CN102504019B - 一种分离天蚕素抗菌肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离天蚕素抗菌肽的方法。本发明提供了分离天蚕素抗菌肽的方法，包括如下步骤：1)将含有天蚕素抗菌肽的发酵液经微滤膜过滤，收集微滤透过物；2)将步骤1)得到的微滤透过物经超滤膜过滤，收集超滤透过物；3)将步骤2)得到的超滤透过物经纳滤膜过滤，收集纳滤截留物，得到天蚕素抗菌肽。本发明的实验证明，本发明的目的在于针对现有的天蚕素抗菌肽生产过程中能耗大，成本高等问题，提供一种能耗低，收率高，产品质量高，且适合于工业化大规模生产的一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取天蚕素抗菌肽的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分离天蚕素抗菌肽的方法。
背景技术
抗菌肽是一类不易导致微生物耐药性的新型抗感染多肽。世界上发现的第一种抗菌肽是天蚕素，1980年由瑞典科学家Boman等用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生出有抗菌活性的多肽物质，定名为天蚕素(cecropins)。随后又在其他生物体内陆续发现了多种抗菌肽，如蛙皮素(magainins)、蜂毒素(melittins)、防御素(defensins)等。目前世界上已知的抗菌肽共有1200多种。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为抗菌肽。随着研究工作的深入开展，发现某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有很强的杀伤作用。
天蚕素抗菌肽是由Cecropin A和Cecropin D设计合成的37个氨基酸的杂合肽，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌肽活性具有重要作用，该抗菌肽分子具有独特的广谱抗菌活性，体外试验已经证明它能够有效的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄杆菌、沙门氏菌等有害菌，因此，它成为抗生素替代物的绝佳选择之一，随着研究工作的进一步深入开展，发现某些抗菌肽会对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有很强杀伤作用，并在其它领域也具有很好的应用前景，天蚕素抗菌肽是生物体自身合成的一种具有生物抗菌活性的小分子蛋白质是生物体内经诱导产生的一种重要免疫因子，多数具有强碱性，热稳定性以及杀菌、抗菌等特点，对生物的天然免疫起关键作用，其作用于细菌细胞壁，导致膜通透性增大，以此穿透，杀灭细菌，细菌必须改变膜的结构，即改变相当部分的基因才能防御天蚕素抗菌肽的进攻，而这几乎是不可能的，因此，天蚕素抗菌肽极大的减少了产生耐药性的可能。
但是，目前对于天蚕素抗菌肽的分离存在生产过程中能耗大，成本高等问题，尤其是对发酵产生的天蚕素抗菌肽的分离更是不太理想，因此，寻求新的分离天蚕素抗菌肽的方法称为研究的一个热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离天蚕素抗菌肽的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将含有天蚕素抗菌肽的发酵液经微滤膜过滤，收集微滤透过物；
2)将步骤1)得到的微滤透过物经超滤膜过滤，收集超滤透过物；
3)将步骤2)得到的超滤透过物经纳滤膜过滤，收集纳滤截留物，得到天蚕素抗菌肽。
在上述方法中，步骤1)中，所述微滤膜的孔径为0.05um-0.10um；
步骤2)中，所述超滤膜的截流分子量为6KD-10KD；
步骤3)中，所述纳滤膜的截流分子量为1KD-4KD。
在上述方法中，步骤1)中，所述微滤膜过滤的压力为4bar-5bar，所述微滤膜过滤的温度为20℃-40℃；
步骤2)中，所述超滤膜过滤的压力为4bar-10bar，所述超滤膜过滤的温度为20℃-40℃；
步骤3)中，所述纳滤膜过滤的压力为10bar-25bar，所述纳滤膜过滤的温度为20℃-35℃。
在上述方法中的各参数在本发明的实施例中具体如下：
