CN115838398A - 一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115838398A CN115838398A CN202211550826.6A CN202211550826A CN115838398A CN 115838398 A CN115838398 A CN 115838398A CN 202211550826 A CN202211550826 A CN 202211550826A CN 115838398 A CN115838398 A CN 115838398A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- glucosidase
- alpha
- enzymolysis
- chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抑制α‑葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该多肽具有α‑葡萄糖苷酶抑制作用强和安全无毒副作用的优点，可用作Ⅱ型糖尿病的药品，拓宽蛙皮的附加值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用。
背景技术
棘胸蛙因兼具食用与药用的双重价值，又被称为“山泉中的活人参”。目前棘胸蛙以餐饮销售和活体零售为主要营销方式，市面售卖的多为去皮后的新鲜蛙肉，加工产品较为少见，产业链简单加工产品形式单一。棘胸蛙加工过程中会产生较多副产物如蛙皮、骨、内脏等，合理利用蛙皮等副产物资源对棘胸蛙的多样化与高值化开发有着积极影响。
糖尿病根据不同的发病机制可分为I型、II型、特殊类型和妊娠糖尿病，其中II型糖尿病占我国糖尿病患者人数的95％以上，为主要发病类型。控制血糖水平是II型糖尿病治疗过程中的关键要素，α-葡萄糖苷酶可以通过调节多糖类的代谢过程对血糖加以调节。目前常用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病的典型药物虽然能够较好的调控血糖水平，但大多会引起腹痛、胀气等副作用，例如阿卡波糖、米格列醇。从天然产物中寻找毒副作用更小的α-葡萄糖苷酶抑制剂受到人们的关注。
发明内容
为解决上述问题，本发明的实施例在第一方面提出了一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
根据本发明实施例的一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽，该多肽的分子量为685.2927Da，该多肽具有α-葡萄糖苷酶抑制作用强和安全无毒副作用的优点，可用作Ⅱ型糖尿病的药品，拓宽蛙皮的附加值。
本发明的实施例在第二方面提出了一种上述的抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)棘胸蛙蛙皮按照料液比1g:15～25mL加蒸馏水均质，调节pH至6.5～7.5，按照蛙皮质量添加4％～6％的木瓜蛋白酶，调整酶解温度为40～50℃，酶解处理4～6h后，沸水灭酶10min；
(2)调节步骤(1)灭酶后的酶解液pH至1.0～3.0，按照蛙皮质量添加4％～6％的酸性蛋白酶，调整酶解温度为45～55℃，酶解处理4～6h后沸水灭酶10min；
(3)将步骤(2)灭酶后的酶解液离心，取上清液，经超滤和层析，得到抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽。
根据本发明的实施例，该方法对蛙皮进行分步酶解，再经超滤和层析，获得可抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽。
可选地，步骤(1)中，木瓜蛋白酶的酶活力≥200U/mg。
可选地，步骤(2)中，酸性蛋白酶的酶活力≥200U/mg。
可选地，步骤(3)中，超滤为使用截留分子量为3kD的超滤管收集分子量小于3kD的酶解产物。
可选地，步骤(3)中，层析为使用Sephadex G-15凝胶色谱柱对超滤后的酶解液进行柱层析：上样浓度为20～40mg/mL，上样量2～4mL，流速980μL/min，每10min收集一管，在220nm检测并绘制吸光度曲线。
可选地，对层析后的组分进行反相高效液相色谱纯化，反相高效液相色谱条件为：进样量10～20μL；使用C18反向色谱柱，柱温为25～30℃，流动相：A为含有0.1％三氟乙酸的水，B为乙腈，梯度洗脱：0～40min、乙腈浓度从0至50％，洗脱速度1.0mL/min；紫外检测波长280nm。
根据本发明的实施例，本发明还提出上述的棘胸蛙多肽在制备降血糖药物中的应用，以实现棘胸蛙高附加值的综合利用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的酶解超滤物的柱层析洗脱图；
图2为根据本发明实施例的棘胸蛙多肽的反向高效液相色谱图；
图3为根据本发明实施例的棘胸蛙多肽的质谱图；
图4为根据本发明实施例的棘胸蛙多肽在α-葡萄糖苷酶口袋中的构象、在α-葡萄糖苷酶活性位点中的结合模式、相互作用平面图；
图5为根据本发明实施例的超滤组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性，a-d表示组间差异极显著(P<0.05)；
图6为根据本发明实施例的棘胸蛙多肽对LO2细胞毒性。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
(1)棘胸蛙蛙皮按照料液比1g:15mL加蒸馏水均质，调节pH至6.7，按蛙皮质量添加5％的木瓜蛋白酶(酶活力≥200U/mg)，调整酶解温度为45℃，酶解处理5.3h后沸水灭酶10min。
(2)调节步骤(1)灭酶后的酶解液pH至2.2，按蛙皮质量添加4％的酸性蛋白酶(酶活力≥200U/mg)，调整酶解温度为45℃，酶解处理4.8h后沸水灭酶10min。
(3)将步骤(2)灭酶后的酶解液冷却至室温后，在4℃下8000r/min离心10min，离心后取上清液。
(4)步骤(3)的上清液使用截留分子量为3kD和10kD的超滤管进行分离分级，得到三个组分：QSPH-Ⅰ(<3kD)、QSPH-Ⅱ(3～10kD)、QSPH-Ⅲ(>10kD)。
(5)使用Sephadex G-15凝胶色谱柱(规格为Ф1.6×60cm)对步骤(4)超滤后的QSPH-Ⅰ酶解液进行柱层析纯化。上样浓度为20mg/mL，上样量2mL，流速980μL/min，每10min收集一管，在220nm检测并绘制吸光度曲线，结果如图1所示，分别收集组分1～4冷冻干燥后检测其α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中，第11-13管为α-葡萄糖苷酶抑制活性最高组分，为凝胶层析酶解物。
