CN108715600A - 一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽及其制备方法和应用 - Google Patents
一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于功能性食品生物技术领域，公开了一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽，所述寡肽的氨基酸序列为：Val‑Ala‑Pro‑Glu‑Glu‑His‑Pro‑Val‑Leu‑Leu或Ser‑Tyr‑Glu‑Leu‑Pro‑Asp‑Gly‑Gln‑Val‑Ile‑Thr‑Ile‑Gly‑Asn‑Glu‑Arg中的一种或两种。本发明制备的肽组分及寡肽对肠黏膜上皮细胞迁移具有显著促进作用；且对肠黏膜细胞增殖具有选择性，对正常培养细胞促进作用不明显，但在细菌脂多糖存在的培养条件下，表现出明显的促进效果。本发明寡肽取自牡蛎，来源丰富，制备过程采用生物酶解技术，安全可靠，在食品和医药等领域应用前景好。
Description
技术领域
本发明属于功能性食品生物技术领域，更具体地，涉及一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽及其制备方法和应用。
背景技术
炎症性肠病（Inflammatory bowel disease, IBD）是北美和欧洲等发达国家和地区的常见疾病，但近年来在亚洲、澳洲和非洲等国家地区的发生率却在不断上升。随着我国近几十年来工业化和城市化的快速发展，国内的IBD发病率呈逐年上升趋势。IBD发病不但会严重影响患者正常生活，而且癌变的风险较高，已引起医学界的广泛关注。IBD的治疗药物主要包括化学类药物、免疫抑制类药物和单抗类药物。激素类药物一般存在较高的癌变、心衰和肺结核等副作用。而单抗类进口药物价格昂贵，普通民众难以承受，而且停药后容易复发。放化疗患者在接收治疗过程中，肠黏膜也会不同程度地受到损伤，不但影响营养吸收功能，而且降低了患者对治疗的耐受程度和愈后身体状况，亟需对应的肠道黏膜保护和修复制剂。因此，无论IBD的治疗还是放化疗患者，都需要寻找更有效、毒副作用更小的活性物质和更适合普通大众的辅助治疗方法。
食物来源的生物活性肽，不但可作为营养成分被人体吸收利用，无毒、副作用，而且表现出多样的生物活性，是医药和功能食品活性物质的重要来源。目前研究已发现，从牛奶酪蛋白水解获得转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)和酪蛋白糖巨肽。TGF-β已经应用于IBD病人的配方食品，起到缓解症状的作用。而酪蛋白糖巨肽在动物实验层面也表现出缓解IBD症状的效果，但仍在研究完善当中。研究还发现L-谷氨酰胺、精氨酸、小肠三叶因子、表皮生长因子、胰高血糖素样肽和外源性抗菌肽类等蛋白肽及氨基酸类成分，都表现出对肠黏膜有一定的保护和促进修复的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽。
本发明的另一目的在于提供所述促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽的应用。
本发明的上述技术目的通过以下技术方案实现：
一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽，所述寡肽的氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu或Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg中的一种或两种。
本发明同时提供所述的促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.将贝肉清洗搅碎、加水均质化，贝肉与水的重量比为1:2～1:5；
S2.将步骤S1中混合物加入或不加入蛋白酶进行水解，水解完成后灭酶、过滤、离心去杂质；
S3.将步骤S2中离心后的清液经超滤，浓缩后得到浓缩液，然后干燥或冷冻得到待处理物质；超滤截留的标称分子量为5~10 kDa；
S4. 将步骤S3中待处理物质经过排阻色谱处理并收集220纳米吸收流分，浓缩得贝肉粗肽OP1；
S5. 将贝肉粗肽OP1采用反相高效液相色谱分离纯化，以含0.1~2%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，按洗脱的时间先后获得肽组分OP2；OP2以含0.1~2%体积三氟乙酸的水溶液为A相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min（色谱柱规格为250 × 10 mm I.D. S-5 μm, 12 nm）；按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2，肽组分OP2以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min（色谱柱规格为250 × 4.6 mm I.D. S-5 μm, 12 nm）；按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，收集上述2个主要流分峰经干燥处理得到所述寡肽。
