CN111138518B

CN111138518B - 细菌转位子组分蛋白及其截短体的表达和应用

Info

Publication number: CN111138518B
Application number: CN201911394862.6A
Authority: CN
Inventors: 董汉松; 陈蕾; 邹珅珅; 马井玉; 王浩; 王付彬; 刘书义; 张丽媛
Original assignee: JINING CITY ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES; Shandong Agricultural University
Current assignee: JINING CITY ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES; Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111138518A

Abstract

本发明公开了一种细菌转位子组分蛋白及其截短体的表达和应用。本发明所获得的HrpF_Xoo和HrpF_536‑802两种蛋白产品，可以显著提高番茄、花生、小麦等作物的生长以及提高其产量，对于生物源增产药剂的开发具有应用价值；特别是，本发明利用hrpF的截短体序列的重组质粒pET30a(+)::hrpF’_Xoo，显著地提高了其在大肠杆菌中的表达量和表达效率，明显地节约了成本。

Description

细菌转位子组分蛋白及其截短体的表达和应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学与植物遗传工程技术领域，具体涉及一种细菌转位子组分蛋白及其截短体的表达和应用。

背景技术

水稻是人类的主要粮食产物，世界上近一半人口，都以大米为主食。而由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病(Bacterial blight,BB)是水稻上发病比较严重的细菌病害，对水稻的危害仅次于稻瘟病。

水稻白叶枯病的病原物是水稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)，属于革兰氏阴性细菌，通过由hrp(hypersensitive response andpathogenicity)基因簇编码(Knoop et a1.,1991)的III型分泌(type III secretion,T3S)系统分泌致病相关蛋白质，包括致病效应子(effector)和辅助蛋白质(accessoryprotein)。

植物病原细菌T3S系统的辅助蛋白质大都高度保守，分别形成结构类似的针状物(needle)和纤毛(pilus)通道。通道末端，T3转位子蛋白质(translocator)通过复杂的分子互作嵌入寄主细胞膜(plasma membrane，PM)，构成转位子(translocon)，帮助效应子转位(translocation)，从细菌细胞转入寄主细胞。

部分转位子蛋白可以作为致病因子调控病原细菌与植物寄主抗感性互作的一类广谱蛋白激发子，由革兰氏阴性病原菌III型分泌系统分泌。许多研究证明，转位子蛋白可能经由细菌III型分泌系统分泌到植物细胞的质外体，而不是像III型分泌系统分泌的效应蛋白一样被转运到植物细胞胞质内。一些研究发现转位子蛋白能够与其他组分协作在寄主细胞膜上形成III型分泌系统注射孔洞，介导后续毒性或无毒效应蛋白向寄主胞内转运；这在一定程度上解释了转位子蛋白作为致病因子调控病原菌致病性的机理。

Translocon通常包括两种疏水性的转位子蛋白(the hydrophobictranslocators)以及一种亲水性转位子蛋白(the hydrophilic translocators)。动物病原菌III型分泌系统疏水性转位子蛋白主要分为两类，一类是主要疏水性转位子蛋白(major hydrophobic translocators)，例如分别来自于Yersinia、PseudomonasAeruginosa、Shigella、Salmonella以及Pathogenic Escherichia coli菌株中的YopB、PopB、IpaB、SipB和EspD；另一类是次要疏水性转位子蛋白(minor hydrophobictranslocators)，例如分别来自于上述菌株中的YopD、PopD、IpaC、SipC和EspB。

分析预测主要疏水性转位子蛋白(major hydrophobic translocators)的结构发现，它们大多含有两个跨膜的α-螺旋结构域(Transmembrane Helices，TMs)，同时在N和C末端分别含有一个普通的α-螺旋区域(α-helix)。而在TM结构区域序列同源性较高，推测该区域在寄主细胞膜孔洞形成以及效应因子转运过程可能发挥重要作用。相对于主要疏水性转位子蛋白，近些年来对次要疏水性转位子蛋白(minor hydrophobic translocators)的研究更加深入，该类蛋白往往只含有一个跨膜TM结构域。

在植物病原细菌中，最先被鉴定的疏水性转位子蛋白是(Xathomonas campestrispv.vesicatoria，Xcv)菌属的HrpF，由位于hrp基因簇右端的hrpF基因编码。蛋白结构分析预测HrpF存在两个疏水性结构域；蛋白亚细胞定位实验发现，HrpF蛋白兼具可溶性以及与细胞膜共定位的特点，因此推测HrpF蛋白可能部分嵌入到磷脂双分子层中，同时又可以调控一些效应蛋白AvrB、Avrpto、AvrXa10以及PthXo1转运到植物胞内发挥病理作用，因此推测HrpF可能作为T3S转位装置的关键蛋白锚定在植物细胞膜上，调控后续相关致病因子进入寄主细胞，引起病原–寄主植物的抗感性互作。在体外人工磷脂双分子层结合实验中，HrpF蛋白也可以与人工膜特异性的结合形成孔洞，从而造成膜内外电势发生变化。

