CN102212547A - 肠三叶因子重组表达载体及肠三叶因子制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以pGAP为启动子，以毕赤酵母GS115为工程菌，在发酵罐中发酵表达肠三叶因子的工艺方法，首先构建重组毕赤酵母表达载体pGAPZɑA-ITF并转化到大肠杆菌Top10中扩增，提取大肠杆菌质粒线性化后转入酵母菌GS115中，根据载体上所带的zeocin抗性基因筛选高拷贝转化子并进行组成性表达，筛选高表达中试工程菌在培养基中发酵2天分泌表达ITF；通过纯化处理得到纯度95%以上的目的蛋白ITF，产量约为200mg/L，收率约50%；本发明生产成本低，发酵周期短，纯化方法简单，无需甲醇诱导，蛋白表达量高，为ITF的大规模工业化生产奠定了良好的基础。

Description

肠三叶因子重组表达载体及肠三叶因子制备方法

技术领域

本发明属于生物技术和工程领域，特别涉及肠三叶因子的制备方法。

背景技术

肠三叶因子（以下简称ITF）是分布于肠道的特异小分子蛋白，分子量约6～7kD。ITF由59个氨基酸残基构成，包含一个由38～39个氨基酸残基组成的特定序列，其中的6个半胱氨酸以1－5，2－4，3－6的顺序依次形成3个二硫键，从而产生特异而稳定的三叶结构。这种稳定的结构确保其在肠道中发挥活性，不受消化酶和pH变化的影响。正常情况下，ITF分布于整个小肠，特别是小肠绒毛环状细胞的基底部。ITF在体内以20％单体和80％二聚体的形式存在,但只有二聚体才具有生物活性。ITF不仅能促进肠上皮细胞增殖和移行，还能同粘蛋白中的寡聚糖或多糖的侧链相连，稳定肠粘液层。因此，ITF对肠道的保护作用非常强，它在治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤等方面具有显著效果。

“Characterization of human and rat intestinal trefoil factor produced in yeast”一文公开了肠三叶因子在酵母中的表达方法，该方法是利用第一代酿酒酵母发酵获得重组肠三叶因子。但它存在的缺陷是：它由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降，原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，导致了产量的降低，仅为48mg/L；它的纯化方法烦琐，操作复杂、步骤较多。 美国专利US 20020052483A1公开了应用真核表达载体（如pMAMneo），在COS 细胞、CHO 细胞等真核细胞中表达或直接从肠粘膜中提取肠三叶因子。但按照它所介绍的方法具有以下不足：1.利用真核细胞表达获得肠三叶因子，虽然蛋白活性尚好，但成本较高、产量低，难以大规模生产；2.利用肠粘膜提取肠三叶因子，虽然可以得到天然的肠三叶因子，但其原料（肠粘膜）来源受限，产量非常低，不能用于工业化大规模制备。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种重组表达载体，该重组表达载体可以保证工程菌在后续发酵中有较高的表达量，且无需借助甲醇诱导。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

肠三叶因子重组表达载体，所述肠三叶因子重组表达载体为如SEQ ID NO:1所示的DNA片段与pGAPZɑA载体连接而成。

进一步，所述肠三叶因子重组表达载体含有如SEQ ID NO:2所示的启动子核苷酸序列；

进一步，所述肠三叶因子重组表达载体携带zeocin抗性基因；

进一步，所述肠三叶因子重组表达载体为：由RT-PCR扩增出的如SEQ ID NO:1所示的DNA片段，经EcoRI和NotI双酶切，然后与经EcoRI和NotI双酶切的pGAPZɑA载体连接而成的重组表达载体；

进一步，所述肠三叶因子重组表达载体含有组氨酸标签基因。

本发明的目的之二在于提供一种工程菌，该工程菌能分泌肠三叶因子的，且性质稳定。

为实现上述目的，本发明的技术方案为:

含有所述的肠三叶因子重组表达载体的工程菌。

进一步，所述工程菌为含有重组酵母表达质粒pGAPZɑA-ITF的酵母菌；

进一步，所述工程菌为经100-300μg/ml的zeocin抗性梯度法筛选后或/和再经TCA沉淀法筛选后所得的工程菌。

本发明的目的之三在于提供一种制备肠三叶因子的方法，该方法产量高，成本低，适用于工业生产。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

