CN101294188B - 乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途。本发明利用牛初乳中的乳铁蛋白和酶制剂，通过酶法水解，制备得到乳铁蛋白抗菌肽酶解物，再将上述酶解物经大孔吸附静态或动态脱盐、凝胶过滤色谱、半制备高效液相色谱和分析型高效液相色谱分离纯化后得到纯的乳铁蛋白抗菌肽产品，该产品具有高效和广谱的抗菌能力，因此在食品、饲料、医药领域中具有很广阔的应用前景。

Description

乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途

【技术领域】

本发明涉及生物活性肽的技术领域，具体地，本发明涉及乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途。

【背景技术】

三十多年来，新型合成抗生素药物研究进展缓慢，只有极少数新型抗生素化学结构的报道出现。而且这些新型抗生素抗菌谱窄、应用范围有限，并有较大的毒性而限制了广泛使用。一方面严重破坏了动物肠道的微生态平衡，并在动物体内残留；另一方面容易刺激耐药菌株的产生，导致畜禽疫病的日益复杂化，严重影响畜产品质量和人类健康。人类对自身健康和环保问题认识的不断提高，药物副作用的研究大大加强，不少合成抗生素被发现有潜在的致癌、致畸和致突变作用，使新型化学合成抗生素的开发难度越来越大。研究结果表明，抗菌肽的抗菌谱广、杀灭微生物的作用强，在抑制细菌移位、防治感染方面效果特异，因此抗菌肽的研究应用已成为当前食品医药研究的热点。抗菌肽作为一大类新型抗菌机理的天然抗生素，有望给临床医药学、食品加工、动物和植物转基因技术等领域带来广阔的开发应用前景。

在临床上，抗菌肽可用于治疗外伤感染、褥疮和不宜用抗生素的感染性患者。在食品加工领域，可用于绿色食品的防腐剂，减少有害防腐剂的应用。在转基因技术方面，可将强效抗菌肽基因转入植物或动物以增强其抗病能力。相信在不久的将来，天然抗菌肽必将极大造福于人类。

我国目前成年乳牛超过1400万头，除喂养牛犊外每年至少存在50万吨潜在的初乳资源，而牛初乳中含有丰富的生物活性物质，其中乳铁蛋白具有独特的生物活性。大量的研究报道显示，乳铁蛋白具有广谱的抗菌能力、增强铁的传递和吸收、免疫调节作用、抗病毒作用和抑制脂肪的氧化等生物活性，可广泛应用于食品、医药和化妆品领域。1992年以来，有关乳铁蛋白的国际研讨会议已经召开了多次，历届会议就乳铁蛋白的结构、性质、生理活性以及在临床上的应用进行了广泛探讨。这表明乳铁蛋白特有的生物学意义已受到世界范围的广泛重视。随着我国奶牛养殖业的发展和牛奶产量的提高，以及消费者的需求，乳品深加工的时机已经到来。但是乳铁蛋白分子质量大，空间结构复杂，因而耐热性差，在热加工中易失活，限制了其在食品及饲料等工业中的应用。随着人们生活水平的提高，人们对食品的要求也越来越高，摄取食品不仅仅是为了解决温饱问题，也不仅仅是为了获得必需的营养以维持生存，而且还要求它具有一定的调节生理活动的功能。

通过特定的方法将乳铁蛋白水解制备相应的乳铁蛋白抗菌肽，减小了蛋白质肽链的长度，而且有望暴露其抑菌活性位点。这样，不仅可以提高产品的耐热、耐胃肠道的稳定性，还可以进一步提高其抑菌活性，这将为高效、稳定的天然抗菌剂的开发开拓一个崭新的思路，并将具有广泛的应用前景。

CN 200410016102.9公开了调节免疫功能、抗肿瘤的天然营养剂，涉及从牛初乳、牛奶、乳浆及其相关制品中提取乳铁蛋白和活性多肽的方法。其中活性多肽是提取乳铁蛋白后得到的产物，即酪蛋白和乳清蛋白水解得到的产物，其中不含乳铁蛋白，也未提及其抗菌活性。

CN 00804843.6描述了抗微生物/中和内毒素的多肽，公开了一种通过蛋白水解消化乳铁蛋白分子产生的6kDa宿主防御多肽。这种6kDa宿主防御多肽具有抗微生物和抗内毒素活性。还公开了该6kDa宿主防御多肽的功能性变体及相关疾病治疗方法。该专利涉及采用溶酶体蛋白酶，主要是组织蛋白酶来制备乳铁蛋白防御多肽，并未涉及其其它制备和分离纯化方法。

但是，目前还缺乏可以具有实际广泛应用的提取乳铁蛋白抗菌肽的方法，以及获得这些乳铁蛋白抗菌肽的性质与用途，因此，本申请人进行了大量实验研究，终于作出了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种利用在牛初乳中具有较多功能性而稳定性却较差的乳铁蛋白制备乳铁蛋白抗菌肽的制备方法，该方法是一种条件温和、效果显著的方法。