根据寄主-病菌互作亲和性与非亲和性的分化，进入寄主细胞的效应子行使截然不同的功能，或作为毒性因子而引起病害，或作为免疫反应激活子，诱导寄主抗病性，即效应子激发的免疫反应(effector-triggered immunity,ETI)。HrpF作为一种参与寄主和病菌亲和互作的蛋白质，在致病菌中表达时，可以促进病菌侵染寄主，但是如果仅仅是HrpF与寄主结合，而没有后续的病菌来行使致病过程的话，此时的HrpF就可能起到激发寄主免疫反应的作用。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种含有疏水性结构的转位子蛋白HrpF_Xoo及其截短体蛋白HrpF_536-802，以及上述蛋白的高效表达方法和在促进植物生长、增加作物产量中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种截短体蛋白HrpF_536-802，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。该截短体蛋白HrpF_536-802与野生型转位子蛋白HrpF_Xoo相比，N端截短了535个氨基酸，所述野生型转位子蛋白HrpF_Xoo的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的截短体蛋白HrpF_536-802与野生型转位子蛋白HrpF_Xoo相比，具有更高的表达量和表达效率，在促进作物生长、抗病或者增产等方面具有更优的效果。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码上述截短体蛋白HrpF_536-802。

优选的，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.3所示。

包含上述多核苷酸的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供一种表达上述截短体蛋白HrpF_536-802的方法，包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.3所示的多核苷酸连接到表达载体上，得到重组质粒；然后将重组质粒转入大肠杆菌，得到阳性重组菌株；

(2)将阳性重组菌株在LB液体培养基中振荡培养过夜，然后转接到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h；然后加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃诱导培养2-3h；将诱导培养后的菌液离心，收集菌体，洗涤，重悬于磷酸缓冲液中，得到菌体悬浮液；向菌体悬浮液中加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶和终浓度为0.1mM的蛋白酶抑制剂，超声波破碎，离心取上清，即为粗提蛋白；对粗提蛋白进行纯化，即得。

优选的，步骤(1)中，所述表达载体为pET30a(+)。

优选的，步骤(2)中，所述蛋白酶抑制剂为PMSF。

优选的，步骤(2)中，采用Ni-NTA Agarose对粗提蛋白进行纯化。

本发明的第四方面，提供如下1)-3)中任一所述的蛋白在促进植物生长、增加作物产量和/或提高作物抗病性中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2)氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的蛋白；

3)在SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

本发明的第五方面，提供如下a)-d)中任一项所述的DNA片段在促进植物生长、增加作物产量和/或提高作物抗病性中的应用；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)除a)以外编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

d)除c)以外编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段。

本发明的第六方面，提供携带上述DNA片段的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在促进植物生长、增加作物产量和/或提高作物抗病性中的应用。

本发明的第七方面，提供一种促进植物生长、增加作物产量和/或提高作物抗病性的方法，包括以下步骤：

将SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白配制成浓度为30-50μg/ml的蛋白溶液，在播种之前采用所述蛋白溶液对植物种子进行浸种处理；

或者，将SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白配制成浓度为30-50μg/ml的蛋白溶液，在作物生长期采用所述蛋白溶液进行喷雾处理。

优选的，所述植物为番茄、花生或小麦。

本发明的第八方面，提供一种促进植物生长、抗病或增加作物产量的生物制剂，所述生物制剂以SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白为有效成分。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用pET30a(+)融合表达HrpF-6xHis蛋白，显著提高其在大肠杆菌中的表达量。并通过Ni-NTA Agarose(QIAGEN公司购买)对目的蛋白进行纯化，纯蛋白浓度约为1mg/ml。

(2)本发明通过蛋白序列分析，构建了获得了和全长HrpF_Xoo拥有在生长、抗病或者增产等方面相同或者更高效率的截短体蛋白HrpF_536-802的方法。

(3)本发明利用hrpF的截短体序列的重组质粒pET30a(+)::hrpF’_Xoo，显著地提高了其在大肠杆菌中的表达量和表达效率，明显地节约了成本。

(4)本发明所获得的HrpF_Xoo和截短体蛋白HrpF_536-802两种蛋白产品，可以显著提高番茄、花生、小麦等作物的生长、抗病或增产，对于生物源增产药剂的开发具有应用价值。

附图说明

图1.重组质粒pET30a(+)::hrpF_Xoo和pET30a(+)::hrpF’_Xoo的构建：(A)hrpF_Xoo和hrpF’_Xoo基因的PCR扩增，其中hrpF’_Xoo是截短体蛋白HrpF_536-802所对应的基因序列，M为DNAmarker DL5000；(B)重组质粒pET30a(+)::hrpF_Xoo和pET30a(+)::hrpF’_Xoo的质粒构成图谱。其质粒骨架为pET30a(+)，图中未标明；T7 promoter为T7启动子，T7 terminator为T7终止子；其中，hrpF_Xoo基因被分成两段，分别以不同深浅的灰色示意，深色部分为hrpF’_Xoo。

图2.HrpF_Xoo蛋白性质分析。(A)HrpF_Xoo亲疏水性分析。得分(score)小于0的部分意味着亲水可能性较大，大于0的部分，疏水可能性较大；横坐标的position为蛋白序列的位置；图中两个矩形所在位置为预测的两个疏水结构域。(B)HrpF_Xoo中疏水性的跨膜α螺旋结构域预测。其中SPOCTOPUS服务器预测含有一个跨膜α螺旋结构域，位于蛋白质的第一个疏水结构域位置。(C)使用SMART服务器预测的HrpF_Xoo功能域图。数字显示各个功能域的起始和终止位置。

图3.HrpF_Xoo和HrpF_536-802的表达及纯化。Crude HrpF_Xoo和HrpF_536-802为Ni-NTAAgarose纯化前的粗蛋白样，purified HrpF_Xoo和HrpF_536-802为Ni-NTA Agarose纯化后蛋白样。