运用所述工程菌制备肠三叶因子的方法，将所述工程菌连续发酵不低于2天，收集发酵液，所述发酵液含有肠三叶因子。

进一步，将所述工程菌连续发酵不低于2天，收集发酵液，对发酵液进行浓缩和去杂质后，得肠三叶因子；

进一步，将发酵液离心后取上清液通过中空纤维柱过滤，得过滤液，对过滤液浓缩并沉淀后，用镍离子柱对带组氨酸标签的蛋白进行亲和层析分离纯化，浓缩后得肠三叶因子。

进一步，将所述工程菌种子液在发酵罐内BSM培养基中发酵表达不少于2天，收集发酵液，所述发酵液中含有肠三叶因子。

本发明的有益效果为：（1）目的基因整合稳定，易于筛选高表达工程菌；（2）表达产物分泌到胞外，蛋白活性更高且利于纯化；（3）易于进行高密度发酵，表达产量高，适于大规模工业生产；（4）pGAP和pAOX1相比无需甲醇诱导，避免了甲醇污染和火灾隐患（5）表达的蛋白具有更好的生物活性，对宿主菌无毒（6）组成型表达，使用单一碳源，无需诱导，发酵方式简单；（7）pGAP表达量和pAOX1不相上下。

按照本发明表达方法获得的重组肠三叶因子，表达产量可达200mg/L，提纯纯度可达95%或更高，纯化的蛋白产物经检测结果表明：用本发明表达方法获得的重组肠三叶因子为高纯度、无热源、无内毒素，有正确的分子量，与天然的肠三叶因子有相同的等电点、氨基酸序列和紫外光谱，及其完好的生物学活性的重组蛋白。将其应用于治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤疗效明显。

附图说明

图1是酵母表达载体构建技术路线示意图；

图2是重组质粒pGAPZɑA-ITF酶切电泳图，1为DL2000；2为双酶切；3为单酶切；4为λDNA+Hind Ⅲ；

图3是重组质粒pGAPZɑA-ITF测序结果图；

图4是重组酵母GS115-pGAPZɑA-ITF基因组PCR电泳图，1为DL2000，3,4为目的基因ITF；

图5是工程菌组成性高表达筛选电泳图，1为蛋白分子量marker，5为最高表达的工程菌株

图6是表达纯化的ITF12%SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白marker，2为纯化ITF；

图7是中试表达纯化的ITF2倍倍比稀释western-blot图，其中1为ITF原液，2-5为依次2倍稀释液；

图8是AKTA explorer 50ml镍离子柱纯化ITF图；

图9是细胞划痕实验显示的不同浓度重组人ITF促进细胞移行图,其中A为对照组（0μg/ml），B为25μg/ml组，C为50μg/ml组；

图10是Transwell实验显示的不同浓度重组人ITF促进细胞移行图；

图11是重组人ITF减轻灌胃乙醇小鼠胃粘膜损害图；其中，A：正常对照组, B：灌胃乙醇6h组,C：ITF治疗组。

图12是重组人ITF减轻烧伤小鼠胃粘膜损害图，其中，A：正常对照组, B：烧伤24h组,C：ITF治疗组。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，进一步阐述发明。应当理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不限于本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，本文表述的浓度均为质量体积浓度。

本申请人曾申报了ITF摇瓶表达的相关专利，2008年获得授权，其采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，启动子为pPIC，授权号：ZL 2005 10057295.7。本次申请的专利中使用了不同的表达启动子pGAP，二者均为真核表达系统常用的表达启动子。相比之下，pPIC在外源蛋白表达过程中需用甲醇诱导，并且发酵过程中需更换培养基进行不同培养基分批发酵，使整个实验过程操作繁琐，增加了污染的可能，同时使用的诱导剂和碳源为极易带来火灾隐患和后期纯化污染的甲醇，大大增加了发酵和蛋白纯化的工艺困难，不利于外源蛋白的工业化生产，而以pGAP为表达启动子则克服了上述不足，使用的碳源也是无毒性的葡萄糖或者甘油，并且重组蛋白产量和纯度也略高于pPIC。

实施例1 重组表达载体的构建

由RT-PCR扩增出的肠三叶因子基因序列，经EcoRI和NotI双酶切，然后与用同样的限制性内切酶处理过的酵母分泌表达型载体pGAPZɑA连接，转化入大肠杆菌Top10，以浓度20～30μg/mlZeocin的低盐LB平板筛选重组质粒，得到含有重组酵母表达质粒pGAPZɑA-ITF的重组大肠杆菌Top10。步骤详见图1，具体如下：

1. 由RT-PCR扩增出的肠三叶因子基因序列，根据在GeneBank检索得到的hITF mRNA序列(Accession No NM003226)，以hITF的成熟肽cDNA编码区（180bp）为模板，使用Primer 5.0软件设计以下引物，hITF上游引物：5′-gagagaattccaccaccaccaccaccacgaggagtacgtgggcctgtc -3′；hITF下游引物：5′- tttagcggccgctcagaaggtgcattctgcttc -3′。上游和下游引物分别引入EcoRI、NotI酶切位点（下划线），同时上游引物在N端还添加了组氨酸标签，以便于后期的检测和纯化。经EcoRI和NotI双酶切。使用的GAP启动子序列为atggaacaaa acgcgattca gcggcgcgaa cgcccgttcg tcgccggcga gtgggtctcc。

2．酶切产物的纯化

1）割下含ITF DNA的琼脂糖块，放人 1．5ml 离心管；

2）加人400μl 结合缓冲液，置无55-60℃水浴7分钟，使琼脂块完全熔化，每2分钟颠倒混匀一次；

3）将熔化的琼脂糖液移人吸附柱，10000转/分离心1分钟，倒掉收集管中液体，再将吸附柱放人同一收集管中；

4）在吸附柱中加人750μl洗脱缓冲液，静置2分钟后，离心1分钟倒掉收集管中液体，将吸附柱放人同一收集管中；

5）同（4），离心1分钟；

6）将吸附柱放人一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附柱中央加入30-50ml去离子水，离心1分钟，将1.5ml离心管（DNA）贮存于-20℃冰箱。

3.连接

取2.5μl目的基因片断和5μl载体片断,建立20μl连接体系,4℃连接过夜。

4.转化

1）  取10μl连接产物加人到100μl 大肠杆菌TOP10感受态细菌轻轻混合，冰上放置 30分钟；

2） 42℃热休克90秒，冰上放置 2分钟；

2）  加人900μl LB培养基,37℃水平摇1小时；

3）  取100μl分别涂于低盐LB琼脂平板（含Zeocin 25μg/ml），37℃过夜培养。

5.观察结果

第二天LB平板长出数十个阳性菌落.

6.酶切及测序鉴定

从大肠杆菌TOP10中提取小量质粒pGAPZɑA－ITF，用EcoRI和NotI消化，切下预期大小片段，按设计编码pGAPZɑA－ITF序列，分别约210bp和3300bp，如图2中2,3所示。用重组质粒pGAPZɑA－ITF酶切电泳图，和pGAPZɑA－ITF测序图谱测序鉴定，测序结果证明，所克隆pGAPZɑA－ITF序列完全正确，见图3，而且是按照设计准确进入载体。

酶切体系：质粒DNA            16μl

EcoRI              1μl

NotI                1μl

10 X缓冲液          2μl

共计20μl

反应条件：                 37℃4-6小时。

实施例2 工程菌的制备

从实施例1所得的重组大肠杆菌Top10中提取重组酵母表达质粒，单酶切线性化后转化酵母菌GS115，以浓度100μg/mL的zeocinYPD平板筛选阳性转化子。

1. GS115酵母菌感受态的制备

1）  接种GS115酵母菌到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约10⁸ Cells/ml）;

2）  收获酵母菌，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10分钟;

