JP2008245640A - 耐虫性タンパク質及び該耐虫性タンパク質をコードする耐虫性遺伝子 - Google Patents
耐虫性タンパク質及び該耐虫性タンパク質をコードする耐虫性遺伝子 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】少量であっても虫に対して十分な耐虫性を示す耐虫性タンパク質、該耐虫性タンパク質をコードする耐虫性遺伝子、該耐虫性遺伝子を含有する組換えベクター、組換えベクターが導入された宿主細胞及び植物細胞、耐虫性遺伝子により形質変換された形質変換体及びその製造方法、これらにより回収された回収タンパク質、並びに、これらを有効成分とする耐虫剤を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第１アミノ酸配列を有し、且つ第２アミノ酸配列がｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する植物由来の耐虫性タンパク質。
【選択図】図１
【解決手段】特定のアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第１アミノ酸配列を有し、且つ第２アミノ酸配列がｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する植物由来の耐虫性タンパク質。
【選択図】図１
Description
本発明は、耐虫性タンパク質、該耐虫性タンパク質をコードする耐虫性遺伝子、該耐虫性遺伝子を含有する組換えベクター、組換えベクターが導入された宿主細胞及び植物細胞、耐虫性遺伝子により形質変換された形質変換体及びその製造方法、これらにより回収された回収タンパク質、並びに、これらを有効成分とする耐虫剤に関する。
耐虫性を有するタンパク質（以下「耐虫性タンパク質」という。）は植物に遺伝子導入を行い遺伝子耐虫性植物の遺伝育種を行う上で必要不可欠な素材である。また、微生物、培養細胞、多細胞動植物個体に発現させ回収した耐虫性タンパク質を散布することにより新規の農薬等の耐虫剤として用いることも可能である。
産業上広く用いられている耐虫性タンパク質としてはグラム陽性細菌であるBacillus thuringiensisが生産するＢｔ毒素（タンパク質）が挙げられる。
かかるＢｔ毒素は低濃度（１ｐｐｍ程度）で殺虫・耐虫性活性を示すことが知られている（例えば、非特許文献１又は２参照）。
かかるＢｔ毒素は低濃度（１ｐｐｍ程度）で殺虫・耐虫性活性を示すことが知られている（例えば、非特許文献１又は２参照）。
ところが、上記Ｂｔ毒素は、バクテリア由来であり、遺伝子組み換え作業等、組換え体の遺伝子資源として使用するのに根強い抵抗感があるので、植物由来の耐虫性タンパク質の発見が望まれている。
これに対し、植物由来の耐虫性タンパク質として、ササゲ由来のプロテアーゼインヒビター（例えば、非特許文献３又は特許文献１参照）や、インゲン由来のアミラーゼインヒビター（例えば、非特許文献４参照）や、スノードロップ由来のレクチン（例えば、非特許文献５又は特許文献２参照）が知られている。
Canadian Journal of Microbiology 51, 988-995(2005) Journal of Pesticide Reform 14, 13-20 (1994) Pest Management Science 57, 57-65(2001) Plant Physiology 107, 1233-1239(1995） Journal of Insect Physiology 43, 727-739(1997) 米国特許第４６４０８３６号公報
米国特許第５５４５８２０号公報
Canadian Journal of Microbiology 51, 988-995(2005) Journal of Pesticide Reform 14, 13-20 (1994) Pest Management Science 57, 57-65(2001) Plant Physiology 107, 1233-1239(1995） Journal of Insect Physiology 43, 727-739(1997)
しかしながら、上記非特許文献１又は２に記載の耐虫性タンパク質であるＢｔ毒素は、耐虫性が十分とは言えず、現にコナガ、アワノメイガ等のようにＢｔ毒素に対して抵抗性を有する昆虫が出現している。
上記非特許文献３又は特許文献１に記載のプロテアーゼインヒビターは、総タンパク質の２％にも達する高濃度で加えても蛾の幼虫の成長を２週間で半分にした程度にしか耐虫性活性を発揮しない。
上記非特許文献４記載のアミラーゼインヒビターは、エンドウに発現させた場合で豆の総可溶性タンパク質の２−３％と多量に発現させてやっと７割のマメゾウムシが途中で死ぬが、３割は正常に育ってしまう。また、１％だと８割以上が正常に成虫まで成育してしまう程度の弱い耐虫性活性である。
上記非特許文献５又は特許文献２に記載のレクチンは、人工飼料に総タンパク質量の２％濃度と多量に加えた餌を蛾幼虫に一月食べさせて体重が２割程度軽くなる程度の非常に弱い耐虫性活性である。
すなわち、上記非特許文献３〜５、特許文献１及び２に記載のプロテアーゼインヒビター、アミラーゼインヒビター、レクチンはいずれも耐虫性活性が不十分である。
すなわち、上記非特許文献３〜５、特許文献１及び２に記載のプロテアーゼインヒビター、アミラーゼインヒビター、レクチンはいずれも耐虫性活性が不十分である。
本発明は、少量であっても虫に対して十分な耐虫性を示す耐虫性タンパク質、該耐虫性タンパク質をコードする耐虫性遺伝子、該耐虫性遺伝子を含有する組換えベクター、組換えベクターが導入された宿主細胞及び植物細胞、耐虫性遺伝子により形質変換された形質変換体及びその製造方法、これらにより回収された回収タンパク質、並びに、これらを有効成分とする耐虫剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、植物の乳液から得られるタンパク質のうち、所定のアミノ酸配列を有するタンパク質が優れた耐虫性を有することを見出した。本発明者らは、更に鋭意研究を重ねた結果、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）植物由来の耐虫性タンパク質であって、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第１アミノ酸配列と、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第２アミノ酸配列と、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第３アミノ酸配列と、を有し、且つ第２アミノ酸配列がｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する耐虫性タンパク質に存する。
本発明は、（２）第２アミノ酸配列が、第１アミノ酸配列と第３アミノ酸配列との間に位置する上記（１）記載の耐虫性タンパク質に存する。
本発明は、（３）植物由来の耐虫性タンパク質であって、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第４アミノ酸配列からなり、ｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する耐虫性タンパク質に存する。
本発明は、（４）植物由来の耐虫性タンパク質であって、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第５アミノ酸配列からなり、ｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する耐虫性タンパク質に存する。
本発明は、（５）植物がクワ科植物であり、該クワ科植物の乳液から抽出される上記（１）記載の耐虫性タンパク質に存する。
本発明は、（６）クワ科植物の乳液を抽出し、該乳液を遠心分離して上清を分離し、該上清を非変性条件で電気泳動させて分画し、分子量が５０〜６０ｋＤａである画分から採取することにより得られる耐虫性タンパク質に存する。
本発明は、（７）上記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の耐虫性タンパク質をコードする耐虫性遺伝子に存する。
本発明は、（８）植物由来の耐虫性遺伝子であって、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡに対する相同性が５０％以上の第６ＤＮＡを有し、ｓｐｐｐｐ配列をコードする塩基配列を少なくとも１つ有する耐虫性遺伝子に存する。
本発明は、（９）第６ＤＮＡと、相補的な塩基配列からなるＤＮＡとがストリンジェントな条件下でハイブリダイズされている上記（８）記載の耐虫性遺伝子に存する。
本発明は、（１０）植物由来の耐虫性遺伝子であって、配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに対する相同性が５０％以上の第７ＤＮＡを有し、ｓｐｐｐｐ配列をコードする塩基配列を少なくとも１つ有する耐虫性遺伝子に存する。
本発明は、（１１）第７ＤＮＡと、相補的な塩基配列からなるＤＮＡとがストリンジェントな条件下でハイブリダイズされている上記（１０）記載の耐虫性遺伝子に存する。
