CN113567569A - 一种头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，该方法包括如下步骤：建立Caco‑2细胞体外吸收模型，设立头花蓼提取物组、喹诺酮类药物组、头花蓼提取物与喹诺酮类药物合用组，利用BCA试剂盒技术和UPLC‑MS/MS法考察头花蓼提取物中两个指标性成分没食子酸、原儿茶酸与喹诺酮类药物单用和合用时的摄取量差异。通过本发明的方法可以考查头花蓼提取物与左氧氟沙星联用后两药在Caco‑2细胞模型中吸收的影响，从而为两药在临床上使用提供参考价值。

Description

一种头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其一种头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法。

背景技术

抗菌药物，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有光谱活性，临床上主要用于治疗呼吸道和泌尿道感染。头花蓼为苗族传统药用植物头花蓼的全草，具有利尿通淋、清热利湿、活血散瘀等功效，传统医学认为该药用植物治疗尿路感染具有较好的治疗效果，其多酚化学成分没食子酸和原儿茶酸经现代药理学研究表明具有抗氧化、抗菌和抗炎等作用。

在现有技术中，公开号为CN102526218A的发明专利公开了一种制备头花蓼提取物的方法和头花蓼提取物，其基本上包括以下步骤：(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加水煎煮，过滤，使滤液浓缩、干燥；(2)将步骤(1)所得干燥物用76～84％乙醇提取，过滤，使滤液浓缩、干燥，即得。该方案得到的头花蓼提取物可用于制备清热利湿用药，利尿通淋用药，泌尿系统感染或结石用药，肾盂肾炎用药，解毒、散瘀用药，抗菌、抗炎、镇痛用药，前列腺炎用药。公开号为CN103550309A的发明专利公开了一种头花蓼降糖提取物颗粒剂的制备方法，其包括以下工艺步骤：1)头花蓼降糖提取物提取；2)配料；3)制粒和装袋。该方案通过对头花蓼醇提后水提后得到的混合药液经过合理的参数、步骤控制制成颗粒剂。公开号为CN105326913A的发明专利提供了头花蓼提取物及其在降血糖药物中的应用，头花蓼提取物的制备方法是：头花蓼全草药材干燥切段，含水低级醇溶液浸泡后，再用含水低级醇溶液渗漉提取，提取液浓缩干燥后，得头花蓼总提物；取此头花蓼总提物，加蒸馏水混悬后，依次分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行分步萃取，其中正丁醇萃取相回收溶剂至无醇味后，加适量蒸馏水溶解并进行离心，离心后的上清液进行聚苯乙烯多孔性吸附大孔树脂柱色谱，先以蒸馏水水淋除去杂质，再用含水低级醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥后，即得头花蓼提取物。动物实验证实：上述头花蓼提取物通过促进胰岛素分泌、抗氧化以及调节脂质代谢紊乱等作用，对糖尿病大鼠具有显著的降血糖作用。

目前，以头花蓼为原料药已开发上市了四季草颗粒、热淋清颗粒等苗药制剂，其中热淋清颗粒是以头花蓼经水提取后制成的单方制剂，对泌尿系统感染具有独特疗效。据报道，热淋清颗粒常与喹诺酮类抗生素合用治疗泌尿道感染，特别是与左氧氟沙星联用，用于前列腺炎、急性附睾炎等泌尿道感染疾病，与单独使用相比，联用后具有起效快、不良反应少、用药周期短、治愈率高等优点，但两药联用后是否发生药物相互作用未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，以考查头花蓼提取物与左氧氟沙星联用后两药在Caco-2细胞模型中吸收的影响，从而为两药在临床上使用提供参考价值。

为实现本发明的上述目的，本发明的技术方案：

一种头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，该方法包括如下步骤：建立Caco-2细胞体外吸收模型，设立头花蓼提取物组、喹诺酮类药物组、头花蓼提取物与喹诺酮类药物合用组，利用BCA试剂盒技术和UPLC-MS/MS法考察头花蓼提取物中两个指标性成分没食子酸、原儿茶酸与喹诺酮类药物单用和合用时的摄取量差异。其中，前述的喹诺酮类药物为左氧氟沙星。

其中，Caco-2细胞体外吸收模型的建立包括Caco-2细胞的培养及形态变化和细胞摄取过程；其中，Caco-2细胞的培养及形态变化包括如下步骤：选取Caco-2细胞，将其接种于高糖DMEM培养基的培养液中，置于培养箱中培养；待细胞生长至预定状态，采用胰蛋白酶消化液消化细胞接种于培养板，一周内隔天换1次培养液，1周后每天换液1次，细胞培养至细胞单层膜形成。

