CN105085610A

CN105085610A - 抗菌肽的分级二次超滤纯化方法

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Publication number: CN105085610A
Application number: CN201510505667.1A
Authority: CN
Inventors: 张卫民
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2015-08-17
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明公开了抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，该方法包括预处理、微滤、二次超滤和纳滤等步骤；所述的预处理是诱导抗菌肽的产生、收集含抗菌肽的液体、去除杂质及大分子物质、低温抑制蛋白酶；所述的二次超滤是分别采用高于和低于目标抗菌肽分子量的2种不同截留分子量超滤膜，截取目标抗菌肽。本发明的方法流程简单，耗时缩短，费用降低，可用于抗菌肽的工业化制备，本发明的抗菌肽纯化方法可最大限度保持抗菌肽的活性和纯度。

Description

抗菌肽的分级二次超滤纯化方法

技术领域

本发明涉及抗菌肽的纯化方法，具体涉及抗菌肽的分级二次超滤纯化方法。

背景技术

无论宿主是低等动物还是高等动物，微生物都必须克服宿主的天然免疫或获得性免疫防御机制才能生存。在宿主天然免疫防御机制中，多种细胞产生的抗菌因子发挥重要作用。天然免疫的所有效应因子均为多肽或小分子量蛋白，其中抗菌肽(antibacterialpeptides，ABP)是天然免疫的主要效应分子，是动物机体具有天然免疫力的重要原因。

1972年，Boman等发现果蝇(Drosophila)经诱导可产生有抗菌作用的蛋白。1981年，Steiner、Boman等在惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)中分离并命名了第一个昆虫抗菌肽—cecropins(杀菌肽)。同年，Patterson-Delafield、Lehrer等从兔肺泡巨噬细胞中分离出另一种抗菌肽—defensins(防御素)。此后，在哺乳动物猪的小肠(1989)及无脊椎动物(1997)等生物中相继发现抗菌肽。目前在从细菌到高等动物(比如人)的所有生物中均发现了不同结构不同分子量的天然抗菌肽。

最初，人们将这类具有抗菌活性的多肽统称为“antibacterialpeptides”，即“抗菌肽”，本意为抗细菌多肽。随后人们发现这类多肽具有抗细菌、病毒、真菌等几乎所有种类微生物的作用，便称之为“antimicrobialpeptides”。随着研究工作的深入，发现这类多肽还具有抗寄生虫、杀伤肿瘤细胞等功能，又将其称为“peptideantibiotics”—“多肽抗生素”。但“抗菌肽”一词已在国内被广泛采用，并且习惯上不包括那些在代谢过程中通过酶促反应合成的多肽性质抗生素，如杆菌肽、多粘菌素E、短杆菌肽S等，而特指由基因编码在核糖体上合成的具有生物活性的多肽，故仍沿用。

抗菌肽系阳离子多肽(cationicpeptides)，其本身具有以下二个特点：①抗菌肽分子表面带净正电荷，抗菌肽一级结构中有精氨酸和赖氨酸残基并且最多只有一个带负电荷的氨基酸残基；②抗菌肽系两亲分子(具有疏水性和亲水性)。抗菌肽在多肽链长度、氨基酸构成及二级结构等方面差异极大。抗菌肽长度约11～50个氨基酸残基；分子量2000～8000Dal；由十余种氨基酸组成；PI较高；对热稳定，100℃持续30min仍保持杀菌活性；对蛋白酶及酸性环境具有较强的耐受性。二级结构为α螺旋、β折叠等多种结构。

抗菌肽的应用受制于其来源较少而显得困难。天然抗菌肽的纯化费用高、产量少，而且除少数天然抗菌肽如nisin外，多数抗菌活性低于合成的新型抗菌肽。因此，开发新的生产方法对抗菌肽的应用非常重要。

