CN116539702B - 检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种反义寡核苷酸的检测方法，具体为检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法。猕猴血取样完成后，加入枸橼酸钠溶液和枯草芽孢杆菌发酵，这对血浆起到保鲜和增加溶解性的效果。采用两步固相萃取(SPE)法结合无胶筛分毛细管电泳(NGCE)技术建立了猕猴血浆中的反义寡核酸的定量分析方法。优化并确定了SPE的相关条件(阴离子交换柱,上样缓冲液pH值为9.0上样体积及洗脱体积分别为5mL和3mL)和NGCE的分析条件(灌胶时间为30min,分离电压为24 kV)。使用本发明提供的检测方法检测结果精准，并且稳定性良好。

Description

检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，主要涉及一种反义寡核苷酸含量的检测方法，特别涉及检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法。
背景技术
反义寡核酸类(antisense oligonucleotides,ASODN)是人工合成的 DNA 或 RNA单链片段,能与特定的靶mRNA或DNA以Watson-Crick 碱基互补配对结合,抑制或封闭该基因的转录和表达，可用于病毒感染性疾病、心血管系统疾病以及癌症等多种疾病的治疗,比传统药物更具有特异性和高效性。迄今为止,反义寡核酸的修饰类型主要有磷酸骨架修饰、糖环修饰和碱基修饰。其中磷酸骨架修饰是目前了解最为透彻、应用最为广泛的第1 代反义核酸4。硫代修饰寡核苷酸,即用硫原子取代磷酸基团中的一个非桥键氧原子,能够增加寡核苷酸对核酶的抗性,通过与靶 mRNA 杂交,激活RNase H,降解靶mRNA，阻断靶基因过表达，具有很好的药学应用前景。
反义寡核酸的分析方法有:a.聚丙烯酷胺凝胶电泳PAGE;b.毛细管凝胶电泳(CGE);c.高效液相色谱(HPLC);d.高效薄层色谱(HPTLC)；质谱(MS);f.P 核磁共振(3PNMR)].这些方法中兼有定性和定量两方面优势的只有 HPLC和 CGE。阴离子交换高效液相色谱对反义寡核酸的长度不敏感,不能分离相差一个碱基的反义寡核酸1E细管凝胶电泳可很好地分离长度相差一个碱基的反义寡核酸,不能分离同长硫代和部分反义寡核酸
发明内容
针对以上问题，本发明采用两步固相萃取(SPE)法结合无胶筛分毛细管电泳(NGCE)技术建立了猕猴血浆中的反义寡核酸的定量分析方法：
检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法，其特征在于：步骤如下：
S1、取待测猕猴血浆,向每100mL待测猕猴血浆中加入枸橼酸钠溶液，PBS以及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC No. 20479发酵液5ml，38℃发酵60-60min后分装在5ml离心管中，12000 rpm离心10 min后用微量加样器吸取200μL，加入内标液充分混匀，用5mL上样缓冲液稀释并放置在 4℃冰箱直到加载到强阴离子交换柱；
所述枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479保藏日期为2020年8月3日、保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 20479。
S2、上样缓冲液活化强阴离子交换柱时需依次用 1mL 乙晴、 1mL 去离子水 3mL上样缓冲液进行活化；加载到柱上之前，需将准备好的血浆样品在室温下复温 5 min,待其完全流出后，使用3 mL 上样缓冲液进行淋洗,然后用 3 mL 洗脱缓冲液进行洗脱并收集；
S3、按顺序使用1mL乙腈、1mL 去离子水和3L 稀释缓冲液来平衡反相C18柱，用5mL 稀释缓冲液稀释阴离子交换柱洗脱液，稀释完成后上样，用5L 去离子水淋洗，寡核苷酸用 3 mL乙腈洗脱，洗脱液放置于氮吹仪中吹干；
S4、经固相萃取后吹干得到的样品重新溶解于 50 μL 去离子水中，将重新溶解的溶液滴加到悬浮于去离子水上的VSWP滤膜上进行透析脱盐，随后采用高速离心 (12000rpm，10 min)脱除样品中的气泡，检测前样品进行脱气处理即可。
