。

生物材料保藏

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JNFE1126，于2020年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.20479。

附图说明

图1是实施例1中诱变菌株传代10次后纳豆激酶酶活曲线图

图2是实施例2中随着发酵时间的变化菌株的生长曲线

图3是实施例2中随着发酵时间的变化纳豆激酶酶活曲线图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

纳豆激酶的酶活单位定义为：37℃1min内分解1nmol溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中的浓度为5×10^-4mol/L的H-D-Val-Leu-Lys-PNA的所需的纳豆激酶量为1IU。其活力测定是以其相对于尿激酶的活力单位表示的。采用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶的活力。

发酵培养后，测定纳豆激酶的酶活的方法：将出发菌和诱变菌株分别用接种环挑取一环接种到50mL种子培养液中，在200r/min、37℃恒温摇床培养12h后，2％转接到发酵培养基培养，培养条件是200r/min、37℃，发酵时间60-72小时；在0-72h内每隔12h取1mL样品，在4℃，5000r/min、10min的条件下离心，去除菌体，上清液即为粗酶液，用纤维蛋白平板测定不同时间粗酶液的酶活。具体的纤维蛋白平板测定酶活方法如下：首先将纤维蛋白15mg溶于15mL的0.9％氯化钠溶液中，配制成纤维蛋白原溶液，取琼脂糖1.5g并加入PBS缓冲溶液125mL，加热溶解，加凝血酶4IU/ml，将三者混匀，倒入平板，并在纤维蛋白平板上打一系列直径2mm的点样孔；然后取10μL粗酶液点样于纤维蛋白平板点样孔中，37℃下恒温培养18h后，测量其透明圈直径，并计算其乘积近似为纤维蛋白溶解圈的面积。将此面积数值与尿激酶标准曲线相比较，得出酶活相当于尿激酶单位(IU/mL)，即纳豆激酶酶活力。进一步地，在纳豆激酶的酶活的测定过程中，尿激酶酶活标准曲线的绘制方法如下：将尿激酶标准品用pH7.4的磷酸盐缓冲液依次稀释至不同的浓度，并在纤维蛋白平板上打一系列直径2mm的点样孔，用移液枪各取10μL不同浓度的尿激酶溶液注入点样孔中，放入37℃恒温培养箱中反应18h，然后分别测定纤维蛋白溶解圈的两个垂直直径，将其乘积近似为纤维蛋白溶解圈的面积，并根据尿激酶的活力单位与纤维蛋白溶解圈的面积绘制酶活标准曲线。

实施例1：高产纳豆激酶菌株的诱变

将实验室原有出发菌株(Bacillus subtilis JNFE0126，CGMCC No.18057)的菌悬液在15W紫外灯下距离20cm处理90s，通过酪蛋白平板初筛、纤维蛋白平板复筛得到紫外诱变菌株，然后将紫外诱变菌株的菌悬液在400Gy的60Co-γ射线照射下，通过酪蛋白平板初筛、纤维蛋白平板复筛，获得诱变菌株JNFE1126。

通过用二代+三代即Illumina Hiseq+PacBio的测序方式对出发菌株和诱变菌株JNFE1126分别进行全基因组测序。通过序列比对发现，经过诱变后，与出发菌枯草芽孢杆菌JNFE0126(CGMCC No.18057)相比较，出发菌株和诱变菌株共有的基因家族数量为4464，诱变菌株JNFE1126特有的基因家族数量为42，这些特异性基因包括28个编码假想蛋白的基因。特异性基因注释到的功能为tr系统钾摄取蛋白D、复制蛋白、孢子形态发生蛋白、S26家族信号肽酶、孢子萌发蛋白、特定部位整合、转录调节子、动员蛋白、DNA结合蛋白、磷酸己糖异位酶、50S核糖体蛋白L14、金属肽酶、蛋白酶HtpX同源物。通过序列比对发现，诱变菌株的基因长度高于出发菌株，但是两者GC含量均为43.4％。并且诱变菌株含有2个质粒，原始菌株检测到1个质粒。诱变菌株比原始菌株多了9个编码蛋白质的基因序列。从预测到的tRNA和rRNA的数量来看，诱变菌株的数量高于原始菌株。并且，诱变菌株比原始菌株多两个转运蛋白基因，一个是ktr系统钾摄取蛋白，一个是位于质粒上的分泌系统蛋白OS，推测其作用于酶的胞外分泌。