本発明は、（１２）上記（８）〜（１１）のいずれか一つに記載の耐虫性遺伝子を含有する組換えベクターに存する。
本発明は、（１３）上記（１２）記載の組換えベクターが導入された宿主細胞に存する。
本発明は、（１４）上記（１２）記載の組換えベクターが導入された植物細胞に存する。
本発明は、（１５）上記（８）〜（１１）のいずれか一つに記載の耐虫性遺伝子により形質変換された形質変換体に存する。
本発明は、（１６）上記（８）〜（１１）のいずれか一つに記載の耐虫性遺伝子により形質変換された形質変換体の製造方法に存する。
本発明は、（１７）上記（１３）記載の宿主細胞により回収された回収タンパク質に存する。
本発明は、（１８）上記（１４）記載の植物細胞により回収された回収タンパク質に存する。
本発明は、（１９）上記（１５）又は（１６）に記載の形質変換体により回収された回収タンパク質に存する。
本発明は、（２０）上記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の耐虫性タンパク質を有効成分とする耐虫剤に存する。
本発明は、（２１）上記（８）〜（１１）のいずれか一つに記載の耐虫性遺伝子を有効成分とする耐虫剤に存する。
なお、本発明の目的に添ったものであれば、上記（１）〜（２１）を適宜組み合わせた構成も採用可能である。
本発明の耐虫性タンパク質によれば、極めて低濃度であっても、十分な耐虫性を発揮する。
また、上記耐虫性タンパク質は、植物由来であり、人体に対して毒性が低い。
さらに、上記耐虫性タンパク質は、糖類似アルカロイドや他の耐虫性因子と共存させることにより、該耐虫性因子の働きを増強する作用を有する。
また、上記耐虫性タンパク質は、植物由来であり、人体に対して毒性が低い。
さらに、上記耐虫性タンパク質は、糖類似アルカロイドや他の耐虫性因子と共存させることにより、該耐虫性因子の働きを増強する作用を有する。
上記耐虫性タンパク質は、植物がクワ科植物であり、該クワ科植物の乳液から抽出されるものであると、該乳液中に１〜数％と多量に含まれるので、精製が比較的容易となる。
上記耐虫性タンパク質は、耐虫剤として用いられると、人体に被害をもたらす虫や植物の成長を阻害する虫等を簡便に取り除くことができる。
本発明の遺伝子によれば、植物に遺伝子導入を行い遺伝子耐虫性植物の遺伝育種を行うことができる。
本発明の組換えベクターは、異種の宿主に、上記遺伝子を運ぶ機能を発揮する。
これにより、上記遺伝子を他の遺伝子に組み込むことができる。
例えば、上記組換えベクターを宿主細胞や植物細胞に導入することができる。
これにより、上記遺伝子を他の遺伝子に組み込むことができる。
例えば、上記組換えベクターを宿主細胞や植物細胞に導入することができる。
本発明の形質変換体によれば、上記遺伝子により形質変換された植物において、煩雑な農薬散布の作業を省けると共に、茎等の植物組織内部に潜み、駆除しにくい害虫に対しても、容易に効果を発揮することができる。
また、宿主細胞、植物細胞、形質変換体により回収された回収タンパク質においても、十分な耐虫性を発揮する。
上記耐虫性タンパク質、上記耐虫性遺伝子は、耐虫剤の有効成分として好適に用いられる。
本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
（耐虫性タンパク質）
本発明の耐虫性タンパク質は、植物由来であり、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列（以下便宜的「第１タンパク質断片」ともいう。）に対する相同性が５０％以上の第１アミノ酸配列と、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列（以下便宜的「第２タンパク質断片」ともいう。）に対する相同性が５０％以上の第２アミノ酸配列と、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列（以下便宜的「第３タンパク質断片」ともいう。）に対する相同性が５０％以上の第３アミノ酸配列と、を有する。なお、上記相同性はそれぞれ独立している。
（耐虫性タンパク質）
本発明の耐虫性タンパク質は、植物由来であり、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列（以下便宜的「第１タンパク質断片」ともいう。）に対する相同性が５０％以上の第１アミノ酸配列と、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列（以下便宜的「第２タンパク質断片」ともいう。）に対する相同性が５０％以上の第２アミノ酸配列と、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列（以下便宜的「第３タンパク質断片」ともいう。）に対する相同性が５０％以上の第３アミノ酸配列と、を有する。なお、上記相同性はそれぞれ独立している。
上記耐虫性タンパク質は、第１アミノ酸配列、第２アミノ酸配列及び第３アミノ酸配列を有し、第２アミノ酸配列がｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有することにより、極めて低濃度であっても、十分な耐虫性を発揮する。
ここで、相同性１００％の場合、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列（第１タンパク質断片）と第１アミノ酸配列とは同じ配列であり、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列（第２タンパク質断片）と第２アミノ酸配列とは同じ配列であり、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列（第３タンパク質断片）と第３アミノ酸配列とは同じ配列である。
したがって、相同性１００％である場合、本発明の耐虫性タンパク質は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列と、を有するものである。
したがって、相同性１００％である場合、本発明の耐虫性タンパク質は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列と、を有するものである。
上記第１タンパク質断片及び上記第３タンパク質断片は、キチン結合モチーフであり、ゴム由来ヘベイン類似のキチン結合タンパク質と相同性が認められる。
ここで、ヘベイン類似のキチン結合タンパク質とは、ヘベインに見られる約４０アミノ酸からなりシステイン残基により内部が架橋されたキチン結合部位に類似したアミノ酸配列を分子内に単数又は複数もつキチンに対して、結合する性質を有するタンパク質を意味する。
一方、上記第２タンパク質断片は、特異的なｓｐｐｐｐ配列の反復（ＳｅｒＰｒｏＰｒｏＰｒｏＰｒｏ）が認められる。なお、本発明の耐虫性タンパク質においては、第２アミノ酸配列がｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する。
ここで、ｓｐｐｐｐ配列とは、ＳｅｒのあとにＰｒｏが典型的には４つ、場合によっては３〜７つ繋がった配列を意味する。かかるｓｐｐｐｐ配列は、一般に複数回繰り返される特徴がある。
ここで、ヘベイン類似のキチン結合タンパク質とは、ヘベインに見られる約４０アミノ酸からなりシステイン残基により内部が架橋されたキチン結合部位に類似したアミノ酸配列を分子内に単数又は複数もつキチンに対して、結合する性質を有するタンパク質を意味する。
一方、上記第２タンパク質断片は、特異的なｓｐｐｐｐ配列の反復（ＳｅｒＰｒｏＰｒｏＰｒｏＰｒｏ）が認められる。なお、本発明の耐虫性タンパク質においては、第２アミノ酸配列がｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する。
ここで、ｓｐｐｐｐ配列とは、ＳｅｒのあとにＰｒｏが典型的には４つ、場合によっては３〜７つ繋がった配列を意味する。かかるｓｐｐｐｐ配列は、一般に複数回繰り返される特徴がある。
本発明の耐虫性タンパク質は、第１アミノ酸配列、第２アミノ酸配列及び第３アミノ酸配列を有することにより、優れた耐虫性を示す。
ここで、本発明において、耐虫性とは、殺虫性又は虫の成長を阻害する特性（以下「成長阻害性」という。）を意味する。
ここで、本発明において、耐虫性とは、殺虫性又は虫の成長を阻害する特性（以下「成長阻害性」という。）を意味する。
第１アミノ酸配列、第２アミノ酸配列及び第３アミノ酸配列の配列順序は特に限定されないが、第２アミノ酸配列が、第１アミノ酸配列と第３アミノ酸配列との間に位置することが好ましい。
この場合、耐虫性がより発揮される。
この場合、耐虫性がより発揮される。
本発明の耐虫性タンパク質は、例えば、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列（以下「活性部分アミノ酸配列」ともいう。）に対する相同性が５０％以上の第４アミノ酸配列からなる。なお、相同性１００％の場合、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列（活性部分アミノ酸配列）と第４アミノ酸配列とは同じ配列である。
かかる第４アミノ酸配列は、ｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有しており、乳液由来全ＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行うことによりアミノ酸配列が同定される。