优选地，步骤S2中蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶中的一种或者多种；步骤S2中按每g原料添加1000~5000U的蛋白酶。
优选地，步骤S2中酶水解的温度为40~55℃，pH为6.5~8.0，水解的时间为3~5h。
优选地，步骤S2中的酶解产物在95℃保持10分钟灭酶。
优选地，步骤S1中贝肉为牡蛎肉。本发明以牡蛎作为贝类代表的提取原料物质，但本发明保护的贝类来源不限于牡蛎。
目前关于牡蛎来源肠黏膜修护活性物质的研究主要集中于活性组分，没有明确到具体活性组分结构信息。发明专利申请（申请号201310437598.6）公开了一种肠道黏膜保护与修复型肠内营养制品及其制备方法，但未明确具体起作用的活性肽氨基酸序列。发明专利申请（申请号201310437598.6）公开了一种保护化疗损伤的肠黏膜屏障功能的肠内营养制剂，其主要活性成分为牡蛎的活性多糖，而非牡蛎蛋白肽。
牡蛎是我国沿海水产重要品种，其食用营养价值高，但缺乏功能和活性物质结构明确的功能制品，限制了其高值化利用。本发明提供了一种简单的途径，使其能够获得高价值的应用。
优选地，步骤S3中所述的超滤处理，超滤膜为0.2μm、100000、10000、5000、3000MWCO指标的超滤膜组合。
优选地，步骤S4中所述经过排阻色谱处理为采用凝胶层析柱进行纯化，凝胶层析柱为sephadex G-10、25、50、75中的一种或者组合。
最优选地，贝类与水的重量比为1:4，采用胰蛋白酶3000u/g条件下，酶水解的温度为40℃，pH为8.0，水解的时间为4h，超滤截留的标称分子量为10~5kDa处理下得到的超滤组分，具有最佳的促进肠粘膜上皮细胞增殖和迁移的效果，且本发明发现上述超滤组分在正常培养条件下促进作用不明显，但在菌多糖（LPS）共培养条件下则分别变现出150.81 ±12.34% (5 μg/ml)和151.73 ± 12.28% (6.25 μg/ml)的显著增殖促进效果，在较低剂量情况下保持与超滤组分相当的活性（如图4和7所示）。
因而，上述超滤组分也在本发明的保护范围内。
同时，在造模前后都给药的培养模式下，上述10~5 kDa牡蛎肽超滤组分对小鼠肠黏膜细胞迁移促进率达到342.91 ± 42.54% （8小时，500 μg/ml）和340.33 ± 15.05%（24小时，500μg/ml），分别达到同剂量下对照物（五肽胃泌素）的3倍和2倍，作用显著（如图5和6所示）。
本发明进一步提供所述的促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽在制备肠黏膜保护修复肽食品及药物中的应用。
例如，可以应用于肠黏膜损伤的食品或药物，由于本发明采用的是生物来源的贝类，且采用的是生物酶解技术，过程完全无毒，使用安全有效。
尤其地，所述的促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽在菌多糖存在的培养条件下显示出促进细胞增殖效果，可应用于肠黏膜上皮细胞的增殖。本发明发现，相比较于普通培养条件下，所述寡肽在菌多糖共培养条件下对于肠黏膜上皮细胞的增殖促进作用更为显著。
进一步地，所述寡肽经过乙酰化、磷酸化、糖基化或者氨基化修饰。
本发明还保护一种药物组合物，其包含了所述的促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽及药学上可接受的赋形剂。
本发明同时保护一种营养制品组合物，包括所述的促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽，以及一种或者多种选自以下营养组分的组合：蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素、矿物质、螯合物等。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明的牡蛎寡肽对肠黏膜上皮细胞有选择性的促进增殖作用，在正常培养条件下促进作用不明显，但在菌多糖（LPS）共培养条件下则表现出显著增殖促进效果，在较低剂量情况下保持与超滤组分相当的活性。本发明的牡蛎寡肽对肠黏膜上皮细胞的迁移有明显的促进作用。本发明采用的寡肽原材料牡蛎在我国沿海地区养殖规模大，常年生产，价格合理，适合工业化生产。本发明明确了活性寡肽氨基酸序列，酶解后经超滤获得的产物可直接用于肠黏膜保护作用保健食品、特医食品。
附图说明
图1为实施例8的Sephadex G-25葡聚糖凝胶色谱图；
图2为实施例8的反相高效液相色谱柱分离得到3个组分，以及组分3纯化获得的2个寡肽的色谱图；
图3为实施例8的2个寡肽的氨基酸序列的质谱分析鉴定图；
图4为实施例8的酶解物超滤组分对细胞株的增殖促进作用统计图；
图5为实施例8的酶解物超滤组分对细胞株迁移促进作用统计图；
图6为实施例8的酶解物超滤组分对细胞株迁移促进作用效果图；
图7为实施例8的反相高效液相色谱处理3个组分及纯化获得的2个寡肽的细胞增殖促进作用统计图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1（菠萝蛋白酶）
（1）将贝肉（本发明实施例中均采用的是牡蛎）清洗、取肉、搅碎、按1:2重量体积比（kg/L）加纯净水均质化。按3000U/g贝肉的比例，加入菠萝蛋白酶，调节pH值为6.5，40℃下水解4小时。加热至95℃保持10分钟灭酶，冷却，过滤、浓缩，得到贝肉酶解浓缩清液。贝肉浓缩清液经过0.2μm、100,000和3,000 MWCO超滤膜处理，去掉大蛋白和低分子量氨基酸和小分子化合物，得到标称分子量为100~3 kDa的超滤组分，浓缩冻干得到贝肉酶解超滤组分干粉A。