S5、处理完成后进行无胶筛分毛细管电泳检测，检测条件为：涂层毛细管2根(65cX75 /m),线性大分子SS-DNA 100-R 凝胶等。毛细管柱总长为27 cm,有效长度为 20 cm,灌胶时间 30 min;紫外检测器,检测波长 254 nm;电动进样 10 kV·10 s;毛细管温度25C;负极到正极模式于24 kV 恒压分离。
优选地：所述步骤S1所用的枸橼酸钠溶液为每100ml全血中加入2.5%枸椽酸钠溶液10ml，PBS溶液加入量为每100ml全血中加入50ml。
优选地：所述步骤S1所用的枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No. 20479，将枯草芽孢杆菌接种于CGMCC No. 20479牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱33-37 ℃进行培养，培养至形成微黄色菌落说明活化完成；活化的枯草芽孢杆菌转接于500-1000ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇瓶中发酵6~10h即可得到浓度在2×108~5×109cfu/ml的枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479发酵菌液。
优选地：所述步骤S1所用的内标液为IS 24。
优选地：步骤S1和S2中上样缓冲液的配制为：0.05 M Tris-HC1，pH=9.0，0.5MKC1，20%ACN。
优选地：步骤S2中脱洗缓冲液的配制：0.05 M Tris-HC1，pH=9.0，0.5 M KCl，1.0MNaBr。
优选地：步骤S3中稀释缓冲液的配制：0.05 M Tris-HC1，pH=9.0，0.05 M KC1，0.1M NaBr。
优选地：所述步骤S4中SS-DNA 100-R 凝胶需称取 0.2 g SS-DNA100-R胶,加入经过滤的Tris-硼酸-尿素缓冲液1mL,磁力搅拌 3~5 h,配制完成后置于 4℃冰箱中储存, 使用当天取出50 μL,于12 00 r/min 离心10min脱气后使用。
本发明的有益效果在于：
1、本发明通过两步固相萃取(SPE)法结合无胶筛分毛细管电泳(NGCE)技术检测结果精准，并且稳定性好。
2、血浆中的大量蛋白质和盐会影响反义寡核苷酸的测定，本团队意外发现，在待测血浆中加入枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No. 20479进行低温轻发酵可以有效对蛋白质进行消耗，不产生新物质在检测体系中，同时减少了其他加入物质对检测结果的影响。并且预料不到的是，枯草芽孢杆菌发酵后，对血样中反义寡核苷酸的检测结果稳定性大大改善。本团队尝试用其他微生物，甚至不同株的枯草芽孢杆菌实验，发现枯草芽孢杆菌CGMCCNo. 20479效果显著更好。
3、本发明中通过加入枸橼酸钠溶液防止在血液处理过程中的凝固。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为反义寡核苷酸五次标准曲线线性拟合图。
图2为上样缓冲液 pH不同对反义寡核苷酸萃取回收率的影响图。
图3为反义寡核苷酸标准品和内标在不同分离电压下的电泳图。
图4为反义寡核苷酸和内标分离方法的特异性。
实施方式
为了使本发明专利所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明内容，并不用于限定本发明专利。
本发明公开了一种反义寡核苷酸的检测方法，具体为检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法。
具体实施方法
配制标准溶液：标准品液:精密称取反义寡核苷酸和内标IS 24各约0.0010g，加1mL去离子水溶解，作为母液。实验中用去离子水稀释成不同浓度的标准溶液，并储存于 4C冰箱中备用。
反义寡核酸:全硫代寡聚脱氧核糖核酸(Cantide) 和内标IS 24 由军事医学科学院放射与辐射医学研究所合成提供，白色冻干粉末，毛细管电泳检测纯度大于97%，4℃保存。序列信息如下：