かかる第４アミノ酸配列は、ｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有しており、乳液由来全ＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行うことによりアミノ酸配列が同定される。
活性部分アミノ酸配列においては、アミノ酸番号４６〜９７番目に第２タンパク質断片が認められ、また、第２タンパク質断片を挟むように、アミノ酸番号６〜４４番目に第１タンパク質断片及びアミノ酸番号１０６〜１４４番目に第３タンパク質断片が存在している。なお、活性部分アミノ酸配列において、アミノ酸番号１４５番目以降のアミノ酸配列は、その機能が明確にはなっていないものの、キチンを分解する酵素の情報を有しているものと考えられる。
活性部分アミノ酸配列からなる耐虫性タンパク質によれば、確実に耐虫性が発揮される。
活性部分アミノ酸配列からなる耐虫性タンパク質によれば、確実に耐虫性が発揮される。
本発明の耐虫性タンパク質は、例えば、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列（以下「完全長アミノ酸配列」ともいう。）に対する相同性が５０％以上の第５アミノ酸配列からなる。なお、相同性１００％の場合、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列（完全長アミノ酸配列）と第５アミノ酸配列とは同じ配列である。
かかる第５アミノ酸配列は、ｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有しており、乳液由来全ＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行うことによりアミノ酸配列が同定される。
かかる第５アミノ酸配列は、ｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有しており、乳液由来全ＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行うことによりアミノ酸配列が同定される。
完全長アミノ酸配列においては、活性部分アミノ酸配列を含んでおり、具体的には、完全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１〜２１番目を活性部分アミノ酸配列に追加したものである。
完全長アミノ酸配列においては、アミノ酸番号６７〜１１８番目に第２タンパク質断片が認められ、また、第２タンパク質断片を挟むように、アミノ酸番号２７〜６５に第１タンパク質断片及びアミノ酸番号１２７〜１６５番目に第３タンパク質断片が存在している。
完全長アミノ酸配列においては、アミノ酸番号６７〜１１８番目に第２タンパク質断片が認められ、また、第２タンパク質断片を挟むように、アミノ酸番号２７〜６５に第１タンパク質断片及びアミノ酸番号１２７〜１６５番目に第３タンパク質断片が存在している。
なお、完全長アミノ酸配列において、塩基番号１〜２１番目のアミノ酸配列は、適切な位置に上記耐虫性タンパク質を組み込むための位置情報を有しているものと考えられる。
また、塩基番号１６５番目以降のアミノ酸配列は、その機能が明確にはなっていないものの、キチンを分解する酵素の情報を有しているものと考えられる。
また、塩基番号１６５番目以降のアミノ酸配列は、その機能が明確にはなっていないものの、キチンを分解する酵素の情報を有しているものと考えられる。
完全長アミノ酸配列からなる耐虫性タンパク質によれば、正確な位置にアミノ酸配列が組み込まれることになるので、より確実に耐虫性が発揮される。なお、これらのアミノ酸配列からなる耐虫性タンパク質は、キチナーゼ活性を示さないにも関わらず、耐虫性に優れるものである。
上記耐虫性タンパク質が耐虫性活性を示す虫としては、鞘翅目、鱗翅目、双翅目、膜翅目、半翅目、直翅目、蜻翅目等の種類の昆虫、ダニ等の節足動物が挙げられる。
また、上記耐虫性タンパク質は、植物由来であるので、バクテリア由来に比べて、消費者に抵抗性が少なく、人体に対して毒性が低い。
また、上記耐虫性タンパク質は、植物由来であるので、バクテリア由来に比べて、消費者に抵抗性が少なく、人体に対して毒性が低い。
この植物としては、特に限定されないが、乳液を含む植物であることが好ましい。
具体例としては、キク科、キキョウ科、ヒルガオ科、クワ科、トウダイグサ科、ガガイモ科、キョウチクトウ科、バショウ科、ケシ科、ウルシ科、オトギリソウ科、マメ科、サボテン科、ユリ科等の植物が挙げられる。
これらの中でも、上記植物がクワ科植物であることが好ましい。すなわち、上記耐虫性タンパク質は、クワ科植物の乳液から抽出されたものであることがより好ましい。
クワ科植物から耐虫性タンパク質を抽出する場合、クワ科植物の乳液中に比較的多く含まれるため、精製が容易となる。
具体例としては、キク科、キキョウ科、ヒルガオ科、クワ科、トウダイグサ科、ガガイモ科、キョウチクトウ科、バショウ科、ケシ科、ウルシ科、オトギリソウ科、マメ科、サボテン科、ユリ科等の植物が挙げられる。
これらの中でも、上記植物がクワ科植物であることが好ましい。すなわち、上記耐虫性タンパク質は、クワ科植物の乳液から抽出されたものであることがより好ましい。
クワ科植物から耐虫性タンパク質を抽出する場合、クワ科植物の乳液中に比較的多く含まれるため、精製が容易となる。
耐虫性タンパク質は、糖類似アルカロイド等の耐虫性因子と共存させることにより、該耐虫性因子の働きを増強する作用を有する。
上記糖類似アルカロイドとしては、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール、１−デオキシノジリマイシン、１，４−ジデオキシー１，４−イミノ−Ｄ−リビトール等が挙げられる。
上記糖類似アルカロイドとしては、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール、１−デオキシノジリマイシン、１，４−ジデオキシー１，４−イミノ−Ｄ−リビトール等が挙げられる。
配列表の配列番号４又は５に示されるアミノ酸配列の両末端に、別のアミノ酸が接続されていてもよい。
この場合、優れた耐虫性を発揮させる観点から、上記別のアミノ酸を含むタンパク質の総量の０．１質量％以上が上記アミノ酸配列になるようにすることが好ましく、０．２質量％以上が上記アミノ酸配列になるようにすることがより好ましい。
この場合、優れた耐虫性を発揮させる観点から、上記別のアミノ酸を含むタンパク質の総量の０．１質量％以上が上記アミノ酸配列になるようにすることが好ましく、０．２質量％以上が上記アミノ酸配列になるようにすることがより好ましい。
上記耐虫性タンパク質は、殺虫剤、農薬、耐虫用餌等の耐虫剤として好適に用いられる。
ここで、耐虫用餌とは、餌中に耐虫性物質含有させ、虫に食べさせることにより、耐虫性を発揮させる餌を意味する。すなわち、上記耐虫性タンパク質は、耐虫性餌として用いられると、人体に被害をもたらす虫や植物の成長を阻害する虫等がそれを食べることにより、虫の成長が阻害され、又は、虫が死滅されることになるので、虫を簡便に取り除くことができる。
ここで、耐虫用餌とは、餌中に耐虫性物質含有させ、虫に食べさせることにより、耐虫性を発揮させる餌を意味する。すなわち、上記耐虫性タンパク質は、耐虫性餌として用いられると、人体に被害をもたらす虫や植物の成長を阻害する虫等がそれを食べることにより、虫の成長が阻害され、又は、虫が死滅されることになるので、虫を簡便に取り除くことができる。
次に、本発明の耐虫性タンパク質の相同性について説明する。
本発明の耐虫性タンパク質は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第１アミノ酸配列と、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第２アミノ酸配列と、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第３アミノ酸配列と、を有する。
また、好ましくは、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第４アミノ酸配列を有する。
さらに、より好ましくは、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第５アミノ酸配列を有する。
本発明の耐虫性タンパク質は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第１アミノ酸配列と、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第２アミノ酸配列と、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第３アミノ酸配列と、を有する。
また、好ましくは、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第４アミノ酸配列を有する。
さらに、より好ましくは、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第５アミノ酸配列を有する。