（2）超滤干粉A溶解为50mg/ml的水溶液，经Sephadex G-10凝胶层析柱分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，收集220纳米吸收主要流分，冻干得到贝肉肽粉OP1。
（3）将粗肽OP1采用反相高效液相色谱做进一步的分离纯化，以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min；按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2。OP2以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min；按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，经干燥处理获得氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu和Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg的对肠黏膜上皮细胞增殖和迁移有促进作用牡蛎寡肽。
实施例2（木瓜蛋白酶）
（1）将贝肉清洗、取肉、搅碎、按1:3重量体积比（kg/L）加纯净水均质化。按4000U/g贝肉的比例，加入木瓜蛋白酶，调节pH值为6.5，50℃下水解4小时。加热至95℃保持10分钟灭酶，冷却，过滤、浓缩，得到贝肉酶解浓缩清液。贝肉浓缩清液经过0.2μm、100,000和5,000 MWCO超滤膜处理，去掉大蛋白和低分子量氨基酸和小分子化合物，得到标称分子量为100~5 kDa的超滤组分，浓缩冻干得到贝肉酶解超滤组分干粉A。
（2）超滤干粉A溶解为50mg/ml的溶液，经Sephadex G-75凝胶层析柱分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，收集220纳米吸收主要流分，冻干得到贝肉肽粉OP1。
（3）将粗肽OP1采用反相高效液相色谱做进一步的分离纯化，以含0.1~2%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min；按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2。OP2以含0.1~2%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min；按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，经干燥处理获得氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu和Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg的对肠黏膜上皮细胞增殖和迁移有促进作用牡蛎寡肽。
实施例3（胃蛋白酶）
（1）将贝肉清洗、取肉、搅碎、按1:4重量体积比（kg/L）加纯净水均质化。按1000U/g贝肉的比例，加入胃蛋白酶，调节pH值为3.0，40℃下水解4小时。加热至95℃保持10分钟灭酶，冷却，过滤、浓缩，得到贝肉酶解浓缩清液。贝肉浓缩清液经过0.2μm、100,000和10,000 MWCO超滤膜处理，去掉大蛋白和低分子量氨基酸和小分子化合物，得到标称分子量为100~10kDa的超滤组分，浓缩冻干得到贝肉酶解超滤组分干粉A。
（2）超滤干粉A溶解为50mg/ml的溶液，经Sephadex G-50凝胶层析柱分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，收集220纳米吸收主要流分，冻干得到贝肉肽粉OP1。
（3）将粗肽OP1采用反相高效液相色谱做进一步的分离纯化，以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min；按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2。OP2以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min；按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，经干燥处理获得氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu和Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg的对肠黏膜上皮细胞增殖和迁移有促进作用牡蛎寡肽。
实施例4（无蛋白酶）
（1）将贝肉清洗、取肉、搅碎、按1:4重量体积比（kg/L）加纯净水均质化。不外加蛋白酶，调节pH值为7.0，50℃下水解4小时。加热至95℃保持10分钟灭酶，冷却，过滤、浓缩，得到贝肉酶解浓缩清液。贝肉浓缩清液经过0.2μm、100,000和5,000 MWCO超滤膜处理，去掉大蛋白和低分子量氨基酸和小分子化合物，得到标称分子量为100~5 kDa的超滤组分，浓缩冻干得到贝肉酶解超滤组分干粉A。
（2）超滤干粉A溶解为50mg/ml的溶液，经Sephadex G-25凝胶层析柱分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，收集220纳米吸收主要流分，冻干得到贝肉肽粉OP1。
