CN112480227B

CN112480227B - 一种提高鲟鱼抵抗病原菌能力的蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112480227B
Application number: CN202011324415.6A
Authority: CN
Inventors: 王晓雯; 朱华; 胡红霞; 张蓉; 刘丽丽
Original assignee: Beijing Fisheries Research Institute
Current assignee: Beijing Fisheries Research Institute
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2040-11-23
Also published as: CN112480227A

Abstract

本发明涉及一种提高鲟鱼抵抗病原菌能力的蛋白及其制备方法与应用。本发明提供的能提高鲟鱼抵抗病原菌能力的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过对不同条件下鲟鱼的肝脏转录组测序，根据测序结果找到一段免疫功能发生变化的不同条件下差异表达的基因，提取鲟鱼脾脏的总RNA，采用RACE技术，拼接得到了cDNA序列全长如SEQ ID NO.1所示，通过重组表达技术获得重组蛋白AbIRP，试验发现注射重组蛋白AbIRP对鲟鱼感染病原菌具有显著的清除和抑制作用，作为免疫佐剂能提高菌苗的免疫效果，作为饲料添加剂能提高杂交鲟鱼对病原菌的抗病力。

Description

一种提高鲟鱼抵抗病原菌能力的蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种提高鲟鱼抗病原菌能力的蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

鲟鱼(Sturgeon)属软骨硬鳞类，具有易驯养，生长快的特点，经济价值高，是我国重要的一个养殖品种。近年来，随着鲟鱼养殖规模扩大，高密度养殖模式下往往导致病害频发，给养殖业者带来巨大损失。在整个鲟鱼养殖期间，危害最广，死亡最大的疾病主要是嗜水气单胞菌引起的鲟鱼败血症，温和气单胞菌引发的混合型肠炎。

目前，药物防控是水产类疾病治疗的主要措施，在鲟鱼的疾病防治技术中，常用的方法是加工饲料中直接添加成品抗生素药，药物虽然短时间内可以在一定程度上防治病害，但也会带来一些弊端，如长期频繁使用抗生素及其它一些化学药物会造成病原产生耐药性，药物在鱼体内残留及对水环境造成污染等，也影响水产品质量和人类健康。有必要探索一种新的疾病防治技术，兼顾调节鲟鱼机体的免疫力和作为免疫佐剂的作用，增强机体抵抗疾病能力，将会在鲟鱼养殖中的应用具有重要意义，并且进一步提升鱼类养殖效率和经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供来自鱼类自身具有调节和提高鲟鱼免疫能力、对环境无污染的蛋白及其制备方法与应用。

申请人在介于软骨鱼类和硬骨鱼类之间的鲟鱼上开展相关免疫因子分子水平研究，发现通过对不同条件刺激下鲟鱼的肝脏转录组测序，根据测序结果找到一段差异表达的基因，该基因随着鲟鱼免疫功能发生变化而呈现差异显著的表达量。本发明采用RACE技术，拼接得到了Abirp(Acipenser baeri Immune-related protein)基因的cDNA序列，其具有：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

该基因的ORF序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明进一步发现，该cDNA序列编码鲟鱼蛋白的氨基酸序列含有：

a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

b)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或

c)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明提供了含有前述鲟鱼蛋白编码基因的生物材料，所述生物材料为质粒、载体、宿主菌或转化细胞。

本发明进一步提供了一种重组鲟鱼蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)以西伯利亚鲟脾脏cDNA为模板，设计分别带有NcoI和HindIII酶切位点的引物对进行PCR扩增，扩增目的基因片段；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；

(2)将原核表达载体与目的基因片段进行重组，构建重组质粒：将目的基因序列替换pET30a(+)载体的NcoI和HindIII酶切位点间的DNA分子，得到的重组质粒；

(3)将重组质粒导入表达菌株中，利用诱导剂诱导重组质粒在表达菌株中表达。

上述制备方法制得的重组蛋白属于本发明的保护范围。

本发明提供了所述鲟鱼蛋白、或其编码基因，或含有编码基因的生物材料，或前述制备方法制得的重组蛋白的以下任一所述的用途：

(1)在制备提高鱼类免疫功能药物中的应用；

(2)在制备体内和/或体外抑制鱼类病原菌制剂中的应用；

(3)在制备免疫佐剂中的应用；

(4)在制备饲料添加剂中的应用。

所述病原菌为嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、维氏气单胞菌、温和气单胞菌。

本发明还提供了一种产品，该产品含有所述鲟鱼蛋白、或其编码基因，或含有编码基因的生物材料，或前述制备方法制得的重组蛋白；所述产品为药物、保健品、食品、佐剂、饲料添加剂。