ここで、相同性が５０％以上とは、所定のアミノ酸配列（第１タンパク質断片、第２タンパク質断片、第３タンパク質断片、活性部分アミノ酸配列、完全長アミノ酸配列）において、５０％以上のアミノ酸が同じ配列になっていることを意味する。すなわち、所定のアミノ酸配列において、５０％未満の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入により変換されていてもよいことを意味する。
上記相同性は、７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより一層好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９８％以上であることが更に一層好ましく、９９％以上であることが特に好ましく、１００％であることが最も好ましい。
上記所定のアミノ酸配列（第１タンパク質断片、第２タンパク質断片、第３タンパク質断片、活性部分アミノ酸配列、完全長アミノ酸配列）において、置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡが所望の耐虫性を有する限り特に限定されないが、９個以下であることが好ましく、４個以下であることがより好ましい。
これらの範囲であれば、耐虫性は確実に消失されない。
これらの範囲であれば、耐虫性は確実に消失されない。
なお、上記耐虫性タンパク質は、配列番号４又は５に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアント及びホモログ等を含む。
このようなアミノ酸配列に係るＤＮＡを調製するための方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Kramer, W.& Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）等が挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。なお、ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。
ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。
ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。なお、これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。なお、これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
（耐虫性タンパク質の合成）
本発明の耐虫性タンパク質は、固相法や液相法、生物的な合成方法により合成することができる。
ここで、固相法とは、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズ等を固相として用い、ここから脱水反応によって1つずつアミノ酸鎖を伸長していき、目的とするペプチドの配列ができあがったら固相表面から切り出し、目的の物質を得る方法である。
また、液相法とは、合成しようするペプチドを固相に固定せず、液相で合成を行うものであり、アミノ酸残基を１つ伸長するたびに精製を行う方法である。
本発明の耐虫性タンパク質は、固相法や液相法、生物的な合成方法により合成することができる。
ここで、固相法とは、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズ等を固相として用い、ここから脱水反応によって1つずつアミノ酸鎖を伸長していき、目的とするペプチドの配列ができあがったら固相表面から切り出し、目的の物質を得る方法である。
また、液相法とは、合成しようするペプチドを固相に固定せず、液相で合成を行うものであり、アミノ酸残基を１つ伸長するたびに精製を行う方法である。
上記生物的な合成方法とは、大量発現にふさわしいプロモーターの支配下に合成しようとするペプチドの遺伝暗号をもつ翻訳領域を結合させた人工的なＤＮＡを構築し、大腸菌、酵母、昆虫もしくは脊椎動物の培養細胞に合成させる方法である。なお、必ずしも生きた細胞を用いるとは限らず、遺伝子の転写及び翻訳に関わる因子を全て含む細胞抽出物を用いた無細胞転写翻訳系を用いる場合を含む。
（耐虫性タンパク質の搾取）
本発明の耐虫性タンパク質は、以下のようにして搾取される。
まず、クワ科植物の乳液を抽出し、これを上清と粒子層とに分離する。この分離手段としては、特に限定されないが、遠心分離、ろ過等が挙げられる。
本発明の耐虫性タンパク質は、以下のようにして搾取される。
まず、クワ科植物の乳液を抽出し、これを上清と粒子層とに分離する。この分離手段としては、特に限定されないが、遠心分離、ろ過等が挙げられる。
分離手段として、遠心分離を行う場合、遠心力は、１５０００〜２００００Ｇとすることが好ましく、１〜６０分間回転させることが好ましい。
そうすると、所望のタンパク質が少なくとも５％（体積（ｍｌ）に対する質量（ｇ）の割合）以上含まれる上清が得られる。なお、得られた上清は、遠心分離後、孔径０．１〜０．８μｍのフィルターでろ過することが好ましい。これにより、コンタミ等の不純物を確実に除去できる。
そうすると、所望のタンパク質が少なくとも５％（体積（ｍｌ）に対する質量（ｇ）の割合）以上含まれる上清が得られる。なお、得られた上清は、遠心分離後、孔径０．１〜０．８μｍのフィルターでろ過することが好ましい。これにより、コンタミ等の不純物を確実に除去できる。
次いで、得られた上清から本発明の耐虫性タンパク質を抽出する。かかる抽出手段としては、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー等が挙げられる。
これらの中でも電気泳動を行うことが好ましく、非変性条件の電気泳動（native-PAGE）を行うことがより好ましい。
この場合、効率的に他のタンパク質を除去できるという利点がある。なお、上記電気泳動には、無担体電気泳動、濾紙電気泳動、アガロースやポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電気泳動、等電点電気泳動、二次元電気泳動、キャピラリー電気泳動、パルスフィールド電気泳動等が含まれる。
これらの中でも電気泳動を行うことが好ましく、非変性条件の電気泳動（native-PAGE）を行うことがより好ましい。
この場合、効率的に他のタンパク質を除去できるという利点がある。なお、上記電気泳動には、無担体電気泳動、濾紙電気泳動、アガロースやポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電気泳動、等電点電気泳動、二次元電気泳動、キャピラリー電気泳動、パルスフィールド電気泳動等が含まれる。
ここで、非変性条件でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う場合について説明する。
まず、ＴＢＳ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、ＴＥ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液等の緩衝剤でｐＨ６．８〜８．８に調整した緩衝溶液を作成する。
まず、ＴＢＳ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、ＴＥ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液等の緩衝剤でｐＨ６．８〜８．８に調整した緩衝溶液を作成する。
次いで、混合割合が１２．５％（体積（ｍｌ）に対する質量（ｇ）の割合）となるように、ポリアクリルアミドゲルを投入する。そして、上記上清を投入して電気泳動を行う。
そうすると、上清がいくつかのバンドに分画される。その中で、分子量が５０〜６０ｋＤａである画分を採取し、培養することにより、本発明の耐虫性タンパク質が得られる。
そうすると、上清がいくつかのバンドに分画される。その中で、分子量が５０〜６０ｋＤａである画分を採取し、培養することにより、本発明の耐虫性タンパク質が得られる。
（遺伝子）
本発明の遺伝子は、上述した耐虫性タンパク質をコードする。
具体的には、植物由来の耐虫性遺伝子であって、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡに対する相同性が５０％以上の第６ＤＮＡを有する。なお、配列番号６に示される塩基配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードしたものである。
本発明の遺伝子は、上述した耐虫性タンパク質をコードする。
具体的には、植物由来の耐虫性遺伝子であって、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡに対する相同性が５０％以上の第６ＤＮＡを有する。なお、配列番号６に示される塩基配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードしたものである。
また、植物由来の耐虫性遺伝子であって、配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに対する相同性が５０％以上の第７ＤＮＡを有する。なお、配列番号７に示される塩基配列は、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードしたものである。
