CN114621336A - 一种酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽的制备方法，采用胰蛋白酶将牛乳酪蛋白酶解，酶解物经过大孔非极性树脂分离及脱盐，再经过半制备凝胶色谱仪纯化，冷冻干燥，即加工成酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽粉，经申请人进行的胰脂肪酶抑制功能试实验结果表明，制得的该酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽对胰脂肪酶活性具有较高的抑制率，酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽一级结构明确，分子量均小于3000，易于吸收利用。酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽对于促进人类健康以及其在减肥功能食品方面的应用将具有重要且长远的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽技术领域，涉及一种胰脂肪酶抑制肽及其制备，特别涉及一种酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽的制备方法。
背景技术
生物活性肽是由氨基酸通过肽键相连的、具有调节机体生理功能和为机体提供营养的肽类化合物。活性肽的调节功能涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。全世界的科学工作者已经从不同的动植物个体以及微生物中分离鉴定出了2000多种活性肽。
近年来，肥胖在我国已呈流行趋势，由肥胖带来的疾病造成的经济负担正在成为严重的社会问题。胰脂肪酶抑制剂能抑制胰脂肪酶的活性，减少食物中脂类物质的消化和吸收，达到控制和治疗肥胖的目的。奥利司他是最常见的胰脂肪酶抑制剂药物，该药物可以帮助人体减少30％摄入脂肪的吸收，同时增加粪便的排泄，从而达到减重的目的。已作为减肥药物奥利司他曾被广泛使用，但长期服用可能出现胀气、腹泻、脂肪性大便、等不良症状。酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽来源于牛奶，无任何毒副作用，为减肥功能产品的研发和应用提供理论依据，这对预防和控制体重，促进人类健康及乳品工业持续健康发展均具有重要而长远的意义。
乳是新生哺乳动物的主要食物来源，酪蛋白和乳酪蛋白是牛乳中的两种主要蛋白质，分别约占牛奶中蛋白质总量的80％和20％，在酶解过程中可以产生促进矿质元素吸收和抑制胰脂肪酶活性等多种活性肽。目前，关于胰脂肪酶抑制肽的研究较少，刘丽媛等以鲫鱼蛋白为原料，酶解制备具有胰脂肪酶抑制活性的短肽，研究不同条件对该肽稳定性的影响。而其他蛋白源脂肪酶抑制肽的研究还未见报道。
根据申请人所进行的资料检索，目前还没有已授权的胰脂肪酶抑制肽的中国专利申请。相关专利，中国专利申请(申请号：201210303834.0)公开一种减肥肽的制备方法，该方法是提取鲫鱼肉中的水溶性蛋白，选用碱性蛋白酶水解鲫鱼蛋白，制备胰脂肪酶抑制肽，摘要说进行了动物试验具有减肥功能，实际并没有进行动物实验，也没有明确其一级结构，该专利申请已被驳回。
发明内容
针对一般胰脂肪酶抑制剂存在的副作用，本发明的目的在于，提供一种来源于牛乳酪蛋白来源的胰脂肪酶抑制肽的制备方法，采用胰蛋白酶将牛乳酪蛋白酶解，酶解物经过大孔非极性树脂分离及脱盐，再经过半制备凝胶色谱仪纯化，冷冻干燥，即加工成酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽粉，其分子量在3000以下。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
一种酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽的制备方法，其特征在于，具体按下列步骤进行：
1)牛乳酪蛋白的提取
牛乳酪蛋白的提取是将鲜牛乳离心脱脂后，利用等电点沉淀法将酪蛋白提取出来。
2)酪蛋白酶解物的制备
牛乳酪蛋白酶解物的制备是用胰蛋白酶在规定的底物浓度、pH、温度和加酶量条件下水解规定时间后，灭酶，冷却，离心，上清液真空浓缩后得酶解浓缩液。
3)胰脂肪酶抑制肽脱盐及分离纯化
将步骤2)获得的牛乳酪蛋白酶解浓缩液，先通过大孔吸附树脂层析柱脱盐、再用乙醇梯度洗脱，收集胰脂肪酶抑制肽活性较高的乙醇洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化，冷冻干燥，即得牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽粉。