步骤1)中，所述微滤膜过滤的压力为4bar或5bar，所述微滤膜过滤的温度为20℃、35℃或40℃；
步骤2)中，所述超滤膜过滤的压力为4bar、8bar或10bar，所述超滤膜过滤的温度为20℃、35℃或40℃；
步骤3)中，所述纳滤膜过滤的压力为10bar、15bar或25bar，所述纳滤膜过滤的温度为20℃、25℃或35℃。
在上述方法中的步骤1)前，还包括将所述含有天蚕素抗菌肽的发酵液进行如下A或B处理的步骤：
A、将所述含有天蚕素抗菌肽的发酵液经筛网过滤，收集透过物；
B、将所述含有天蚕素抗菌肽的发酵液离心，收集上清液。
在上述方法中的A所示的处理中，所述筛网的孔径大小为0.20mm-0.30mm；
在上述方法中的B所示的处理中，所述离心力为1000g-2000g，所述离心的时间为10min-20min。
在上述方法中，所述含有天蚕素抗菌肽的发酵液按照如下方法制备：发酵如下重组菌得到发酵液：将序列表序列1所示编码基因导入枯草杆菌1A747得到的重组菌。
上述发酵为将所述含有天蚕素抗菌肽编码基因的重组菌pNF11-CAD1接种到25ml的LB培养基中，于32℃、200rpm的条件下振荡培养12小时至600nm波长处的吸光值(0D600)达到2～4，加质量百分比浓度为30％麦芽糖5ml，进行诱导表达；于32℃、250rpm的条件下振荡培养36小时后，调整pH至8.5、温度25℃培养12小时，收集发酵液。
本发明的实验证明，本发明提供了一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取天蚕素抗菌肽的方法，其能耗低，收率高，产品质量高，适合于工业化大规模生产。
本发明的方法具体有如下优点：
1)可以有效地将含有天蚕素抗菌肽的发酵液浓缩至原体积的10-15％，从而降低能耗，节约成本；
2)在浓缩中可以脱除多余的杂质，提高天蚕素抗菌肽的纯度；
3)本发明的方法使生产天蚕素抗菌肽的工艺流程缩短，简便，节约耗料量40％以上，大大降低了原材料的消耗，节约了成本。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、天蚕素抗菌肽的膜分离
重组菌pNF11-CAD1是将序列表序列1所示编码基因导入枯草杆菌1A747得到的重组菌，具体构建方法与专利ZL200810132258.1中的重组菌pNF11-CAD1构建方法一致。
将重组菌pNF11-CAD1接种到25ml的LB培养基中，于32℃、200rpm的条件下振荡培养12小时至600nm波长处的吸光值(0D600)达到4，加质量百分比浓度为30％麦芽糖5ml，进行诱导表达；于32℃、250rpm的条件下振荡培养36小时后，用氢氧化钠调整pH至8.5、温度25℃培养12小时，收集发酵液，即为含有天蚕素抗菌肽的发酵液(具体方法见专利ZL200810132258.1)。
2、天蚕素抗菌肽的膜分离
方法一：
1)筛网脱除大颗粒培养基
将上述步骤1得到的含有天蚕素抗菌肽的发酵液25.0L通过0.25mm筛网(南京大华仪器仪表厂，Ф200)脱除大颗粒培养基，收集透过物；
2)微滤膜
将步骤1)得到的透过物通过孔径为0.05μm的微滤膜(上海朗极膜分离设备工程有限公司，MCM14)脱除菌体，操作压力4bar温度35℃，得到微滤透过物；
3)超滤膜
将步骤2)得到的微滤透过物通过截流分子量为10KD的超滤膜(上海朗极膜分离设备工程有限公司，US100/1812)脱除胶体和超过截流分子量的大分子，操作压力8bar，温度35℃，得到超滤透过物；
4)纳滤膜
将步骤3)得到的超滤透过物通过截流分子量为1KD的纳滤膜(上海朗极膜分离设备工程有限公司，NS10)脱除盐、色素、核苷酸、氨基酸、短肽以及低聚糖等小分子杂质，操作压力15bar，温度35℃，浓缩倍数8-9倍，收集纳滤截留物，即得到纯化的天蚕素抗菌肽。
方法二：
1)筛网脱除大颗粒培养基：与方法一基本相同，不同的是筛网的孔径大小为0.20mm；
2)微滤膜：与方法一相同；
3)超滤膜：与方法一相同；
4)纳滤膜：与方法一相同。
方法二：
1)筛网脱除大颗粒培养基：与方法一基本相同，不同的是筛网的孔径大小为0.30mm；
2)微滤膜：与方法一相同；
3)超滤膜：与方法一相同；
4)纳滤膜：与方法一相同。
3、检测