进一步的，前述的细胞摄取过程包括如下步骤：将培养并形成单层膜状态的Caco-2细胞用HBSS缓冲溶液在培养箱中培养后，弃去缓冲溶液；再用HBSS缓冲溶液洗去细胞单分子层表面的杂质，连续冲洗两遍；加入含药的HBSS溶液培养，取出后，加入屈臣氏水溶液终止化合物的细胞摄取实验，并快速用屈臣氏水溶液清洗三遍细胞单分子层，最后加入屈臣氏水溶液；反复冻融裂解细胞，取出细胞超声处理，得细胞悬液，低温保存待处理。

进一步的，该方法包括溶液配制步骤，其中，头花蓼提取物母液配制步骤如下：称取头花蓼提取物，加入PBS和DMSO，配制成头花蓼溶液，低温保存备用；左氧氟沙星母液配制步骤如下：称取左氧氟沙星标准品粉末，加入PBS和DMSO，配制成左氧氟沙星溶液，低温保存备用；标准溶液和储备溶液的配制步骤如下：精密称取原儿茶酸，没食子酸，左氧氟沙星，置于容量瓶中，并用甲醇定容，获得原儿茶酸，没食子酸，左氧氟沙星的储备液；分别精密量取3种对照品储备液适量，用甲醇按梯度稀释成所需浓度，得混合系列标准溶液，低温保存备用；精密称取葛根素，用甲醇定容获得葛根素的储备液；取内标储备液至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成内标溶液，低温保存备用。

进一步的，UPLC-MS/MS法的测定条件如下：

色谱条件：色谱柱：Waters BEH C₁₈柱；保护柱：Waters Van Guard BEH C₁₈柱，流速：0.30mL/min，柱温：40℃，进样器的温度：25℃，进样体积为1μL；流动相：0.1％甲酸乙腈A-0.1％甲酸水B梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～0.3min90％A，0.3～1min90～85％A，1～2min85～90％A，2～3min90％A，3～4min90～10％A；

质谱条件：采用电喷雾电离源，正、负离子模式下扫描采集数据，毛细管电压：2.0kV，离子源温度：120℃；喷雾气与反吹气：N₂，去溶剂气流速：800L/hr，去溶剂气温度：400℃，扫描方式为选择离子监测，质谱数据采集及处理软件为MassLynx4.1质谱工作站。

进一步的，左氧氟沙星单用及其与头花蓼提取物合用的细胞摄取过程包括如下步骤：将培养14天并形成单层膜状态的Caco-2细胞用HBSS缓冲液洗去其表面杂质，用于实验；实验分为三组：头花蓼提取物给药组：加入浓度为1mg/mL头花蓼提取物溶液2mL；左氧氟沙星给药组：加入浓度为160μmol/L左氧氟沙星提取物溶液2mL；头花蓼提取物与左氧氟沙星合用组：加入终浓度为1mg/mL头花蓼提取物溶液和浓度为160μmol/L左氧氟沙星提取物溶液共2mL，放置37℃的培养箱，培养1h，取出后，加入4℃的屈臣氏水溶液终止化合物的细胞摄取实验，并快速用屈臣氏水溶液清洗三遍细胞单分子层，最后每孔加入2mL的屈臣氏水溶液；反复冻融裂解细胞，取出细胞超声10min，得细胞悬液，置-20℃冰箱保存，待处理。

本发明具有以下技术效果：

本发明的方法证明两药合用后，左氧氟沙星的细胞摄取量(3.903±0.394mg/g)比单用时(5.895±0.663mg/g)的细胞摄取量减少，且有统计学意义；头花蓼提取物指标性成分没食子酸和原儿茶酸合用后的细胞摄取量分别为0.076±0.015和0.060±0.008mg/g，单用时分别为0.094±0.022和0.074±0.018mg/g，合用的细胞摄取量减少，但差异没有统计学意义。通过本发明的方法可以得出结论：头花蓼提取物能显著影响左氧氟沙星的吸收，而左氧氟沙星不能影响头花蓼提取物的吸收。

