UA124757C2 - Інсектицидний поліпептид проти лускокрилого або твердокрилого шкідника та його застосування - Google Patents

Інсектицидний поліпептид проти лускокрилого або твердокрилого шкідника та його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA124757C2
UA124757C2 UAA201704588A UAA201704588A UA124757C2 UA 124757 C2 UA124757 C2 UA 124757C2 UA A201704588 A UAA201704588 A UA A201704588A UA A201704588 A UAA201704588 A UA A201704588A UA 124757 C2 UA124757 C2 UA 124757C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
sequence
polypeptide
amino acid
protein
plant
Prior art date
Application number
UAA201704588A
Other languages
English (en)
Inventor
Андре Р. Абад
Андрэ Р. Абад
Ендрю К. Кроу
Эндрю К. Кроу
Бред ПОЛАНД
Брэд Поланд
Сяомей Ши
Томас Ч. Вулф
Original Assignee
Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк.
Пионир Хай-Бред Интернэшнл, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк., Пионир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. filed Critical Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк.
Publication of UA124757C2 publication Critical patent/UA124757C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Винахід стосується нуклеїнової кислоти, одержаної із штаму Bacillus thuringiensis, який кодує поліпептид з інсектицидною активністю щодо комах-шкідників, у тому числі Lepidoptera та Coleoptera, інсектицидної композиції, рослини, що містить таку нуклеїнову кислоту, та їх застосування в способах контролю лускокрилого та твердокрилого шкідників рослин.