表1 反义寡核苷酸的序列结构
PS-ODNs Sequence 5‘→3’
反义寡核苷酸 ACTCACTCAGGCCTCAGACT
内标液 IS 24 ACTGACTCACTCAGGCCTCAGACT
图1 为反义寡核苷酸五次标准曲线线性拟合图，用于后续测得反义寡核苷酸含量的计算。
检测步骤：
S1、取待测猕猴血浆,向每100ml待测猕猴血浆中加入2.5%枸橼酸钠溶液10ml和50ml PBS以及5mL枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479发酵液，38℃发酵60min后分装在5ml离心管中，12000 rpm离心10 min后用微量加样器吸取200μL，加入内标液充分混匀，用5mL上样缓冲液稀释并放置在 4℃冰箱直到加载到强阴离子交换柱；
S2、上样缓冲液活化强阴离子交换柱时需依次用 1mL 乙晴、 1mL 去离子水 3mL上样缓冲液进行活化；加载到柱上之前，需将准备好的血浆样品在室温下复温 5 min,待其完全流出后，使用3 mL 上样缓冲液进行淋洗,然后用 3 mL 洗脱缓冲液进行洗脱并收集；
S3、按顺序使用1mL乙腈、1mL 去离子水和3L 稀释缓冲液来平衡反相C18柱，用5mL 稀释缓冲液稀释阴离子交换柱洗脱液，稀释完成后上样，用5L 去离子水淋洗，寡核苷酸用 3 mL乙腈洗脱，洗脱液放置于氮吹仪中吹干；
S4、经固相萃取后吹干得到的样品重新溶解于 50 μL 去离子水中，将重新溶解的溶液滴加到悬浮于去离子水上的VSWP滤膜上进行透析脱盐，随后采用高速离心 (12000rpm，10 min)脱除样品中的气泡，检测前样品进行脱气处理即可。
S5、处理完成后进行无胶筛分毛细管电泳检测，检测条件为：涂层毛细管2根(65cX75 /m),线性大分子SS-DNA 100-R 凝胶等。毛细管柱总长为27 cm,有效长度为 20 cm,灌胶时间 30 min;紫外检测器,检测波长 254 nm;电动进样 10 kV·10 s;毛细管温度25C;负极到正极模式于24 kV 恒压分离。
其中：
枯草芽孢杆菌的活化：将枯草芽孢杆菌接种于CGMCC No. 20479牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中37 ℃进行培养，培养至形成微黄色菌落说明活化完成；活化的枯草芽孢杆菌转接于500ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇瓶中发酵6h即可得到接种量在3.2×108cfu/ml的枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479发酵菌液，枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479由赠送获得。
枸橼酸钠溶液为每100ml全血中加入2.5%枸椽酸钠溶液10ml。
内标液为IS 24。
上样缓冲液的配制为：0.05 M Tris-HC1，pH=9.0，0.5M KC1，20%ACN。
脱洗缓冲液的配制：0.05 M Tris-HC1，pH=9.0，0.5 M KC，1.0M NaBr。
稀释缓冲液的配制：0.05 M Tris-HC1，pH=9.0，0.05 M KC1，0.1M NaBr。
SS-DNA 100-R 凝胶的配制: 需称取 0.2 g SS-DNA100-R胶,加入经过滤的Tris-硼酸-尿素缓冲液1mL,磁力搅拌 3h,配制完成后置于 4℃冰箱中储存, 使用当天取出50 μL,于1200 r/min 离心10min脱气后使用。
血浆中的大量蛋白质和盐会影响反义寡核苷酸的测定，本团队意外发现，在待测血浆中加入枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No. 20479可以有效对蛋白质进行消耗，不产生新物质在检测体系中，同时减少了其他加入物质对检测结果的影响。并且预料不到的是，枯草芽孢杆菌发酵后，对血样中反义寡核苷酸的检测结果稳定性大大改善。本团队尝试用其他微生物，甚至不同株的枯草芽孢杆菌实验，并无此惊奇效果。作为示例，在此记录对比例1：除步骤S1中所用的枯草芽孢杆菌替换为ACCC 10719外其余均不变，枯草芽孢杆菌ACCC10719由上海沪峥生物科技有限公司提供。