附图说明

图1Caco-2细胞一般形态图(A：Caco-2细胞培养2d；B：Caco-2细胞培养14d)；

图2典型UPLC-MS/MS色谱图，图中，1.左氧氟沙星，2.葛根素，3.原儿茶酸，4.没食子酸；

图3头花蓼提取物对Caco-2细胞毒性的影响(

n＝6)；

图4左氧氟沙星对Caco-2细胞毒性的影响(

n＝6)；

图5左氧氟沙星与头花蓼提取物联用前后三种成分的细胞摄取量的比较(

n＝5)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下述方法中所涉及配料或材料，如无特殊说明，均为商业途径可获得。相关实验方法中如无特殊说明的均为本技术领域现有常规方法。其中的数值或数值比例，如无标注，均指质量数值或质量比例。

实验例1：

1.实验材料

1.1仪器

二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Model 680酶标仪(伯乐生命医学产品有限公司)；TS-100F倒置显微镜(日本Nikon公司)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；Millipore Millicell ERS.2细胞电阻仪(美国Millipore公司)；Transwell培养板(聚碳酯膜，孔径0.4μm，直径12mm)(美国Coming公司)；ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色谱-三重四级杆质谱串联仪(美国Waters公司，包括自动进样器，二元梯度泵，柱温箱，真空脱气机，MassLynx4.1质谱工作站)；氮气吹干仪装置(MTN-2800D天津奥特塞恩斯仪器有限公司)；超低温冰箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2材料

头花蓼提取物(参照中国药典热淋清颗粒的提取方式提取)^[15]；左氧氟沙星对照品(批号130455-201607)，葛根素对照品(批号110752-201512)均购自中国食品药品检定研究院；青、链霉素、0.25％胰蛋白酶和Hank′s缓冲溶液(HBSS，Gibco公司)；DMEM高糖培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；BCA蛋白定量试剂盒(美国索莱宝公司)；MTS细胞增殖试剂盒(普洛麦格生物有限公司)；实验用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3细胞株

Caco-2细胞株(上海中科院)。

2.方法

2.1溶液配制

2.1.1头花蓼提取物母液配制

称取500mg的头花蓼提取物，加入4950μL的PBS和50μL的DMSO，配制成100mg/mL的头花蓼溶液，置冰箱(-20℃)保存，备用。

2.1.2左氧氟沙星母液配制

称取90mg的左氧氟沙星标准品粉末，加入2970μL的PBS和30μL的DMSO，配制成30mg/mL(83102μmol/L)的左氧氟沙星溶液，置冰箱(-20℃)保存，备用。

2.1.3标准溶液和储备溶液的配制

精密称取原儿茶酸，没食子酸，左氧氟沙星适量，置于容量瓶中，并用甲醇定容至10mL。获得原儿茶酸(0.831mg/mL)，没食子酸(1.002mg/mL)，左氧氟沙星(1.002mg/mL)的储备液。分别精密量取原儿茶酸等3种对照品储备液适量，用甲醇按梯度稀释成所需浓度，得混合系列标准溶液，置-20℃冰箱保存，备用。精密称取葛根素(4.95mg)，用50％甲醇定容至10mL获得葛根素(0.495mg/mL)的储备液。取内标储备液适量至100mL容量瓶中，用50％甲醇定容至刻度，配制成20ng/mL的内标溶液，置-20℃冰箱保存，备用。

2.2测定条件

2.2.1色谱条件

色谱柱：Waters BEHC₁₈(2.1mm×100mm，1.7μm)柱；保护柱：Waters Van GuardBEHC₁₈(2.1mm×5mm，1.7μm)柱，流速：0.30mL/min，柱温：40℃，进样器的温度：25℃，进样体积为1μL；流动相：0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～0.3min90％A，0.3～1min90～85％A，1～2min85～90％A，2～3min90％A，3～4min90～10％A。

2.2.2质谱条件

采用电喷雾电离源(ESI)，正、负离子模式下扫描采集数据，毛细管电压：2.0kV，离子源温度：120℃；喷雾气与反吹气：N₂，去溶剂气流速：800L/hr，去溶剂气温度：400℃，扫描方式为选择离子监测(MRM)，质谱数据采集及处理软件为MassLynx4.1质谱工作站。没食子酸等3成分以及内标用于定量分析的监测离子见表1。

表1没食子酸、原儿茶酸、左氧氟沙星以及内标的质谱条件

2.3Caco-2细胞摄取模型的建立

2.3.1Caco-2细胞的培养及形态变化

选取生长状态良好的Caco-2细胞，将其接种于含10％胎牛血清和1％的链、青霉素的高糖DMEM培养基的培养液中，置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。待细胞生长约80％时，采用0.25％胰蛋白酶消化液消化细胞，按1×10⁵个/mL接种于6孔培养板，每孔2mL，一周内隔天换1次培养液，1周后每天换液1次，细胞培养14d后，细胞单层膜形成可以进行细胞摄取实验。