本发明的另一个目的是提供抑菌活性较强、纯度较高的乳铁蛋白抗菌肽。

本发明的另一个目的是所述乳铁蛋白抗菌肽的用途。

[技术方案]

本发明涉及以乳铁蛋白为原料，采用蛋白酶水解乳铁蛋白，用大孔吸附树脂进行脱盐，以抑菌率为指标，检测抗菌肽的抗菌活性，采用凝胶过滤色谱、半制备高效液相色谱和分析型高效液相色谱进行分离纯化。本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明的乳铁蛋白抗菌肽的制备方法包括酶解步骤、静态或动态脱盐步骤、蒸发浓缩步骤、凝胶过滤色谱分离步骤、半制备高效液相色谱分离步骤与分析型高效液相色谱分离步骤。下面分别描述这些步骤。

(i)酶解步骤：蛋白质分子是以氨基酸通过肽键结合而成的多肽链。采用蛋白酶可以断裂肽键，将蛋白质水解为多肽、寡肽和氨基酸。在酶解过程中，酶的种类、底物的用量、酶的用量、酶解温度、酶解pH值，都会影响酶解的进程和酶解产物的特性。在本发明中，采取的酶解方法是：在酶反应器中制备浓度10-50mg/mL乳铁蛋白去离子水溶液，在40-50℃预处理10-20min，然后用酸或碱将其pH调节到2.0-7.5，再加入以乳铁蛋白重量计0.5-4.0重量％蛋白酶，在这个温度下进行酶解直到水解度达到10-12％，同时用酸或碱保持该反应介质的pH恒定，然后在85-100℃灭酶5-10min，用酸或碱将其反应介质的pH调节到6.8-7.2，再在7000-15000r/min下冷冻离心10-30min，得到含有10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶解物的上清液，或所述的上清液进行冷冻干燥得到乳铁蛋白抗菌肽酶解物冻干粉。

在本发明中，所述的乳铁蛋白选自DMV公司以商品名乳铁传递蛋白(Lactoferrin)销售的产品，其乳铁蛋白纯度大于90％。

所述的蛋白酶是一种或多种选自胃蛋白酶、537酸性蛋白酶、Alcalase2.4L碱性蛋白酶、胰蛋白酶、2709碱性蛋白酶或AS1398中性蛋白酶的蛋白酶。上述蛋白酶都是目前市场上销售的产品，例如Sigma公司生产的EC3.4.23.1胃蛋白酶、无锡雪梅酶制剂有限公司生产的537酸性蛋白酶、2709碱性蛋白酶和AS1398中性蛋白酶、Novozyme公司生产的Alcalase2.4L碱性蛋白酶和6.0S胰蛋白酶。

优选地，所述的蛋白酶是一种或多种选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、AS1398中性蛋白酶的蛋白酶或537酸性蛋白酶。

更优选地，所述的蛋白酶是胃蛋白酶或胰蛋白酶。

在本发明的这个步骤中使用的酸选自无机酸或有机酸，所述的碱选自无机碱或有机碱。例如，所述的无机酸选自盐酸、磷酸或硫酸，所述的有机酸选自乙酸、酒石酸或柠檬酸；所述的无机碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或氢氧化钾，所述的有机碱选自乙胺、丙胺或乙醇胺。

所述酸或碱的使用浓度一般不宜太高，通常是0.5-1.5mol/L。

在本发明中控制乳铁蛋白的酶解进程是通过水解度值来确定的，该水解度值应该理解是在蛋白质水解反应过程中被裂解的肽键占蛋白质总肽键的百分数。在本发明中，在碱性或中性条件下水解时，水解度的测定采用pH-Stat法〔参考文献：Alder Nissen J.Enzymatic hydrolysis of food protein[M].London：Elsevier applied science publishers，1986.12～14.〕。在酸性条件下水解时水解度的测定采用TNBS法〔参考文献：Alder Nissen J.Determination ofdegree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonicacid[J].J.Agri.Food Chem.，1999，27：1256～1262.〕。

(ii)静态脱盐步骤：往步骤(i)得到的上清液中加入大孔吸附树脂，所述上清液与大孔吸附树脂的体积比是1∶1-2∶1，在温度15-30℃下以150-200r/min振荡6-12h进行静态脱盐，然后分离上清液，该树脂用去离子水洗涤至电导率小于15μs/cm，再用70-85％乙醇水溶液进行洗脱；在上述条件下，所述树脂吸附乳铁蛋白抗菌肽的吸附率是85-95％，乳铁蛋白抗菌肽的脱盐率是85-95％。