（3）将粗肽OP1采用反相高效液相色谱做进一步的分离纯化，以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min；按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2。OP2以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min；按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，经干燥处理获得氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu和Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg的对肠黏膜上皮细胞增殖和迁移有促进作用牡蛎寡肽。
实施例5（中性蛋白酶）
（1）将贝肉清洗、取肉、搅碎、按1:5重量体积比（kg/L）加纯净水均质化。按5000U/g贝肉的比例，加入胃蛋白酶，调节pH值为6.5，40℃下水解4小时。加热至95℃保持10分钟灭酶，冷却，过滤、浓缩，得到贝肉酶解浓缩清液。贝肉浓缩清液经过0.2μm、10,000和3,000 MWCO超滤膜处理，去掉大蛋白和低分子量氨基酸和小分子化合物，得到标称分子量为10~3 kDa的超滤组分，浓缩冻干得到贝肉酶解超滤组分干粉A。
（2）超滤干粉A溶解为50mg/ml的溶液，经Sephadex G-10凝胶层析柱分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，收集220纳米吸收主要流分，冻干得到贝肉肽粉OP1。
（3）将粗肽OP1采用反相高效液相色谱做进一步的分离纯化，以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min；按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2。OP2以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min；按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，经干燥处理获得氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu和Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg的对肠黏膜上皮细胞增殖和迁移有促进作用牡蛎寡肽。
实施例6（碱性蛋白酶）
（1）将贝肉清洗、取肉、搅碎、按1:3重量体积比（kg/L）加纯净水均质化。按3000U/g贝肉的比例，加入碱性蛋白酶，调节pH值为8.0，50℃下水解4小时。加热至95℃保持10分钟灭酶，冷却，过滤、浓缩，得到贝肉酶解浓缩清液。贝肉浓缩清液经过0.2μm、5,000和3,000 MWCO超滤膜处理，去掉大蛋白和低分子量氨基酸和小分子化合物，得到标称分子量为5~3 kDa的超滤组分，浓缩冻干得到贝肉酶解超滤组分干粉A。
（2）超滤干粉A溶解为50mg/ml的溶液，经Sephadex G-25凝胶层析柱分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，收集220纳米吸收主要流分，冻干得到贝肉肽粉OP1。
（3）将粗肽OP1采用反相高效液相色谱做进一步的分离纯化，以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min；按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2。OP2以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min；按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，经干燥处理获得氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu和Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg的对肠黏膜上皮细胞增殖和迁移有促进作用牡蛎寡肽。
实施例7（风味蛋白酶）
（1）将贝肉清洗、取肉、搅碎、按1:5重量体积比（kg/L）加纯净水均质化。按4000U/g贝肉的比例，加入风味蛋白酶，调节pH值为6.5，50℃下水解4小时。加热至95℃保持10分钟灭酶，冷却，过滤、浓缩，得到贝肉酶解浓缩清液。贝肉浓缩清液经过0.2μm、10,000和3,000 MWCO超滤膜处理，去掉大蛋白和低分子量氨基酸和小分子化合物，得到标称分子量为10~3 kDa的超滤组分，浓缩冻干得到贝肉酶解超滤组分干粉A。
（2）超滤干粉A溶解为50mg/ml的溶液，经Sephadex G-75凝胶层析柱分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，收集220纳米吸收主要流分，冻干得到贝肉肽粉OP1。