用倒置显微镜观察Caco-2细胞接种到6孔板后培养2d及14d时的细胞单分子层形态，如下图1所示Caco-2细胞生长14d后细胞生长均匀，边界清晰，成单层膜状态，可用于摄取实验。

2.3.2细胞摄取过程

将培养14d并形成单层膜状态的Caco-2细胞用pH6、37℃的HBSS缓冲溶液在培养箱中培养20min后，弃去缓冲溶液。再用HBSS缓冲溶液洗去细胞单分子层表面的杂质，连续冲洗两遍。加入含药的HBSS溶液2mL，培养1h，取出后，加入4℃的屈臣氏水溶液终止化合物的细胞摄取实验，并快速用屈臣氏水溶液清洗三遍细胞单分子层，最后每孔加入2mL的屈臣氏水溶液。反复冻融裂解细胞(放置-80℃冰箱1个小时，取出放置37℃30分钟，反复重复3次)，取出细胞超声10min，得细胞悬液，置-20℃冰箱保存，待处理。

2.4样品处理方法

取细胞悬液500μL，加入20ng/ml葛根素内标溶液50μL，再加入500μL甲醇沉淀蛋白，涡旋超声10min，12000r/min离心10min，取上清液置离心管中37℃N₂吹干，200μL50％的甲醇水溶液互溶，涡旋超声10min，12000r/min离心10min，取上清液进样分析。另取10μL的细胞悬液，严格按照BCA试剂盒处理步骤测定蛋白含量。摄取量以mg(药物)/g(蛋白)表示。

3.结果

3.1UPLC-MS/MS的分析方法确证

取空白细胞悬液，按“2.4样品处理方法”项下操作，获得空白样品A色谱图；将一定浓度的对照品溶液和葛根素(内标)加入空白细胞悬液，按“2.4样品处理方法”项下操作，获得B色谱图；取进行摄取实验的细胞样品溶液，按“2.4样品处理方法”项下操作，获得C色谱图。在本实验条件下，空白细胞悬液中无杂质峰干扰，细胞悬液中左氧氟沙星、没食子酸、原儿茶酸及内标葛根素分离完全。见图2。

精密量取左氧氟沙星、原儿茶酸、没食子酸三种对照品储备液适量，按梯度稀释成一系列浓度的标准溶液，按“2.4样品处理方法”项下操作。得到左氧氟沙星、原儿茶酸、没食子酸3种成分的工作曲线，其线性范围、回归方程如表2所示。

表2回归曲线方程

选取表2中2、4、6ng/mL这3个浓度的标液，加入空白细胞混悬液中作为质量控制样品(QC)，分别进样分析，将测定的浓度与加入的已知标准溶液浓度比较，求得三种指标成分及内标的提取回收率在87.06～105.59％范围内，每个浓度进行5样本分析，连续测定3d，三种成分的日内精密度RSD为3.53～11.69％，日间精密度RSD为5.16～13.23％。上述质控样品分别于室温下保持1、2、3d后处理测定，与零时结果比较，RSD均小于15％。以上结果表明，该方法稳定、可靠、灵敏、重现性好，满足生物样品分析方法的要求。

3.2不同浓度受试化合物对Caco-2细胞的毒性研究

3.2.1头花蓼提取物对Caco-2细胞毒性考察

选取生长状态良好的Caco-2细胞，以每孔100μL，铺板密度为1×10⁵个/mL接种于96孔板中，将96孔板置37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h，可用于实验。实验分为空白对照组、头花蓼提取物不同浓度给药组。空白对照组每孔加入100μL DMEM培养液；头花蓼提取物不同浓度给药组：0.5、1、2、4、5、8、16mg/mL，每孔加入100μL，作用Caco-2细胞24h后，用MTS法检测，实验每个浓度平行6个孔，实验重复3次。实验结果见图3，结果表明在所设置的浓度范围内，1mg/mL以下的浓度对细胞没有影响，后期将选择1mg/mL这个浓度作为给药浓度。