目前有两种方法被认为有应用前景：多肽自动液相化学合成法(solution-phasechemistrysynthesismethod，与传统的固相合成法不同)和基因工程法(recombinantsynthesis)，其中采用基因工程法在大肠杆菌中表达抗菌肽融合蛋白，抗菌肽的回收率达总蛋白的2％。此外，抗菌肽在酵母中分泌表达量也较高，且后处理简单。

化学合成法：为了研究抗菌肽的作用机制及临床应用，许多天然抗菌肽及其类似物已通过化学合成的方法得到。其中研究最多的是具有双亲α螺旋结构的带正电荷的多肽。通过改变或增删某些位置的氨基酸，杂合两种抗菌肽等方法，可以研究多肽结构与功能的关系，寻找具有更高抗菌活性或更广抗菌谱的多肽抗生素。例如，由cecropin和melititn的前13个氨基酸组成的杂合肽具有很强的抗菌活性而无溶血活性。化学合成法可以方便地在合成过程中改变多肽的一级结构，加入特殊氨基酸，对多肽末端进行修饰，但成本较高仍是限制该方法广泛应用的最大障碍。

基因工程法：利用基因工程的方法生产抗菌肽是降低成本的一条有效途径。但是抗菌肽对原核细胞的毒性限制了原核表达系统的应用。为了克服抗菌肽对原核表达系统中细菌细胞的毒性，人们采用融合表达或选择对抗菌肽具有抗性的细菌株系进行原核表达。例如，1993年，Piers等将defensin，HNp-1，cecropin/melittin杂合肽基因分别与不同的载体蛋白相融合，并在大肠杆菌中进行表达。对表达产物的产量、细胞定位、蛋白降解情况进行了较为系统的研究。对其中的一些融合蛋白进行化学裂解或酶解后，得到了具有抗菌活性的小肽。Maeno等利用链霉菌表达系统分泌表达了apidaecin的融合蛋白，裂解后得到了有活性的产物。国内已在酵母中成功表达抗菌肽AD，并得到活性较高的重组多肽。

过去的50余年是“抗生素时代”，天然的、合成和半合成的抗生素成功治愈了许多威胁人类生命的感染性疾病。但致病菌对常规抗生素的抗药性日益严重。寻找新型抗生素是解决抗药性的一条有效途径。抗菌肽因抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，被认为有广阔应用前景。

目前，已有多种多肽抗生素进入临床试验阶段。给药途径包括局部、口服和全身用药(静脉给药)，治疗范围包括局部和全身的细菌和真菌感染。由于抗菌肽的产生是感染局部最重要的防御反应，因此很自然第一个进入临床试验的项目便是用于局部感染。这种给药方法安全有效，因为一些毒性更强的多肽和脂多肽，如短杆菌肽S，多粘菌素B已被用于制造皮肤软膏。此外，有学者将抗菌肽作为探针用于诊断细菌性及真菌性疾病，为避免常规肿瘤化疗对正常细胞的非特异性毒性，利用抗菌肽对肿瘤细胞的靶向特异性，将抗菌肽作为载体进行选择性化疗(peptide-mediatedselectivechemotherapy)。

抗菌肽的活性检测目前仍采用Hultmark建立的琼脂扩散法，这种方法最经典、应用最广、引用最多。由于抗菌肽种类多，分子量低，制备提纯流程复杂且费用高、提取量少，因此目前尚无诸如应用单克隆抗体的免疫学方法或其它快速简便检测抗菌肽活性方法的报道。

蛋白质及多肽的分离纯化的方法很多，如盐析法、透析法、超滤法、离心法、层析法(凝胶过滤法、高效液相色谱法等)、电泳法、等电点沉淀和pH值调节法等，以及多种分离纯化方法的联合应用。对于不同的目标产物，根据蛋白质分子大小及溶解度不同可采取多种分离纯化方法。通常，盐析、离心、沉淀、萃取技术只能获得粗品，而凝胶层析技术,可获得纯度较高的生物产品。蛋白质分离纯化的方法虽然很多，但尚无一种简便、高效、适应范围广的方法能够将蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但根据目标产物的理化和生物特性，选择合适的分离纯化工艺路线，可以获得符合要求的目标产物得率和纯度。