在本发明中，大孔吸附树脂应该理解是非离子型高分子多孔性吸附剂，是由苯乙烯、二乙烯苯或甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构，在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，在整个颗粒内部及外部都具有表面活性，它对化合物的吸附作用主要是基于化合物的疏水基团与非极性吸附剂之间的范德华引力，这样就可以对不同极性的化合物进行分离，同时也可通过本身的多孔网状孔穴结构对分子大小不同的化合物加以筛选。由于树脂与被分离成分之间的吸附为物理吸附，被吸附的物质较易洗脱，并具有成本低、效率高、稳定性好和容易再生等特点，因此大孔吸附树脂分离技术现已大量用于环保、化工、医药和食品行业。本发明采用大孔吸附树脂对乳铁蛋白抗菌肽进行脱盐。

在脱盐步骤中，所述树脂吸附乳铁蛋白抗菌肽的吸附率是根据下式进行计算的：

其中，乳铁蛋白抗菌肽浓度是采用TNBS法测定的。

所述乳铁蛋白抗菌肽的脱盐率是根据下式进行计算的：

其中，灰分含量是采用高温(550℃)灼烧法测定的。

根据本发明的另一个优选实施方式，本发明还可以用大孔吸附树脂柱进行动态脱盐，所述的动态吸附脱盐具有脱盐彻底，洗脱液用量少和回收率高的优点，适于工业化生产使用。对同一浓度的上样溶液，若吸附流速过大，被吸附物质来不及扩散到树脂的内表面就提早泄露而造成样品流失，树脂的吸附量就会下降；但吸附流速过小，吸附时间就会延长。确定最佳的吸附流速通常应综合考虑树脂的吸附效果和工作效率。解吸流速一般都比吸附流速慢一倍以上。所述的动态吸附脱盐是使用尺寸φ2.6×30cm柱，让步骤(i)得到的含有乳铁蛋白抗菌肽酶解物的上清液以流速1-2mL/min通过该大孔吸附树脂柱，然后该树脂用去离子水以流速1-2mL/min洗涤至电导率小于15μs/cm，再用70-85％乙醇水溶液以流速0.5-1mL/min进行洗脱。在这样的条件下，所述树脂吸附乳铁蛋白抗菌肽的吸附率是90-95％，乳铁蛋白抗菌肽的脱盐率是90-99％。

在本发明中，所述的大孔吸附树脂经过如下的预处理：先用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇清洗至220nm无吸收峰，去离子水清洗后备用。

所述的大孔吸附树脂选自DA201-A、DA201-B、DA201-C或DA201-D。

优选地，所述的大孔吸附树脂是DA201-B、DA201-C或DA201-D。

更优选地，所述的大孔吸附树脂是DA201-C或DA201-B。

所述的大孔吸附树脂是江苏苏青水处理工程集团有限公司以商品名DA201-A、DA201-B、DA201-C或DA201-D销售的产品。

(iii)蒸发浓缩步骤：步骤(ii)得到的乙醇洗脱液在50-65℃进行旋转蒸发浓缩至浓度为100-300mg/mL，再进行冷冻干燥，得到乳铁蛋白抗菌肽冻干物-1。

旋转蒸发浓缩使用的是沪西分析仪器厂以商品名RE52-3旋转蒸发器销售的产品，上海亚荣生化仪器厂以商品名RE5220旋转蒸发仪销售的产品。

冷冻干燥使用的是北京四环科学仪器厂以商品名LGJ-10冷冻干燥器销售的产品，或LABCON公司以商品名6L Freeze Dry System销售的产品。

(iv)凝胶过滤色谱分离步骤：将步骤(iii)得到的乳铁蛋白抗菌肽冻干物-1制备成10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，使用Sephadex G-50凝胶过滤色谱柱，上样流速为2-3mL/min，再以去离子水以洗脱流速12-25mL/h洗脱，得到的每个组分然后进行抑菌能力的测定，收集抑菌能力最强的组分进行冷冻干燥，得到乳铁蛋白抗菌肽冻干物-2。

冷冻干燥使用的设备如前面所述。

检测波长：220或280nm；柱温：25℃；上样流速2-3mL/min；进样浓度：20mg/mL；进样量：3-8mL；

洗脱条件：去离子水，洗脱流速12-25mL/h。

在本发明中，乳铁蛋白抗菌肽抑菌能力的测定方法如下：

将目前市场上销售的E.coli O157大肠杆菌菌种接种于营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养24h，连续进行活化2次。经2次活化的实验菌种，用无菌生理盐水洗涤后，转移至无菌试管并振荡使菌体分布均匀，将菌液调至10⁶cfu/mL。取装有4mL肉汤蛋白胨培养基(胰蛋白胨1％-牛肉浸膏0.3％-NaCl 0.5％，pH7.2)的试管，分别编号，各试管加入菌浓为10⁶cfu/mL的菌液0.5mL，然后分别加入0.5mL浓度为0.01～10mg/mL的乳铁蛋白抗菌肽溶液，然后置于37±1℃摇床培养。培养6h后，平板计数。三个样品平行进行试验，取其平均值。抑菌性能是以抑菌率表示的，抑菌率根据下式进行计算。