采用本方法得到的牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽粉，经申请人进行的胰脂肪酶抑制功能试验，具有如下显著的技术优势：
(1)酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽对胰脂肪酶活性具有较高的抑制率。
(2)酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽一级结构明确，分子量均小于3000，易于吸收利用。
(3)酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽对于促进人类健康以及其在减肥功能食品方面的应用将具有重要且长远的意义。
附图说明
图1是牛乳酪蛋白粗胰脂肪酶抑制肽凝胶色谱图；
图2是牛乳酪蛋白粗胰脂肪酶抑制肽HPLC分离图；
以下结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本发明给出一种牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽的制备方法，包括酪蛋白的提取、酪蛋白酶解液的制备和酪蛋白胰脂肪酶抑制肽的分离纯化三部分。
1)酪蛋白的提取
取鲜牛乳过滤除杂，低温离心脱脂，用2mol/L的HCl溶液调节脱脂牛乳的pH值到4.5，水浴40℃静置30min沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤后4000r/min离心10min，所得沉淀物为酪蛋白粗品。
2)牛乳酪蛋白酶解物制备
称取适量的牛乳酪蛋白粗品置于酶解罐中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液助溶，用去离子水定容至规定体积，得到30g/kg～60g/kg的牛乳酪蛋白溶液，调节pH值至7.5，95℃加热5min，冷却到30℃～40℃，准确加入300U/g～500U/g的胰蛋白酶，水解过程中流加2mol/L的NaOH溶液，使pH值保持恒定，酶解3.0～4.0h后，95℃灭酶10min，冷却到室温，10000g离心15min，取上清液在45～50℃，0.09MPa下浓缩，得牛乳酪蛋白酶解浓缩物(即粗牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽)。
3)牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽脱盐及分离纯化
对大孔吸附树脂LS-106等进行预处理后，将一定量的树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇将树脂洗至220nm处无吸收峰，再用去离子水洗去乙醇并湿法装层析柱。
将步骤2)获得的牛乳酪蛋白酶解浓缩物(粗胰脂肪酶抑制肽)，先后通过大孔吸附树脂层析柱、凝胶色谱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化。
所述大孔吸附树脂可以是LS-106等比表面积较大的极性大孔吸附树脂。将粗酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽以0.5～1BV/h的流速，通过LS-106大孔吸附树脂层析柱，再用一定量的去离子水洗脱层析柱，当水洗脱液的电导率和纯水基本一致时，脱盐结束，然后用超纯水进行洗脱。流速为1.5～2BV/h，收集超纯水的洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱。
所述凝胶色谱的色谱柱为Peptide 10/300GL柱，流动相为超纯水，流速0.8mL/min，进样量500μL，收集左数第2个峰即峰2(图1)，浓缩后即为精制胰脂肪酶抑制肽。
精制酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽可以用半制备型高效液相色谱仪进一步纯化。
所述半制备型高效液相色谱仪，采用C18柱，流动相A相为含0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯水，B相为含0.1％TFA的乙腈，流速1mL/min，柱温30℃，洗脱程序：
0～10min：A相95％～80％，B相5～20％；
10～25min：A相80％～50％，B相75～85％；
25～40min：A相50％～25％，B相50～75％；
40～50min：A相25％～15％，B相75～85％；
50～55min：A相15％～95％，B相85～5％。
总洗脱时间为55min，收集其中的三个主峰，分别称为F2-1、F2-2和F2-3(图2)，经过检测F2-1、F2-2和F2-3为单一峰，冷冻干燥即得纯胰脂肪酶抑制肽粉。