根据目前的文献检索，抗菌肽的分离纯化多采用层析法。如采用离子交换从牛血液及黄鳝中分离纯化抗菌肽，利用高效液相色谱法对免疫小皱蝽产生的抗菌肽进行了分离纯化，并获得了抗菌肽的纯品。但这种方法流程复杂、费用高、费时长并且提取量少。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，该方法快速、简便、低成本，且纯化效果好。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，包括以下步骤：

(1)预处理

不同来源抗菌肽的预处理方法不相同。目的是收集含抗菌肽的液体然后采用分级二次超滤纯化。预处理的步骤一般包括：诱导抗菌肽的产生、收集含抗菌肽的液体、去除杂质及大分子物质、低温抑制蛋白酶(避免抗菌肽被降解)。

对于天然昆虫抗菌肽，预处理的步骤是：诱导昆虫产生抗菌肽，接着收集昆虫的血淋巴，沸水浴10-30min，然后离心取上清，得到粗提抗菌肽。

对于采用基因工程方法获得的各类抗菌肽，预处理的步骤是：①分泌表达的基因工程抗菌肽：取发酵液，离心取上清，得到粗提抗菌肽。②细胞内表达的基因工程抗菌肽(包括细胞内不溶性表达(包涵体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等)：先裂解细胞，然后离心取上清，得到粗提抗菌肽。

对于细菌类抗菌肽(如幽门螺杆菌抗菌肽)的预处理步骤为：从液体或固体培养基中大量收集活菌；裂解细胞，然后离心取上清，得到粗提抗菌肽。

步骤(1)所述的昆虫是柞蚕或家蚕；

步骤(1)所述的诱导昆虫产生抗菌肽，可以采用温水浸泡法、超声波刺激法或注射活菌法；

所述的温水浸泡法是将昆虫在40-60℃中水浴20-30min；

所述的注射活菌法是往昆虫的滞育蛹中注射活菌，然后25℃温育7天；优选注射E.coliK₁₂D₃₁活菌，优选往每只昆虫滞育蛹注射1×10⁷个E.coliK₁₂D₃₁活菌；

步骤(1)所述的所述的离心是在4℃下10000rpm离心10-20min；

步骤(1)所述的裂解细胞是采用反复冻融裂解或超声波裂解；

所述的反复冻融是将细胞从-20℃取出，待其溶解后再放回，反复多次；

所述的超声裂解是在冰浴下超声裂解；

步骤(1)中，为提高产量，可在离心取上清之后，往沉淀中加入2-3倍于沉淀体积的灭菌蒸馏水，混匀后离心取上清；重复上述操作2-3次，合并所有上清液，得到粗提抗菌肽；

(2)微滤

将步骤(1)得到的粗提抗菌肽用孔径为0.1-1μm的微孔滤膜过滤，滤过压力0.7-7MPa，取过滤液。

(3)超滤

采用二次超滤：先采用孔径大于目标抗菌肽分子量的超滤膜对步骤(2)得到的过滤液进行超滤，取滤过液，然后再采用孔径小于目标抗菌肽分子量的超滤膜对滤过液进行超滤，取截留液，即为目标产物；或者是，先采用孔径小于目标抗菌肽分子量的超滤膜对步骤(2)得到的过滤液进行超滤，取截留液，然后再采用孔径大于目标抗菌肽分子量的超滤膜对截留液进行超滤，取滤过液，即为目标产物；超滤操作时压差为0.1-0.5Mpa。