图4.HrpF_Xoo和HrpF_536-802对花生和小麦的促生长作用。使用分别处理(A)番茄和(B)花生，CK为空白对照；(B)图中三条等长的白色线段为标尺，用以显示不同处理中花生株高的差异。(C)为(B)图中花生株高的统计结果，“*”表示与对照相比呈显著差异，“**”表示与“*”相比呈显著差异，p<0.05。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

根据本发明，术语“截短体蛋白HrpF_536-802”是指在野生型转位子蛋白HrpF_Xoo的N端去掉535个氨基酸。其中，野生型转位子蛋白HrpF_Xoo的具体氨基酸序列可以从公共数据库(例如GenBank数据库)中获得，例如GenBank中的Sequence ID：AAW73320.1。或者，以水稻白叶枯病菌水稻黄单胞稻黄单胞杆菌致病变种的基因组DNA为模板，经克隆得到hrpF_Xoo基因，由hrpF_Xoo基因编码得到HrpF_Xoo的氨基酸序列。

正如背景技术部分所介绍的，HrpF作为一种参与寄主和病菌亲和互作的蛋白质，具有一定的应用前景。但是，HrpF蛋白的体外表达量低，纯化复杂，纯化所得的蛋白构想不均一，存在多聚体。因此，如何在体外高效的表达目的蛋白，并同时保持HrpF蛋白的天然构象，成为研究者们的研究重点。

对野生型蛋白的N端或C端进行截短获得截短型突变体，是研究方向之一，但是，不同方法获得的截短型突变体的表达水平是无法预测的，在截短体中即使出现1个或几个氨基酸的差异，均可显著影响其表达水平；另一方面，所获得的截短型突变体的性能也难以进行预测。因此，如何使所获得的截短型突变体与野生型蛋白具有等效或者更高效的作用，同时获得比野生型蛋白更高的表达效率，是目前研究的难点所在。

为获得高效、高表达的截短体蛋白HrpF，本发明使用ProtScale对HrpF蛋白质及其功能域的亲水性进行分析预测，分析此蛋白的重要疏水性结构域；使用SMART和Phyre2服务器对蛋白二级结构和NoIX功能域进行预测，分析各个二级结构和功能域可能对有效功能产生的影响；综合上述的结果做进一步分析，得到若干截短体蛋白HrpF，再对其表达效率和功效进行验证，最终得到了截短体蛋白HrpF_536-802，该截短体可与完整的HrpF等效或更高效地用于作物的增产，同时获得比完整HrpF更高的表达率。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：水稻白叶枯病菌水稻黄单胞稻黄单胞杆菌致病变种基因组的获取

水稻白叶枯病菌水稻黄单胞稻黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)A1菌株采集于江苏省南京市。28℃条件下于NB固体培养基(10g/L蛋白胨，3g/L牛肉浸膏，5g/L氯化钠，2g/L琼脂粉)上培养，待菌株生长到对数期，通过细菌基因组提取试剂盒Bacteria Genomic DNA Kit(康为世纪公司购买)按照试剂盒中提供的方法提取A1菌株基因组DNA。

实施例2：水稻白叶枯病菌A1菌株hrpF_Xoo基因的克隆与测序

水稻白叶枯病菌A1菌株首先在NB固体培养基上活化，将选取的单克隆菌落，于28℃条件下在NB液体培养基(10g/L蛋白胨，3g/L牛肉浸膏，5g/L氯化钠)中震荡培养24h，收集菌体，用于提取基因组DNA。根据Genbank中登录号为AB045312.1的hrpF_Xoo序列，设计蛋白质编码区(CDS)引物，在5'端分别引入Nde I和Hind III酶切位点；

hrpF_Xoo-P1：5'-GGAATTCCATATGATGTCGCTCAACATGCTTTCTAC；(SEQ ID NO.5)

hrpF_Xoo-P2：5'-CCCAAGCTT TCTGCGACGTATCCTGACATTG。(SEQ ID NO.6)

以A1菌株的基因组DNA为模板，hrpF-P1和hrpF-P2为引物，进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，循环35次；72℃延伸10min。将PCR产物进行DNA凝胶电泳检测(图1A)，纯化本PCR产物，将纯化后的DNA片段与pMD18-T载体(TAKARA公司购买)连接，转化到大肠杆菌感受态DH5α中，经质粒PCR和酶切验证得到阳性转化子。提取阳性转化子中的重组质粒DNA，送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。对重组质粒pMD18-T::hrpF_Xoo序列测定结果显示，hrpFxoo基因大小为2409bp(SEQ IDNO.1所示)，编码802个氨基酸(SEQ ID NO.2所示)。