3.2.2左氧氟沙星对Caco-2细胞毒性考察

选取生长状态良好的Caco-2细胞，以每孔100μL，铺板密度为1×10⁵个/mL接种于96孔板中，将96孔板置37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h，可用于实验。实验分为空白对照组、左氧氟沙星不同浓度给药组。空白对照组每孔加入100μL DMEM培养液；左氧氟沙星不同浓度给药组：5、10、20、40、80、160、320、640μmol/L，每孔加入100μL，作用Caco-2细胞24h后，用MTS法检测，实验每个浓度平行6孔，实验重复3次。实验结果见图4，结果表明在所设置的浓度范围内，160μmol/L以下的浓度对细胞没有影响，可以进行下一步的摄取实验。

3.3左氧氟沙星单用及其与头花蓼提取物合用的细胞摄取过程

将培养14天并形成单层膜状态的Caco-2细胞用HBSS缓冲液洗去其表面杂质，用于实验。实验分为三组：头花蓼提取物给药组：加入浓度为1mg/mL头花蓼提取物溶液2mL；左氧氟沙星给药组：加入浓度为160μmol/L左氧氟沙星提取物溶液2mL；头花蓼提取物与左氧氟沙星合用组：加入终浓度为1mg/mL头花蓼提取物溶液和浓度为160μmol/L左氧氟沙星提取物溶液共2mL，放置37℃的培养箱，培养1h，取出后，加入4℃的屈臣氏水溶液终止化合物的细胞摄取实验，并快速用屈臣氏水溶液清洗三遍细胞单分子层，最后每孔加入2mL的屈臣氏水溶液。反复冻融裂解细胞，取出细胞超声10min，得细胞悬液，置-20℃冰箱保存，待处理。实验结果如图5所示，左氧氟沙星与头花蓼提取物合用后，左氧氟沙星的细胞摄取量(3.903±0.394mg/g)比单用时(5.895±0.663mg/g)的细胞摄取量少，且有统计学意义；头花蓼提取物指标性成分没食子酸和原儿茶酸合用后的细胞摄取量分别为0.076±0.015和0.060±0.008mg/g比单用时分别为0.094±0.022和0.074±0.018mg/g的细胞摄取量减少，但没有统计学意义。

4.讨论

Caco-2细胞是通过克隆人类的结肠癌细胞而来，Caco-2细胞不仅在显微镜下形态、极性及胞饮功能与小肠上皮细胞相似，而且其含有的转运系统和代谢酶也与小肠刷状缘上皮相似，因接近药物在人体内吸收的实际环境，并具有较高的重现性，兼具快速、易于控制、干扰小、可连续检测等优点，而成为预测药物体内吸收、阐明药物吸收机制的良好工具，近年来被广泛用于药物摄取、外排及跨膜转运等药物经肠道吸收机制的研究，是目前应用最广泛的体外吸收模型。

根据实验室前期研究，选择37℃的温度、pH为7.4的HBSS缓冲溶液、作用时间为1h的条件作为细胞实验条件，开展实验。实验结果显示，头花蓼提取物指标型成分原儿茶酸单用时细胞摄取量为0.074±0.018mg/g，与左氧氟沙星合用时细胞摄取量为0.060±0.008mg/g；没食子酸单用时细胞摄取量为0.094±0.022mg/g，与左氧氟沙星合用时细胞摄取量为0.076±0.015mg/g，根据实验结果分析，两药合用后，头花蓼提取物指标性成分没食子酸和原儿茶酸单用时的细胞摄取量都比合用时的细胞摄取量高，但无统计学意义，说明左氧氟沙星对头花蓼提取物的影响不明显，这与前期药动学研究结果一致。左氧氟沙星单用时细胞摄取量为5.895±0.663mg/g，与头花蓼提取物合用时细胞摄取量为3.903±0.394mg/g，从实验结果分析，两药合用后，左氧氟沙星合用后细胞摄取量比单用时的低，并且有明显统计学意义，说明头花蓼提取物对左氧氟沙星的影响很大，这与前期药动学研究结果一致。产生这样的原因可能是因为根据文献报道左氧氟沙星为P-gp底物，原儿茶酸也为P-gp底物，可能是原儿茶酸和左氧氟沙星存在竞争关系，原儿茶酸抑制了Caco-2细胞对左氧氟沙星的吸收，也有可能是原儿茶酸与Caco-2细胞膜上的P-gp发生作用，使左氧氟沙星更好的与P-gp结合从而使左氧氟沙星大量排出细胞，降低了其在细胞内的浓度，产生两药合用后左氧氟沙星的细胞摄取量减少的结果，具体两药合用产生怎样的作用还需进一步研究。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤：建立Caco-2细胞体外吸收模型，设立头花蓼提取物组、喹诺酮类药物组、头花蓼提取物与喹诺酮类药物合用组，利用BCA试剂盒技术和UPLC-MS/MS法考察头花蓼提取物中两个指标性成分没食子酸、原儿茶酸与喹诺酮类药物单用和合用时的摄取量差异。