可根据粗提抗菌肽中抗菌肽含量的高低、超滤膜的种类、生产规模的大小等选择以上超滤操作中的一种。

步骤(3)中，取滤过液的超滤，超滤膜截留分子量可以为目标抗菌肽分子量的2-5倍以上，10倍以内；取截留液的超滤，超滤膜截留分子量可以为目标抗菌肽分子量的一半以下；

步骤(3)中，取滤过液的超滤，超滤膜优选三醋酸纤维超滤膜或聚砜膜；取截留液的超滤，超滤膜优选聚砜膜。

(4)纳滤

将步骤(3)得到的目标产物过纳滤膜浓缩，得到纯化后的抗菌肽；浓缩时的滤过液回收用于超滤，以提高纯化效率及节约水资源。

步骤(4)所述的过纳滤膜浓缩，体积浓缩倍数(volumetricconcentrationfactor，VCF)为3-5倍。

抗菌肽是生物活性蛋白，为提高纯化效率，整个纯化过程最好在4-8℃的环境下进行；纯化开始前，须清除各类蛋白酶，避免抗菌肽被蛋白酶降解，提高产量，可使用苯甲基磺酰氟(PMSF)等蛋白酶抑制剂处理用于抗菌肽纯化的各个设备和器具，特别是各类直接接触粗提抗菌肽的超滤膜、各类管道等。

“微滤”又称微孔过滤，原料液在静压差作用下，透过孔径范围为0.1-100μm的微滤膜，截留原料液中的颗粒物和一些细菌及寄生虫等，而溶剂及大分子溶质可透过微滤膜。微滤膜的种类有：混合纤维酯微孔滤膜；硝酸纤维素滤膜；聚偏氟乙烯滤膜；醋酸纤维素滤膜；再生纤维素滤膜；聚酰胺滤膜；聚四氟乙烯滤膜以及聚氯乙烯滤膜等。

“超滤”是以压差为驱动力的膜分离技术。选用不同孔径的不对称性微孔膜，按照截留分子量的大小，可分离的大分子物质。溶质或悬浮物料按大小不同而分离，比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较大的物质则被截留。这是一个简单的过程，在操作过程中无“相变化”，不会改变产品的性能和活性；超滤过程不用添加任何化学药剂，无需热处理，特别适用于热敏性物质，对不稳定产品也安全；超滤设备和工艺较其它分离方法简单，耗能低，滤膜可以反复多次使用；超滤处理量大，处理时间短，样品残留小，产品收率高。正是由于超滤技术具有如此多的优越性，所以广泛应用于基因工程下游蛋白质的分离纯化。主要用于脱盐、浓缩、缓冲液置换、蛋白质分级分离以及除热原过程。

超滤膜的孔径是用分子量来标定的，比膜标定分子量大的粒子和分子将被截留，而比膜标定分子量小的粒子或分子将透过膜；但是，超滤膜的孔径不是绝对的，膜在截留大部分比其标定分子量大的溶质的同时，也会截留一部分比其分子量小的溶质。因为溶质的形状、可压缩性和与溶液中其它物质的相互作用，都会影响膜对它的截留性。由于超滤的滤过性能受到所用膜材质、被处理微粒的电荷、分子大小及形状等方面的影响，其精度不可能很高，要使蛋白质达到较好的分离效果，一般要求超滤膜截留分子量与目标蛋白分子量相差10倍以上。对于分子量小于3kD的产品，超滤还有除热原作用。超滤膜技术在60年代就已实现了工业化。已广泛用于分离、浓缩、纯化生物制品、医药制品以及食品；还用于血液处理、废水处理和超纯水制备中的终端处理装置。在我国已成功地利用超滤技术进行了中草药的浓缩提纯。

“纳滤”介于反渗透和超滤之间，通过压力驱动分离过程。纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右，允许溶剂分子或某些低分子量溶质或低价离子透过，截留分子量为150～800D。

综上所述，“微滤”、“超滤”及“纳滤”所截取的分子量从高到低逐级减少。

本发明所采用的分级、二次超滤法中，“分级”是将原料液(粗提抗菌肽)经“预处理”后，分别进行“微滤”、“超滤”及“纳滤”逐级纯化，纯化效果非常好。

即：“预处理”除去肉眼可见颗粒及沉淀物；“微滤”除去0.1μm以上颗粒物及微生物等；“超滤”获得目标产物；“纳滤”浓缩。

二次超滤法：分别采用高于和低于目标抗菌肽分子量的2种不同截留分子量超滤膜，截取目标抗菌肽。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、目前采用的离子交换层析、高效液相色谱法等抗菌肽纯化方法流程复杂、耗时长，仅适用于实验中小量抗菌肽的纯化，用于抗菌肽的科研目的；本发明流程简单，耗时明显缩短，可用于抗菌肽的工业化制备。

2、目前，“微滤”、“超滤”及“纳滤”技术等早已实现工业化，并在医药工业中广泛应用。本发明较目前的抗菌肽纯化方法费用明显降低，可用于人用药品制备。

3、我国是蚕业大国，有丰富的蚕蛹资源。本发明采用水浴法诱导昆虫滞育蛹产生抗菌肽，可扩大抗菌肽原料的来源。

4、本发明的抗菌肽纯化方法可最大限度保持抗菌肽的活性和纯度。

附图说明

图1是采用琼脂扩散法鉴定实施例1纯化得到的抗菌肽活性的结果图；其中，画面中间5排抑菌圈，从上到下分别是抗菌肽原液、原液的1/2、1/4、1/8、1/16稀释液所形成的。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

柞蚕抗菌肽的分级、二次超滤法纯化，包括以下步骤：

(1)预处理

将柞蚕滞育蛹在40-50℃水浴20-30min(温水浸泡法诱导昆虫产生抗菌肽)，25℃温育3-5天，收集昆虫滞育蛹中的血淋巴，沸水浴10-30min，4℃下离心，取上清，得到粗提抗菌肽。

(2)微滤

采用0.2μm孔径的无机陶瓷微滤实验用装置对步骤(1)获得的上清液进行微滤。操作参数为40℃、0.3MPa、pH7.5。

为减缓膜的污染程度，试验中每运行20min通过管路阀门改变连接，利用透过液进行反向冲洗2min。每运行20min向料液中补充去离子水至体积浓缩因子达到5时停止运行。

(3)二次超滤

①milipore超滤膜的准备：第一次使用时，光面向下置于烧杯中，在灭菌水中漂洗1小时以上，换水三次。

②超滤膜光面向上安装在milipore8003型小型超滤器上，装入经过微滤的原料液3ml，连接胶管，充入氮气，压力在2.5-4.0个大气压范围内，置于磁力搅拌器上，4℃条件下进行。先用10000截留分子量的超滤膜，取滤过液；再用1000截留分子量的超滤膜超滤，取截留液。

(4)纳滤

采用实验室小型纳滤设备，选用截留分子质量为160D的聚醚砜卷式膜(有效膜面积0.25m²)。将经过上述超滤的原料液通过纳滤设备浓缩，使其体积浓缩倍数(volumetricconcentrationfactor，VCF)为5；纳滤压力为2bar，料液温度为室温。得到纯化后的抗菌肽。

(5)纯化后抗菌肽的活性检测

纯化后的抗菌肽用琼脂扩散法鉴定活性：在内径为8.65cmPetri平皿中，将标准菌株E.coliK₁₂D₃₁均匀混入10ml45-50℃LB琼脂培养基，使活菌数最终达10⁶/ml，凝固后打出2.7mm直径孔穴。