将发酵液、步骤2中的方法一得到的0.25mm透过物、0.05μm透过物、超滤透过物、纳滤截留物利用高效液相色谱法检测，其中高效液相色谱仪(Agilent1260)，色谱柱：ZORBAX 300SB-C8，4.6×150mm，5μm，流速：1ml/min，TFA∶乙腈的体积比为0.1％∶80％，均收集12.5min-14min的处理物即为天蚕素抗菌肽(以人工合成的天蚕素抗菌肽作为标准品)，结果见下表1。
表1为膜分离中各处理物的含量
| 体积(L) | 天蚕素抗菌肽(g/L) | 收率(％) | |
| 发酵液 | 25.0 | 78.5 | |
| 透过物 | 26.5 | 72.6 | 98.1 |
| 微滤透过物 | 32.2 | 58.8 | 98.5 |
| 超滤透过物 | 38.5 | 48.4 | 98.3 |
| 纳滤截留物 | 46.0 | 39.6 | 97.8 |
| 总收率 | 92.8 |
采用同样的方法检测方法二、三中的处理物，结果与方法一无显著差异。
实施例2、天蚕素抗菌肽的膜分离
1、天蚕素抗菌肽的制备
与实施例1相同。
2、天蚕素抗菌肽的膜分离
方法一：
1)离心分离
将上述步骤1得到的含有天蚕素抗菌肽的发酵液25.0L离心分离脱除菌体，1500g，15分钟，少量水洗涤菌体，合并离心上清液；
2)微滤膜
将步骤1)得到的上清液通过孔径为0.08μm的微滤膜脱除残余的菌体及颗粒性杂质，操作压力5bar，温度20℃，得到微滤透过物；
3)超滤膜
将步骤2)得到的微滤透过物通过截流分子量8KD的超滤膜过滤，操作压力4bar，温度20℃，得到超滤透过物；
4)纳滤膜
将步骤3)得到的超滤透过物通过截流分子量为3KD的纳滤膜，操作压力10bar，温度20℃，浓缩倍数20倍，收集纳滤截留物，即得到纯化的天蚕素抗菌肽。
方法二：
1)离心分离：与方法一基本相同，不同的是离心力为1000g，10分钟；
2)微滤膜：与方法一相同；
3)超滤膜：与方法一相同；
4)纳滤膜：与方法一相同；
方法三：
1)离心分离：与方法一基本相同，不同的是离心力为2000g，20分钟；
2)微滤膜：与方法一相同；
3)超滤膜：与方法一相同；
4)纳滤膜：与方法一相同；
3、检测
将发酵液、步骤2中的方法一得到的离心清液、0.05μm透过物、超滤透过物、纳滤截留物利用高效液相色谱法检测，其中高效液相色谱仪(Agilent1260)，色谱柱：ZORBAX 300SB-C8，4.6×150mm，5μm，流速：1ml/min，TFA∶乙腈的体积比为0.1％∶80％，均收集12.5min-14min的处理物即为天蚕素抗菌肽(以人工合成的天蚕素抗菌肽作为标准品)，结果见下表2。
表2为膜分离中各处理物的含量
| 体积(L) | 天蚕素抗菌肽 | 收率(％) |
| (g/L) | |||
| 发酵液 | 25.0 | 76.8 | |
| 离心清液 | 27.0 | 69.0 | 97.1 |
| 微滤透过物 | 27.0 | 69.0 | 97.1 |
| 超滤透过物 | 40.8 | 43.6 | 97.3 |
| 纳滤截留物 | 48.5 | 35.9 | 97.8 |
| 总收率 | 90.6 |
采用同样的方法检测方法二、三得到的处理物，结果与方法一无显著差异。
实施例3、天蚕素抗菌肽的膜分离
1、天蚕素抗菌肽的制备
与实施例1相同。
2、天蚕素抗菌肽的膜分离
1)微滤膜过滤
将上述步骤1得到的含有天蚕素抗菌肽的发酵液25.0L通过孔径为0.10μm的微滤膜脱除残余的菌体及颗粒性杂质，操作压力5bar，温度40℃，得到微滤透过物；
2)超滤膜
将步骤1)得到的微滤透过物通过截流分子量为6KD的超滤膜过滤，操作压力10bar，温度40℃，得到超滤透过物；
3)纳滤膜
将步骤2)得到的超滤透过物通过截流分子量为4KD的纳滤膜，操作压力25bar，温度25℃，浓缩倍数10倍，收集纳滤截留物，即得到纯化的天蚕素抗菌肽。
3、检测
将发酵液、步骤2中的方法一得到的0.05μm透过物、超滤透过物、纳滤截留物利用高效液相色谱法检测，其中高效液相色谱仪(Agilent1260)，色谱柱：ZORBAX300SB-C8，4.6×150mm，5μm，流速：1ml/min，TFA∶乙腈的体积比为0.1％∶80％，均收集12.5min-14min的处理物即为天蚕素抗菌肽(以人工合成的天蚕素抗菌肽作为标准品)，结果见下表3。
表3为膜分离中各处理物的含量
| 体积(L) | 天蚕素抗菌肽(g/L) | 收率(％) | |