(v)半制备高效液相色谱分离步骤：将步骤(iv)得到的乳铁蛋白抗菌肽冻干物-2制备成10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，使用半制备反相高效液相色谱柱，以流速2-3mL/min进行半制备高效液相色谱分离，得到的每个组分然后进行抑菌能力的测定，收集抑菌能力最强的组分进行冷冻干燥，得到乳铁蛋白抗菌肽冻干物-3。抑菌能力的测定方法如前面所述。

在该半制备高效液相色谱分离步骤中，使用的色谱柱是Waters公司生产的VYDAC^TMC18S/N MT101，其尺寸为φ7.8×250mm。

该半制备高效液相色谱分离的条件如下：

检测波长：220或280nm；柱温：35℃；流速：2-3mL/min；进样浓度：20mg/mL；进样量：150μL；

洗脱条件：流动相：A：水+0.05％三氟乙酸；B：乙腈+0.05％三氟乙酸，梯度洗脱。

(vi)分析型高效液相色谱分离步骤：将步骤(v)得到的乳铁蛋白抗菌肽冻干物-3制备成10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，使用分析型高效液相色谱柱，以流速0.7-1.5mL/min进行分析型高效液相色谱分离，分离得到的每个组分然后进行抑菌能力的测定，收集抑菌能力最强的组分进行冷冻干燥，得到所述的乳铁蛋白抗菌肽。抑菌能力的测定方法如前面所述。

在分析型高效液相色谱分离步骤中，使用的色谱柱为Waters公司生产的VYDAC^TMC18S/N MT101，其尺寸为φ2.6×250mm。

该分析型高效液相色谱分离的条件如下：

检测波长：220或280nm；柱温：35℃；流速：1mL/min；进样浓度：10mg/mL；进样量：20μL；

洗脱条件：流动相：A：水+0.05％三氟乙酸；B：乙腈+0.05％三氟乙酸，梯度洗脱。

根据上述制备方法得到的乳铁蛋白抗菌肽，其中所述的氨基酸是采用氨基酸自动分析仪进行测定的。具体步骤为：将60～100mg乳铁蛋白抗菌肽置于水解管中，加入6mol/L的HCl溶液，真空封口，在110℃下水解24h，冷却后定容、过滤、蒸干，再加入0.02mol/L的HCl溶液，在空气中放置30min，采用Agilent1100液相色谱仪测定氨基酸的含量。

氨基酸分析表明，得到的乳铁蛋白抗菌肽含有18种常见氨基酸，人体必需的8种氨基酸，其含量占36.80％(色氨酸除外)，说明其具有较好的营养。其中疏水性氨基酸占32.90％(色氨酸除外)，碱性氨基酸占19.15％。

所述乳铁蛋白抗菌肽的相对分子质量分布是采用体积排阻高效液相色谱(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)测定的。具体步骤为：吸取样品2mL于10mL容量瓶中，用流动相稀释到刻度，用微孔过滤膜过滤后进样。检测仪器：Waters 600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器(波长220nm)和M32工作站)；色谱柱：TSKgel 2000 SWXLφ300nm×7.8mm；流动相体积比：乙醇∶水∶三氯乙酸＝45∶54∶1；检测波长：220nm；流量：0.5mL/min；柱温：30℃。其测定结果见图4，这些结果表明得到的乳铁蛋白抗菌肽主要分布在200～6000Da。

为了达到实际应用的目的，本发明人对本发明制备的乳铁蛋白抗菌肽进行了有关性能的研究。

(一)产品的稳定性

1.耐消化稳定性

许多来源于食品蛋白质的活性肽在体内测试时就丧失了它们的体外生物活性，这可能是它们本身就是消化酶的作用底物或者在胃肠道的消化过程中被水解而降低了它们的活性。活性肽在体内活性的稳定性可以直接通过动物实验或者临床测试来完成，但是，通过体外培养的过程来模拟胃肠道消化系统作用的方法比体内测试更加实际、方便。由于胃蛋白酶一胰酶复合酶酶解模式最接近人体自然生理消化过程，于是采用了此模式来检测抗菌肽在体内消化的稳定性。胃蛋白酶一胰酶复合酶酶解模式具体地可以参考文献Jiangping，W，Xiaolin，D.Characterization of inhibition and stabilityof soy-protein-derived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides[J].Food Research International，2002(35)：367-375.。

本发明乳铁蛋白抗菌肽耐消化稳定性的结果见表1。

表1本发明乳铁蛋白抗菌肽通过胃肠道酶系统消化前后的活性比较

表1是本发明乳铁蛋白抗菌肽经过胃蛋白酶一胰酶复合酶酶解后的活性比较，由表1可知，该抗菌肽在经过胃肠道消化后活性变化不大，尤其是胃蛋白酶水解后的抗菌肽在胰酶作用下几乎不会对活性有影响。

2.热稳定性

将本发明乳铁蛋白抗菌肽调整至不同的酸碱度，其中一部分置于室温下，另一部分置于高压杀菌锅121℃杀菌15min，最后调节pH 7.0，并进行抑菌性分析，本发明乳铁蛋白抗菌肽的抑菌性实验结果见表2。

表2本发明乳铁蛋白抗菌肽在不同pH以及高压高温杀菌处理后的抑菌性

从2表可以看出，在酸性条件下，该肽在室温下放置有较好的稳定性，即使经过高压杀菌处理后，抑菌性几乎没有变化，这为其在酸性体系中的应用提供了理论依据。但在碱性范围内，一些抗菌肽已经变成不具有活性的沉淀，稳定性较差。

3.贮存稳定性

活性物质若要在食品、医药等行业中加以利用，必需具备一定的贮藏稳定性。将不同pH条件的乳铁蛋白抗菌肽冻干粉在冰箱中4℃分别贮藏3、6、9月后与新鲜制备的冻干粉进行抑菌性比较，结果见表3。

表3贮藏时间对不同pH条件的乳铁蛋白抗菌肽稳定性的影响

注：-未检测到抑菌活性

从表3可以看出，乳铁蛋白抗菌肽在酸性条件(pH 3)和中性条件(pH7)下，贮藏3个月抑菌性几乎没有损失，贮藏6个月抑菌性有略微下降，贮藏9个月抑菌性有明显下降。在碱性条件下贮藏3个月，抑菌性即有显著下降。说明乳铁蛋白抗菌肽适合于酸性或中性的条件下加以利用。

(二)产品的抑菌效果

测定了本发明乳铁蛋白抗菌肽对包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，杆菌和球菌等常见肠道菌群和食品腐败菌的影响，其结果见图5。

从这些实验结果来看，本发明乳铁蛋白抗菌肽对不同菌群具有广谱抗菌性，但不同菌群对本发明乳铁蛋白抗菌肽的敏感程度不同，其中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对乳铁蛋白抗菌肽最敏感，在0.05mg/L时，即表现出很强的抗菌活性，其次是李斯特菌和枯草芽孢杆菌。而志贺氏菌和威尔斯李斯特菌敏感性相对较差。这可能与这些致病菌的细胞壁以及细胞膜结构有关。

本发明还涉及采用上述制备方法得到的乳铁蛋白抗菌肽在营养强化剂、婴幼儿食品功能型添加剂、防腐剂中，在奶粉、酸奶、饮料的抑菌剂中，以及在直接食用或动物饲料或医药领域中的用途。

[有益效果]

本发明采用有效的制备、分离纯化方法得到纯度高的乳铁蛋白抗菌肽，它具有良好的耐消化稳定性、热稳定性与贮藏稳定性，具有广谱抗菌性。本发明方法的效果显著，实用性强，具有良好的应用前景。因此，本发明对于促进牛初乳的深加工及综合利用，拓展乳、功能性食品及医药开发新的领域，增进乳的开发与利用价值，研究和开发功能性食品配料，延长食品保质期，改善婴幼儿肠道菌群等都具有非常重要的意义。

本发明研究了包括酶的蛋白水解特性分析、蛋白酶特异性的选择、最佳水解温度、时间、pH、酶与底物的比例等控制参数，获得了水解度与生物活性之间的关联性，这为酶解法制备生物活性肽提供了一条途径，并具有理论借鉴作用。

目前生物活性物质的脱盐方法主要有透析、超滤和纳滤等，但是这些方法对小分子物质脱盐效果不佳或无法实现，尽管电渗析可以用于小分子物质的脱盐，但是回收率不高、能源消耗大。吸附色谱法是最有可能对小分子有机物质进行脱盐的方法，它是根据溶质在吸附剂表面上的吸附强度不同而对溶质进行分离。其中大孔吸附树脂对多肽具有选择性吸附，用乙醇等有机溶剂洗脱也较为方便。

本发明采用大孔吸附树脂可以对不同极性的化合物进行分离，同时也可通过本身的多孔网状孔穴结构对分子大小不同的化合物加以筛选；被吸附的物质较易洗脱，并具有成本低、效率高、稳定性好和容易再生等特点。

动态吸附具有脱盐彻底，洗脱液用量少、操作方便和回收率高的优点，适于工业化生产使用。

【附图说明】

图1是Sephadex G-50凝胶过滤色谱分离纯化乳铁蛋白抗菌肽图谱；

图2是半制备高效液相色谱分离纯化乳铁蛋白抗菌肽图谱；

图3是分析型高效液相色谱分离纯化乳铁蛋白抗菌肽图谱；

图4是乳铁蛋白抗菌肽相对分子质量分布图；

图5是本发明制备的乳铁蛋白抗菌肽对不同菌种的抑菌活性图

【具体实施方式】

通过下述实施例将更详细地说明本发明。

实施例1

称取DMV公司以商品名乳铁传递蛋白(Lactoferrin)销售的纯度大于90％的乳铁蛋白放到酶反应器中，加入去离子水搅拌均匀制备得到浓度50mg/mL乳铁蛋白，该溶液在40℃预处理20min，再用1.0mol/L HCl将其溶液的pH调节到2.5，以乳铁蛋白重量计加入0.5％Sigma公司生产的EC3.4.23.1胃蛋白酶，然后控制反应体系的pH值恒定，在这个温度下进行酶解，采用TNBS法测定水解度，直到水解度达到11％，反应结束后，在100℃灭酶5min，将其溶液的pH调节到7.0，在10000r/min下进行冷冻离心20min，将该上清液进行浓缩。该乳铁蛋白抗菌肽酶解物在1mg/mL时的抑菌率为94.32％。

采用江苏苏青水处理工程集团有限公司以商品名DA201-C销售的大孔吸附树脂在下述条件下进行动态脱盐：上样300mg，用去离子水，洗至电导率小于15μs/cm；采用的柱尺寸：φ2.6×30cm；上样流速：2mL/min；去离子水洗流速：2mL/min；85％乙醇洗脱流速：1mL/min。洗脱液采用沪西分析仪器厂以商品名RE52-3旋转蒸发器销售的旋转蒸发器进行50℃浓缩，采用TNBS法测定乳铁蛋白抗菌肽浓度，利用上述公式计算得到乳铁蛋白抗菌肽吸附率为92.54％，采用高温灼烧法测定灰分含量，利用上述公式计算得到乳铁蛋白抗菌肽脱盐率为97.40％。

然后，进行Sephadex G-50凝胶过滤色谱分离纯化乳铁蛋白抗菌肽。脱盐后乳铁蛋白抗菌肽浓度50mg/mL，上样5mL；上样流速为2.5mL/min；以去离子水为洗脱液；洗脱流速：15mL/h；自动分部收集器每12min收集一管。所述凝胶过滤色谱结果如图1所示，本实施例制备的乳铁蛋白抗菌肽经Sephadex G-50凝胶过滤色谱分离共得到6个组分，采用上述方法测定各组分在浓度1mg/mL时的抑菌能力。结果表明2号峰表现出最强的抑菌能力，该峰相应组分在浓度1mg/mL时的抑菌率为99.01％。收集2号峰，冷冻干燥。

其次，对2号峰相应组分进行VYDAC^TMC18S/N MT101(φ7.8×250mm)半制备高效液相色谱分离。使用2号峰相应组分制备50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶的去离子水溶液，以流速3mL/min进行所述半制备高效液相色谱分离，其半制备高效液相色谱结果如图2所示，收集主要3个峰，采用上述方法测定各组分在浓度0.1mg/mL时的抑菌能力。结果表明峰a表现出最强的抑菌能力，该峰相应组分在浓度0.1mg/mL时的抑菌率为99.05％。收集峰a，冷冻干燥。

再对峰a相应组分进行VYDAC^TMC18S/N MT101(φ2.6×250mm)分析型高效液相色谱纯化。使用峰a相应组分制备30mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，以流速1.0mL/min进行分析型高效液相色谱分离，其分析型高效液相色谱结果如图3所示，得到纯度很高的抑菌活性强的乳铁蛋白抗菌肽精制品。采用上述方法测定其组分在浓度在0.1mg/mL时的抑菌率为99.82％。相对分子质量主要分布在2500左右。

实施例2

本实施例按照与实施例1同样的方式实施，但称取DMV公司以商品名乳铁传递蛋白(Lactoferrin)销售的纯度大于90％的乳铁蛋白放到酶反应器中，加入去离子水搅拌均匀制备得到浓度10mg/mL乳铁蛋白，在50℃预处理10min，用1.0mol/L NaOH调pH至7.0，以乳铁蛋白重量计加入4％Novozyme公司生产的6.0S胰蛋白酶，反应过程中维持pH恒定，反应结束后，在90℃灭酶8min，调pH至7.0，以7000r/min冷冻离心30min，上清液浓缩，冷冻干燥，得到的冻干粉即为乳铁蛋白抗菌肽酶解物。乳铁蛋白抗菌肽酶解物在1mg/mL时，抑菌率为67.39％。

采用DA201-B大孔树脂静态脱盐，加入乳铁蛋白抗菌肽，在20℃于150r/min转速下，振荡12h后，弃去上清液，加去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，加80％乙醇洗脱，洗脱液浓缩，冷冻干燥得到乳铁蛋白抗菌肽。该静态脱盐，树脂吸附率88.54％，脱盐率为89.04％。

然后，进行Sephadex G-50凝胶过滤色谱分离纯化乳铁蛋白抗菌肽。脱盐后乳铁蛋白抗菌肽浓度30mg/mL，上样7mL；以去离子水为洗脱液；洗脱流速：18mL/h；自动分部收集器每12min收集一管。本实施例制备的乳铁蛋白抗菌肽经Sephadex G-50凝胶过滤色谱分离共得到5个组分，采用上述方法测定各组分在浓度1mg/mL时的抑菌能力。结果表明1号峰表现出最强的抑菌能力，该峰相应组分在浓度1mg/mL时的抑菌率为90.14％。收集1号峰，冷冻干燥。