（3）将粗肽OP1采用反相高效液相色谱做进一步的分离纯化，以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min；按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2。OP2以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min；按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，经干燥处理获得氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu和Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg的对肠黏膜上皮细胞增殖和迁移有促进作用牡蛎寡肽。
实施例8（胰蛋白酶）
（1）将贝肉清洗、取肉、搅碎、按1:4重量体积比（kg/L）加纯净水均质化。按3000U/g贝肉的比例，加入胰蛋白酶，调节pH值为8.0，40℃下水解4小时。加热至95℃保持10分钟灭酶，冷却，过滤、浓缩，得到贝肉酶解浓缩清液。贝肉浓缩清液经过0.2μm、10,000和5,000 MWCO超滤膜处理，去掉大蛋白和低分子量氨基酸和小分子化合物，得到标称分子量为10~5 kDa的超滤组分，浓缩冻干得到贝肉酶解超滤组分干粉A。
（2）超滤干粉A溶解为50mg/ml的溶液，经Sephadex G-25凝胶层析柱分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，洗脱色谱图如图1所示，收集220纳米吸收主要流分，冻干得到贝肉肽粉OP1。
（3）将粗肽OP1采用反相高效液相色谱做进一步的分离纯化，以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min；洗脱色谱图如图2（A）所示，按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2。OP2以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min；洗脱色谱图如图2（B）所示，按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，经干燥处理获得氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu（1103.481 m/z, M+H+）和Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg（1790.679 m/z,M+H+）的对肠黏膜上皮细胞增殖和迁移有促进作用牡蛎寡肽，两个寡肽的鉴定图谱如图3所示。
应用实施例
细胞增殖促进活性检测方法：
取对数生长期的IEC-6细胞，胰蛋白酶消化收集细胞，台盼蓝染色计数活细胞数，调整活细胞浓度为2.5×105/ml加于96孔培养板，每孔100μl，培养24h后，再分别加入不同剂量药物，置37℃，体积分数为5％CO2培养24h，于结束前4小时加入MTT 20μl/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100μl/孔，振荡10min左右，置酶标仪测定OD值，波长为492nm。按公式（存活率%＝加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100％）计算存活率，评价受试样品对细胞株的增殖促进作用。
细胞迁移促进活性检测方法：
取对数生长期的IEC-6细胞，胰蛋白酶消化收集细胞，用含15%胎牛血清的培养基将其制备成细胞悬液，用台盼兰染色计数活细胞数（存活率应在95%以上），调整细胞浓度为6.25×104个/孔种植于6孔板中，每孔1000μl，培养板内已预先铺好一薄层Matrigel。
给药方式分为预给药且造模后持续给药、预给药但造模后无持续给药、造模后给药共三种方式，具体操作如下：
（1）预给药且造模后持续给药培养方式
移植细胞后的6孔板，置于37℃，5% CO2培养箱培养16h，细胞贴壁后立即加药，以完全培养基加入不同剂量的样品1000μl/孔，继续培养细胞，隔天换液一次，持续补充各样品至所需剂量。预处理4天后，在细胞刮除造模当天，以无血清培养基洗涤细胞残骸和碎片2次，继续加入含相同终浓度样品的无血清培养基。
（2）预给药但造模后无持续给药培养方式
细胞刮除前操作同上，造模当天以无血清培养基洗涤细胞残骸和碎片2次，加入不含样品无血清培养基。
（3）造模后给药培养方式
移植细胞后的6孔板，置于37℃，5% CO2培养箱培养24h后换液一次。再培养24h后，换无血清培养基继续作用24h，于接种后第4天，进行细胞迁移造模。细胞刮除完毕，以无血清培养基漂洗2次，换以完全培养基加入不同剂量的样品1000μl/孔。
各种给药培养方式刮除造模后，8h和24h采用倒置显微镜数码相机照相，观察受试样品对细胞迁移造模前后的影响，计算细胞迁移面积，以μm2表示。
对实施例8步骤（1）获得的酶解超滤组分对小鼠肠黏膜上皮细胞（IEC-6）的增殖和迁移活性进行测定，结果如图4、5和6所示，其中造模前后均给药组：图5（A）为8小时检测结果，图5（B）为24小时检测结果；造模前给药组：图5（C）为8小时检测结果，图5（D）为24小时检测结果；造模后给药组：图5（E）为8小时检测结果，图5（F）为24小时检测结果。结果显示10~5kDa组分的细胞增殖和迁移促进效果最优，该超滤组分在造模前后均给药组实验中，对小鼠肠黏膜细胞迁移促进效果达到342.91 ± 42.54% （8小时，500 μg/ml）和340.33 ±15.05%（24小时，500μg/ml），分别达到同剂量下对照物（五肽胃泌素）的3倍和2倍，作用显著。
对实施例8步骤（3）的3个高效液相色谱组分和纯化获得的2个寡肽对小鼠肠黏膜上皮细胞（IEC-6）的促进增殖活性进行测定，结果如图7所示。结果显示，组分3活性最优，纯化获得的两个寡肽，在正常培养条件下对细胞增殖促进作用不明显，但在菌多糖（LPS）共培养条件下则分别显示出150.81 ± 12.34% (5 μg/ml)和151.73 ± 12.28% (6.25 μg/ml)的增殖促进效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽及其制备方法和应用
<140> 2018103273263
<141> 2018-04-12
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 牡蛎(ostrea gigas thunberg)
<400> 1
Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 牡蛎(ostrea gigas thunberg)
<400> 2
Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg
1 5 10 15
Claims (10)
1.一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽，其特征在于，所述寡肽的氨基酸序列为Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Leu-Leu或Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro-Asp-Gly-Gln-Val-Ile-Thr-Ile-Gly-Asn-Glu-Arg中的一种或两种。
2.一种包含权利要求1所述的促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽的超滤组分，其特征在于，由如下方法制备得到：
S1.将贝肉清洗搅碎、加水均质化，贝肉与水的重量比为1:2～1:5；
S2.将步骤S1中混合物加入或不加入蛋白酶进行水解，水解完成后灭酶、过滤、离心去杂质；
S3.将步骤S2中离心后的清液经超滤截留获得标称分子量为10~5 kDa的组分，浓缩后得到浓缩液，然后干燥或冷冻即得。
3.一种权利要求1所述的促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将贝肉清洗搅碎、加水均质化，贝肉与水的重量比为1:2～1:5；
S2.将步骤S1中混合物加入或不加入蛋白酶进行水解，水解完成后灭酶、过滤、离心去杂质；
S3.将步骤S2中离心后的清液经超滤，浓缩后得到浓缩液，然后干燥或冷冻得到待处理物质；超滤截留的标称分子量为5~10 kDa；
S4. 将步骤S3中待处理物质经过排阻色谱处理并收集220纳米吸收流分，浓缩得贝肉粗肽OP1；
S5. 将贝肉粗肽OP1采用反相高效液相色谱分离纯化，以含0.1~2%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的乙腈为B相，按洗脱的时间先后获得肽组分OP2；OP2以含0.1~2%体积三氟乙酸的水溶液为A相，A相在0~5分钟保持6%，5~30分钟A相线性地从6%提高到55%，总流速3ml/min；按洗脱的时间先后依次得到3个组分，收集第3个组分获得肽组分OP2，肽组分OP2以含0.1%体积三氟乙酸的水溶液为A相，含相同三氟乙酸体积含量的甲醇为B相，A相在0~45分钟线性地从45%提高到100%，总流速1ml/min；按洗脱的时间先后获得2个主要流分峰，收集上述2个主要流分峰经干燥处理得到所述寡肽。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶中的一种或者多种；步骤S2中按每g原料添加1000~5000U的蛋白酶。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中酶水解的温度为40~55℃，pH为6.5~8.0，水解的时间为3~5h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中贝肉为牡蛎肉。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述的超滤处理，超滤膜为0.2μm、100000、10000、5000、3000 MWCO指标的超滤膜组合；步骤S4中所述经过排阻色谱处理为采用凝胶层析柱进行纯化，凝胶层析柱为sephadex G-10、25、50、75中的一种或者组合。
8.权利要求1所述的促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽在制备肠黏膜保护修复肽食品及药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽在与菌多糖存在的培养条件下应用于肠黏膜上皮细胞的增殖。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述寡肽为经过乙酰化、磷酸化、糖基化或者氨基化修饰。
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