图2考察了用阴离子交换柱萃取时所用上样缓冲液的不同 pH 值对反义寡核苷酸萃取回收率的影响，结果(图2)表明 pH值为9.0 时反义寡核苷酸萃取回收率最高，然而当pH 值为 6.0 时没有检测到反义寡核苷酸的存在，故 pH=9.0 可以视为是反义寡核苷酸的最佳萃取条件。
图3实验考察了不同分离电压 (18 kV、21 V、24 kV、27kV) 对迁移时间和分离度的影响 ，综合考虑灵敏度和分析时间等因素，选择分离电压24 kV作为最佳分离电压，反义寡核苷酸和内标IS 24能够在12 min内达到基线分离。
图4显示了猕猴血浆中反义寡核苷酸和内标经过两步固相萃取后毛细管电泳分离示意图，从图中可见枯草芽孢杆菌的发酵以及内源性物质对反义寡核苷酸和内标均无干扰，方法的特异性良好。
NGCE 定猕猴血浆中反义寡核苷酸的批次内准确度(以回收率计)为95.32%~99.31%,相对标准偏差RSD)小于11%;如表2所示，说明NGCE检测法准确度高。
表2 NGCE 法测定猕猴血浆中反义寡核苷酸的准确度和精密度
标准液浓度(mg/L) 批次内 (n=4)检测结果(mg/L) 准确率(%) 相对标准偏差
5 5.09±0.5 97.83 8.26
10 9.96±1.03 99.31 10.27
100 104.53±6.97 95.32 7.11
200 201.61±15.36 99.21 8.93
猕猴血浆样品中的反义寡核苷酸在不同条件下的稳定性结果见表 3。结果表明,经枯草芽孢杆菌发酵以后，含有反义寡核苷酸的猕猴血浆样品分别在室温下放置 24 h反复冻融4次(一80℃至室温)长期在一80℃下保存 30 d，以及在4C下存放 96h条件下稳定性良好。
表3 反义寡核苷酸在猕猴血浆中的稳定性(以回收率计)( n=4)
标准液浓度(mg/L) 重复冷冻-解冻4次 室温存放24h 4℃存放96h -80℃存放30d
5 98.64±9.43 103.41±8.53 99.01±5.13 95.61±5.06
25 92.72±6.33 101.74±3.01 107±12.29 94.34±3.02
200 89.92±7.96 92.49±9.02 109±11.16 96.28±8.98
如表4所示，为使用两种不同枯草芽孢杆菌对猕猴血浆发酵后，反义寡核苷酸含量的检测。从检测结果可以看出，经枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479发酵后对反义寡核苷酸含量的检测更为准确，说明枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479可以对猕猴血浆进行一个特异性发酵。同时对不同菌株发酵后猕猴血浆的保鲜效果进行了对比，如表5所示。经枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479发酵后在实验条件下平均稳定性几乎是枯草芽孢杆菌ACCC 10719的1.3倍。这也说明枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479发酵后的保鲜时间更长，保鲜效果更好。
表4 经不同菌株发酵的猕猴血浆中反义寡核苷酸的准确度
标准液浓度(mg/L) 枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479检测结果(mg/L) 准确率(%) 枯草芽孢杆菌ACCC 10719检测结果(mg/L) 准确率(%)
5 5.02±0.3 98.83 3.62±0.3 68.83
10 9.98±1.06 99.67 7.28±2.03 76.97
100 101.13±5.07 96.58 80.29±3.01 69.91
200 200.21±11.46 98.91 187.64±19.17 73.59
表5 反义寡核苷酸在猕猴血浆中经两种菌发酵后的稳定性(以回收率计)( n=4)
标准液浓度(mg/L) 枯草芽孢杆菌CGMCC No. 20479重复冷冻-解冻4次 室温存放24h 枯草芽孢杆菌ACCC 10719重复冷冻-解冻4次 室温存放24h