2.根据根据权利要求1所述的头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，其特征在于：所述喹诺酮类药物为左氧氟沙星。

3.根据权利要求1所述的头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，其特征在于：Caco-2细胞体外吸收模型的建立包括Caco-2细胞的培养及形态变化和细胞摄取过程；其中，Caco-2细胞的培养及形态变化包括如下步骤：选取Caco-2细胞，将其接种于高糖DMEM培养基的培养液中，置于培养箱中培养；待细胞生长至预定状态，采用胰蛋白酶消化液消化细胞接种于培养板，一周内隔天换1次培养液，1周后每天换液1次，细胞培养至细胞单层膜形成。

4.根据权利要求3所述的头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，其特征在于：所述细胞摄取过程包括如下步骤：将培养并形成单层膜状态的Caco-2细胞用HBSS缓冲溶液在培养箱中培养后，弃去缓冲溶液；再用HBSS缓冲溶液洗去细胞单分子层表面的杂质，连续冲洗两遍；加入含药的HBSS溶液培养，取出后，加入屈臣氏水溶液终止化合物的细胞摄取实验，并快速用屈臣氏水溶液清洗三遍细胞单分子层，最后加入屈臣氏水溶液；反复冻融裂解细胞，取出细胞超声处理，得细胞悬液，低温保存待处理。

5.根据权利要求3所述的头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，其特征在于：该方法包括溶液配制步骤，其中，头花蓼提取物母液配制步骤如下：称取头花蓼提取物，加入PBS和DMSO，配制成头花蓼溶液，低温保存备用；左氧氟沙星母液配制步骤如下：称取左氧氟沙星标准品粉末，加入PBS和DMSO，配制成左氧氟沙星溶液，低温保存备用；标准溶液和储备溶液的配制步骤如下：精密称取原儿茶酸，没食子酸，左氧氟沙星，置于容量瓶中，并用甲醇定容，获得原儿茶酸，没食子酸，左氧氟沙星的储备液；分别精密量取3种对照品储备液适量，用甲醇按梯度稀释成所需浓度，得混合系列标准溶液，低温保存备用；精密称取葛根素，用甲醇定容获得葛根素的储备液；取内标储备液至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成内标溶液，低温保存备用。

6.根据权利要求3所述的头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，其特征在于：UPLC-MS/MS法的测定条件如下：

色谱条件：色谱柱：Waters BEH C₁₈柱；保护柱：Waters Van Guard BEH C₁₈柱，流速：0.30mL/min，柱温：40℃，进样器的温度：25℃，进样体积为1μL；流动相：0.1％甲酸乙腈A-0.1％甲酸水B梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～0.3min 90％A，0.3～1min 90～85％A，1～2min85～90％A，2～3min 90％A，3～4min 90～10％A；

质谱条件：采用电喷雾电离源，正、负离子模式下扫描采集数据，毛细管电压：2.0kV，离子源温度：120℃；喷雾气与反吹气：N₂，去溶剂气流速：800L^/hr，去溶剂气温度：400℃，扫描方式为选择离子监测，质谱数据采集及处理软件为MassLynx4.1质谱工作站。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法，其特征在于：左氧氟沙星单用及其与头花蓼提取物合用的细胞摄取过程包括如下步骤：将培养14天并形成单层膜状态的Caco-2细胞用HBSS缓冲液洗去其表面杂质，用于实验；实验分为三组：头花蓼提取物给药组：加入浓度为1mg/mL头花蓼提取物溶液2mL；左氧氟沙星给药组：加入浓度为160μmol/L左氧氟沙星提取物溶液2mL；头花蓼提取物与左氧氟沙星合用组：加入终浓度为1mg/mL头花蓼提取物溶液和浓度为160μmol/L左氧氟沙星提取物溶液共2mL，放置37℃的培养箱，培养1h，取出后，加入4℃的屈臣氏水溶液终止化合物的细胞摄取实验，并快速用屈臣氏水溶液清洗三遍细胞单分子层，最后每孔加入2mL的屈臣氏水溶液；反复冻融裂解细胞，取出细胞超声10min，得细胞悬液，置-20℃冰箱保存，待处理。

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