实施例3：HrpF_Xoo蛋白的等效或超效截短体和其克隆引物的设计

为提高HrpF_Xoo的生产和应用效率，本研究设计和克隆了HrpF_Xoo蛋白的等效或超效截短体，使用ProtScale对蛋白质的亲水性进行分析预测，发现HrpF_Xoo有较高的可能性是亲水性的蛋白质(图2A)。但是HrpF_Xoo还存在两个疏水性的结构域，位于该蛋白的C端(图2A)。而且这两个疏水性结构域中，有一个被SPOCTOPUS预测为跨膜螺旋(TM-helix)(图2B)。使用SMART服务器对hrpF的蛋白结构和功能域进行预测，结果表明hrpF_Xoo含有两个NoIX功能域，分布于蛋白的259-620位置(图2C)，这些功能域可能参与细菌和寄主的特异性识别，此外还有3个低复杂度区域，它们都位于蛋白质的碳端，分布于蛋白的661-802区域(图2C)。使用Phyre2服务器预测蛋白质二级结构，结果表明此蛋白含有大量的α螺旋，几近均匀地分布于整个蛋白质序列，第536位至542位是一段α螺旋，在此之前，此蛋白含有较多的无二级结构的乱序区，进一步分析显示，HrpF_Xoo的第536位至802位氨基酸组成的截短体蛋白既含有NoIX功能域的部分，又含有碳端重要的疏水性结构域，有较大潜力作为本研究中和HrpF_Xoo等效或者超效的蛋白。为克隆这段截短体，设计了其上游引物：

hrpF_Xoo-P1’：5'-GGAATTCCATATGCAGTTCTATGACCACATGAGTG(SEQ ID No.7)

实施例4：HrpF_Xoo蛋白和其截短体的表达及纯化

以测序正确的阳性重组质粒pMD18-T::hrpF_Xoo为模板，PCR扩增hrpF_Xoo和hrpF’_Xoo。扩增hrpF_Xoo时，以上述实施例2中的hrpF_Xoo-P1和hrpF_Xoo-P2为上下游引物。扩增hrpF’_Xoo时，下游引物保持hrpF_Xoo-P2不变，上游引物采用hrpF_Xoo-P1’。扩增程序保持和实施例2中的程序一致。扩增产物回收后经Nde I和Hind III双酶切后连接到表达载体pET30a(+)上，使得hrpF_xoo和hrpF’_Xoo分别与pET30a(+)上的多聚组氨酸标签6xHis-tag融合，进而得到重组质粒pET30a(+)::hrpF_xoo和pET30a(+)::hrpF’_xoo。将重组质粒和空载体pET30a(+)转入大肠杆菌BL21后，经质粒PCR和酶切鉴定出阳性重组菌株。

重组菌株BL21/pET30a(+)::hrpF_xoo和BL21/pET30a(+)::hrpF’_xoo在LB液体培养基(含km50)中37℃(200rpm/min)振荡培养过夜，次日按照1％的比例转接到含有50μg/ml卡那霉素的液体LB中，37℃振荡培养约2-3h，至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃振荡培养2-3h。取诱导的菌液离心收集菌体，用PBS(磷酸缓冲液)洗三次，重悬于1/20原菌体培养体积的磷酸缓冲液中，向菌体悬浮液中加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶，终浓度为0.1mM的蛋白酶抑制剂PMSF。设置超声波破碎程序，功率设为300瓦，开4秒，关8秒，超声波破碎15分钟。经超声波破碎后离心取上清即为粗提蛋白，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况(图3)。

使用Ni-NTA Agarose(QIAGEN公司购买)对标签蛋白进行纯化，具体操作参见操作说明书进行，纯化时使用蠕动泵上样，使用300mM咪唑洗脱蛋白，洗脱后的蛋白进行SDS-PAGE检测纯化效果，HrpF_Xoo蛋白大小为86kDa，HrpF_536-802蛋白大小为28kDa(图3)。另外，相较于粗提蛋白，提纯后蛋白较为单一。并且，HrpF_536-802比hrpF_Xoo表达效率更高，纯化后也更单一(图3)。纯化的样品经超滤柱超滤、浓缩，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，纯蛋白于-70℃保存。以上获得的纯化hrpF_Xoo和HrpF_536-802可以在促进植物生长或诱导植物抗病方面得到应用，适合作为生物药剂应用于作物。

实施例5：HrpF_Xoo和HrpF_536-802蛋白质的应用举例

1.HrpF_Xoo和HrpF_536-802促进番茄生长、产量增加

将纯化的hrpF_Xoo和HrpF_536-802稀释后浸泡番茄种子，同时以清水为对照。12小时后吸出蛋白液，加入终浓度0.02％的NaClO表面消毒5min，灭菌水清洗三次后倒置于灭菌的滤纸上，待种子吸干水后用灭菌牙签点入含营养土中，置于光照培养箱中培养，每个处理设置3个重复。14天后观察番茄发苗和生长情况，经过3次独立生物学重复得出30-50μg/ml的hrpF_Xoo和HrpF_536-802对番茄有明显的促生作用(图4A)，50μg/ml的hrpF_Xoo与清水对照组存在显著性差异。

除了种子浸泡处理外，本发明还对苗期、初花期和出果期番茄进行喷雾处理，以验证HrpF_Xoo和HrpF_536-802对植株抗病性的影响。在大田中设计试验小区，小区面积15平方米(3米×5米)，每个小区种植3垄番茄。每3个小区为一次技术重复，它们分别为HrpF_Xoo、HrpF_536-802和对照(CK)处理的番茄，共设三个技术重复，四周设保护行。在此基础上，共设计了三次生物学重复。使用新加坡利农HD400型背负式喷雾器，喷头口径为2毫米，工作压力为200千帕斯卡。在番茄苗期进行全株均匀喷雾处理。试验蛋白工作浓度设为50μg/ml，试验各个处理每公顷兑水450升，即每公顷蛋白施用量为22.5g，每1升蛋白溶液再加入200μl表面活性剂Efficiency Aid(购自东莞市瑞德丰生物科技有限公司)，均匀喷雾。在番茄盛果期调查番茄发病情况。统计结果如表1所示。结果表明通过喷施HrpF_Xoo和HrpF_536-802，番茄对自然界中的病害产生了明显的抗性。