其次，对1号峰相应组分进行VYDAC^TMC18S/N MT101(φ7.8×250mm)半制备高效液相色谱分离。使用活性峰相应组分制备20mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，以流速2.5mL/min进行所述半制备高效液相色谱分离，收集主要4个峰，采用上述方法测定各组分在浓度0.1mg/mL时的抑菌能力。结果表明峰b表现出最强的抑菌能力，该峰相应组分在浓度0.1mg/mL时的抑菌率为95.05％。收集峰b，冷冻干燥。

再对峰b相应组分进行VYDAC^TMC18S/N MT101(φ2.6×250mm)分析型高效液相色谱纯化。使用峰b相应组分制备25mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，以流速0.5mL/min进行分析型高效液相色谱分离，得到纯度很高的抑菌活性强的乳铁蛋白抗菌肽精制品。采用上述方法测定其组分在浓度在0.1mg/mL时的抑菌率为99.44％。相对分子质量主要分布在2800左右。

实施例3

本实施例按照与实施例1同样的方式实施，但称取DMV公司以商品名乳铁传递蛋白(Lactoferrin)销售的纯度大于90％的乳铁蛋白放到酶反应器中，加入去离子水搅拌均匀制备得到浓度15mg/mL乳铁蛋白，在50℃预处理10min，用1.0mol/L NaOH调pH至7.0，以乳铁蛋白重量计加入1.5％AS1398中性蛋白酶，控制反应体系的pH值，反应结束后，在85℃灭酶10min，调pH至7.0，以9000r/min冷冻离心20min，得到的上清液进行浓缩。采用DA201-D大孔树脂静态脱盐，在160r/min转速下，加入乳铁蛋白抗菌肽，搅拌7h后，弃去上清液，加去离子水，洗至电导率小于15μs/cm，加85％乙醇洗脱，洗脱液浓缩，冷冻干燥得到乳铁蛋白抗菌肽。该静态脱盐，树脂吸附率88.05％，脱盐率为87.31％；在1mg/mL时，抑菌率为89.39％。

然后，进行Sephadex G-50凝胶过滤色谱分离纯化乳铁蛋白抗菌肽。脱盐后乳铁蛋白抗菌肽浓度50mg/mL，上样5mL；以去离子水为洗脱液；洗脱流速：20mL/h；自动分部收集器每12min收集一管。本实施例制备的乳铁蛋白抗菌肽经Sephadex G-50凝胶过滤色谱分离共得到6个组分，采用上述方法测定各组分在浓度1mg/mL时的抑菌能力。结果表明1号峰表现出最强的抑菌能力，该峰相应组分在浓度1mg/mL时的抑菌率为92.94％。收集1号峰，冷冻干燥。

其次，对1号峰相应组分进行VYDAC^TMC18S/N MT101(φ7.8×250mm)半制备高效液相色谱分离。使用2号峰相应组分制备50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶的去离子水溶液，以流速2mL/min进行所述半制备高效液相色谱分离，收集主要四个峰，采用上述方法测定各组分在浓度0.1mg/mL时的抑菌能力。结果表明峰b表现出最强的抑菌能力，该峰相应组分在浓度0.1mg/mL时的抑菌率为99.01％。收集峰b，冷冻干燥。

再对峰b相应组分进行VYDAC^TMC18S/N MT101(φ2.6×250mm)分析型高效液相色谱纯化。使用峰b相应组分制备50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，以流速1.5mL/min进行分析型高效液相色谱分离，得到纯度很高的抑菌活性强的乳铁蛋白抗菌肽精制品。采用上述方法测定其组分在浓度在0.1mg/mL时的抑菌率为99.75％。相对分子质量主要分布在3700左右。

实施例4

本实施例按照与实施例1同样的方式实施，但称取DMV公司以商品名乳铁传递蛋白(Lactoferrin)销售的纯度大于90％的乳铁蛋白放到酶反应器中，加入去离子水搅拌均匀制备得到浓度50mg/mL乳铁蛋白，在50℃预处理10min，用1.0mol/L NaOH调pH至7.5，以乳铁蛋白重量计加入1.5％Novozyme公司生产的Alcalase2.4L，反应过程中维持pH恒定，反应结束后，在85℃灭酶10min，添加1.0mol/L NaOH调pH至7.0，以7000r/min冷冻离心30min，上清液浓缩，冷冻干燥，得到的冻干粉即为乳铁蛋白抗菌肽酶解物。乳铁蛋白抗菌肽酶解物在1mg/mL时，抑菌率为26.09％。

Claims (10)

1.一种乳铁蛋白抗菌肽的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：

(i)酶解步骤：在酶反应器中制备浓度50mg/mL乳铁蛋白去离子水溶液，该溶液在40℃预处理20min，再用1.0mol/L HCl将其溶液的pH调节到2.5，以乳铁蛋白重量计加入0.5％Sigma公司生产的EC3.4.23.1胃蛋白酶，然后控制反应体系的pH值恒定，在这个温度下进行酶解，采用TNBS法测定水解度，直到水解度达到11％，反应结束后，在85-100℃灭酶5-10min，用碱将其反应介质的pH调节到6.8-7.2，再在7000-15000r/min下冷冻离心10-30min，得到含有10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶解物的上清液；