| 发酵液 | 25.0 | 76.5 | |
| 微滤透过物 | 38.0 | 49.0 | 97.5 |
| 超滤透过物 | 46.6 | 39.4 | 98.3 |
| 纳滤截留物 | 55.3 | 32.3 | 97.5 |
| 总收率 | 93.4 |
Claims (4)
1.一种分离天蚕素抗菌肽的方法，包括如下步骤：
1）将含有天蚕素抗菌肽的发酵液经微滤膜过滤，收集微滤透过物；
2）将步骤1）得到的微滤透过物经超滤膜过滤，收集超滤透过物；
3）将步骤2）得到的超滤透过物经纳滤膜过滤，收集纳滤截留物，得到天蚕素抗菌肽；
步骤1）中，所述微滤膜的孔径为0.05um-0.10um；
步骤2）中，所述超滤膜的截流分子量为6KD-10KD；
步骤3）中，所述纳滤膜的截流分子量为1KD-4KD；
步骤1）中，所述微滤膜过滤的压力为4bar-5bar，所述微滤膜过滤的温度为20℃-40℃；
步骤2）中，所述超滤膜过滤的压力为4bar-10bar，所述超滤膜过滤的温度为20℃-40℃；
步骤3）中，所述纳滤膜过滤的压力为10bar-25bar，所述纳滤膜过滤的温度为20℃-35℃；
所述含有天蚕素抗菌肽的发酵液按照如下方法制备：发酵如下重组菌得到发酵液：将序列表序列1所示编码基因导入枯草杆菌1A747得到的重组菌；
所述发酵为将所述重组菌接种到25ml的LB培养基中，于32℃、200rpm的条件下振荡培养12小时至600nm波长处的吸光值达到2～4，加质量百分比浓度为30％麦芽糖5ml，进行诱导表达；于32℃、250rpm的条件下振荡培养36小时后，调整pH至8.5、温度25℃培养12小时，收集发酵液，即为含有天蚕素抗菌肽的发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述微滤膜过滤的压力为4bar或5bar，所述微滤膜过滤的温度为20℃、35℃或40℃；
步骤2）中，所述超滤膜过滤的压力为4bar、8bar或10bar，所述超滤膜过滤的温度为20℃、35℃或40℃；
步骤3）中，所述纳滤膜过滤的压力为10bar、15bar或25bar，所述纳滤膜过滤的温度为20℃、25℃或35℃。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
在步骤1）前，还包括将所述含有天蚕素抗菌肽的发酵液进行如下A或B处理的步骤：
A、将所述含有天蚕素抗菌肽的发酵液经筛网过滤，收集透过物；
B、将所述含有天蚕素抗菌肽的发酵液离心，收集上清液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
A所示的处理中，所述筛网的孔径大小为0.20mm-0.30mm；
B所示的处理中，所述离心力为1000g-2000g，所述离心的时间为10min-20min。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999046283A1 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Zealand Pharmaceuticals A/S | Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis |
| CN101191129A (zh) * | 2006-11-28 | 2008-06-04 | 武汉大学 | 基因工程家蚕抗菌肽及制备方法和应用 |
| CN101323644A (zh) * | 2008-03-21 | 2008-12-17 | 瑞普（保定）生物药业有限公司 | 重组cecA-mil杂合基因抗菌肽 |
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| CN101191129A (zh) * | 2006-11-28 | 2008-06-04 | 武汉大学 | 基因工程家蚕抗菌肽及制备方法和应用 |
| CN101323644A (zh) * | 2008-03-21 | 2008-12-17 | 瑞普（保定）生物药业有限公司 | 重组cecA-mil杂合基因抗菌肽 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20140423 Termination date: 20211201 |