表1：HrpF_Xoo和HrpF_536-802处理对番茄发病情况的影响

处理	发病率	病情指数	防治效果
				CK	50.00％	34.67	0.00
HrpF<sub>Xoo</sub>	31.33％	18.22	47.44
				HrpF<sub>536-802</sub>	30.67％	17.11	50.64

2.HrpF_Xoo和HrpF_536-802促进花生生长

除了处理茄科作物，本研究还优选了豆科植物花生，进行苗期喷雾处理，以验证HrpF_Xoo和HrpF_536-802对植株进行表面处理所产生的影响。在大田中设计试验小区，小区面积9平方米(3米×3米)，每个小区种植3垄花生。每3个小区为一次技术重复，它们分别为HrpF_Xoo处理的花生、HrpF_536-802处理的花生和对照(CK)处理的花生，共设三个技术重复，四周设保护行。在此基础上，共设计了三次生物学重复。

使用新加坡利农HD400型背负式喷雾器，喷头口径为2毫米，工作压力为200千帕斯卡。在花生苗期进行全株均匀喷雾处理。试验蛋白工作浓度设为50μg/ml，试验各个处理每公顷兑水450升，即每公顷蛋白施用量为22.5g，每1升蛋白溶液再加入200μl表面活性剂Efficiency Aid(购自东莞市瑞德丰生物科技有限公司)，均匀喷雾。喷施HrpF_Xoo和HrpF_536-802两周后的花生在株高上发生了明显的提高(图4B)。统计花生株高，结果表明HrpF_Xoo和HrpF_536-802的喷施对花生株高产生了积极影响，更重要的是，HrpF_536-802相比HrpF_Xoo对株高的影响更为明显(图4C)。

2.HrpF_Xoo和HrpF_536-802提高小麦产量

基于对于植物的促生长作用，本研究还通过喷雾的方式，对大田小麦实施了HrpF_Xoo和HrpF_536-802的处理。试验中，小区面积为32平方米(长20米，宽1.6米)，每个小区种植6垄小麦。每3个小区为一次技术重复，它们分别为HrpF_Xoo处理的小麦、HrpF_536-802处理的小麦和对照(CK)处理的小麦，共设三个技术重复，四周设保护行。在此基础上，共设计了三次生物学重复。

使用新加坡利农HD400型背负式喷雾器，喷头口径为2毫米，工作压力为200千帕斯卡。在小麦杨花初期，对全株进行均匀喷雾处理。试验蛋白工作浓度设为50μg/ml，试验各个处理每公顷兑水450升，即每公顷蛋白施用量为22.5g，每1升蛋白溶液再加入200μl表面活性剂Efficiency Aid，均匀喷雾。待麦穗成熟后，收获后统计产量产量相关数据。统计结果如表2所示。

表2：HrpF_Xoo和HrpF_536-802处理对小麦产量的影响

结果显示，使用HrpF_Xoo和HrpF_536-802处理的小麦亩产量分别为706.7kg和718.8kg，而对照组则为626.7kg。和对照组相比，HrpF_Xoo和HrpF_536-802的处理使得小麦在产量上出现了极显著的提高。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学；济宁市农业科学研究院

<120> 细菌转位子组分蛋白及其截短体的表达和应用

<130> 2019

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2409

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcgctca acatgctttc taccgggagc aaccccagcc aactgctggg cacctcttcc 60