该诱变菌株在斜面培养传代至10代以后，菌株具有较好的遗传稳定性。将传代10次以后的诱变菌株进行发酵培养：种子培养基组成为大豆蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，NaCl0.5％，pH在6.5-7.0；发酵培养基组成为大豆蛋白胨1％，葡萄糖2％，CaCl₂ 0.02％，MgSO₄0.05％，Na₂HPO₄ 0.2％，NaH₂PO₄ 0.1％，pH在6.5-7.0；种子液制备：带刺三角瓶、培养基灭菌，用接种环或铲挑取斜面上适量的菌种，接入制备好的培养基中，放入摇床内，37℃恒温条件下培养24～36小时；发酵培养：发酵培养基进行灭菌，降温至25℃～35℃后，按接种量2％接入种子培养液，放入摇床内，37℃恒温条件下培养72小时。发酵过程中，每隔12h，取样，测定600nm下的吸光值，用纤维蛋白平板测定纳豆激酶酶活，纳豆激酶酶活曲线如图1所示。

将诱变菌株JNFE1126，于2020年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.20479。

实施例2：诱变菌株发酵产纳豆激酶的应用

采用诱变菌株JNFE1126进行培养和发酵，具体方法为：

种子培养基组成为大豆蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，NaCl 0.5％，pH在6.5-7.0。

发酵培养基组成为大豆蛋白胨1％，葡萄糖2％，CaCl₂ 0.02％，MgSO₄ 0.05％，Na₂HPO₄ 0.2％，NaH₂PO₄ 0.1％，pH在6.5-7.0。

(1)种子液制备：

带刺三角瓶、培养基灭菌，用接种环或铲挑取斜面上适量的菌种，接入制备好的培养基中，放入摇床内，37℃恒温条件下培养24～36小时。

(2)发酵培养：

发酵培养基进行灭菌，降温至25℃～35℃后，按接种量2％接入种子培养液，放入摇床内，200rpm、37℃恒温条件下培养60小时。发酵过程中，每隔12h，取样，测定600nm下的吸光值，用纤维蛋白平板测定纳豆激酶酶活。

发酵过程中，菌体浓度的变化情况如图2所示，纳豆激酶的活力变化情况如图3所示，纳豆激酶酶活最高为13000IU/mL。

实施例3：诱变菌株发酵豆乳的应用

采用该诱变菌株JNFE1126进行培养和发酵，具体方法为：

(1)种子液制备：

(2)发酵乳发酵：

将大豆单一原料，或者大豆和小米按4：1复配的原料加入200mL水中加入20g大豆和5g小米进行打浆，灭菌后，将2％的种子菌液加入浆液中，于37℃，200r/min发酵10小时。发酵结束后，测定不同原料发酵得到的豆乳中的酶活和挥发性盐基氮含量。

结果如表1所示，单独以大豆为原料，或以大豆和小米复配原料进行发酵得到的豆乳的纳豆激酶酶活分别为2119IU/mL和4369IU/mL，挥发性氨基氮含量分别为4.17mg/100mL和2.44mg/100mL。诱变菌制备的大豆小米混合发酵豆乳，相对传统豆乳风味更好，且具有纳豆激酶的活性。

表1实施例3中诱变菌发酵豆乳的酶活和挥发性盐基氮的含量

Claims

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于，于2020年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.20479。

2.利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌发酵生产纳豆激酶的方法，其特征在于，包括先培养得到种子液，再将种子液转接到发酵培养基中进行发酵。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按重量百分比计，配方为：大豆蛋白胨0.8-1.5％，葡萄糖1.5-3％，CaCl₂ 0.01-0.03％，MgSO₄ 0.03-0.06％，Na₂HPO₄0.1-0.3％，NaH₂PO₄ 0.05-0.2％，以水补余，pH在6.5-7.0。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，发酵条件是150-250rpm、37-41℃，发酵60-72小时。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养得到种子液时，采用的种子培养基的配方按重量百分比计，为大豆蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，NaCl 0.5％，其余为水，pH在6.5-7.0。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按重量百分比计，大豆蛋白胨1％，葡萄糖2％，CaCl₂ 0.02％，MgSO₄ 0.05％，Na₂HPO₄ 0.2％，NaH₂PO₄ 0.1％，其余为纯净水，pH在6.5-7.0。

7.利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌发酵豆乳的方法，其特征在于，以大豆，或大豆与小米的混合物为原料，与水混合后打浆，然后接种所述枯草芽孢杆菌进行发酵得到豆乳。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以大豆为原料时，将大豆与水按照1：5～1：15比例混合，打浆，然后接种所述枯草芽孢诱变菌株CGMCC No.20479，于150-250rpm、37-41℃，发酵10-14小时。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以大豆和小米为原料时，将大豆、小米与水按照1：5～1：15比例混合，打浆，然后接种所述枯草芽孢诱变菌株CGMCC No.20479，于150-250rpm、37-41℃，发酵10-14小时。

10.权利要求1所述枯草芽孢诱变菌株CGMCC No.20479在制备用于治疗溶栓药物或抑制血栓形成的药物中用途。