なお、これらの耐虫性遺伝子は、上述したｓｐｐｐｐ配列をコードする塩基配列を少なくとも１つ有する。
なお、これらの耐虫性遺伝子は、上述したｓｐｐｐｐ配列をコードする塩基配列を少なくとも１つ有する。
ここで、上記耐虫性遺伝子とは、遺伝形質を規定する因子をいう。なお、通常、染色体上に一定の順序に配列している。
また、上記ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。なお、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの調製は、公知の方法で行えばよい。
また、上記ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。なお、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの調製は、公知の方法で行えばよい。
ここで、相同性１００％の場合、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡと第６ＤＮＡとは同じ配列であり、配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡと第７ＤＮＡとは同じ配列である。
したがって、相同性１００％である場合、本発明の耐虫性遺伝子は、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は、配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ、を有するものである。
配列表の配列番号６又は７に示される塩基配列は、クワ乳液由来全ＲＮＡを鋳型にして、逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを用い、精製タンパク質より同定したＮ末端アミノ酸配列より設計したｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒを利用したＰＣＲにより塩基配列が同定される。
本発明の耐虫性遺伝子によれば、植物、微生物、培養細胞、多細胞動植物、昆虫等の生物に遺伝子導入を行い遺伝子耐虫性生物の遺伝育種を行うことができる。
次に、本発明の耐虫性遺伝子の相同性について説明する。
本発明の耐虫性遺伝子は、配列表の配列番号６に示される塩基配列、又は、配列表の配列番号７に示される塩基配列、からなるＤＮＡにおける相同性が５０％以上のＤＮＡを有する。
本発明の耐虫性遺伝子は、配列表の配列番号６に示される塩基配列、又は、配列表の配列番号７に示される塩基配列、からなるＤＮＡにおける相同性が５０％以上のＤＮＡを有する。
ここで、相同性が５０％以上とは、所定の塩基配列（配列番号６又は７）において、５０％以上の塩基が同じ配列になっていることを意味する。すなわち、所定の塩基配列において、５０％未満の１若しくは複数の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入により変換されていてもよいことを意味する。
上記相同性は、７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより一層好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９８％以上であることが更に一層好ましく、９９％以上であることが特に好ましく、１００％であることが最も好ましい。
本発明の耐虫性遺伝子の塩基配列において、置換、欠失、付加及び／又は挿入されるヌクレオチド（遺伝子）の個数は、その塩基配列からなるＤＮＡが所望の耐虫性を有する限り特に限定されないが、９個以下であることが好ましく、４個以下であることがより好ましい。
これらの範囲であれば、耐虫性は確実に消失されない。
これらの範囲であれば、耐虫性は確実に消失されない。
なお、耐虫性遺伝子には、配列番号６又は７に示される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入された塩基配列からなる変異体、誘導体、アレル、バリアント及びホモログ等が含まれる。
また、このような塩基配列に係るＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Kramer, W.& Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）等がある。
塩基配列の相同性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。
ＢＬＡＳＴＸを用いて塩基配列を解析する場合、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
例えば、配列番号６又は７に示される塩基配列からなるＤＮＡに対する相同性が５０％以上のＤＮＡを調製するために、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Saiki, R. K. et al. (1985) Science, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491）が利用できる。
具体的には、配列番号６又は７に示される塩基配列からなるＤＮＡをプローブとし、配列番号６又は７に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプライマーとして、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号６又は７に示される塩基配列と高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを単離することができる。
このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうる耐虫性タンパク質と同等の耐虫性を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明の耐虫性遺伝子に含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイズとは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件又はこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味する。なお、よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件とすることにより、より相同性の高いＤＮＡの単離が可能となる。さらに、それぞれの条件において、温度は約４０℃以上とすればよく、よりストリンジェンシーの高い条件が必要であれば、温度は約５０℃、さらに約６５℃とすればよい。
ここで、ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイズとは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件又はこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味する。なお、よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件とすることにより、より相同性の高いＤＮＡの単離が可能となる。さらに、それぞれの条件において、温度は約４０℃以上とすればよく、よりストリンジェンシーの高い条件が必要であれば、温度は約５０℃、さらに約６５℃とすればよい。
上記耐虫性遺伝子は、殺虫剤、農薬、耐虫用餌等の耐虫剤として好適に用いられる。
ここで、耐虫用餌とは、餌中に耐虫性物質含有させ、虫に食べさせることにより、耐虫性を発揮させる餌を意味する。すなわち、上記耐虫性遺伝子は、耐虫性餌として用いられると、人体に被害をもたらす虫や植物の成長を阻害する虫等がそれを食べることにより、虫の成長が阻害され、又は、虫が死滅されることになるので、虫を簡便に取り除くことができる。
ここで、耐虫用餌とは、餌中に耐虫性物質含有させ、虫に食べさせることにより、耐虫性を発揮させる餌を意味する。すなわち、上記耐虫性遺伝子は、耐虫性餌として用いられると、人体に被害をもたらす虫や植物の成長を阻害する虫等がそれを食べることにより、虫の成長が阻害され、又は、虫が死滅されることになるので、虫を簡便に取り除くことができる。
（組換えベクター）
本発明の組換えベクターは、上述した耐虫性遺伝子を含有する。
本発明の組換えベクターは、異種の宿主に、上記耐虫性遺伝子を運ぶ機能を発揮する。
これにより、上記耐虫性遺伝子を他の耐虫性遺伝子に組み込むことができる。
上記組換えベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍシャトルベクター等が用いられる。
本発明の組換えベクターは、上述した耐虫性遺伝子を含有する。
本発明の組換えベクターは、異種の宿主に、上記耐虫性遺伝子を運ぶ機能を発揮する。
これにより、上記耐虫性遺伝子を他の耐虫性遺伝子に組み込むことができる。