aacgaatcgt cttcatcgga actgttcggg tcggattcgt ccaacgatgg ctccgacctg 120

ccatcgacga tggataccat ctttcagcaa atctacctat tgctggcggc ccttcaggcc 180

aacacgcaaa ccagtgcatc cggtgatacg ccggccaata cggcaagcgg cgatgctgac 240

acacagatgt ccgcatcgga ctggcaggcc acccagccga tcgaaaagcg cacctcctgg 300

ccatccctgg gctacgactt cgatcccaag aacatcaagg ggaaggatgc gccgccggcg 360

ctggaggggt cgacggttac ctggaacgat ggcacgctga ccaagtctga gcttcagatc 420

gtttcgacgc tgaatgcaca caaggatcag atgccgatcg agtacaagaa tctcgacgac 480

aagatcaacg acccttccac gccccccgac ctgaaggctg cattgcaggg cctgaaacag 540

gacccgcgat tgttctttgc gatcggttct cagggagacg gcaagtgcgg cggcaaggtc 600

agcgcgcagg atctgtggga tttctctgat tcacatccgc aggtcaagga cctgggcgga 660

aagaacgacg agttcaatcc caaggacatc aaggggtcca acccgccaca ggcggcggag 720

ggctcgacgg ttacctggaa cgacggccag ctcaatcaat ccgaactgga gattgtttcg 780

gttctggatc ggcacaagga ccaggtcgac tcgctgtcct tcgatcagct ggatgccaag 840

atcaacgacc cgtccacgca gcctgacttg aagaaagcgc tgaaaggatt gcagaaggat 900

ccgcggttgt tcttcgccat cggctcgcag aaggacggca agtgcggcgg caagatcaag 960

gcgcaggacc tcacagactt ctcgtactac catccgcaga ttgccgaata caacgacaag 1020

aaggcaaaga gctacacgca gaactacatc gcatccgata gccccgacaa aaccaaggcg 1080

tcggtcatga ccaaaagcga tgccctgcgc gagatgtatc gctattccga ctatctgccc 1140

ggcaacctga gtgaggacga attcgccaag atcgtcgatg gcgacagcaa gaccggcaag 1200

tgcccaccgc agttgatcgc ggctgctcaa tattttcgcg atcatccgga cgagtggaag 1260

gaattttcag gagacgccgg cacgatgagc acgccggact tcctgcagaa gtccacctcc 1320

gagatgcacc tgactgcgga cgagcagaag acgctggaca ccatcaacag tcatcaggac 1380

gcgttctacg gcgacggcaa ggaactcacg cgcgacaagc tcgacgcgat ctccaaggac 1440

aacaaggccg acccggcggt caaagaggcc gcaacacagt tggcgtccga tccgctgctg 1500

ttcggcttgt tgaacaactc gatcaccggc tacaagaaac cccatcactt cttcggcggc 1560

ggccatgtcg tcgattcggg caagatcagc cagaacgatt tccggcagtt ctatgaccac 1620

atgagtgcag ccaacaagac cgtgaacacg ccggccacgc acgaggcgag ctcgcccgat 1680

cagcaaaagg ccgtcgcgga catgctgatg ggcaaggacg atccgccggc gatcaagaag 1740

cccaaaaagg atgtcggcac gttccaacag ggcctgcatg agttcctcaa gtgggacagt 1800

aagatcctgg actggatgtc ggtcgggctc agcgcattga acggaattcc cgtgatcggc 1860

gagattgccg atgcggcggc gattgcattg gagagcgagg cgcaggcggc gcaggtggtc 1920

gacactgcga ttcaaggtgg cgacatgtcg cttgccttga agctggccgg catcaacatg 1980

gccggggcag tggttggagc agtcggtgga cccacggcca gaatcggggc caagggcgcc 2040

gccaagggcg tcgccgaagt cgcggccaag gaagccgccg agggcgcggc caaaggaact 2100

gcaaagggat ctgccaaagg cgcaggtaaa accgcggccg aacggcccag cgccgctgcg 2160

ttcgcaaaag gctacgtggc cggcagcacc atcagtaaat cgactgaaat tctcaagaag 2220

cccgtcatgg cgggcttgca ctacgaagaa tatcagctgg acaagcagaa ggacggagag 2280

atccaccaga agctggacaa cgccggcggc gccccggtgg gtaagcagat tatccccaca 2340

ggcatcgccg acaacttcga gggagacgtg cggcagaatc tgcgcaatgt caggatacgt 2400

cgcagataa 2409

<210> 2

<211> 802

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Leu Asn Met Leu Ser Thr Gly Ser Asn Pro Ser Gln Leu Leu

1 5 10 15

Gly Thr Ser Ser Asn Glu Ser Ser Ser Ser Glu Leu Phe Gly Ser Asp

20 25 30

Ser Ser Asn Asp Gly Ser Asp Leu Pro Ser Thr Met Asp Thr Ile Phe

35 40 45

Gln Gln Ile Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Leu Gln Ala Asn Thr Gln Thr

50 55 60

Ser Ala Ser Gly Asp Thr Pro Ala Asn Thr Ala Ser Gly Asp Ala Asp

65 70 75 80

Thr Gln Met Ser Ala Ser Asp Trp Gln Ala Thr Gln Pro Ile Glu Lys

85 90 95

Arg Thr Ser Trp Pro Ser Leu Gly Tyr Asp Phe Asp Pro Lys Asn Ile

100 105 110

Lys Gly Lys Asp Ala Pro Pro Ala Leu Glu Gly Ser Thr Val Thr Trp

115 120 125

Asn Asp Gly Thr Leu Thr Lys Ser Glu Leu Gln Ile Val Ser Thr Leu

130 135 140

Asn Ala His Lys Asp Gln Met Pro Ile Glu Tyr Lys Asn Leu Asp Asp

145 150 155 160

Lys Ile Asn Asp Pro Ser Thr Pro Pro Asp Leu Lys Ala Ala Leu Gln

165 170 175

Gly Leu Lys Gln Asp Pro Arg Leu Phe Phe Ala Ile Gly Ser Gln Gly

180 185 190

Asp Gly Lys Cys Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Asp Leu Trp Asp Phe