(6)将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成50μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据α-葡萄糖苷酶抑制活性得1个对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性的多肽；反相高效液相色谱条件为：进样量10μL；使用C18反向色谱柱(Acclaim PepMap RSLC,75μm×25cmC18-2μm
)；柱温为30℃；流动相：A为含有0.1％三氟乙酸的水，B为乙腈；梯度洗脱：0～40min乙腈浓度从0至50％；洗脱速度1.0mL/min，紫外检测波长280nm。反向高效液相结果图如图2所示，保留时间为25.539min的单峰为活性最强的肽段。
实施例2
使用C18反相色谱柱(Acclaim PepMap RSLC,75μm×25cm C18-2μm
)，流动相为乙腈/水/甲酸＝5/95/0.1(v/v)，60min内流动相A由95％降至62％。质谱采用ThermoFisher Q Exactive系统(美国赛默飞)结合纳升喷雾Nano Flex离子源，喷雾电压为1.9kV，离子传输管加热温度为275℃。质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式(DataDependent Analysis,DDA)，一级质谱扫描范围100-1500m/z，扫描分辨率为70000，最大注入时间100ms。每次DDA循环下最多采集20个电荷为1+到3+的二级图谱，二级质谱离子最大注入时间为50ms。碰撞室能量(高能碰撞诱导解离,HCD)设定为28eV，适用于所有前体离子，动态排除设置为6秒。
得到如图3所示的质谱图，选取目标肽的离子作为母离子与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系列离子，N端碎片离子系列标注为b系列，C端碎片离子系列标注为y系列，将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列为Met-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Pro。
实施例3
基于分子对接使用软件Autodock(version 4.2)对质谱鉴定得到的多肽做生物活性的筛选，多肽的空间结构由ChemDraw 11.0(Cambridge Soft Corporation,Cambridge,Massachusetts,USA )软件绘制。使用Open Babel GUI将多肽结构保存为mol2格式，以Tripos力场能量最小化原则构建多肽分子结构。在Autodock中进行质子化状态和氢取向的优化，并保存为pdbqt文件作为配体文件。采用Lamarkian genetic algorithm(LGA)进行对接的计算，并设置energy range＝4.0，exhaustiveness＝9.0，num modes＝30.0。
从PDB数据库中获取α-葡萄糖苷酶的3D结构(PDB ID:3A4A)，利用Discoverystudio4.5确定结合位点，设置对接参数conf.txt文件，除去蛋白质中的水分子与溶剂分子，利用Autodock tools为蛋白质加氢，保存为pdbqt格式备用。
结果如图4所示，A为Met-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Pro在α-glucosidase口袋中的构象；B.在α-glucosidase活性位点中的结合模式；C.相互作用平面图。Met-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Pro多肽在仅在Arg315和Gln353处形成氢键，在Asp352和Glu411处形成吸引电荷，在Val308处形成pi-sigma相互作用，Lys156处形成疏水作用，Phe178处形成π-π堆积，因此该多肽与受体蛋白α-葡萄糖苷酶具有一定的结合能力。
实施例4
将实施例1制备的QSPH-Ⅰ、QSPH-Ⅱ、QSPH-Ⅲ进行体外α-葡萄糖苷酶抑制实验：将20μL多肽溶液、20μLα-葡萄糖苷酶依次加入96孔板中振荡混匀，室温孵育20min后，加入20μL PNPG充分混匀，37℃避光孵育20min，最后加入100μL 1M碳酸钠溶液使体系反应终止并立即检测410nm处吸光值。空白组以PBS缓冲液代替样品、α-葡萄糖苷酶和对硝基苯基葡萄糖；完全反应组以PBS缓冲液代替样品；阳性药物以阿卡波糖代替样品。
α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[1-(D2-D1)/D3]×100％；
式中：D1为样品对照组；D2为样品反应组(阳性对照)；D3为完全反应组。
结果如图5所示，Met-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Pro对α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制效果。
将实施例1制备的QSPH-Ⅰ进行细胞毒性实验：取对数生长期的LO2细胞制成均匀单细胞悬液，计数后使用培养基稀释至2万个/100μL，以每孔100μL铺至96孔板，培养12-16h后，吸弃旧培养基，加入不同浓度含多肽的培养基(培养基:多肽溶液＝99:1)继续培养24h。最后在避光条件下每孔加入100μL新培养基和15μL 0.5mg/mL的噻唑兰溶液，在培养箱中孵育4h后吸弃上清，每孔加150μL DMSO避光震荡10min，在490nm处检测吸光值。每组样品设置6个平行孔，设定PBS对照组；计算细胞存活率公式如下：
细胞存活率(％)＝[(A1-A0)/(A2-A0)]×100％；
式中：A0为空白组；A1为样品组；A2为对照组。
结果如图6所示，在0.1～10μg/mL浓度条件下Met-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Pro多肽对LO2细胞具有生长促进作用，细胞存活率在98～120％之间。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
2.一种如权利要求1所示的抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)棘胸蛙蛙皮按照料液比1g:15～25mL加蒸馏水均质，调节pH至6.5～7.5，按照蛙皮质量添加4％～6％的木瓜蛋白酶，调整酶解温度为40～50℃，酶解处理4～6h后，沸水灭酶10min；
(2)调节步骤(1)灭酶后的酶解液pH至1.0～3.0，按照蛙皮质量添加4％～6％的酸性蛋白酶，调整酶解温度为45～55℃，酶解处理4～6h后沸水灭酶10min；