(ii)静态脱盐步骤：往步骤(i)得到的上清液中加入大孔吸附树脂，所述上清液与大孔吸附树脂的体积比是1∶1-2∶1，在温度15-30℃下以150-200r/min振荡6-12h，然后分离上清液，该树脂用去离子水洗涤，至电导率小于15μs/cm，再用70-85％乙醇水溶液洗脱；

(iii)蒸发浓缩步骤：步骤(ii)得到的乙醇洗脱液在50-65℃进行旋转蒸发浓缩到100-300mg/mL，再进行冷冻干燥，得到乳铁蛋白抗菌肽冻干物-1；

(iv)凝胶过滤色谱分离步骤：将步骤(iii)得到的乳铁蛋白抗菌肽冻干物-1制备成10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，上样流速为2-3mL/min，再用去离子水以洗脱流速12-25mL/h洗脱，得到的每个组分然后进行抑菌能力的测定，收集抑菌能力最强的组分进行冷冻干燥，得到乳铁蛋白抗菌肽冻干物-2；

(v)半制备高效液相色谱分离步骤：将步骤(iv)得到的乳铁蛋白抗菌肽冻干物-2制备成10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽的去离子水溶液，使用半制备反相高效液相色谱柱，以流速2-3mL/min进行半制备高效液相色谱分离，得到的每个组分然后进行抑菌能力的测定，收集抑菌能力最强的组分进行冷冻干燥，得到乳铁蛋白抗菌肽冻干物-3；

(vi)分析型高效液相色谱分离步骤：将步骤(v)得到的乳铁蛋白抗菌肽冻干物-3制备成10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶的去离子水溶液，使用分析型高效液相色谱柱，以流速0.7-1.5mL/min进行分析型高效液相色谱分离， 分离得到的每个组分然后进行抑菌能力的测定，收集抑菌能力最强的组分进行冷冻干燥，得到所述的乳铁蛋白抗菌肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于将步骤(i)酶解步骤的条件替换为：在酶反应器中制备浓度10mg/mL乳铁蛋白去离子水溶液，在50℃预处理10min，用1.0mol/L NaOH调pH至7.0，以乳铁蛋白重量计加入4％Novozyme公司生产的6.0S胰蛋白酶，反应过程中维持pH恒定，反应结束后，在85-100℃灭酶5-10min，用碱或酸将其反应介质的pH调节到6.8-7.2，再在7000-15000r/min下冷冻离心10-30min，得到含有10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶解物的上清液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于将步骤(i)酶解步骤的条件替换为：在酶反应器中制备浓度15mg/mL乳铁蛋白去离子水溶液，在50℃预处理10min，用1.0mol/L NaOH调pH至7.0，以乳铁蛋白重量计加入1.5％AS1398中性蛋白酶，控制反应体系的pH值，反应结束后，在85-100℃灭酶5-10min，用碱或酸将其反应介质的pH调节到6.8-7.2，再在7000-15000r/min下冷冻离心10-30min，得到含有10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶解物的上清液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于将步骤(i)酶解步骤的条件替换为：在酶反应器中制备浓度50mg/mL乳铁蛋白去离子水溶液，在50℃预处理10min，用1.0mol/L NaOH调pH至7.5，以乳铁蛋白重量计加入1.5％Novozyme公司生产的Alcalase2.4L，反应过程中维持pH恒定，反应结束后，在85-100℃灭酶5-10min，用碱或酸将其反应介质的pH调节到6.8-7.2，再在7000-15000r/min下冷冻离心10-30min，得到含有10-50mg/mL乳铁蛋白抗菌肽酶解物的上清液。

5.根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于将步骤(ii)静态脱盐步骤替换为：用大孔吸附树脂柱进行动态脱盐，让步骤(i)得到的含有乳铁蛋白抗菌肽酶解物的上清液以流速1-2mL/min通过该大孔吸附树脂柱，然后该树脂用去离子水以流速1-2mL/min洗涤至电导率小于15μs/cm，再用70-85％乙醇水溶液以流速0.5-1mL/min进行洗脱。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂 选自DA201-A、DA201-B、DA201-C或DA201-D。

7.根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于在凝胶过滤色谱步骤中使用的色谱柱是Sephadex G-50。

8.根据权利要求1-4中任一权利要求所述制备方法得到的乳铁蛋白抗菌肽。

9.根据权利要求1-4中任一权利要求所述制备方法得到的乳铁蛋白抗菌肽在作为营养强化剂、婴幼儿食品功能型添加剂、防腐剂中的用途。

10.根据权利要求1-4中任一权利要求所述制备方法得到的乳铁蛋白抗菌肽在奶粉、酸奶、饮料中作为抑菌剂的用途。 

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