195 200 205

Ser Asp Ser His Pro Gln Val Lys Asp Leu Gly Gly Lys Asn Asp Glu

210 215 220

Phe Asn Pro Lys Asp Ile Lys Gly Ser Asn Pro Pro Gln Ala Ala Glu

225 230 235 240

Gly Ser Thr Val Thr Trp Asn Asp Gly Gln Leu Asn Gln Ser Glu Leu

245 250 255

Glu Ile Val Ser Val Leu Asp Arg His Lys Asp Gln Val Asp Ser Leu

260 265 270

Ser Phe Asp Gln Leu Asp Ala Lys Ile Asn Asp Pro Ser Thr Gln Pro

275 280 285

Asp Leu Lys Lys Ala Leu Lys Gly Leu Gln Lys Asp Pro Arg Leu Phe

290 295 300

Phe Ala Ile Gly Ser Gln Lys Asp Gly Lys Cys Gly Gly Lys Ile Lys

305 310 315 320

Ala Gln Asp Leu Thr Asp Phe Ser Tyr Tyr His Pro Gln Ile Ala Glu

325 330 335

Tyr Asn Asp Lys Lys Ala Lys Ser Tyr Thr Gln Asn Tyr Ile Ala Ser

340 345 350

Asp Ser Pro Asp Lys Thr Lys Ala Ser Val Met Thr Lys Ser Asp Ala

355 360 365

Leu Arg Glu Met Tyr Arg Tyr Ser Asp Tyr Leu Pro Gly Asn Leu Ser

370 375 380

Glu Asp Glu Phe Ala Lys Ile Val Asp Gly Asp Ser Lys Thr Gly Lys

385 390 395 400

Cys Pro Pro Gln Leu Ile Ala Ala Ala Gln Tyr Phe Arg Asp His Pro

405 410 415

Asp Glu Trp Lys Glu Phe Ser Gly Asp Ala Gly Thr Met Ser Thr Pro

420 425 430

Asp Phe Leu Gln Lys Ser Thr Ser Glu Met His Leu Thr Ala Asp Glu

435 440 445

Gln Lys Thr Leu Asp Thr Ile Asn Ser His Gln Asp Ala Phe Tyr Gly

450 455 460

Asp Gly Lys Glu Leu Thr Arg Asp Lys Leu Asp Ala Ile Ser Lys Asp

465 470 475 480

Asn Lys Ala Asp Pro Ala Val Lys Glu Ala Ala Thr Gln Leu Ala Ser

485 490 495

Asp Pro Leu Leu Phe Gly Leu Leu Asn Asn Ser Ile Thr Gly Tyr Lys

500 505 510

Lys Pro His His Phe Phe Gly Gly Gly His Val Val Asp Ser Gly Lys

515 520 525

Ile Ser Gln Asn Asp Phe Arg Gln Phe Tyr Asp His Met Ser Ala Ala

530 535 540

Asn Lys Thr Val Asn Thr Pro Ala Thr His Glu Ala Ser Ser Pro Asp

545 550 555 560

Gln Gln Lys Ala Val Ala Asp Met Leu Met Gly Lys Asp Asp Pro Pro

565 570 575

Ala Ile Lys Lys Pro Lys Lys Asp Val Gly Thr Phe Gln Gln Gly Leu

580 585 590

His Glu Phe Leu Lys Trp Asp Ser Lys Ile Leu Asp Trp Met Ser Val

595 600 605

Gly Leu Ser Ala Leu Asn Gly Ile Pro Val Ile Gly Glu Ile Ala Asp

610 615 620

Ala Ala Ala Ile Ala Leu Glu Ser Glu Ala Gln Ala Ala Gln Val Val

625 630 635 640

Asp Thr Ala Ile Gln Gly Gly Asp Met Ser Leu Ala Leu Lys Leu Ala

645 650 655

Gly Ile Asn Met Ala Gly Ala Val Val Gly Ala Val Gly Gly Pro Thr

660 665 670

Ala Arg Ile Gly Ala Lys Gly Ala Ala Lys Gly Val Ala Glu Val Ala

675 680 685

Ala Lys Glu Ala Ala Glu Gly Ala Ala Lys Gly Thr Ala Lys Gly Ser

690 695 700

Ala Lys Gly Ala Gly Lys Thr Ala Ala Glu Arg Pro Ser Ala Ala Ala

705 710 715 720

Phe Ala Lys Gly Tyr Val Ala Gly Ser Thr Ile Ser Lys Ser Thr Glu

725 730 735

Ile Leu Lys Lys Pro Val Met Ala Gly Leu His Tyr Glu Glu Tyr Gln

740 745 750

Leu Asp Lys Gln Lys Asp Gly Glu Ile His Gln Lys Leu Asp Asn Ala

755 760 765

Gly Gly Ala Pro Val Gly Lys Gln Ile Ile Pro Thr Gly Ile Ala Asp

770 775 780

Asn Phe Glu Gly Asp Val Arg Gln Asn Leu Arg Asn Val Arg Ile Arg

785 790 795 800

Arg Arg

<210> 3

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cagttctatg accacatgag tgcagccaac aagaccgtga acacgccggc cacgcacgag 60

gcgagctcgc ccgatcagca aaaggccgtc gcggacatgc tgatgggcaa ggacgatccg 120

ccggcgatca agaagcccaa aaaggatgtc ggcacgttcc aacagggcct gcatgagttc 180

ctcaagtggg acagtaagat cctggactgg atgtcggtcg ggctcagcgc attgaacgga 240

attcccgtga tcggcgagat tgccgatgcg gcggcgattg cattggagag cgaggcgcag 300

gcggcgcagg tggtcgacac tgcgattcaa ggtggcgaca tgtcgcttgc cttgaagctg 360

gccggcatca acatggccgg ggcagtggtt ggagcagtcg gtggacccac ggccagaatc 420

ggggccaagg gcgccgccaa gggcgtcgcc gaagtcgcgg ccaaggaagc cgccgagggc 480

gcggccaaag gaactgcaaa gggatctgcc aaaggcgcag gtaaaaccgc ggccgaacgg 540

cccagcgccg ctgcgttcgc aaaaggctac gtggccggca gcaccatcag taaatcgact 600

gaaattctca agaagcccgt catggcgggc ttgcactacg aagaatatca gctggacaag 660

cagaaggacg gagagatcca ccagaagctg gacaacgccg gcggcgcccc ggtgggtaag 720

cagattatcc ccacaggcat cgccgacaac ttcgagggag acgtgcggca gaatctgcgc 780

aatgtcagga tacgtcgcag ataa 804

<210> 4

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Phe Tyr Asp His Met Ser Ala Ala Asn Lys Thr Val Asn Thr Pro