本发明研究发现本发明述及的鲟鱼蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)在体内具有良好的免疫调节作用，提高鲟鱼抵抗病原菌的能力，作为免疫佐剂，进一步提高免疫效果，还能抑制常见的鲟鱼病原菌增殖，具有防治鲟鱼疾病的能力。由于该蛋白来自鲟鱼自体，应用过程中，不会对鲟鱼产生额外的应激反应，体内残留无害，对环境无污染，在鲟鱼养殖中的应用具有重要意义，并且能够进一步提升鱼类养殖效率和经济效益，应用前景广阔。

附图说明

图1为AbIRP表达分析图，其中M，蛋白质marker；1，IPTG诱导后的BL21-pET.30a(+)上清；2，IPTG诱导后的BL21-pET.30a(+)沉淀；3，5，7，IPTG诱导后的BL21-pET.30a(+)-AbIRP菌体破碎后上清；4，6，8，IPTG诱导后的BL21-pET.30a(+)-AbIRP菌体破碎后沉淀。

图2为重组蛋白AbIRP的SDS-PAGE电泳结果和Western blot检测结果图。其中，A图为SDS-PAGE电泳结果，B图为western blot检测结果；A和B中第一泳道均为纯化的AbIRP重组蛋白，第二泳道均为商品牛血清白蛋白BSA蛋白。

图3为实施例3中西伯利亚鲟中的脑、血液、头肾、脾脏、心脏、肌肉、眼、肝脏、肠、皮肤组织中Abirp基因的表达分析。

图4为嗜水气单胞菌感染后不同时间西伯利亚鲟肝脏组织中Abirp基因mRNA的表达量。

图5为嗜水气单胞菌感染后不同时间西伯利亚鲟脾脏组织中Abirp基因mRNA的表达量。

图6为嗜水气单胞菌感染后不同时间西伯利亚鲟头肾组织中Abirp基因mRNA的表达量

图7为西伯利亚鲟原代脾脏细胞在LPS和灭菌嗜水气单胞菌的免疫刺激下Abirp基因mRNA的表达变化图。

图8为重组蛋白AbIRP表达SDS-PAGE图，其中M，蛋白marker；1，重组蛋白AbIRP；2，空白质粒pET-30a(+)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1在不同条件下免疫功能发生变化的差异表达的基因的确定与克隆

为研究免疫原刺激或高温等条件胁迫是否影响鲟鱼免疫功能，发明人所在团队进行了不同条件下鲟鱼的肝脏转录组测序，根据测序结果，从中找到一段免疫功能发生变化的不同条件下差异表达的基因。

依据序列设计引物，以西伯利亚鲟脾脏cDNA为模板，扩增得到cDNA的部分片段。根据获得的cDNA片段序列设计特异性引物GSPI、NP3、GSPII和NP5，用于RACE试验。

Abirp-GSP5-1:5’-CCGCTGCAGGACAGGAAGTAATTAC-3’；SEQ ID NO.7

Abirp-GSP5-2:5’-TGTAGGTGGAGATGAGGGGAGTCACT-3’；SEQ ID NO.8

Abirp-GSP3-1:5’-TAACGGAAGAAAGGACCCAAGACGCG-3’；SEQ ID NO.9

Abirp-GSP3-2:5’-ATAAGGAGATCTGTGATGAACTCAGA-3’；SEQ ID NO.10

提取西伯利亚鲟脾脏的总RNA，反转录得到cDNA作为模板，采用RACE技术，扩增基因的5’和3’端，分别获得了529bp和406bp的扩增片段，结合已扩增的部分序列，拼接得到了cDNA序列全长，即SEQ ID NO.1；该基因的开放阅读框为SEQ ID NO.1中第449位到第880位，该基因命名为Abirp；该基因编码一个143个氨基酸的蛋白质AbIRP，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2，理论蛋白分子量为16.03kDa，等电点为10.45，不含信号肽。

实施例2西伯利亚鲟IRP重组蛋白的制备

1、西伯利亚鲟IRP成熟肽的克隆：根据实施例1获得的基因序列，利用SignalPv5.0 Server软件在线分析无信号肽，以西伯利亚鲟脾脏cDNA为模板，设计分别带有NcoI和HindIII酶切位点的引物F(F:CCCATGGCTCTGCAGCCTCTCGACATC，SEQ ID NO.5)和R(R：CCAAGCTT CTAAACAGGGGGGGC，SEQ ID NO.6)进行PCR扩增，扩增第3-143位氨基酸的西伯利亚鲟IRP成熟肽的cDNA片段。

25μL反应体系中含2.5μL 10×Ex buffer，2μLdNTP，F和R引物各0.3μmol，1U Extaq酶(Takara)，500ng cDNA模板，PCR反应程序为：94℃10min；94℃25s，52℃25s，72℃30s(10个循环)；94℃25s，60℃25s，72℃30s(25个循环)；72℃7min。经1％琼脂糖凝胶电泳分析后用DNA凝胶回收试剂盒(Takara)进行回收纯化。

经过测序，PCR扩增产物具有SEQ ID NO.1第455-880位核苷酸序列(即含有终止子的Abirp基因编码序列)

2、重组质粒的构建：将原核表达载体与目的核苷酸片段进行重组，构成能表达出AbIRP氨基酸的重组质粒：

表达载体pET30a(+)-AbIRP为将SEQ ID NO.1第455-880位所示的AbIRP基因成熟肽编码序列替换pET30a(+)载体(Merck millipore公司，69909)的NcoI和HindIII酶切位点间的DNA分子，得到的重组载体；AbIRP基因成熟肽编码序列与pET30a(+)载体上的His标签融合表达，得到重组蛋白AbIRP(SEQ ID NO.3中第47-187位为蛋白AbIRP成熟肽，第2-7位为N端的6个His标签，第8-46位为一段载体上的序列)。重组质粒编码蛋白质氨基酸序列见SEQID NO.3，构建方法为常规的双酶切连接。

3、重组蛋白的诱导表达：将重组质粒导入表达菌株中，利用诱导剂诱导重组质粒在表达菌株中表达。

3.1重组菌的构建：将上述重组载体pET30a(+)-AbIRP转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(天根生化科技有限公司，CB105)中，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上，37℃培养18h，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定，引物为通用引物T7(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，SEQ ID NO.11)和T7t(5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′，SEQ IDNO.12)，得到762bp为阳性重组菌，将阳性重组菌命名为pET30a(+)-AbIRP-BL21。

采用同样的方法将空载体pET30a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到对照菌pET30a(+)-BL21。

3.2西伯利亚鲟AbIRP重组蛋白的诱导表达

将pET30a(+)-AbIRP-BL21接种于含有卡那霉素(50ng/μL)的LB培养基中，在37℃震荡培养至OD600约为0.6，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续培养6h，离心收集菌体。以培养基1/10体积的PBS悬起菌体，并加入PMSF至终浓度1mM，在冰浴条件下，经100W超声破碎裂解细胞，离心分别收集裂解液上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明，西伯利亚鲟AbIRP重组蛋白存在于包涵体(图1)。

3.3西伯利亚鲟AbIRP重组蛋白的纯化

将收集的经超声破碎的pET30a(+)-AbIRP-BL21的菌体沉淀重悬于BufferA(6M盐酸胍，137mMNaCl，8mM Na2HPO4，2.7mMKCl，1.5mM KH2PO4充分溶解于800mL双蒸水，定容至1L，调节pH至7.4)中，利用TALON Superflow Resin Co2+亲和层析柱纯化带有6×His标签的AbIRP蛋白。

Co²⁺亲和层析纯化蛋白的步骤如下：

(1)收集超声破碎的菌体沉淀，向沉淀中加入适量的洗涤Buffer，重悬沉淀，洗涤包涵体，洗涤完毕后，4℃，12000g离心10min，弃去上清。反复操作3次；

(2)将洗涤后的包涵体重悬于BufferA中，振荡摇匀使蛋白充分溶解。溶解后，4℃，12000g离心10min收集上清；将收集的上清(即溶解于BufferA的包涵体溶解液)用0.45μm孔径的滤膜过滤，去除杂质；

(3)将Co²⁺树脂装入层析柱中，用经0.45μm孔径的滤膜过滤后的5倍柱体积的清水洗柱；然后加5倍柱体积的Buffer A，平衡柱子，至紫外分析仪的数值稳定后调为0.000。

(4)将过滤好的包涵体溶解液加入层析柱中，流速控制在1mL/min；待柱体饱和，停止加上清，改用BufferA洗柱，至紫外吸收峰接近0.000；

(5)加入含150mM咪唑的洗脱液BufferC(5.4M盐酸胍，150mM咪唑，137mMNaCl，8mMNa₂HPO₄，2.7MmKCl，1.5mM KH₂PO₄，充分溶解于800mL双蒸水，定容至1L，调节pH至7.4)洗脱蛋白，收集洗脱组分；

(6)待收集完，依次用10倍柱体积ddH₂O、5倍柱体积MES、10倍柱体积ddH₂O洗柱，然后用20％的乙醇保存柱子以备下次使用；

(7)将收集的洗脱组分置于透析袋中，将透析袋的两头用夹子夹好，放于复性缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0；6M尿素)中，于4℃透析，每24h更换尿素浓度逐级降低的复性缓冲液，使蛋白复性。将复性后的蛋白用10KDa的超滤管(Millipore)超滤浓缩，然后用SDS-PAGE检测目的蛋白AbIRP的纯化结果。

3.4西伯利亚鲟AbIRP重组蛋白6×His标签的western blot检测

取上述纯化的AbIRP重组蛋白1μg上样，并以BSA作对照，进行SDS-PAGE，电泳结果如图2的A所示，其中泳道1为AbIRP重组蛋白，泳道2为BSA蛋白对照。将电泳结束后凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。PBST漂洗3次，每次10min，在含1％BSA的PBST溶液中，4℃下封闭过夜，PBST漂洗后，加入单抗Anti-His-HRP(1：10000)，在37℃下孵育2h，PBST漂洗3次，每次10min，然后用DAB显色。结果如图2的B所示，泳道1对应的条带大小处目的条带发生显色，而泳道2的BSA蛋白对照无显色条带。结果表明，经诱导表达和纯化成功获得了纯度较高的AbIRP重组蛋白rAbIRP。

实施例3 Abirp在西伯利亚鲟不同组织的表达特征

采用实时荧光定量PCR方法检测Abirp在健康西伯利亚鲟体内不同组织的相对表达量，研究AbirpmRNA的组织分布。

具体操作方法：随机选取10尾1龄的雌雄各半的健康西伯利亚鲟(体重约150g)的11个组织，分别为：血液、鳃、眼、头肾、脾脏、心脏、肌肉、皮肤、肝脏、脑和肠。用Trizol法提取组织总RNA，用Takara反转录试剂盒反转录为cDNA。

根据Abirp的cDNA序列设计用于荧光定量PCR的引物，引物序列如下：

AbirpF：5’-GCCCAACTCACCCGTCCT-3’；

AbirpR：5’-GGTTATGTTGCTGTCTCGCTTGT-3’；

内参基因18S rRNA的引物序列如下：

18sF：5’-TGCCCTATCAACTTTCGATGG-3’；

18sR：5’-CTGCCTTCCTTGGATGTGGT-3’。

采用ABI 7500实时荧光定量PCR仪，检测上述10尾鲟鱼的11个组织中Abirp的相对表达量。反应条件为：95℃，15s；95℃5s，59.6℃30s，72℃30s，40个循环。结果表明(如图3)，Abirp基因在10尾鲟鱼中，相同组织的表达量差异不显著；该基因在上述11个组织中均有表达，其中，在脑中的表达量最高，与其它各组织均存在显著性差异(P<0.05)，其次是血液、头肾和脾脏，这三种组织的表达量均显著高于肝、鳃、肠和皮肤(P<0.05)，提示该基因在免疫系统发挥重要作用。

实施例4免疫刺激对西伯利亚鲟Abirp表达的影响

1.细菌感染对西伯利亚鲟Abirp表达的影响

随机选取健康的西伯利亚鲟(体重约100g)60尾，分为对照组30尾和感染组30尾。给感染组的每尾鲟鱼腹腔注射0.2mL嗜水气单胞菌(10⁸CFU/mL)，对照组的每尾鲟鱼注射等量的PBS。在注射后6h，12h，24h，72h和7d，分别随机取两组6尾鲟鱼的肝脏、脾脏和头肾。实时荧光定量PCR的方法检测Abirp基因的相对表达量。

结果表明(如图4-图6所示)，在肝脏、脾脏和头肾三种组织中，AbirpmRNA水平均在嗜水气单胞菌感染6h后迅速升高；在头肾组织，Abirp表达量上调程度最大(约为PBS对照组的7.8倍)，6h达到峰值，之后逐渐下降，直至72h后基本和对照组保持相近的水平；在肝脏组织，Abirp mRNA水平在感染后72h达到峰值，显著高于PBS对照组；在脾脏组织，Abirp mRNA水平在感染后12h达到峰值，之后逐渐降低。

2.不同免疫刺激对原代脾细胞中西伯利亚鲟Abirp基因表达的影响

用0.01％(W/V)高锰酸钾溶液对4尾西伯利亚鲟鱼体分别浸泡消毒30min，然后再用70％的酒精对鱼体体表进行消毒。将其脾脏取出后放置到无菌培养皿中，在含青霉素(500U/mL)和链霉素(500U/mL)的1×PBS溶液中洗涤3～4次。将脾脏组织过100目筛网，用2mL注射器内胆研磨，用不含血清的培养基清洗筛网。将细胞于1000rpm离心5min，并用无血清培养基清洗细胞一次。将离心的细胞沉淀用细胞培养基重悬、计数，并调整浓度为1×10⁶个/ml，加1mL细胞悬液到24孔细胞培养板中。在26℃培养箱中进行原代培养。第二天吸出培养基，每孔添加1mL新鲜培养基。4尾西伯利亚鲟鱼脾脏细胞平均分到4个24孔细胞培养板中，并且每个细胞培养板中的6个孔来自同一尾鲟鱼，分别添加不同的免疫刺激物：PBS(1×)、LPS(100μg/mL)、灭活嗜水气单胞菌(2×10⁶CFU/ml)(80℃高温孵育嗜水气单胞菌NX830(保藏于中国农业部水生动物病原库，保藏编号：BYK20130805)2h，涂LB平板，确认无菌落生长)，每个平板上每尾鱼设置2个免疫刺激物平行孔。分别于免疫刺激的6h、24h、48h、96h时收集细胞，提取RNA，并反转录得到cDNA。采用实时荧光定量PCR的方法检测不同免疫刺激物作用下，不同刺激时间，Abirp mRNA的相对表达量。

结果表明(如图7所示)，组内表达量差异不显著，LPS和灭活嗜水气单胞菌均能刺激西伯利亚鲟脾脏原代细胞上调Abirp mRNA的表达。LPS、灭活嗜水气单胞菌刺激后48h，脾脏原代细胞Abirp mRNA表达量迅速升高，显著高于PBS对照组(P<0.05)。

实施例5注射重组AbIRP提高西伯利亚鲟清除嗜水气单胞菌的效果将重组AbIRP蛋白用生理盐水稀释至0.2mg/mL，即为重组AbIRP蛋白稀释液，试验同时也制备了重组西伯利亚鲟白细胞介素17D(rAbIL-17D)(氨基酸序列见GenBank:AQY56464.1)稀释液。将12尾西伯利亚鲟(体重约85g)随机分为3组，每组4尾鱼，一组为注射200μL生理盐水的对照组，一组为注射200μL重组AbIRP蛋白稀释液的实验组，一组为注射200μL重组AbIL-17D蛋白稀释液的实验组。

细菌悬液制备：LB培养基培养嗜水气单胞菌NX830(保藏于中国农业部水生动物病原库，保藏编号：BYK20130805))至OD600为0.6-0.8，离心(8000g，2min)，倾倒上清，将菌体用生理盐水悬浮，调至终浓度为5×10⁷CFU/mL。

攻毒感染：对试验组和对照组分别注射重组蛋白和生理盐水5h后，在试验组和对照组的鱼体腹腔注射200μL嗜水气单胞菌悬液。在注射24h后，麻醉鲟鱼，解剖，取出脾脏，称重，并根据重量加入不同量(1mL/100mg)的生理盐水，用无菌研磨棒研磨后，取50μL组织匀浆液均匀得涂在LB平板上，28℃培养16-24h，进行菌落计数，并进行统计分析。

结果如表1所示，在体重为85g的鲟鱼的注射试验中，虽然两个注射重组蛋白试验组的菌落数均值小于注射生理盐水对照组，但是只有注射重组AbIRP蛋白试验组鲟鱼脾脏的菌落数显著低于对照组(P＜0.05)；注射重组AbIRP蛋白使得脾脏感染的嗜水气单胞菌菌落数平均降低了78％，菌落数减少的程度最大。可见，注射重组AbIRP蛋白对鲟鱼感染病原菌具有显著的清除和抑制作用，并且比重组AbIL-17D抑制效果更好。

表1 85g鲟鱼的脾脏细菌感染菌落计数

实施例6注射重组AbIRP提高西伯利亚鲟清除类志贺邻单胞菌的效果

将重组AbIRP蛋白用生理盐水稀释至0.2mg/mL，即为重组AbIRP蛋白稀释液。将8尾西伯利亚鲟(体重约55g)随机分为4组，每组4尾鱼，一组为注射200μL生理盐水的对照组，一组为注射200μL重组AbIRP蛋白稀释液的实验组。

细菌悬液制备：LB培养基培养类志贺邻单胞菌(Plesiomonas Shigelloides,PS)HRS12816L(由北京市水产推广站徐立蒲研究员惠赠，分离自患病鲟鱼肝脏)至OD600为0.6-0.8，离心(8000g，2min)，倾倒上清，将菌体用生理盐水悬浮，调至终浓度为1×10⁶CFU/mL。

攻毒感染：对试验组和对照组分别注射重组蛋白和生理盐水5h后，在试验组和对照组的鱼体腹腔注射200μL类志贺邻单胞菌悬液。在注射24h后，麻醉鲟鱼，解剖，取出脾脏，称重，并根据重量加入不同量(1mL/100mg)的生理盐水，用无菌研磨棒研磨后，取50μL组织匀浆液均匀得涂在LB平板上，28℃培养16-24h，进行菌落计数，并进行统计分析。

结果如表2所示，在体重为55g的鲟鱼的注射试验中，注射重组AbIRP蛋白的试验组鲟鱼脾脏的菌落数显著低于对照组(P＜0.05)；注射重组AbIRP蛋白使得脾脏感染的类贺志邻单胞菌菌落数平均降低了72％。可见，注射重组AbIRP蛋白对鲟鱼感染类贺志邻单胞菌具有显著的清除和抑制作用。

表2 55g鲟鱼的脾脏细菌感染菌落计数

实施例7 rAbIRP作为免疫佐剂提高嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫西伯利亚鲟的效果

1.灭活疫苗和蛋白佐剂的制备

嗜水性单胞菌在LB培养基扩大培养，然后离心弃掉培养基，加入含有0.5％福尔马林的PBS，悬起菌体，于4℃灭活24h。取灭活好的菌液50μL，涂LB平板，28℃培养24h，无菌落出现，以验证灭活疫苗的安全性。将灭活菌液浓度调节至1×10⁹CFU/mL，每尾西伯利亚注射200μL，进行安全性验证。

2.免疫

随机选取西伯利亚鲟60尾，随机分成3组。分别是PBS对照组，灭活A.h组，rAbIRP+灭活A.h组。各组免疫剂量为200μL，重组蛋白剂量为20μg/尾，灭活A.h浓度为1×10⁹CFU/mL，注射200μL PBS作为对照。均为腹腔注射。

3.攻毒试验

将菌株NX830接种于TSA平板，于28℃培养24h。挑取单菌落，用无菌PBS溶解，浓度调节至5×10⁸CFU/mL(10×LD50)。在免疫后第28d从各组随机选取试验鱼16尾，用于攻毒试验，水温控制在25℃。

本试验在免疫后第28d进行攻毒试验，得到AbIRP的保护效果，具体数值如表3。结果：攻毒后，福尔马林灭活疫苗组和添加rAbIRP佐剂疫苗组对西伯利亚鲟均有保护力，相对保护率RPS(Relative percent survival，RPS＝1-试验组死亡率/对照组死亡率)分别为42.86％，和50％，并且重组AbIRP增强了灭活疫苗对鲟鱼的保护。

表3各试验组攻毒后死亡情况统计

实施例8 rAbIRP作为饲料添加剂提高杂交鲟抵抗嗜水气单胞菌的效果

为方便将免疫增强剂应用到鲟鱼养殖中，将含有重组质粒的表达菌株扩大培养并超声破碎，以0.5％的量添加到饲料中在杂交鲟(西伯利亚鲟♀×史氏鲟♂)上开展投喂试验，检验其免疫增强和抵抗病原菌的保护效果。

1.rAbIRP的诱导表达及饲料添加物的制备

将实验室保存的含有重组质粒pET-30a(+)-AbIRP的BL21(DE3)种子液接种至Kana-LB(50ng/mL)培养基扩大培养，37℃，180rmp，震荡培养4h，菌液开始产生浑浊时，加入诱导剂IPTG(200mg/mL)至终浓度为1.0mmol/L，180rmp，37℃条件继续培养5h；将诱导表达菌液在4℃，12000rmp条件下离心10min，留沉淀；加入菌液体积十分之一的Buffer PBS使菌体重悬。超声波破碎菌体；破碎后的菌液，4℃，12000rmp，离心10min；用Buffer PBS使沉淀重悬，Bradford法测定蛋白浓度，一部分用于SDS-PAGE电泳，检验AbIRP是否表达。结果见图8，rAbIRP均成功表达，可进行下一步投喂试验。

2.试验鱼及投喂试验

试验用杂交鲟(西伯利亚鲟♀×史氏鲟♂)，体重为(80.8±8.7)g，挑选规格统一的健康鲟鱼进行28d的投喂试验。一日投喂两次，日投喂量为1％。分三组，对照组投喂商品饲料，试验组投喂添加0.5％rAbIRP破碎菌液的饲料，添加对照组添加0.5％含pET-30a(+)质粒的破碎菌液的饲料。

3.生长指标

经过28d的投喂，添加0.5％rAbIRP增重较大，但无显著性差异(P＞0.05)。

表4各试验组杂交鲟生长和存活情况

4.攻毒试验

将菌株NX830接种于TSA平板，于28℃培养24h。挑取单菌落，用无菌PBS溶解，浓度调节至5×10⁸CFU/mL(10×LD50)。在免疫后第28d从各组随机选取试验杂交鲟16尾，通过腹腔注射200μL嗜水气单胞菌，统计得到各组的死亡情况。

结果见表5：攻毒后，两个饲料添加组对杂交鲟均有保护力，RPS为：pET30a-AbIRP添加组66.7％，添加对照组44.4％。

表5嗜水气单胞菌感染后杂交鲟死亡情况及相对保护率

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市水产科学研究所

<120> 一种提高鲟鱼抵抗病原菌能力的蛋白及其制备方法与应用

<130> KHP201116459.9

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1221

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacacaaagc gaatccacag agcgacagca ccggaacaaa cagagcacaa taccgccagc 60

aaagcaaagc gaagcgacgc agctgcactg caatatactt cataacgaca cacagcgcca 120

catcaggaaa cgctgacgta tcggtgatct gttgagaaac aaaacccccc tccttgatat 180

ttgccgtaca ctttggagca cgtgatggaa gggtgaagaa agcatcaatc cgcttcatgc 240

atttcctccc tttgagagaa ttcagcgcgt ggatcgtaat gttctcttgc cccgcccctc 300

aggtcacggg gtcctggact cggtcagcta tcgggaatcg ggccagctga tacggggaca 360

ctatgccgtg ccccactcga tctgcgacgt gtataacaag tactgggtgc tgaaagggct 420

ggaccggtac cgcccagagc tgtcagccat gatgctgcag cctctcgaca tctcacagca 480

agtgactccc ctcatctcca cctacatacc gcagagcaac cccagatcgg ggcagctcat 540

ggttctgggc atcaagggca gtaattactt cctgtcctgc agcggcccgc ccaactcacc 600

cgtcctgaac ctggagacag tagtggagcc ggctaagagt ttgaagacga tcagcaggag 660

cagcgacacg gcccggttcc tgttttacaa gcgagacagc aacataacct ccgctttcga 720

gtcgtttctg ttccccggct ggtttatcag caaccacaga cataaggaca tttcaacagc 780

ggccatgtgt aacggaagaa aggacccaag acgcgtcacc gagttcaatc tctcacgcat 840

aaggagatct gtgatgaact cagacgcccc ccctgtttag attgtgctcc tagatctcct 900

gctccgcccc tcctgctccg cactggactc tcctgacctc agcaccacgt tactggatcc 960

tcagctgatg cgctatcctt gcactattgc actgctaaca tgtcactgta gataaaactt 1020

gctgtgatcc taactggctg catcctagtt catattgtat tctagtagta ttattattat 1080

tatctgcact gactgtaaac tacactgtgt ttaaatatga agcttgcatt gtaaccctgt 1140

gctgccctgg aacacctgtg agtcgcctgg gataaagacg tctgcctgat aaataaagaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1221

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Leu Gln Pro Leu Asp Ile Ser Gln Gln Val Thr Pro Leu Ile

1 5 10 15

Ser Thr Tyr Ile Pro Gln Ser Asn Pro Arg Ser Gly Gln Leu Met Val

20 25 30

Leu Gly Ile Lys Gly Ser Asn Tyr Phe Leu Ser Cys Ser Gly Pro Pro

35 40 45

Asn Ser Pro Val Leu Asn Leu Glu Thr Val Val Glu Pro Ala Lys Ser

50 55 60

Leu Lys Thr Ile Ser Arg Ser Ser Asp Thr Ala Arg Phe Leu Phe Tyr

65 70 75 80

Lys Arg Asp Ser Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Phe Leu Phe Pro

85 90 95

Gly Trp Phe Ile Ser Asn His Arg His Lys Asp Ile Ser Thr Ala Ala

100 105 110

Met Cys Asn Gly Arg Lys Asp Pro Arg Arg Val Thr Glu Phe Asn Leu

115 120 125

Ser Arg Ile Arg Arg Ser Val Met Asn Ser Asp Ala Pro Pro Val

130 135 140

<210> 3

<211> 187

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp

20 25 30

Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Leu Gln

35 40 45

Pro Leu Asp Ile Ser Gln Gln Val Thr Pro Leu Ile Ser Thr Tyr Ile

50 55 60

Pro Gln Ser Asn Pro Arg Ser Gly Gln Leu Met Val Leu Gly Ile Lys

65 70 75 80

Gly Ser Asn Tyr Phe Leu Ser Cys Ser Gly Pro Pro Asn Ser Pro Val

85 90 95

Leu Asn Leu Glu Thr Val Val Glu Pro Ala Lys Ser Leu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Arg Ser Ser Asp Thr Ala Arg Phe Leu Phe Tyr Lys Arg Asp Ser

115 120 125

Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Phe Leu Phe Pro Gly Trp Phe Ile

130 135 140

Ser Asn His Arg His Lys Asp Ile Ser Thr Ala Ala Met Cys Asn Gly

145 150 155 160

Arg Lys Asp Pro Arg Arg Val Thr Glu Phe Asn Leu Ser Arg Ile Arg

165 170 175

Arg Ser Val Met Asn Ser Asp Ala Pro Pro Val

180 185

<210> 4

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgatgctgc agcctctcga catctcacag caagtgactc ccctcatctc cacctacata 60

ccgcagagca accccagatc ggggcagctc atggttctgg gcatcaaggg cagtaattac 120

ttcctgtcct gcagcggccc gcccaactca cccgtcctga acctggagac agtagtggag 180

ccggctaaga gtttgaagac gatcagcagg agcagcgaca cggcccggtt cctgttttac 240

aagcgagaca gcaacataac ctccgctttc gagtcgtttc tgttccccgg ctggtttatc 300

agcaaccaca gacataagga catttcaaca gcggccatgt gtaacggaag aaaggaccca 360

agacgcgtca ccgagttcaa tctctcacgc ataaggagat ctgtgatgaa ctcagacgcc 420

ccccctgttt ag 432

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccatggctc tgcagcctct cgacatc 27

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaagcttct aaacaggggg ggc 23

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgctgcagg acaggaagta attac 25

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtaggtgga gatgagggga gtcact 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taacggaaga aaggacccaa gacgcg 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ataaggagat ctgtgatgaa ctcaga 26

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taatacgact cactataggg 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcccaactca cccgtcct 18

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggttatgttg ctgtctcgct tgt 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgccctatca actttcgatg g 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctgccttcct tggatgtggt 20

Claims

1.一种鲟鱼蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述鲟鱼蛋白的编码基因，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述鲟鱼蛋白的编码基因，其特征在于，其ORF序列如SEQ ID NO.4所示。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为质粒、载体、宿主菌或转化细胞。

5.一种重组鲟鱼蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以西伯利亚鲟脾脏cDNA为模板，设计分别带有NcoI和HindIII酶切位点的引物对进行PCR扩增，扩增目的基因片段；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；

（2）将原核表达载体与目的基因片段进行重组，构建重组质粒：将目的基因序列替换pET30a(+)载体的NcoI和HindIII酶切位点间的DNA分子，得到的重组质粒；

（3）将重组质粒导入表达菌株中，利用诱导剂诱导重组质粒在表达菌株中表达。

6.权利要求5所述制备方法制得的重组蛋白。

7.权利要求1所述的鲟鱼蛋白、或权利要求2-3任一所述的编码基因，或权利要求4所述的生物材料，或权利要求6所述的重组蛋白的以下任一所述的用途：

（1）在制备提高鱼类免疫功能药物中的应用；

（2）在制备体内和/或体外抑制鱼类病原菌制剂中的应用，所述鱼类病原菌为嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌；

（3）在制备免疫佐剂中的应用；

（4）在制备饲料添加剂中的应用。

8.一种产品，其特征在于，含有权利要求1所述的鲟鱼蛋白、或权利要求2-3任一所述的编码基因，或权利要求4所述的生物材料，或权利要求6所述的重组蛋白；所述产品为药物、佐剂、饲料添加剂。