上記組換えベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍシャトルベクター等が用いられる。
（宿主細胞）
本発明の宿主細胞には、上記組換えベクターが導入されている。
宿主細胞としては、組換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。
本発明の宿主細胞には、上記組換えベクターが導入されている。
宿主細胞としては、組換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。
宿主細胞への組換えベクターの導入には、公知の方法を用いればよい。
例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M. & Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162、Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580）等が挙げられる。
例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M. & Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162、Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580）等が挙げられる。
（植物細胞）
本発明の植物細胞には、上記組換えベクターが導入されている。
植物細胞としては、単子葉植物や双子葉植物の細胞が含まれる。
単子葉植物としては、イネ科植物、ユリ科植物等が挙げられる。
イネ科植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、ソルガム、ライムギ、アワ、サトウキビ等が挙げられる。
ユリ科植物としては、ネギ、アスパラガス等が挙げられる。
双子葉植物としては、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、クワ科植物、アオイ科植物等が挙げられる。
アブラナ科植物としては、シロイヌナズナ、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワー等が挙げられる。
マメ科植物としては、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、ササゲ等が挙げられる。
ナス科植物としては、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、トウガラシ等が挙げられる。
ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカ等が挙げられる。
ヒルガオ科植物としては、アサガオ、カンショ、ヒルガオ等が挙げられる。
バラ科植物としては、バラ、イチゴ、リンゴ等が挙げられる。
クワ科植物としては、クワ、イチジク、ゴムノキ等が挙げられる。
アオイ科植物としては、ワタ、ケナフ等が挙げられる。
また、本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
本発明の植物細胞には、上記組換えベクターが導入されている。
植物細胞としては、単子葉植物や双子葉植物の細胞が含まれる。
単子葉植物としては、イネ科植物、ユリ科植物等が挙げられる。
イネ科植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、ソルガム、ライムギ、アワ、サトウキビ等が挙げられる。
ユリ科植物としては、ネギ、アスパラガス等が挙げられる。
双子葉植物としては、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、クワ科植物、アオイ科植物等が挙げられる。
アブラナ科植物としては、シロイヌナズナ、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワー等が挙げられる。
マメ科植物としては、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、ササゲ等が挙げられる。
ナス科植物としては、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、トウガラシ等が挙げられる。
ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカ等が挙げられる。
ヒルガオ科植物としては、アサガオ、カンショ、ヒルガオ等が挙げられる。
バラ科植物としては、バラ、イチゴ、リンゴ等が挙げられる。
クワ科植物としては、クワ、イチジク、ゴムノキ等が挙げられる。
アオイ科植物としては、ワタ、ケナフ等が挙げられる。
また、本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
植物細胞への組換えベクターの導入には、公知の方法を用いればよい。
例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等が挙げられる。
例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等が挙げられる。
（形質変換体）
本発明の形質変換体は、上述した遺伝子により形質変換される。
形質変換体の作製は、植物の種類に応じて公知の方法で行えばよい。なお、かかる植物としては、上述した単子葉植物や双子葉植物が用いられる。
本発明の形質変換体は、上述した遺伝子により形質変換される。
形質変換体の作製は、植物の種類に応じて公知の方法で行えばよい。なお、かかる植物としては、上述した単子葉植物や双子葉植物が用いられる。
例えば、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer ToPlants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、減圧処理又は加圧処理とエレクトロポーレーションとにより細胞又は組織へ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（減圧処理／加圧処理の使用を含むエレクトロポーレーション方法（特表２００５−５３４２９９号））、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9:957-962.）及びアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（超迅速単子葉形質転換法（特許第３１４１０８４号））等が挙げられる。
形質変換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。
再分化の方法としては、植物細胞の種類により異なるが、例えば、シロイヌナズナであればＡｋａｍａ等（Plant Cell Reports12:7-11 (1992)）の方法が挙げられ、イネであればＦｕｊｉｍｕｒａ等（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられる。
再分化の方法としては、植物細胞の種類により異なるが、例えば、シロイヌナズナであればＡｋａｍａ等（Plant Cell Reports12:7-11 (1992)）の方法が挙げられ、イネであればＦｕｊｉｍｕｒａ等（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられる。
ゲノム内に本発明の耐虫性遺伝子あるいは本発明の耐虫性遺伝子の発現を抑制するＤＮＡが導入された形質変換植物体が得られれば、形質変換植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。
また、形質変換植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に形質変換植物体を量産することも可能である。なお、上記形質変換植物体には、耐虫性遺伝子が導入された植物体のみならず、耐虫性タンパク質の調製のために耐虫性遺伝子が導入されたものも含まれる。
上記形質変換体には、本発明の耐虫性遺伝子が導入された植物細胞、該植物細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローンが含まれ、更に該植物体、その子孫及びクローンの繁殖材料が含まれる。
例えば、昆虫（カイコ）の場合、ｐｉｇｇｙＢａｃをもとに作製した組換えベクターを田村らの方法（Nat.Biotechnol.18,81-84,2000）を利用して形質変換すればよい。
例えば、昆虫（カイコ）の場合、ｐｉｇｇｙＢａｃをもとに作製した組換えベクターを田村らの方法（Nat.Biotechnol.18,81-84,2000）を利用して形質変換すればよい。
本発明の形質変換体によれば、上記遺伝子により形質変換された植物において、煩雑な農薬散布の作業が省けると共に、茎等の植物組織内部に潜み、農薬をかけにくい害虫に対しても容易に効果を発揮できる。
（回収タンパク質）
本発明の回収タンパク質は、上記宿主細胞、上記植物細胞、上記形質変換体から回収される。