1 5 10 15

Ala Thr His Glu Ala Ser Ser Pro Asp Gln Gln Lys Ala Val Ala Asp

20 25 30

Met Leu Met Gly Lys Asp Asp Pro Pro Ala Ile Lys Lys Pro Lys Lys

35 40 45

Asp Val Gly Thr Phe Gln Gln Gly Leu His Glu Phe Leu Lys Trp Asp

50 55 60

Ser Lys Ile Leu Asp Trp Met Ser Val Gly Leu Ser Ala Leu Asn Gly

65 70 75 80

Ile Pro Val Ile Gly Glu Ile Ala Asp Ala Ala Ala Ile Ala Leu Glu

85 90 95

Ser Glu Ala Gln Ala Ala Gln Val Val Asp Thr Ala Ile Gln Gly Gly

100 105 110

Asp Met Ser Leu Ala Leu Lys Leu Ala Gly Ile Asn Met Ala Gly Ala

115 120 125

Val Val Gly Ala Val Gly Gly Pro Thr Ala Arg Ile Gly Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Ala Lys Gly Val Ala Glu Val Ala Ala Lys Glu Ala Ala Glu Gly

145 150 155 160

Ala Ala Lys Gly Thr Ala Lys Gly Ser Ala Lys Gly Ala Gly Lys Thr

165 170 175

Ala Ala Glu Arg Pro Ser Ala Ala Ala Phe Ala Lys Gly Tyr Val Ala

180 185 190

Gly Ser Thr Ile Ser Lys Ser Thr Glu Ile Leu Lys Lys Pro Val Met

195 200 205

Ala Gly Leu His Tyr Glu Glu Tyr Gln Leu Asp Lys Gln Lys Asp Gly

210 215 220

Glu Ile His Gln Lys Leu Asp Asn Ala Gly Gly Ala Pro Val Gly Lys

225 230 235 240

Gln Ile Ile Pro Thr Gly Ile Ala Asp Asn Phe Glu Gly Asp Val Arg

245 250 255

Gln Asn Leu Arg Asn Val Arg Ile Arg Arg Arg

260 265

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaattccat atgatgtcgc tcaacatgct ttctac 36

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccaagcttt ctgcgacgta tcctgacatt g 31

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaattccat atgcagttct atgaccacat gagtg 35

Claims

1. 一种截短体蛋白HrpF_536-802，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2. 一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的截短体蛋白HrpF_536-802，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.包含权利要求2所述的多核苷酸的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

4.一种表达权利要求1所述的截短体蛋白HrpF_536-802的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将SEQ ID NO.3所示的多核苷酸连接到表达载体上，得到重组质粒；然后将重组质粒转入大肠杆菌，得到阳性重组菌株；

（2）将阳性重组菌株在LB液体培养基中振荡培养过夜，然后转接到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h；然后加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃诱导培养2-3h；将诱导培养后的菌液离心，收集菌体，洗涤，重悬于磷酸缓冲液中，得到菌体悬浮液；向菌体悬浮液中加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶和终浓度为0.1mM的蛋白酶抑制剂，超声波破碎，离心取上清，即为粗提蛋白；对粗提蛋白进行纯化，即得。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述表达载体为pET30a(+)。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述蛋白酶抑制剂为PMSF。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，采用Ni-NTA Agarose对粗提蛋白进行纯化。

8.如下1）或2）所述的蛋白在促进植物生长、增加植物产量和/或提高植物抗病性中的应用；

1）氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的蛋白；

2）在SEQ ID NO.4所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

所述植物为番茄、花生或小麦。

9.如下1）或2）所述的蛋白在促进植物生长或增加植物产量中的应用；

1）氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2）在SEQ ID NO.2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

所述植物为番茄、花生或小麦。

10.如下a）或b)所述的DNA片段在促进植物生长或增加植物产量中的应用；

a）SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b）除a)以外编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

所述植物为番茄、花生或小麦。

11.如下a）或b)所述的DNA片段在促进植物生长、增加植物产量和/或提高植物抗病性中的应用；

a）SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

b）除a)以外编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

所述植物为番茄、花生或小麦。

12.权利要求3所述的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在促进植物生长、增加植物产量和/或提高植物抗病性中的应用；

所述植物为番茄、花生或小麦。

13.一种促进植物生长、增加作物产量和/或提高作物抗病性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将SEQ ID NO.4所示的蛋白配制成浓度为30-50μg/ml的蛋白溶液，在播种之前采用所述蛋白溶液对植物种子进行浸种处理；

或者，将SEQ ID NO.4所示的蛋白配制成浓度为30-50μg/ml的蛋白溶液，在作物生长期采用所述蛋白溶液进行喷雾处理；

所述植物为番茄、花生或小麦。

14.一种促进植物生长和/或增加作物产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将SEQ ID NO.2所示的蛋白配制成浓度为30-50μg/ml的蛋白溶液，在播种之前采用所述蛋白溶液对植物种子进行浸种处理；

或者，将SEQ ID NO.2所示的蛋白配制成浓度为30-50μg/ml的蛋白溶液，在作物生长期采用所述蛋白溶液进行喷雾处理；

所述植物为番茄、花生或小麦。

15. 一种促进植物生长、增加作物产量和/或提高作物抗病性的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂以SEQ ID NO.4所示的蛋白为有效成分。