CN104031965B - 一种山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法，采用木瓜蛋白酶将山羊乳酪蛋白酶解，酶解物经过大孔非极性树脂分离及脱盐，再经过半制备凝胶色谱仪纯化，冷冻干燥，即加工成山羊乳酪蛋白源抗菌肽粉，经申请人进行的抗菌功能试实验结果表明，制得的该山羊乳酪蛋白源抗菌肽的分子量均在3000以下，易于吸收利用，所得山羊乳酪蛋白源抗菌肽二级结构主要为无规则卷曲，为无毒性的绿色天然抗菌肽，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等具有优良的抗菌性能，在乳与乳制品、化妆品和其他食品保鲜方面具有极其广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽技术领域，涉及一种抗菌肽及其制备，特别涉及一种山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法。
背景技术
生物活性肽是由氨基酸通过肽键相连的、具有调节机体生理功能和为机体提供营养的肽类化合物。活性肽的调节功能涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。全世界的科学工作者已经从不同的动植物个体以及微生物中分离鉴定出了2000多种活性肽。
由于抗生素的大量使用，耐药菌株和多重耐药菌株的不断增加，使抗感染治疗成为一个棘手难题。近三十多年来，新型合成抗生素药物研究进展缓慢，抗菌肽正是在这种形势下出现的一类具有发展潜力的新型抗菌药物。抗菌肽又叫抗微生物肽或天然抗生素，一般是由10～50个氨基酸组成的一类小分子肽类物质。它广泛存在于生物体内，包括细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物等。天然的抗菌肽是一类由基因编码或者经大分子蛋白质水解产生的小分子多肽，具有广谱抗细菌、真菌、病毒等活性。抗菌肽除具有广谱抗微生物活性外，还具有耐高温、热稳定好的特性，并对细菌毒素具有中和作用，其作用机制独特，不易产生耐药性，这将为解决细菌对传统抗菌药物日益增强的耐药性这一棘手难题提供新途径，有望给临床医药学、食品和化妆品加工、动物和植物转基因技术等领域带来广阔的开发应用前景，尤其在食品保鲜方面，可以作为绿色食品保鲜剂使用，对降低合成防腐剂的副作用方面具有重要价值。
乳是新生哺乳动物的主要食物来源，酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，约占牛奶中蛋白质总量的80％，在酶解过程中可以产生促进矿质元素吸收、抗菌和抗氧化等多种活性肽。牛乳的抗菌特性最初由Jones和Simms于1930年发现，他们鉴定了一种能够抑制链球菌生长的物质命名为乳烃素(lactenin)；Hill等(1974)通过凝乳酶水解牛αs1-酪蛋白，得到了第一个从牛αs1-酪蛋白分离出来的抗菌肽Isracidin；国内胡志和等(2003)、翟青新等(2006)均用胰蛋白酶酶解酪蛋白制备抗菌肽，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好抑菌作用；Birkemo等(2009)从牛初乳中分离并鉴定出三种抗菌肽。
山羊奶是北方仅次于牛奶的第二大奶源，山羊乳酪蛋白与牛乳的酪蛋白具有一定的同源性，但在酪蛋白质的构成、同一组分蛋白的氨基酸序列等方面存在很大的差异，以山羊乳酪蛋白为原料同样能获得多种活性肽，如抗氧化肽和抗菌肽。
根据申请人所进行的资料检索，已授权的中国专利申请基本都属于乳铁蛋白抗菌肽，例如，乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途(专利号：ZL200810110996.6)，一种酶法制备乳铁蛋白抗菌肽的方法(专利号：ZL200710190609.X)和一种牛乳铁蛋白工程菌及抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法(ZL200610166536.6)等，因为乳铁蛋白本身就有抗菌作用，经过酶水解后只是提高了乳铁蛋白的抗菌作用和利用稳定性。乳酪蛋白抗菌肽也有报道，中国专利(专利号：ZL201010104660.6)公开一种牛乳源抗菌肽的制备方法，选用胃蛋白酶水解乳酪蛋白，所得抗菌肽的分子量在7000-140000之间。由于分子量为140000的抗菌“肽”就根本不能称为“肽”，而实质上还是蛋白质。