将步骤(4)纯化后的抗菌肽原液，及将原液进行四次倍比稀释后形成的5个浓度抗菌肽液，按6μl/孔加入孔穴，培养18h后观察结果，观察有无抑菌圈。

结果如图1所示，抗菌肽原液、原液的1/2、1/4稀释液都出现了明显的抑制圈，即说明纯化后的抗菌肽有活性，纯化成功。

实施例2

幽门螺杆菌抗菌肽的分级、二次超滤法纯化，包括以下步骤：

(1)预处理

幽门螺杆菌NCTC11639标准株经分离培养、收获活菌，裂解菌体，取幽门螺杆菌菌体裂解液，4℃高速离心(10000rpm，20分钟)后取上清。在沉淀中加2-3倍于沉淀体积的灭菌蒸馏水，震荡混匀后4℃高速离心(10000rpm，10～20分钟)，取上清；重复3次；合并所有上清液后备用。

(2)分级、二次超滤纯化

微滤、二次超滤、纳滤和活性检测的步骤均同实施例1。可见抑菌圈形成，说明纯化后有活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)预处理

对于天然昆虫抗菌肽，预处理的步骤是：诱导昆虫产生抗菌肽，接着收集昆虫的血淋巴，沸水浴10-30min，然后离心取上清，得到粗提抗菌肽；

对于采用基因工程方法获得的各类抗菌肽，预处理的步骤是：①分泌表达的基因工程抗菌肽：取发酵液，离心取上清，得到粗提抗菌肽；②细胞内表达的基因工程抗菌肽：先裂解细胞，然后离心取上清，得到粗提抗菌肽；

对于细菌类抗菌肽，预处理步骤为：从液体或固体培养基中收集活菌；裂解细胞，然后离心取上清，得到粗提抗菌肽；

(2)微滤

将步骤(1)得到的粗提抗菌肽用孔径为0.1-1μm的微孔滤膜过滤，取过滤液；

(3)超滤

采用二次超滤：先采用孔径大于目标抗菌肽分子量的超滤膜对步骤(2)得到的过滤液进行超滤，取滤过液，然后再采用孔径小于目标抗菌肽分子量的超滤膜对滤过液进行超滤，取截留液，即为目标产物；或者是，先采用孔径小于目标抗菌肽分子量的超滤膜对步骤(2)得到的过滤液进行超滤，取截留液，然后再采用孔径大于目标抗菌肽分子量的超滤膜对截留液进行超滤，取滤过液，即为目标产物；

可根据粗提抗菌肽中抗菌肽含量的高低、超滤膜的种类、生产规模的大小等选择以上超滤操作中的一种；

(4)纳滤

将步骤(3)得到的目标产物过纳滤膜浓缩，得到纯化后的抗菌肽。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的诱导昆虫产生抗菌肽，是采用温水浸泡法、超声波刺激法或注射活菌法。

3.根据权利要求2所述的抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于：

所述的温水浸泡法是将昆虫在40-60℃中水浴20-30min；

所述的注射活菌法是往昆虫的滞育蛹中注射活菌，然后25℃温育7天。

4.根据权利要求3所述的抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于：所述的注射活菌是注射E.coliK₁₂D₃₁活菌，往每只昆虫滞育蛹注射1×10⁷个E.coliK₁₂D₃₁活菌。

5.根据权利要求1所述的抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的昆虫是柞蚕或家蚕。

6.根据权利要求1所述的抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的所述的离心是在4℃下10000rpm离心10-20min。

7.根据权利要求1所述的抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的裂解细胞是采用反复冻融裂解或超声波裂解。

8.根据权利要求1所述的抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，取滤过液的超滤，超滤膜截留分子量为目标抗菌肽分子量的2-5倍以上、10倍以内；取截留液的超滤，超滤膜截留分子量为目标抗菌肽分子量的一半以下。

9.根据权利要求1所述的抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，取滤过液的超滤，超滤膜为三醋酸纤维超滤膜或聚砜膜；取截留液的超滤，超滤膜为聚砜膜。

10.根据权利要求1所述的抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，其特征在于：步骤(4)所述的过纳滤膜浓缩，体积浓缩倍数为3-5倍。