F2-1、F2-2和F2-3峰经过纳升电喷雾串联气质联用仪鉴定，所获得的胰脂肪酶抑制肽的一级结构分别为：SLKALEVPLAARLGVPFPKALVL，LLLAKVSLMLVTVLFPKALVL和TKVVLVQAPLKGFLLAKLVML。其分子量分别为2401.49、2280.49和2280.49，均小于3000。
以下是发明人给出的具体实施例，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
(1)取鲜牛乳过滤除杂，低温离心脱脂，用2mol/L的HCl溶液调节脱脂牛乳的pH值到4.5，水浴40℃静置30min沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤后4000r/min离心10min，所得沉淀物为酪蛋白粗品，凯氏定氮法测定粗酪蛋白的蛋白质含量。
(2)称取适量的牛乳酪蛋白粗品置于酶解罐中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液助溶，用去离子水定容至规定体积，得到30g/kg的牛乳酪蛋白溶液，调节pH值至7.5，95℃加热5min，冷却到40℃，准确加入400U/g的胰蛋白酶，水解过程中流加2mol/L的NaOH溶液，使pH值保持恒定，酶解4.0h后，95℃灭酶10min，冷却到室温，10000×g离心15min，取上清液在48℃，0.09MPa浓缩，得牛乳酪蛋白酶解浓缩物(即粗牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽)。
(3)将(2)获得的酪蛋白源蛋白酶解浓缩物，通过LS-106大孔吸附树脂层析柱，再用一定量的去离子水洗脱层析柱，当水洗脱液的电导率和纯水基本一致时，脱盐结束，然后用超纯水洗脱，收集洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱纯化。
所述凝胶色谱的色谱柱为Peptide 10/300GL柱，流动相为超纯水，流速0.8mL/min，进样量500μL，收集左数第2个峰即峰2(图1)，浓缩后即为精制牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽。
精制牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽可以通过制备型高效液相色谱再纯化得到纯牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽。
实施例2：
1)取鲜牛乳过滤除杂，低温离心脱脂，用2mol/L的HCl溶液调节脱脂牛乳的pH值到4.5，水浴40℃静置30min沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤后4000r/min离心10min，所得沉淀物为酪蛋白粗品。
(2)称取适量的牛乳酪蛋白置于酶解罐中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液助溶，用去离子水定容至规定体积，得到40g/kg的牛乳酪蛋白溶液，调节pH值至7.5，95℃加热5min，冷却到50℃～70℃，准确加入500U/g的胰蛋白酶，水解过程中流加2mol/L的NaOH溶液，使pH值保持恒定，酶解4.0h后，95℃灭酶10min，冷却到室温，10000×g离心15min，取上清液在50℃，0.09MPa下浓缩，得牛乳酪蛋白酶解浓缩物(即粗牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽)。
(3)脱盐及分离纯化同实施例1得到精制牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽，冷冻干燥即得到牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽粉。
上述实施例中所用的胰蛋白酶酶解牛乳酪蛋白是根据发明人多次科学试验为依据而制定的，只要在本申请的技术方案给出的范围内，均可以达到本发明的目的。
酶解牛乳酪蛋白制备胰脂肪酶抑制肽，制备工艺比较简单，胰脂肪酶抑制肽易于规模化生产，在功能性食品和医药领域都有极大的发展前景。
以下是发明人所做的酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽分离纯化试验及体外功能试验。
试验1：大孔吸附树脂分离牛乳酪蛋白酶解物
牛乳酪蛋白酶解物，通过LS-106大孔吸附树脂，各洗脱组分对胰脂肪酶活性的抑制率见表1。表1表明不同浓度的乙醇洗脱组分的每毫克肽胰脂肪酶抑制率均低于未洗脱组分，收集超纯水洗脱液真空浓缩，得粗胰脂肪酶抑制肽，用做凝胶色谱分离。
试验2：凝胶色谱分离纯化牛乳酪蛋白粗胰脂肪酶抑制肽
粗胰脂肪酶抑制肽经过凝胶色谱分离，基本得到六个色谱峰(图1)，对凝胶色谱试验收集的6个峰组分进行胰脂肪酶抑制率和多肽含量的测定，试验结果如表2所示。