例えば、宿主細胞内で発現させた組換えタンパク質は、宿主細胞又はその培養上清から、公知の方法により精製し、タンパク質を回収することが可能である。なお、組換えタンパク質を上記のマルトース結合タンパク質等との融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
本発明の回収タンパク質は、上記宿主細胞、上記植物細胞、上記形質変換体から回収される。
例えば、宿主細胞内で発現させた組換えタンパク質は、宿主細胞又はその培養上清から、公知の方法により精製し、タンパク質を回収することが可能である。なお、組換えタンパク質を上記のマルトース結合タンパク質等との融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
本発明の耐虫性遺伝子が導入された形質変換体である微生物、培養細胞、多細胞動植物、昆虫等を作製し、該形質変換体に発現させ回収タンパク質を回収できる。
かかる回収タンパク質は、散布することにより耐虫性の農薬等の耐虫剤として用いることができる。
かかる回収タンパク質は、散布することにより耐虫性の農薬等の耐虫剤として用いることができる。
（耐虫剤）
本発明の耐虫剤は、上述した耐虫性タンパク質、又は、上述した耐虫性遺伝子、を有効成分とする。
本発明の耐虫剤は、上述した耐虫性タンパク質、又は、上述した耐虫性遺伝子、を有効成分とする。
上記耐虫性タンパク質を耐虫剤として用いる場合、耐虫性タンパク質を含む微生物、植物、動物等の生物を粗精製又は精製したもの、また、該生物に耐虫性タンパク質を発現させたものから生化学的手法で耐虫性タンパク質を粗精製又は精製したものが用いられる。なお、これらの粗精製又は精製したものを、精製耐虫性タンパク質という。
精製耐虫性タンパク質の形態は、液状、粉状、顆粒状、錠剤等で用いられる。なお、これらの耐虫剤には、増量剤、展着剤等を適宜加えてもよい。
耐虫剤に含まれる精製耐虫性タンパク質の含有割合は、耐虫剤全量に対して、０．０１質量％以上であればよく、確実性の観点から０．０２質量％以上であることが好ましい。
このように、本発明の耐虫性タンパク質によれば、少量であっても十分な耐虫性を発揮する。
このように、本発明の耐虫性タンパク質によれば、少量であっても十分な耐虫性を発揮する。
上記耐虫性遺伝子を耐虫剤として用いる場合、耐虫性遺伝子を含む微生物、植物、動物等の生物を粗精製又は精製したもの、また、該生物に耐虫性遺伝子を発現させたものから生化学的手法で耐虫性遺伝子を粗精製又は精製したものが用いられる。
なお、これらの粗精製又は精製したものを、精製耐虫性遺伝子という。
なお、これらの粗精製又は精製したものを、精製耐虫性遺伝子という。
精製耐虫性遺伝子の形態は、液状、粉状、顆粒状、錠剤等で用いられる。なお、これらの耐虫剤には、増量剤、展着剤等を適宜加えてもよい。
耐虫剤に含まれる精製耐虫性遺伝子の含有割合は、耐虫剤全量に対して、０．０１質量％以上であればよく、確実性の観点から０．０２質量％以上であることが好ましい。
このように、本発明の耐虫性遺伝子によれば、少量であっても十分な耐虫性を発揮する。
このように、本発明の耐虫性遺伝子によれば、少量であっても十分な耐虫性を発揮する。
以下、本発明を実施例で具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（耐虫性タンパク質の搾取）
クワ科植物（品種しんいちのせ）の乳液を５００μｌ抽出し、この乳液を遠心分離（製品名：ＫＵＢＯＴＡインバーターマイクロ冷却遠心機１９２０、クボタ社製）で遠心分離した。なお、遠心分離の条件は、回転速度１３０００ｒｐｓ、１５分間であった。
そして、分離された上清を取出し、０．４５μｍのフィルターでろ過した。
クワ科植物（品種しんいちのせ）の乳液を５００μｌ抽出し、この乳液を遠心分離（製品名：ＫＵＢＯＴＡインバーターマイクロ冷却遠心機１９２０、クボタ社製）で遠心分離した。なお、遠心分離の条件は、回転速度１３０００ｒｐｓ、１５分間であった。
そして、分離された上清を取出し、０．４５μｍのフィルターでろ過した。
次に、電気泳動を行った。
電気泳動は、上清４００μｌを等量のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ緩衝液と混ぜ、さらに、１２．５％（体積に対する質量の割合）となるようにポリアミドゲルを投入し、非変性条件（室温（２５℃）、ｐＨ６．８〜８．８）でＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。
得られた結果を図１の（ａ）に示す。
電気泳動は、上清４００μｌを等量のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ緩衝液と混ぜ、さらに、１２．５％（体積に対する質量の割合）となるようにポリアミドゲルを投入し、非変性条件（室温（２５℃）、ｐＨ６．８〜８．８）でＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。
得られた結果を図１の（ａ）に示す。
そして、図１の（ａ）に示す番号１〜６のバンド部分のゲルをそれぞれ切り出し、１．０ｍｌのＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ６．８）に浸し、４℃で一晩培養し、タンパク質溶液を得た。
以下、得られた番号１〜６のタンパク質溶液をそれぞれフラクション１〜６という。
なお、フラクション１には５０〜６０ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれており、フラクション２には４４，１８ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれており、フラクション３には６０ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれており、フラクション４には４２ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれており、フラクション５にはタンパク質が殆ど含まれておらず、フラクション６には３０，２５ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれていた。
以下、得られた番号１〜６のタンパク質溶液をそれぞれフラクション１〜６という。
なお、フラクション１には５０〜６０ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれており、フラクション２には４４，１８ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれており、フラクション３には６０ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれており、フラクション４には４２ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれており、フラクション５にはタンパク質が殆ど含まれておらず、フラクション６には３０，２５ｋＤａのバンドから得られるタンパク質が含まれていた。
（実験内容）
（主要画分の調査）
フラクション１〜６についてタンパク定量をビシンコニン法（BCA Protein Assay Reagent Kit、PIERCE社）で行い、精製し、それぞれについてSDS-PAGE電気泳動（１５％ゲル、１５μｌ/ｌａｎｅ）を行った。
得られた結果の泳動像を図１の（ｂ）に示す。なお、図１の（ｂ）中、Ｍは分子マーカーを意味する。
この結果から、フラクション１〜３が、乳液タンパク質の主要画分であることが明らかとなった。
（主要画分の調査）
フラクション１〜６についてタンパク定量をビシンコニン法（BCA Protein Assay Reagent Kit、PIERCE社）で行い、精製し、それぞれについてSDS-PAGE電気泳動（１５％ゲル、１５μｌ/ｌａｎｅ）を行った。
得られた結果の泳動像を図１の（ｂ）に示す。なお、図１の（ｂ）中、Ｍは分子マーカーを意味する。
この結果から、フラクション１〜３が、乳液タンパク質の主要画分であることが明らかとなった。
（耐虫性評価１）
フラクション１〜６それぞれのタンパク質緩衝液３０μｌと、Ｌ４Ｍ（広食性昆虫用人工飼料、乾燥粉末１：水２．５を加えて蒸した湿体飼料、日本農産工業製）１００ｍｇとを混合し、エリサン（ヤママユガ科の広食性の鱗翅目昆虫）孵化幼虫に摂食させ、２日後、４日後の体重を測定した。なお、このときのフラクション１及びフラクション２のタンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍｌであり、フラクション３のタンパク質濃度は、０．４ｍｇ／ｍｌであった。
フラクション１〜３について得られた結果のグラフを図２に示す。なお、図２中、縦軸は孵化幼虫の体重（ｗｅｉｇｈｔ）を示し、横軸は日数（ｄａｙ）を示す。
フラクション１〜６それぞれのタンパク質緩衝液３０μｌと、Ｌ４Ｍ（広食性昆虫用人工飼料、乾燥粉末１：水２．５を加えて蒸した湿体飼料、日本農産工業製）１００ｍｇとを混合し、エリサン（ヤママユガ科の広食性の鱗翅目昆虫）孵化幼虫に摂食させ、２日後、４日後の体重を測定した。なお、このときのフラクション１及びフラクション２のタンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍｌであり、フラクション３のタンパク質濃度は、０．４ｍｇ／ｍｌであった。