(3)将步骤(2)灭酶后的酶解液离心，取上清液，经超滤和层析，得到抑制α-葡萄糖苷酶抑制活性的棘胸蛙多肽。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，木瓜蛋白酶的酶活力≥200U/mg。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，酸性蛋白酶的酶活力≥200U/mg。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，超滤为使用截留分子量为3kD的超滤管收集分子量小于3kD的酶解产物。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，层析为使用Sephadex G-15凝胶色谱柱对超滤后的酶解液进行柱层析：上样浓度为20～40mg/mL，上样量2～4mL，流速980μL/min，每10min收集一管，在220nm检测并绘制吸光度曲线。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，对层析后的组分进行反相高效液相色谱纯化，反相高效液相色谱条件为：进样量10～20μL；使用C18反向色谱柱，柱温为25～30℃，流动相：A为含有0.1％三氟乙酸的水，B为乙腈，梯度洗脱：0～40min、乙腈浓度从0至50％，洗脱速度1.0mL/min；紫外检测波长280nm。
8.如权利要求1所述的棘胸蛙多肽在制备降血糖药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211550826.6A CN115838398A (zh) | 2022-12-05 | 2022-12-05 | 一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211550826.6A CN115838398A (zh) | 2022-12-05 | 2022-12-05 | 一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115838398A true CN115838398A (zh) | 2023-03-24 |
Family
ID=85578025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211550826.6A Pending CN115838398A (zh) | 2022-12-05 | 2022-12-05 | 一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115838398A (zh) |
-
2022
- 2022-12-05 CN CN202211550826.6A patent/CN115838398A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109400678B (zh) | 一种刺参来源的抗氧化和dpp-iv抑制活性肽 | |
| CN110627897B (zh) | 一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用 | |
| WO2019205662A1 (zh) | 一种蛹虫草培养基多糖及其分离纯化方法和用途 | |
| CN107384877A (zh) | 一种慢病毒的纯化方法 | |
| CN108715600A (zh) | 一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽及其制备方法和应用 | |
| CN117247430B (zh) | 一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用 | |
| CN111269290B (zh) | 一种鲟鱼抗炎肽的制备方法 | |
| CN111304171B (zh) | 烟碱乙酰胆碱受体靶向性的过表达circDYM的外泌体及其制备方法与应用 | |
| CN111281951A (zh) | 一种中药发酵抗肿瘤活性多肽口服液的制备方法 | |
| CN111269292B (zh) | 具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用 | |
| CN109503699A (zh) | 一种带鱼鱼肉降血压肽 | |
| CN115838398A (zh) | 一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用 | |
| US20230142954A1 (en) | Ace inhibitory peptide composition derived from ginkgo protein and preparation method and application thereof | |
| CN116925181A (zh) | 牡蛎活性肽在制备抗糖尿病的药物中的应用 | |
| CN115611971A (zh) | 一种富含支链氨基酸的蛋白肽及其制备方法与应用 | |
| CN113567569A (zh) | 一种头花蓼提取物对喹诺酮类药物吸收作用的测定方法 | |
| CN106191184B (zh) | 一种新颖魁蚶抗氧化活性肽的制备及其用途 | |
| CN114276953A (zh) | 一株能抑制肠道细胞dpp-4活性的植物乳杆菌ye4及其缓解糖尿病的应用 | |
| CN116041429A (zh) | 一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用 | |
| CN116199741A (zh) | 抑制血管紧张素转化酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用 | |
| CN105085618B (zh) | 一种缢蛏活性八肽及其制备方法和应用 | |
| CN118221766A (zh) | 一种鱼源抗菌肽及其筛选方法和应用 | |
| CN108101829B (zh) | 一种吲哚化合物、其制备方法及应用 | |
| CN115960982A (zh) | 一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法 | |
| CN116621929A (zh) | 一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其改造方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |