CN105601706A - 一种抗菌带鱼四肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗菌带鱼四肽，氨基酸序列为Gln-Ala-Glu-Gly。本发明提供了一种新的抗氧化肽--带鱼四肽，通过碱性蛋白酶水解而成，水解度为69.52％，羟自由基清除率为76.74％。本发明提供了一种新的抗菌肽--带鱼四肽，具有很强的抗菌活性，本发明所得带鱼四肽滤过液的抗菌活性达85.2％，抗氧化活性达77.8％。对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.20mg/ml，对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)为0.26mg/ml。本发明带鱼四肽制备方法简单，只需一步水解即可，水解条件温和，纯化过程简单，适何扩大化的工业化生产。其中，水解过程是采用碱性蛋白酶水解，水解度为69.52％。

Description

一种抗菌带鱼四肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种从带鱼蛋白中分离出的抗菌肽，属于氨基酸提取工艺领域。

背景技术

抗菌肽是生物体内的小分子多肽，是构成生物体先天免疫系统的重要成分。抗菌肽具有广谱抗菌及抗病毒等特性，细菌对抗菌肽比传统抗生素更难产生抗性，是传统抗生素的理想替代品。目前已从各种生物中分离出了逾2000种抗菌肽。鱼类种类繁多，生境复杂，是抗菌肽的重要来源，目前已报道了150余种鱼源抗菌肽。刘超(基于酶法制备鲶鱼抗菌肽纯化试验,食品工业,2014)利用酶法水解鲶鱼体表黏液蛋白制备抗菌肽,对大肠杆菌的抑菌效果较好。他采用20％～60％饱和度的硫酸铵沉淀,SupherdexG-25凝胶过滤层析对抗菌肽进行分离提纯。并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电(SDSPAGE)对分离纯化的效果进行了检验。检测出该抗菌肽分子量为27.7ku,抑菌率达到2.9％。然而，上述工艺比较复杂，制备研究还只能停留在实验室阶段，很难产业化实施。

鱼类是抗菌肽分离制备的重要来源。鱼我国是水产大国，带鱼产量高，然而，目前为止，还仍未对水产酶解制抗菌肽展开广扩的研究，对于优质蛋白含量高的带鱼的蛋白的分离和提取，未曾有相关文献记载。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种新的抗菌肽--带鱼四肽；

本发明的另一目的是提供上述带鱼四肽的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：

一种抗菌带鱼四肽，氨基酸序列为Gln-Ala-Glu-Gly。抗菌带鱼四肽的编码基因如序列表中序列1所示，抗菌带鱼四肽如序列表中序列2所示。

优选的，上述抗菌带鱼四肽的制备方法，包括如下步骤：

1)带鱼预处理

带鱼去头，去内脏，清洗后用匀浆制成肉浆，用水漂洗、离心脱脂，沉淀物冷冻干燥，得到脱脂带鱼蛋白，-20℃保存备用；

2)酶法水解带鱼蛋白制得带鱼四肽

将步骤1)得到的脱脂带鱼蛋白溶于水中，形成质量分数3％的带鱼蛋白溶液，再调pH值7.0，水浴振荡30min后加入碱性蛋白酶开始水解，水解过程中控制溶液pH值维持8.5；水解4h，灭活后冷冻离心，去除上清中微量油脂及沉淀，将中间部分清液真空浓缩；

3)超滤分离

在0.25MPa压力下超滤，依次透过分子质量为10KD,5KD,3KD的超滤膜；得到>10KD,10KD～5KD,5KD～3KD,<3KD四个不同分子量段组分，将<3KD的组分真空浓缩，冷冻干燥；

4)凝胶过滤层析

用SephalexG25色谱柱，加步骤3)中分离的溶液2mL，以pH7.5，0.15mol/L的磷酸缓冲液作为洗脱液，以流动相溶液为10mL/h的流速进行洗脱，洗脱后有4个组分，经抗菌实验检测后得到第一个组分的抗菌活性最强，收集第一个组分的流出相真空浓缩，冷冻干燥；

5)RP-HPLC分离提纯

利用XBrigeTMPrep-C18柱将步骤4)的组分进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：

色谱柱为XBrigeTMPrep-C18、250mm×4.6mm、5μm色谱柱。流动相A：甲醇溶液，流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；洗脱方式：梯度洗脱，A:B＝5:95；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10ul；运行时间：15min；紫外检测波长：254nm；

所述流动相中的磷酸二氢钠的PH为7.25，所述梯度洗脱的程序为0min→5min→15min→95min，甲醇10％→30％→65％→95％。

优选的，所述步骤1)中，所述肉浆：水的体积比为1：4；进一步优选的，所述水为蒸馏水；

优选的，所述步骤1)中，所述匀浆于高速分散均质机中进行。

优选的，所述步骤1)中，用水漂洗30min后4000r/min下离心脱脂15min。

优选的，所述步骤2)中，用5mol/LHCl溶液调pH值7.0；用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl溶液调节溶液pH值维持8.5。

优选的，所述步骤2)中，碱性蛋白酶的加入量为2000U/g，酶解温度为45℃，水解完成后，90℃灭活10min。

优选的，所述步骤2)中，所述冷冻离心过程具体为于4℃下12000r/min冷冻离心30min；

优选的，所述步骤2)中，所述真浓缩过程具体条件为于旋转蒸发器40℃下真空浓缩。

优选的，所述步骤3)中，膜分离条件是:带鱼肽水溶液质量分数30％,pH7.5,温度35℃。

优选的，所述步骤4)和步骤5)中，真空浓缩的条件均为40℃下浓缩60min，冷冻干燥的条件均为-50℃下冷冻24h。

本发明提供了一种新的抗氧化肽--带鱼四肽，具有很强的抗菌活性，本发明所得带鱼四肽滤过液的抗菌活性达85.2％，抗氧化活性达77.8％。对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.20mg/ml，对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)为0.26mg/ml。本发明带鱼四肽制备方法简单，只需一步水解即可，水解条件温和，纯化过程简单，适何扩大化的工业化生产。其中，水解过程是采用碱性蛋白酶水解，水解度为69.52％，羟自由基清除率为76.74％。

附图说明

图1是凝胶过滤层析分离四个组分；

图2是半制备RP-HPLC分离提纯F1组分的色谱图；

图3是半制备RP-HPLC分离提纯F1组分4个部分的抑菌圈照片(浓度0.5mg/ml)；

图4是组分F1-1的分子量报告图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

为了说明本发明的实质，申请人进行了如下实验。

仪器与设备

U-2800紫外分光光度计，日本日立有限公司；PHS-3CpH计，上海兰科仪器公司；FJ300SH数显高速分散均质机,上海隆拓仪器设备有限公司；UPT-11-60L优普超纯水机，杭州雷琪实验器材有限公司。

试验方法

1、带鱼预处理

带鱼去头，去内脏，清洗后立即用高速分散均质机匀浆，用蒸馏水(体积比1:4)漂洗30min后4000g离心脱脂15min，沉淀物冷冻干燥，得到脱脂带鱼蛋白，-20℃保存备用。

2、酶法水解脱脂带鱼蛋白

用碱性蛋白酶水解脱脂带鱼蛋白。

具体方法如下：

将脱脂带鱼蛋白用水溶解，得质量分数3％的蛋白溶液，用5mol/LHCl溶液或5mol/LNaOH溶液调pH值7.0，水浴振荡30min后加入碱性蛋白酶(加酶量为2000U/g)开始水解。反应过程中用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl溶液调节溶液pH值维持8.5。酶解温度45℃，水解4h，90℃灭活10min后于4℃12000g冷冻离心30min，去除上清中微量油脂及沉淀，将中间部分清液于旋转蒸发器40℃真空浓缩。

带鱼碱性蛋白酶水解产物的水解度为69.52％，羟自由基清除率为76.74％。

3、超滤分离

在0.25MPa压力下超滤，透过分子质量为3ku超滤膜。最佳膜分离条件是:带鱼肽质量分数30％,pH7.5,温度35℃,此时带鱼肽滤过液的抗菌活性达85.2％，抗氧化活性达77.8％。

4、凝胶过滤层析

用SephalexG25色谱柱，加待分离样品溶液2mL，以pH7.5，0.15mol/L的磷酸缓冲液作为洗脱液，以流动相溶液为10mL/h的流速进行洗脱。图1为凝胶过滤层析色谱图，出现4个洗脱峰，只有F1有抑菌活性(F1组分冷冻干燥后为淡黄色粉末状固体)。

5、半制备RP-HPLC分离提纯

利用XBrigeTMPrep-C18柱将F1进一步进行梯度洗脱，洗脱条件如下。最终分成了4个主要组分，如图2所示：F1-1、F1-2、F1-3、F1-4。通过测定各组分的金黄色葡萄球菌抑菌能力，发现3个部分都没有抑菌能力，如图3抑菌圈照片可以看出，只有组分F1-2有抑菌能力。采用LichrospherC18反相柱对组分F1-2进行了分子量测定，结果如图4所示，其分子量为666D。

RP-HPLC的梯度洗脱程序：

色谱柱为XBrigeTMPrep-C18、250mm×4.6mm、5μm色谱柱。流动相A：甲醇溶液，流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；洗脱方式：梯度洗脱，A:B＝5:95；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10ul；运行时间：15min；紫外检测波长：254nm。

所述流动相中的磷酸二氢钠的PH为7.25，所述梯度洗脱的程序为0min→5min→15min→95min，甲醇10％→30％→65％→95％。

6、带鱼肽序列分析

根据质谱、红外光谱、核磁共振等检测，推测该带鱼肽段为Gln-Ala-Glu-Gly。

7、带鱼四肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度

由表2﹣表3可确定，带鱼四肽对金黄色葡萄球菌的MIC为0.25mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MBC为0.2mg/mL。

表2带鱼四肽的MIC测定(抑菌率％)

注：“+”表示有菌落生长，“﹣”表示无菌落生长；

表3带鱼四肽的MBC测定(抑菌率％)

注：“+”表示有菌落生长，“﹣”表示无菌落生长。

由表2、3可确定：带鱼四肽金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.20mg/ml，带鱼四肽对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)为0.26mg/ml。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗菌带鱼四肽，其特征在于：氨基酸序列为Gln-Ala-Glu-Gly。

2.根据权利要求1所述的抗菌带鱼四肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)带鱼预处理

带鱼去头，去内脏，清洗后用匀浆制成肉浆，用水漂洗、离心脱脂，沉淀物冷冻干燥，得到脱脂带鱼蛋白，-20℃保存备用；

2)酶法水解带鱼蛋白制得带鱼四肽

将步骤1)得到的脱脂带鱼蛋白溶于水中，形成质量分数3％的带鱼蛋白溶液，再调pH值7.0，水浴振荡30min后加入碱性蛋白酶开始水解，水解过程中控制溶液pH值维持8.5；水解4h，灭活后冷冻离心，去除上清中微量油脂及沉淀，将中间部分清液真空浓缩；

3)超滤分离

在0.25MPa压力下超滤，依次透过分子质量为10KD,5KD,3KD的超滤膜；得到>10KD,10KD～5KD,5KD～3KD,<3KD四个不同分子量段组分，将<3KD的组分真空浓缩，冷冻干燥；

4)凝胶过滤层析

用SephalexG25色谱柱，加步骤3)中分离的溶液2mL，以pH7.5，0.15mol/L的磷酸缓冲液作为洗脱液，以流动相溶液为10mL/h的流速进行洗脱，洗脱后有4个组分，经抗菌实验检测后得到第一个组分的抗菌活性最强，收集第一个组分的流出相真空浓缩，冷冻干燥；

5)RP-HPLC分离提纯

利用XBrigeTMPrep-C18柱将步骤4)的组分进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：

色谱柱为XBrigeTMPrep-C18、250mm×4.6mm、5μm色谱柱。流动相A：甲醇溶液，流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；洗脱方式：梯度洗脱，A:B＝5:95；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10ul；运行时间：15min；紫外检测波长：254nm。

所述流动相中的磷酸二氢钠的PH为7.25，所述梯度洗脱的程序为0min→5min→15min→95min，甲醇10％→30％→65％→95％。

3.根据权利要求2所述的抗菌带鱼四肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述肉浆：水的体积比为1：4；优选的，所述水为蒸馏水；

和/或，所述步骤1)中，所述匀浆于高速分散均质机中进行。

4.根据权利要求2所述的抗菌带鱼四肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，用水漂洗30min后4000r/min下离心脱脂15min。

5.根据权利要求2所述方法制备的抗菌带鱼四肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，用5mol/LHCl溶液调pH值7.0；用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl溶液调节溶液pH值维持8.5。

6.根据权利要求2所述的抗菌带鱼四肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，碱性蛋白酶的加入量为2000U/g，酶解温度为45℃，水解完成后，90℃灭活10min。

7.根据权利要求2所述的抗菌带鱼四肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述冷冻离心过程具体为于4℃下12000r/min冷冻离心30min；

和/或，所述真浓缩过程具体条件为于旋转蒸发器40℃下真空浓缩。

8.根据权利要求2所述的抗菌带鱼四肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，膜分离条件是:带鱼肽水溶液质量分数30％,pH7.5,温度35℃。

9.根据权利要求2所述的抗菌带鱼四肽的制备方法，其特征在于：所述步骤4)和步骤5)中，真空浓缩的条件均为40℃下浓缩60min，冷冻干燥的条件均为-50℃下冷冻24h。