由表2可知，粗胰脂肪酶抑制肽经过凝胶色谱分离后的6个组分中，F2的每毫克胰脂肪酶抑制率为1.15±0.29％，显著高于凝胶色谱分离前样品的抑制率0.81±0.07％
表1牛乳酪蛋白经大孔树脂分离纯化结果
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05
表2凝胶色谱分离组分抑制率测定结果
注：P＜0.05
(P＜0.05)，说明F2峰中具有较多对胰脂肪酶抑制活性高的多肽，因此将F2峰真空浓缩后(精制胰脂肪酶抑制肽)用高效液相色谱进一步分离，主要得到峰F2-1、F2-2和F2-3三个峰(图2)，收集峰F2-1、F2-2和F2-3，对收集的3个组分进行浓缩，测定各组分的胰脂肪酶抑制率和多肽含量，结果如表3所示。
表3高效液相色谱分离组分抑制率
注：P＜0.05
F2-1、F2-2和F2-3峰经过纳升电喷雾串联气质联用仪鉴定，所获得的胰脂肪酶抑制肽的一级结构分别为：
SLKALEVPLAARLGVPFPKALVL，LLLAKVSLMLVTVLFPKALVL和TKVVLVQAPLKGFLLAKLVML。其分子量分别为：2401.49、2280.49和2280.49，均小于3000。
Claims (5)
1.一种酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽的制备方法，其特征在于，具体按下列步骤进行：
1)牛乳酪蛋白的提取
牛乳酪蛋白的提取是将鲜牛乳离心脱脂后，利用等电点沉淀法将牛乳沉淀后弃去上清液，所得沉淀洗涤后，即为粗酪蛋白。
2)酪蛋白酶解物的制备
牛乳酪蛋白酶解液的制备是将粗酪蛋白用胰蛋白酶在规定的底物浓度、pH、温度和加酶量条件下水解规定时间后，灭酶，冷却，离心，上清液真空浓缩后得酶解浓缩物；
3)酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽脱盐及分离纯化
将步骤2)获得的乳酪蛋白酶解浓缩液，先通过大孔吸附树脂层析柱脱盐、再用超纯水洗脱，收集超纯水洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化，冷冻干燥，即得酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽粉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的牛乳酪蛋白的提取的方法是，取鲜牛乳过滤除杂，低温离心脱脂，调节脱脂牛乳的pH值到4.5，沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用50mM的pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤后4000r/min离心10min，所得沉淀物为酪蛋白粗品。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的牛乳酪蛋白酶解物的制备方法是，称取适量的牛乳酪蛋白粗品，配置30g/kg～60g/kg的牛乳酪蛋白溶液，调节pH至7.5，95℃加热5min，冷却到50℃～70℃，加入300-500U/g的胰蛋白酶，用2mol/L的NaOH溶液使pH值保持恒定，酶解4.0h后，95℃灭酶10min，冷却到室温，10000g离心15min，取上清液在45～50℃，0.09MPa下浓缩，得牛乳酪蛋白酶解浓缩物(即粗牛乳酪蛋白胰脂肪酶抑制肽)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽脱盐及分离纯化方法是，对大孔吸附树脂LS-106等进行预处理后，将获得的牛乳酪蛋白酶解浓缩物，先后通过大孔吸附树脂层析柱、凝胶色谱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化。
所述大孔吸附树脂用超纯水洗脱，流速为1.5～2BV/h，收集超纯水的洗脱液，真空浓缩，再过凝胶色谱柱纯化。所述凝胶色谱的色谱柱为Peptide 10/300GL柱，流动相为超纯水，流速0.8mL/min，进样量500μL，收集左数第2个峰即峰2(图1)，浓缩后即为精制胰脂肪酶抑制肽，再用半制备型高效液相色谱仪进一步纯化，收集其中的三个主峰，分别称为F2-1、F2-2和F2-3(图2)，分别冷冻干燥即得纯胰脂肪酶抑制肽粉。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胰脂肪酶抑制肽的一级结构为：
SLKALEVPLAARLGVPFPKALVL，LLLAKVSLMLVTVLFPKALVL和TKVVLVQAPLKGFLLAKLVML，其分子量均在3000以下。
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