中国专利申请(公开号：CN201210218734.8)公开一种乳酪蛋白抗菌肽的制备方法，该方法选用胰蛋白酶水解酪蛋白，所得抗菌肽的分子量在3000-10000之间，从文献公开的内容，尚不清楚其抗菌肽的一二级结构。
发明内容
针对一般抗菌素的耐药性及合成防腐剂存在的副作用，以及目前乳源抗菌肽存在的缺陷，本发明的目的在于，提供一种来源于山羊乳酪蛋白抗菌肽的制备方法，采用木瓜蛋白酶将山羊乳酪蛋白酶解，酶解物经过大孔非极性树脂分离及脱盐，再经过半制备凝胶色谱仪纯化，冷冻干燥，即加工成山羊乳酪蛋白源抗菌肽粉，其分子量均在3000以下。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
一种山羊乳酪蛋白抗菌肽的制备方法，其特征在于，具体按下列步骤进行：
1)酪蛋白的提取
山羊乳酪蛋白的提取是将鲜山羊乳离心脱脂后，利用等电点沉淀法将酪蛋白提取出来。
2)酪蛋白酶解物的制备
酪蛋白酶解液的制备是用木瓜蛋白酶在规定的底物浓度、pH、温度和加酶量条件下水解规定时间后，灭酶，冷却，离心，上清液真空浓缩后得酶解浓缩液。
3)抗菌肽脱盐及分离纯化
将步骤2)获得的山羊乳酪蛋白酶解浓缩液，先通过大孔吸附树脂层析柱脱盐、再用乙醇梯度洗脱，收集抑菌作用较高的乙醇洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化，冷冻干燥，即得山羊乳酪蛋白源抗菌肽粉。
采用本方法得到的山羊乳酪蛋白源抗菌肽，经申请人进行的抗菌功能试验，结果表明具有如下显著的技术优势：
(1)山羊乳酪蛋白源抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等具有优良的抗菌性能。
(2)山羊乳酪蛋白源抗菌肽分子量均小于3000，易于吸收利用。
(3)山羊乳酪蛋白源抗菌肽的二级结构主要为无规则卷曲，属于无毒天然的抗菌肽。
(4)山羊乳酪蛋白源抗菌肽是兼具营养价值的抗菌肽，在乳与乳制品、化妆品和其他食品保鲜方面具有极其广阔应用前景。
附图说明
图1是山羊乳酪蛋白源粗抗菌肽凝胶色谱图；
图2是山羊乳酪蛋白源精制抗菌肽HPLC分离图；
图3山羊乳酪蛋白源抗菌肽F3-1和F3-2一级结构质谱图，其中，图(a)是F3-1一级结构质谱图，图(b)是F3-2一级结构质谱图；
图4是山羊乳酪蛋白源抗菌肽F3-1和F3-2的二级结构预测框图，其中，图(a)是F3-1二级结构预测框图，图(b)是F3-2二级结构预测框图；
图5是山羊乳酪蛋白源抗菌肽F3-1和F3-2二级结构圆二色谱验证图；
以下结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本实施例给出一种山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法，包括酪蛋白的提取、酪蛋白酶解液的制备和抗菌肽的分离纯化三部分。
1)酪蛋白的提取
取鲜山羊乳过滤除杂，低温离心脱脂，用2mol/L的HCl溶液调节脱脂羊乳的pH值到4.3，水浴40℃静置30min沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用pH值为4.3的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤后4000r/min离心10min，所得沉淀物即为酪蛋白粗品。
2)酪蛋白酶解物的制备
称取适量的山羊乳酪蛋白粗品置于酶解罐中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液助溶，用去离子水定容至规定体积，得到30g/kg～120g/kg(优化为60g/kg～100g/kg)的山羊乳酪蛋白溶液，调节pH值至5.0～7.0(优化5.5～6.5)，95℃加热5min，冷却到50℃～70℃，准确加入3000U/g～7000U/g(优化4000U/g～6000U/g)的木瓜蛋白酶，水解过程中流加2mol/L的NaOH溶液，使pH值保持恒定，酶解0.5h～4.0h后(优化1.0h～2.0h)，95℃灭酶10min，冷却到室温，10000×g离心15min，取上清液在45～50℃，0.09MPa下浓缩，得山羊乳酪蛋白酶解浓缩物(即粗抗菌肽)。
3)抗菌肽脱盐及分离纯化
对大孔吸附树脂LS-106等进行预处理后，将一定量的树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇将树脂洗至220nm处无吸收峰，再用去离子水洗去乙醇并湿法装层析柱。
将步骤2)获得的山羊乳酪蛋白酶解浓缩物(粗抗菌肽)，先后通过大孔吸附树脂层析柱、凝胶色谱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化。
所述大孔吸附树脂可以是LS-106等比表面积较大的极性大孔吸附树脂。将粗抗菌肽以0.5～1BV/h的流速，通过LS-106大孔吸附树脂层析柱，再用一定量的去离子水洗脱层析柱，当水洗脱液的电导率和纯水基本一致时，脱盐结束，然后用乙醇进行梯度洗脱。
所述乙醇浓度的体积分数为40％、60％和80％(以下百分数均为体积分数)，流速为1.5～2BV/h，收集60％的乙醇洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱。
所述凝胶色谱的色谱柱为SephadexG-75等，流动相为50mmol/L(pH6.0)醋酸-醋酸铵溶液，流速0.8mL/min，进样量500μL，收集左数第3个峰即峰3(图1)，浓缩后即为精制抗菌肽。
精制抗菌肽可以用半制备型高效液相色谱仪进一步纯化。
所述半制备型高效液相色谱仪，采用C18柱，流动相A相为含0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯水，B相为含0.1％TFA的乙腈，流速0.8mL/min，柱温30℃，洗脱程序：
0～2min：A相100％～90％，B相0～10％；
2～50min：A相90％～0，B相10％～100％；
50～65min：A相0，B相浓度为100％；
65～70min：A相0～100％，B相100％～0。
总洗脱时间为70min，收集其中的两个主峰，分别称为F3-1和F3-2(图2)，经过检测F3-1和F3-2为单一峰，冷冻干燥即得纯山羊乳酪蛋白抗菌肽粉。
F3-1峰和F3-2峰经过纳升电喷雾串联气质联用仪鉴定，所获得的山羊乳酪蛋白源抗菌肽的一级结构分别为：
Arg-Val-Asp-Thr-Asn-Pro-Asp-Pro-Glu-Gln-Val-Gly-Gly-Leu(1497.76)和Pro-Asn-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Leu(1101.62)，分子量均在3000以下。
采用Netsurfp1.1软件预测并经圆二色谱鉴定，所得山羊乳酪蛋白源抗菌肽二级结构主要为无规则卷曲，为无毒性的绿色天然抗菌肽。
以下是发明人给出的具体实施例，但本发明并不限于这些实施例，在实施例中，以下参考文献被引用。
【1】Jones F S，Simms H S.The bacterial growth inhibitor(lactenin)ofmilk【J】.The Jounal of Experimental Medicine，1930，51(2)：327–339.
【2】Hill R D,Lahov E,Givol D.A rennin-sensitive bond in alpha and betacasein[J].Journal of Dairy Research，1974，41(2)：147-153.
【3】胡志和，庞广昌，陈庆森，等.不同条件下水解酪蛋白所得到的抗菌肽抑菌效果比较[J].食品科学，2003，24(2)：130-133.
【4】翟青新,张源淑,哈惠馨.乳源抗菌肽的分离纯化及部分性质的研究[J].药物生物技术.2006，13(06)，422-425.
实施例1：
(1)取鲜山羊乳过滤除杂，4℃，5000r/min离心20min脱去乳脂肪，用2mol/L HCl溶液调节脱脂山羊乳的pH值到4.3，水浴40℃静置30min沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用pH4.3的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤后4000r/min离心10min，所得沉淀物即为粗酪蛋白，凯氏定氮法测定粗酪蛋白的蛋白质含量。
(2)称取一定量的山羊乳粗酪蛋白置于酶解罐中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液助溶，用去离子水定容至规定体积，得到80g/kg的山羊乳酪蛋白溶液，调节pH值至6.0，95℃加热5min，冷却到60℃，准确加入5000U/g的木瓜蛋白酶，水解过程中流加2mol/L的NaOH溶液，使pH值保持在6.0±0.1，60℃酶解1.5h后，95℃灭酶10min，冷却到室温，10000×g离心15min，取上清液在45～50℃，0.09MPa下浓缩到原来体积的1/3。
(3)将(2)获得的山羊乳酪蛋白酶解浓缩物，通过LS-106大孔吸附树脂层析柱，再用一定量的去离子水洗脱层析柱，当水洗脱液的电导率和纯水基本一致时，脱盐结束，然后用40％、60％和80％的乙醇进行梯度洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱纯化。
凝胶色谱柱选SephadexG-75，流动相为50mmol/L(pH6.0)醋酸-醋酸铵溶液，流速0.8mL/min，进样量500μL，收集左数第3个峰即峰3(图2)，真空浓缩后冷冻干燥即为精制抗菌肽。
精制抗菌肽可以通过制备型高效液相色谱再纯化得到纯抗菌肽。
实施例2：
1)取鲜山羊乳过滤除杂，低温离心脱脂，用2mol/L HCl溶液调节脱脂山羊乳的pH值到4.3，水浴40℃静置30min沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用pH4.3的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤后4000r/min离心10min，所得沉淀物即为山羊乳粗酪蛋白。
(2)称取取一定量的山羊乳粗酪蛋白置于酶解罐中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液助溶，用去离子水定容至规定体积，得到70g/kg的山羊乳酪蛋白溶液，调节pH值至6.0，95℃加热5min，冷却到60℃，准确加入6000U/g的木瓜蛋白酶，水解过程中流加2mol/L的NaOH溶液，使pH值保持在6.0±0.1，60℃酶解80min后，95℃灭酶10min，冷却到室温，10000×g离心15min，取上清液真空浓缩即得粗抗菌肽。
(3)脱盐及分离纯化同实施例1得到精制抗菌肽和纯抗菌肽粉。
上述实施例中所用的木瓜蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白是根据发明人多次科学试验为依据而制定的，只要在本申请的技术方案给出的范围内，均可以达到本发明的目的。
酶解山羊乳酪蛋白制备抗菌肽，制备工艺比较简单，粗抗菌肽和精制抗菌肽易于规模化生产，在乳与乳制品、化妆品、其他食品贮藏保鲜、医药领域都有极大的发展前景。
以下是发明人所做的羊乳酪蛋白抗菌肽分离纯化试验及抗菌功能试验。
试验1：大孔吸附树脂分离山羊乳酪蛋白酶解物
山羊乳酪蛋白酶解物，通过LS-106大孔吸附树脂，各乙醇洗脱组分的抑菌效果见表1。表1表明60％乙醇洗脱液对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果远强于其他组分，收集60％乙醇洗脱液真空浓缩(得粗抗菌肽)做凝胶色谱分离。
表1：山羊乳酪蛋白酶解物乙醇洗脱组分抑菌效果(n＝3)
注：青霉素钠的浓度是1280μg/mL；琼脂孔直径为8.0mm；“－”表示没有抑菌圈。
试验2：凝胶色谱分离纯化山羊乳酪蛋白源粗抗菌肽
粗抗菌肽经过凝胶色谱分离，基本得到三个色谱峰(图1)，其中峰1、峰2和峰3所占的比例分别为49.9％、18.24％和19.22％。分别收集这三个色谱峰，真空浓缩后做抑菌试验，结果见表2。
表2：山羊乳酪蛋白源粗抗菌肽凝胶色谱各洗脱峰的抑菌效果(n＝3)
注：青霉素钠的浓度是1280μg/mL；琼脂孔直径为8.0mm；“－”表示没有抑菌圈。
由表2可知，粗抗菌肽经过凝胶色谱分离后的3个组分中，峰1和峰3的抑菌作用较强，测定可知，峰1和峰3的多肽含量分别为5.662mg/mL和1.993mg/mL，说明峰3抑菌作用远强于峰1，因此将峰3真空浓缩后(精制抗菌肽)用高效液相色谱实施进一步分离，主要得到峰F3-1和F3-2两个峰(图2)，收集峰F3-1和F3-2。峰F3-1和F3-2再经过一次分离后检测为单一峰，其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)见表4。
经纳升电喷雾串联气质联用仪鉴定，峰F3-1和F3-2的一级结构分别为Arg-Val-Asp-Thr-Asn-Pro-Asp-Pro-Glu-Gln-Val-Gly-Gly-Leu(1497.76)和Pro-Asn-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Leu(1101.62)，分子量均在3000以下(图3)。
表4：山羊乳酪蛋白源抗菌肽F3-1和F3-2的MIC和MBC(n＝3)
注：青霉素钠对三种菌的MIC均为10μg/mL，MBC均为160μg/mL。
采用Netsurfp1.1软件预测并经圆二色谱鉴定，所得抗菌肽F3-1和F3-2二级结构的主要元件为无规则卷曲(图4和图5)。以α-螺旋为主要二级结构的抗菌肽的抗菌活性较高，但其导致溶血的副作用也较高。二级结构主要由无规则卷曲的抗菌肽虽然抗菌作用稍弱，但却没有溶血副作用，因此，本试验获得的山羊乳酪蛋白源抗菌肽是绿色天然的抗菌肽，在食品、药品和化妆品等方面前景广阔。
Claims (1)
1.一种山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法，其特征在于，具体按下列步骤进行：
1)酪蛋白的提取
山羊乳酪蛋白的提取是将鲜山羊乳离心脱脂后，利用等电点沉淀法将山羊乳酪蛋白提取出来；
2)酪蛋白酶解物的制备
酪蛋白酶解液的制备是用木瓜蛋白酶在规定的底物浓度、pH、温度和加酶量条件下水解规定时间后，灭酶，冷却，离心，上清液真空浓缩后得酶解浓缩物；
3)抗菌肽脱盐及分离纯化
将步骤2)获得的山羊乳酪蛋白酶解浓缩液，先通过大孔吸附树脂层析柱脱盐、再用乙醇梯度洗脱，收集抑菌作用较高的乙醇洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化，冷冻干燥，即得山羊乳酪蛋白源抗菌肽粉；
所述的山羊乳酪蛋白的提取的方法是，取鲜山羊乳过滤除杂，低温离心脱脂，用2mol/L的HCl溶液调节脱脂羊乳的pH值到4.3，水浴40℃静置30min沉淀山羊乳酪蛋白，4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用pH值为4.3的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤后4000r/min离心10min，所得沉淀物即为山羊乳酪蛋白粗品；
所述的山羊乳酪蛋白酶解物的制备方法是，称取适量的山羊乳酪蛋白粗品置于酶解罐中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液助溶，用去离子水定容至规定体积，得到30g/kg～120g/kg的羊乳酪蛋白溶液，调节pH值至5.0～7.0，95℃加热5min，冷却到50℃～70℃，准确加入3000U/g～7000U/g的木瓜蛋白酶，水解过程中流加2mol/L的NaOH溶液，使pH值保持恒定，酶解0.5h～4.0h后，95℃灭酶10min，冷却到室温，10000×g离心15min，取上清液在45～50℃，0.09MPa下浓缩，得山羊乳酪蛋白酶解浓缩物；
所述的抗菌肽脱盐及分离纯化方法是，对大孔吸附树脂进行预处理后，用无水乙醇将树脂洗至220nm处无吸收峰，再用去离子水洗去乙醇并湿法装层析柱；将获得的山羊乳酪蛋白酶解浓缩物，先后通过大孔吸附树脂层析柱、凝胶色谱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化；
所述大孔吸附树脂采用LS-106极性大孔吸附树脂，获得的山羊乳酪蛋白酶解浓缩液，以0.5～1BV/h的流速，通过LS-106大孔吸附树脂层析柱，再用去离子水洗脱层析柱，当水洗脱液的电导率和纯水基本一致时，脱盐结束，然后用乙醇进行梯度洗脱；
所述乙醇浓度为40％、60％和80％，流速为1.5～2BV/h，收集浓度为60％的乙醇洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱纯化；
所述凝胶色谱的色谱柱为SephadexG-75，流动相为pH6.0的50mmol/L醋酸-醋酸铵溶液，流速0.8mL/min，进样量500μL，收集左数第3个峰，浓缩后即为精制山羊乳酪蛋白源抗菌肽；精制山羊乳酪蛋白源抗菌肽用半制备型高效液相色谱仪进一步纯化2次，收集其中的两个主峰，分别称为F3-1和F3-2，分别冷冻干燥即得纯山羊乳酪蛋白抗菌肽粉；
所述的山羊乳酪蛋白源抗菌肽的一级结构为：Arg-Val-Asp-Thr-Asn-Pro-Asp-Pro-Glu-Gln-Val-Gly-Gly-Leu；和Pro-Asn-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Leu；分子量均在3000以下，二级结构的主要元件为无规则卷曲；
所述的山羊乳酪蛋白源抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有抗菌性能。
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2014
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