フラクション１〜３について得られた結果のグラフを図２に示す。なお、図２中、縦軸は孵化幼虫の体重（ｗｅｉｇｈｔ）を示し、横軸は日数（ｄａｙ）を示す。
図２に示すように、分子量が５０〜６０ｋＤａである画分のフラクション１においては、顕著な耐虫性活性（成長阻害活性）が認められた。一方、フラクション２及び３には耐虫性活性（成長阻害活性）は認められなかった。
また、図示しないが、フラクション４〜６にも全く耐虫性活性は認められなかった。
また、図示しないが、フラクション４〜６にも全く耐虫性活性は認められなかった。
（耐虫性評価２）
フラクション１のタンパク質溶液を、Ｌ４Ｍ１ｇに対して、０（Ｃｏｎｔｒｏｌ）,９０，１８０，２７０μｇとなるように混合し、エリサン孵化幼虫に摂食させ、２日後及び４日後の体重を測定した。
得られた結果のグラフを図３に示す。なお、図３中、縦軸は孵化幼虫の体重（ｗｅｉｇｈｔ）を示し、横軸は日数（ｄａｙ）を示す。
フラクション１のタンパク質溶液を、Ｌ４Ｍ１ｇに対して、０（Ｃｏｎｔｒｏｌ）,９０，１８０，２７０μｇとなるように混合し、エリサン孵化幼虫に摂食させ、２日後及び４日後の体重を測定した。
得られた結果のグラフを図３に示す。なお、図３中、縦軸は孵化幼虫の体重（ｗｅｉｇｈｔ）を示し、横軸は日数（ｄａｙ）を示す。
図３から明らかなように、本発明に係るフラクション１に含まれるタンパク質は、９０，１８０μｇ／ｇの濃度（湿体飼料当たり０．０１〜０．０２質量％、乾燥飼料当たり０．０３〜０．０６質量％、食餌タンパク質当たり０．１〜０．２％）の低濃度で成長量（体重増加量）を半分にできることが確認された。
また、成長阻害効果は２日後にも顕著に現れ、２日後でも体重増加が半分程度になるなど（４日後では更に増加が抑えられる）短時間で顕著な成長阻害効果を持つことが明らかとなった。
上述の濃度はこれまで発見され実用化にむけて研究されているタンパク質に比べて１０〜１００倍以上低く、このタンパク質が単位重量あたり以前から用いられてきた耐虫性タンパク質（アミラーゼインヒビター・レクチン・プロテアーゼインヒビター）の１０〜１００倍の効果を持つといえる。
上述の濃度はこれまで発見され実用化にむけて研究されているタンパク質に比べて１０〜１００倍以上低く、このタンパク質が単位重量あたり以前から用いられてきた耐虫性タンパク質（アミラーゼインヒビター・レクチン・プロテアーゼインヒビター）の１０〜１００倍の効果を持つといえる。
（耐虫性評価３）
フラクション１のタンパク質溶液を、Ｌ４Ｍ１ｇに対して、０（Ｃｏｎｔｒｏｌ）,１２０，３００μｇとなるように混合し、Mamestra属のヨトウガ（Mamestra brassicae）の孵化幼虫に摂食させ、６日後及び１０日後の体重を測定した。
得られた結果のグラフを図４に示す。なお、図４中、縦軸は孵化幼虫の体重（ｗｅｉｇｈｔ）を示し、横軸は日数（ｄａｙ）を示す。
フラクション１のタンパク質溶液を、Ｌ４Ｍ１ｇに対して、０（Ｃｏｎｔｒｏｌ）,１２０，３００μｇとなるように混合し、Mamestra属のヨトウガ（Mamestra brassicae）の孵化幼虫に摂食させ、６日後及び１０日後の体重を測定した。
得られた結果のグラフを図４に示す。なお、図４中、縦軸は孵化幼虫の体重（ｗｅｉｇｈｔ）を示し、横軸は日数（ｄａｙ）を示す。
図４から明らかなように、本発明に係るフラクション１に含まれるタンパク質は、１２０，３００μｇ／ｇの低濃度で成長量（体重増加量）を半分以下にできることが確認された。
（プロテアーゼ耐性）
フラクション１のタンパク質溶液を、表１に示すような配合でプロテアーゼあるいは昆虫消化液と混合して処理し、得られたサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うことでプロテアーゼ耐性を調査した。なお、かかる調査は、ｐＨ８．８、３７℃、２４時間の条件下で行った。
得られた結果の泳動像を図５に示す。
フラクション１のタンパク質溶液を、表１に示すような配合でプロテアーゼあるいは昆虫消化液と混合して処理し、得られたサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うことでプロテアーゼ耐性を調査した。なお、かかる調査は、ｐＨ８．８、３７℃、２４時間の条件下で行った。
得られた結果の泳動像を図５に示す。
図５のＮｏ２，３，６，７から明らかなように、本発明に係るフラクション１に含まれるタンパク質は、５０〜６０ｋＤａの位置に、バンドが認められることから、昆虫の消化液のタンパク質分解酵素を始め、種々のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）に全く分解されないことがわかった。なお、図５のＮｏ４，５，８，９から、このバンドは、プロテアーゼに基づくものではない。
このことから、本発明の耐虫性タンパク質は、プロテアーゼ活性が高い昆虫消化管内であっても、活性を維持し作用させることができるといえる。
このことから、本発明の耐虫性タンパク質は、プロテアーゼ活性が高い昆虫消化管内であっても、活性を維持し作用させることができるといえる。
以上より、本発明の耐虫性タンパク質によれば、少量であっても虫に対して十分な耐虫性を示すことが確認された。
本発明の耐虫性タンパク質、耐虫性遺伝子は、少量であっても十分な耐虫性を発揮する。したがって、これらは、殺虫剤、農薬、耐虫用餌等の耐虫剤として好適に用いられる。
Claims (21)
- 植物由来の耐虫性タンパク質であって、
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第１アミノ酸配列と、
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第２アミノ酸配列と、
配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第３アミノ酸配列と、
を有し、且つ
前記第２アミノ酸配列がｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する耐虫性タンパク質。 - 前記第２アミノ酸配列が、前記第１アミノ酸配列と前記第３アミノ酸配列との間に位置する請求項１記載の耐虫性タンパク質。
- 植物由来の耐虫性タンパク質であって、
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第４アミノ酸配列からなり、ｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する耐虫性タンパク質。 - 植物由来の耐虫性タンパク質であって、
配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する相同性が５０％以上の第５アミノ酸配列からなり、ｓｐｐｐｐ配列を少なくとも１つ有する耐虫性タンパク質。 - 前記植物がクワ科植物であり、該クワ科植物の乳液から抽出される請求項１記載の耐虫性タンパク質。
- クワ科植物の乳液を抽出し、該乳液を遠心分離して上清を分離し、該上清を非変性条件で電気泳動させて分画し、分子量が５０〜６０ｋＤａである画分から採取することにより得られる耐虫性タンパク質。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の耐虫性タンパク質をコードする耐虫性遺伝子。
- 植物由来の耐虫性遺伝子であって、
配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡに対する相同性が５０％以上の第６ＤＮＡを有し、ｓｐｐｐｐ配列をコードする塩基配列を少なくとも１つ有する耐虫性遺伝子。 - 前記第６ＤＮＡと、相補的な塩基配列からなるＤＮＡとがストリンジェントな条件下でハイブリダイズされている請求項８記載の耐虫性遺伝子。
- 植物由来の耐虫性遺伝子であって、
配列表の配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに対する相同性が５０％以上の第７ＤＮＡを有し、ｓｐｐｐｐ配列をコードする塩基配列を少なくとも１つ有する耐虫性遺伝子。 - 前記第７ＤＮＡと、相補的な塩基配列からなるＤＮＡとがストリンジェントな条件下でハイブリダイズされている請求項１０記載の耐虫性遺伝子。
- 請求項８〜１１のいずれか一項に記載の耐虫性遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項１２記載の組換えベクターが導入された宿主細胞。
- 請求項１２記載の組換えベクターが導入された植物細胞。
- 請求項８〜１１のいずれか一項に記載の耐虫性遺伝子により形質変換された形質変換体。
- 請求項８〜１１のいずれか一項に記載の耐虫性遺伝子により形質変換された形質変換体の製造方法。
- 請求項１３記載の宿主細胞により回収された回収タンパク質。
- 請求項１４記載の植物細胞により回収された回収タンパク質。
- 請求項１５又は請求項１６に記載の形質変換体により回収された回収タンパク質。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の耐虫性タンパク質を有効成分とする耐虫剤。
- 請求項８〜１１のいずれか一項に記載の耐虫性遺伝子を有効成分とする耐虫剤。
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