5 98.64±9.43 103.41±8.53 78.21±6.13 73.32±7.13
50 97.12±6.33 101.74±3.01 70.12±4.46 71.04±5.57
100 96.08±4.05 98.18±3.01 69.81±3.06 66.02±7.33
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法，其特征在于：具体制备方法如下：
S1、取待测猕猴血浆，向待测猕猴血浆中加入枸橼酸钠溶液和PBS以及枯草芽孢杆菌发酵液，38℃发酵后分装在5mL离心管中，离心后用微量加样器吸取200μL，加入内标液IS 24充分混匀，内标液IS 24的序列结构为：ACTGACTCACTCAGGCCTCAGACT，用5mL上样缓冲液稀释并放置在 4℃冰箱直到加载到强阴离子交换柱；
S2、上样缓冲液活化强阴离子交换柱时需依次用 1mL乙腈、 1mL 去离子水和 3mL 上样缓冲液进行活化；将准备好的血浆样品在室温下复温 5 min后加载到柱上，待其完全流出后，使用3 mL 上样缓冲液进行淋洗，然后用 3 mL 洗脱缓冲液进行洗脱并收集；
S3、按顺序使用1mL乙腈、1mL 去离子水和3L 稀释缓冲液来平衡反相C18柱，用 5mL 稀释缓冲液稀释强阴离子交换柱洗脱液，稀释完成后上样，用5L 去离子水淋洗，反义寡核苷酸用 3 mL乙腈洗脱，洗脱液放置于氮吹仪中吹干；
S4、将吹干得到的样品重新溶解于 50 μL 去离子水中，将重新溶解的溶液滴加到悬浮于去离子水上的VSWP滤膜上进行透析脱盐，随后采用高速离心 脱除样品中的气泡，检测前样品进行脱气处理即可；
S5、处理完成后进行无胶筛分毛细管电泳检测，检测条件为：涂层毛细管2根，线性大分子SS-DNA 100-R 凝胶；紫外检测器检测波长 254 nm；电动进样 10 kV·10 s；毛细管温度25℃；负极到正极模式于24 kV 恒压分离；
所述步骤S1所用的枸橼酸钠溶液为每100mL待测猕猴血浆中加入2.5%枸椽酸钠溶液10mL，PBS加入量为每100mL待测猕猴血浆中加入50mL；
所述步骤S1所用的枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No. 20479，将枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于烘箱中33-37 ℃进行培养，培养至形成微黄色菌落说明活化完成；活化的枯草芽孢杆菌转接于500-1000mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇瓶中发酵6~10h即可得到浓度为2×108~5×109 cfu/mL的枯草芽孢杆菌发酵液。
2.根据权利要求1所述的检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法，其特征在于：步骤S1和S2中上样缓冲液的配制为：pH=9.0的0.05 M Tris-HCl，0.5M KCl，20%ACN。
3.根据权利要求1所述的检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法，其特征在于：步骤S2中洗脱缓冲液的配制为：pH=9.0的0.05 M Tris-HCl，0.5 M KCl，1.0M NaBr。
4.根据权利要求1所述的检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法，其特征在于：步骤S3中稀释缓冲液的配制为：pH=9.0的0.05 M Tris-HCl，0.05 M KCl，0.1M NaBr。
5.根据权利要求1所述的检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法，其特征在于：所述步骤S5中SS-DNA 100-R 凝胶需称取 0.2 g SS-DNA100-R胶，加入经过滤的Tris-硼酸-尿素缓冲液1mL，磁力搅拌 3~5 h，配制完成后置于 4℃冰箱中储存， 使用当天取出50 μL，于12 00 r/min 离心10min脱气后使用。
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