3）  重悬酵母菌于1mL浓度为100mM 氯化锂溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；

4）  离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400μL浓度为 100mM 氯化锂溶液中；

5）  按50μl/管分装，立即进行转化。

2. GS115酵母菌的转化

1）煮沸1mL鲑鱼精DNA 5分钟，迅速冰浴以制备单链单体DNA；

2）将处于感受态的GS115酵母菌离心，去除残余的氯化锂溶液；

3）  对于每一个转化，按以下顺序加入：

50% PEG3350                      240μl

1M LiCl                           36μl

2mg/ml 单链Salmon sperm DNA       25μl

5～10μg/50μl H₂O 质粒DNA        50μl

4）剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；

5）30℃水浴孵育30分钟；

6）42℃水浴热休克20～25分钟；

7）6000～8000转/分离心收集酵母菌体(吸出液体)；

8）重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；

9）1～4h后，取25～100μl菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定。

3.重组酵母基因组PCR鉴定

采用煮冻煮法提取GS115酵母菌DNA，以公用引物α-因子及AOX引物进行PCR鉴定，方法如下：

1）取1ml摇过夜重组菌菌液，2500rpm离心5min，弃上清；

2）用500ulPBS悬浮沉淀，2500rpm离心3min，弃上清；

3）75ulElution buffer溶解沉淀，沸水浴10，-80℃冷冻40min，再沸水浴10min；

4）1500rpm离心3min；

5）取1ul上清作为模板，以公用引物α-因子上游引物及AOX下游引物进行PCR。

5’α-Factor引物F：tactattgcc agcattgctg c

3’AOX1引物R：gcaaatggca ttctgacatc c

PCR反应体系（50ul）：

水：       34.5μl

10×buffer：  5μl

dNTP：        3μl

MgCl₂：       4μl

上引(20μM)： 1μl

下引(20μM)： 1μl

模板：        1μl

Tag酶：     0.5μl

共计50μl

反应条件：

94℃预变性5分钟后进入循环；94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；循环完成后72℃继续延伸10分钟。图4中第3、4条带显示的是从酵母GS115中，通过PCR扩增ITF基因的结果。

（3）高表达菌株的筛选

使用100-300μg/mL的zeocin抗性梯度从阳性转化子中初步筛选多拷贝菌株，所得菌株组成性表达3天后使用TCA沉淀法进一步筛选目的蛋白高表达菌株作为中试发酵工程菌。

1）    氯化锂法转化后的菌液涂布含不同zeocin浓度的YPD平板，30℃培养3天，筛选高zeocin抗性的阳性转化子；

2）获得的阳性转化子在30℃，250rpm摇床中培养3天，进行组成性表达；

3）表达结束后，菌液室温12000rpm离心2min，收集上清；

4）    取900μl上清置于EP管中，加入100ul100%TCA（三氯乙酸），颠倒混匀10次后冰浴6h；

5）    15000rpm离心10min，小心吸出上清，加入200μl预冷的丙酮，洗去管壁和管底残余的TCA；

6）    15000rpm离心10min，弃上清，重复用丙酮清洗一次后，小心吸净丙酮，离心管37℃烘烤15min；

7）加入去离子水和2×上样buffer各10μl，沸水浴10min后上样电泳；

8）    考马斯亮蓝染色后，再用水脱色数小时，观察不同转化子上清中的目的蛋白量，从而筛选得到高表达的菌株作为发酵的工程菌，即重组毕赤酵母pGAPZɑA-ITF-GS115菌株，图5中5所示的是表达量最高的工程菌。

实施例3 运用工程菌制备肠三叶因子

一、 发酵

将制备好的种子培养基接种到30L发酵罐的10L发酵培养基中，以来源广泛的无机盐培养基作为发酵培养基，以葡萄糖作为碳源，无需甲醇诱导和分阶段发酵，连续发酵2天。具体步骤如下：

1）菌种：实施例2所得工程菌，即重组毕赤酵母pGAPZɑA-ITF-GS115菌株。

2）培养基

种子培养基：

蛋白胨20g，D-葡萄糖20g，酵母提取物10g，定容至1L。

发酵基础盐培养基BSM： 85% H₃PO₄ 26.7ml/L，CaSO₄·2H₂O 0.93g/L，K₂SO₄·18.2g/L，MgSO₄·2H₂O 14.9g/L， KOH 4.13g/L，甘油 40g/L，PTM1 4.0ml/L

其中：PTM1微量元素培养基：

CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，KI 0.088g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L， H₃BO₃ 0.02g/L，CoCl₂·6H₂O 0.5g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7H₂O 65.0g/L，Biotin 0.2g/L 浓H₂SO₄ 5.0ml。

3）方法：

从新鲜YPDZ平板上挑取一环单菌落接种到10ml种子培养基中，30℃250rpm培养18h；再将菌液接种到1LYPD中，30℃250rpm培养24-36h至OD₆₀₀达10左右；配制BSM培养基10L，加至30L发酵罐中，121℃30min高压灭菌培养基，发酵罐和管道。待发酵罐培养基冷却到室温时，用氨水调节pH至4左右，加入40mlPTM1培养基和15ml生物素贮备液，将1LYPD种子液加入到发酵罐，开始发酵培养。发酵过程中，罐内温度恒定为30℃，流加氨水补充氮源并调节pH在4左右，流加葡萄糖为碳源，流加速率7.2ml/h/L，控制溶氧在30%-40%，发酵2天，得发酵液，所述发酵液中含有肠三叶因子。

二、肠三叶因子的提纯

将发酵液重复离心3次后所得上清通过中空纤维住过滤，然后使用硫酸铵按照常规方法沉淀浓缩蛋白，用平衡液10mM咪唑复溶沉淀并调节pH至7.4后，用镍离子柱对带his标签目的蛋白进行亲和层析分离纯化，经过平衡、上样、平衡、洗脱及平衡的过程获得溶于250mM咪唑洗脱液中的目的蛋白，使用10kd孔径的超滤管将其反复超滤除去盐，咪唑等小分子物质，纯化浓缩后得到纯度95%以上的目的蛋白，及肠三叶因子。具体步骤如下：

1）发酵完后收集罐内发酵液，4℃8000rpm离心30min，弃沉淀，重复离心3次；

2）收集的上清液用中空纤维柱过滤进一步除去其中的杂质；

3）每升滤液中缓慢加入固体无水硫酸铵450g，搅拌至其完全溶解，冰浴6h左右；

4）溶液4℃9000rpm离心10min，弃上清，沉淀用100ml平衡液10mM咪唑复溶，用NaOH调节pH至7.4，4℃10000rpm离心10min，弃沉淀，上清用0.45um滤膜过滤后准备上镍离子柱；

5）用去离子水冲洗系统和镍柱，至电导将为0.02mS/cm；

6）用平衡液平衡系统和镍柱至电导上升至水平稳定；

7）打开紫外灯上样品液，收集部分流穿液电泳鉴定是否有目的蛋白流穿；

8）用平衡液平衡系统和镍柱至紫外吸收峰降至几乎水平；

9）用洗脱液250mM咪唑洗脱镍柱上结合的蛋白，收集出现的紫外吸收峰；

10）电泳鉴定上样液，流穿液，平衡液和洗脱液中的蛋白；

11）将洗脱峰溶液加入到超滤管（10kd）中，补充PBS至总体积10ml，4℃4000rpm离心60min，收集部分滤出液；

12）继续补充PBS至总体积10ml，4℃4000rpm离心60min，弃滤出液；

13）重复离心3次后，用枪头小心析出管内残留液体，取少量电泳，其余-80℃冻存

电泳鉴定滤出液和残留液，测蛋白浓度。图6、图7显示的是采用Wb技术鉴定重组表达蛋白为ITF，图8显示的是蛋白洗脱、分离图谱。

实施例4 药理学实验

一 细胞实验

1、划痕实验

收集对数期细胞，接种于24孔板，调节细胞数5×10⁵/孔，置于37℃，5%CO₂温箱培养：待细胞贴壁融合后，换无FCS的DMEM继续培养24h，用剃须刀刮除约5mm×10mm区域的细胞，造成IEC-6机械损伤，用无血清培养液冲洗细胞表面2次以除去细胞残骸和碎片；加入含25-50μg/ml实施例3所得的肠三叶因子的DMEM溶液继续孵育，24h后观察细胞移行情况，计数跨国2mm损伤边界的细胞数。

结果：实验结果显示，本方法制备的 ITF具有很强的促进细胞移行能力，并存在剂量和时间依赖效应。提示，重组表达的人ITF通过提高细胞移行能力，维护肠黏膜屏障，加快受损黏膜的修复，详见图9。

2、Transwell迁移实验

按照Transwell迁移实验的常规步骤进行。实验分为25μg/ml组和50μg/ml组，分别设置4、6、8和12小时4个时间点。

Transwell实验结果显示，ITF浓度在25-50μg/ml时有很好的促进细胞移行的作用，促进移行作用最佳时间在12小时，详见图10。说明ITF能快速促进细胞移行，对促进受损黏膜的修复具有重要价值。

二 动物实验

采用灌胃乙醇和30%体表面积Ⅲ°烧伤小鼠模型，治疗组给予1mg/kg的重组ITF,每天两次，对照组给予等量生理盐水。观察致伤动物胃粘膜损害程度的变化。实验结果显示，灌胃乙醇和重度烧伤均能导致动物胃粘膜严重受损，主要病理表现为胃粘膜充血、水肿、糜烂、浅表溃疡和大面积出血。胃体、胃窦部为溃疡好发部位，呈多发、散在分布。使用重组表达的ITF能显著减轻灌胃乙醇和烧伤导致的急性胃黏膜损害，主要病理改变为充血和水肿，偶见糜烂、溃疡和点状出血，详见图11和图12。

本发明属于生物技术和工程领域，涉及一种以pGAP为启动子的重组毕赤酵母中试表达和纯化生物蛋白的方法，具体是以pGAP为启动子的重组毕赤酵母中试表达和纯化肠三叶因子的工艺方法。包括表达载体的构建，重组工程菌的制备，高表达菌株的筛选，中试发酵和产物纯化等过程。按照本发明表达方法获得的重组肠三叶因子，表达产量可达200mg/L，提纯纯度可达95%或更高，纯化的蛋白产物经检测结果表明：用本发明表达方法获得的重组肠三叶因子为高纯度、无热源、无内毒素，有正确的分子量，与天然的肠三叶因子有相同的等电点、氨基酸序列和紫外光谱，及其完好的生物学活性的重组蛋白。它在治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤等方面具有显著效果。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>  肠三叶因子重组表达载体及肠三叶因子制备方法

<160>  6

<210>  1

<211>  180

<212>  DNA

<213>  智人（Homo sapiens）

<220>

<223>  hITF cDNA

<400>  1

gaggagtacg tgggcctgtc tgcaaaccag tgtgccgtgc cagccaagga cagggtggac      60

tgcggctacc cccatgtcac ccccaaggag tgcaacaacc ggggctgctg ctttgactcc     120

aggatccctg gagtgccttg gtgtttcaag cccctgcagg aagcagaatg caccttctga     180

<210>  2

<211>  60

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  pGAP启动子

<400>  2

atggaacaaa acgcgattca gcggcgcgaa cgcccgttcg tcgccggcga gtgggtctcc          60

<210>  3

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  hITF引物 F

<400>  3

gagagaattccaccaccacc accaccacga ggagtacgtg ggcctgtc                   48

<210>  4

<211>  43

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  hITF引物R

<400>  4

tttagcggcc gctcagaagg tgcattctgc ttc                                                 43

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  α-Factor引物F

<400>  5

tactattgcc agcattgctg c                                               21

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  AOX1引物R

<400>  6

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Claims (12)

1.肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体为如SEQ ID NO:1所示的DNA片段与pGAPZɑA载体连接而成。

2.根据权利要求1所述的肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体含有如SEQ ID NO:2所示的启动子核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体携带zeocin抗性基因。

4.根据权利要求1所述的肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体为：由RT-PCR扩增出的如SEQ ID NO:1所示的DNA片段，经EcoRI和NotI双酶切，然后与经EcoRI和NotI双酶切的pGAPZɑA载体连接而成的重组表达载体。

5.根据权利要求1所述的肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体含有组氨酸标签基因。

6.含有权利要求1-5任一项所述的肠三叶因子重组表达载体的工程菌。

7.根据权利要求6所述的肠三叶因子重组表达载体的工程菌，其特征在于：所述工程菌为含有重组酵母表达质粒pGAPZɑA-ITF的酵母菌。

8.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为经100-300μg/ml的zeocin抗性梯度法筛选后或/和再经TCA沉淀法筛选后所得的工程菌。

9.运用权利要求6所述的工程菌制备肠三叶因子的方法，其特征在于：将所述工程菌连续发酵不低于2天，收集发酵液，所述发酵液含有肠三叶因子。

10.根据权利要求9所述的制备肠三叶因子的方法，其特征在于：将所述工程菌连续发酵不低于2天，收集发酵液，对发酵液进行浓缩和去杂质后，得肠三叶因子。

11.根据权利要求9或10所述的制备肠三叶因子的方法，其特征在于：将发酵液离心后取上清液通过中空纤维柱过滤，得过滤液，对过滤液浓缩并沉淀后，用镍离子柱对带组氨酸标签的蛋白进行亲和层析分离纯化，浓缩后得肠三叶因子。

12.根据权利要求9所述的制备肠三叶因子的方法，其特征在于：将所述工程菌种子液在发酵罐内BSM培养基中发酵表达不少于2天，收集发酵液，所述发酵液中含有肠三叶因子。

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