Description

ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕНИЙ В ЕЛЕКТРОННОМУ
ВИГЛЯДІ
Перелік послідовностей із назвою файла "б6059УМОРСТ зедиепсе Ііб(пд", створений 20 серпня 2015 року та розміром 53 кілобайти, подається у машиночитальній формі одночасно з даним описом. Перелік послідовностей є частиною даного опису та включений у даний документ за допомогою посилання в усій своїй повноті.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Дане розкриття відноситься до нуклеїнових кислот, що зустрічаються в природних умовах, та рекомбінантних нуклеїнових кислот, одержаних із нових генів Васійи5 іигіпдіепвів, які кодують пестицидні поліпептиди, що характеризуються пестицидною активністю щодо комах- шкідників. У композиціях та способах згідно з даним винаходом використовуються розкриті нуклеїнові кислоти та пестицидні поліпептиди, що кодуються ними, для контролю шкідників рослин.
ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ
Комахи-шкідники є основним фактором, що завдає шкоди сільськогосподарським культурам у світі. Наприклад, живлення совок, пошкодження совкою-іпсилон або пошкодження вогнівкою кукурудзяною можуть бути спустошувальними в економічному плані для сільськогосподарських виробників. Пов'язана з комахою-шкідником шкода, зумовлена нападами вогнівки кукурудзяної тільки на польову та солодку кукурудзу, досягла приблизно одного мільярда доларів на рік за збитками внаслідок пошкодження та витратами на контроль.
Традиційно головним способом впливу на популяції комах-шкідників є застосування хімічних інсектицидів широкого спектра дії. Проте споживачі, а також органи державного регулювання стають все більш стурбованими ризиком несприятливого впливу на довкілля, пов'язаного з одержанням та застосуванням синтетичних хімічних пестицидів. Унаслідок таких побоювань органи державного регулювання заборонили або обмежили застосування деяких із більш небезпечних пестицидів. Таким чином, розробка альтернативних пестицидів становить значний інтерес.
Біологічний контроль комах-шкідників, що мають сільськогосподарське значення, із застосуванням мікробного агента, такого як гриби, бактерії або інші види комах, являє собою
Зо альтернативу синтетичним хімічним пестицидам, яка не справляє негативного впливу на довкілля та є привабливою з комерційного погляду. Загалом можна сказати, що застосування біопестицидів викликає менший ризик забруднення та несприятливих впливів на довкілля та біопестициди забезпечують більшу специфічність щодо мішені, ніж та, яка притаманна традиційним хімічним інсектицидам широкого спектра дії. Крім того, найчастіше виробництво біопестицидів коштує дешевше, та, внаслідок цього, поліпшується економічно ефективний вихід продукції для широкого спектра сільськогосподарських культур.
Певні види мікроорганізмів із роду Васіїш5, як відомо, мають пестицидну активність щодо широкого спектра комах-шкідників, у тому числі І ерідорієга, Оірієга, СоІєорієга, Нетірієга та інших. Васійи5 пигіпдіеєпвів (ВО та Васійи5 раріїїає відносяться до найбільш успішних засобів біологічного контролю, виявлених на сьогодні. Патогенність щодо комах також приписували штамам В. Іагуає, В. Іепійтогрив, В. 5рпаєгтісив (Нагмоок, єй., (1989) Васіййив5 (Ріепит Ргевв5), 306) та В. сегеиб5 (ММО 96/10083). Як з'ясувалося, пестицидна активність сконцентрована у параспоральних кристалічних білкових включеннях, хоча пестицидні білки також були виділені з
Васійи5 на вегетативній стадії росту. Декілька генів, що кодують ці пестицидні білки, були виділені та охарактеризовані (див., наприклад, патенти США МоМо 5366892 та 5840868).
Мікробні інсектициди, зокрема одержані зі штамів Васійй5, відіграють важливу роль у сільському господарстві як альтернатива хімічному контролю шкідників. Нещодавно науковці, які працюють у галузі сільського господарства, створили культурні рослини з поліпшеною стійкістю до комах за допомогою генної інженерії культурних рослин, так щоб вони продукували пестицидні білки, що походять із Васійй5. Наприклад, за допомогою генної інженерії були створені рослини кукурудзи та бавовнику для продукування пестицидних білків, виділених із штамів Ві (див., наприклад, Агопзоп (2002) СеїЇ Мої. І Ме сі. 59(3):417-425; ЗеНпері єї а)ї. (1998)
Місторіо! Мої Віо! Неу. 62(3):775-806). Ці сільськогосподарські культури, створені за допомогою генної інженерії, на сьогодні широко застосовуються в американському сільському господарстві та надають фермеру альтернативу традиційним способам контролю комах, яка не чинить негативного впливу на довкілля. Крім того, різновиди картоплі, змінені за допомогою генної інженерії таким чином, щоб вони містили пестицидні Сгу-токсини, реалізовувалися американськими фермерами. Незважаючи на те, що вони були визнані дуже комерційно успішними, ці створені за допомогою генної інженерії стійкі до комах культурні рослини 60 забезпечують стійкість тільки до вузького діапазону економічно важливих комах-шкідників.
Відповідно, залишається потреба у нових токсинах Ві з більш широким спектром інсектицидної активності щодо комах-шкідників, наприклад, токсинах, активних щодо більшого діапазону комах із ряду І ерідорієга. Крім того, залишається потреба у біопестицидах, які мають активність щодо деякого діапазону комах-шкідників, та в біопестицидах, які мають поліпшену інсектицидну активність.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Передбачаються композиції та способи здійснення впливу на комах-шкідників. Більш конкретно варіанти здійснення даного винаходу відносяться до способів здійснення впливу на комах із використанням нуклеотидних послідовностей, що кодують інсектицидні пептиди, для одержання трансформованих мікроорганізмів та рослин, які експресують інсектицидний поліпептид згідно з варіантами здійснення. У деяких варіантах здійснення нуклеотидні послідовності кодують поліпептиди, що є пестицидними щонайменше для однієї комахи, яка належить до ряду І ерідоріега.
Варіанти здійснення передбачають молекули нуклеїнової кислоти, а також їх фрагменти та варіанти, які кодують поліпептиди, що мають пестицидну активність щодо комах-шкідників (наприклад, 5ЕО І МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІО МО: 7 або 5ЕО ІО МО: 9).
Нуклеотидна послідовність дикого типу (наприклад, що зустрічається в природних умовах) згідно з варіантами здійснення, яка була одержана з Ві, кодує інсектицидний пептид. Варіанти здійснення додатково передбачають фрагменти та варіанти розкритої нуклеотидної послідовності, які кодують біологічно активні (наприклад, інсектицидні) поліпептиди.
Варіанти здійснення додатково передбачають виділені пестицидні (наприклад, інсектицидні) поліпептиди, які кодуються або нуклеїновою кислотою, що зустрічається в природних умовах, або модифікованою (наприклад, підданою мутагенезу або маніпуляції) нуклеїновою кислотою згідно з варіантами здійснення. У конкретних прикладах пестицидні білки згідно з варіантами здійснення включають фрагменти білків та поліпептидів повної довжини, що одержані з нуклеїнових кислот, підданих мутагенезу, сконструйованих для введення конкретних амінокислотних послідовностей у поліпептиди згідно з варіантами здійснення. У конкретних варіантах здійснення поліпептиди мають посилену пестицидну активність порівняно з активністю поліпептиду, що зустрічається в природних умовах, з якого вони одержані.
Нуклеїнові кислоти згідно з варіантами здійснення також можна застосовувати для одержання трансгенних (наприклад, трансформованих) однодольних або дводольних рослин, які характеризуються геномами, що містять щонайменше одну стабільно вбудовану нуклеотидну конструкцію, що містить кодувальну послідовність згідно з варіантами здійснення, функціонально пов'язану з промотором, який керує експресією кодованого пестицидного поліпептиду. Відповідно, також передбачаються трансформовані рослинні клітини, тканини рослин, рослини та їхнє насіння.
У конкретному варіанті здійснення трансформовану рослину можна одержати із застосуванням нуклеїнової кислоти, що була оптимізована для підвищеної експресії у рослині- хазяїні. Наприклад, один із пестицидних поліпептидів згідно з варіантами здійснення може бути відтворений за поліпептидною послідовністю з одержанням нуклеїнової кислоти, що містить кодони, оптимізовані для експресії у конкретному хазяїні, наприклад, у культурній рослині, такій як рослина кукурудзи (7еа тау5). Експресія кодувальної послідовності такою трансформованою рослиною (наприклад, дводольною або однодольною) буде приводити в результаті до продукування пестицидного поліпептиду та надавати рослині підвищену стійкість до комах.
Деякі варіанти здійснення передбачають трансгенні рослини, що експресують пестицидні поліпептиди, які знаходять застосування у способах здійснення впливу на різних комах- шкідників.
Варіанти здійснення додатково включають пестицидні або інсектицидні композиції, що містять інсектицидні поліпептиди згідно з варіантами здійснення, та при цьому вони необов'язково можуть містити додаткові інсектицидні пептиди. Варіанти здійснення охоплюють застосування таких композицій щодо середовища існування комах-шкідників з метою впливу на комах-шкідників.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Варіанти здійснення даного винаходу спрямовані на композиції та способи здійснення впливу на комах-шкідників, особливо на шкідників рослин. Більш конкретно, виділена нуклеїнова кислота згідно з варіантами здійснення, а також її фрагменти та варіанти містять нуклеотидні послідовності, які кодують пестицидні поліпептиди (наприклад, білки). Розкриті пестицидні білки є біологічно активними (наприклад, пестицидними) щодо комах-шкідників, таких як, без обмеження, комахи-шкідники ряду І ерідорієга. 60 Композиції згідно з варіантами здійснення передбачають виділені нуклеїнові кислоти, а також їхні фрагменти та варіанти, які кодують пестицидні поліпептиди, касети експресії, що містять нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення, виділені пестицидні білки та пестицидні композиції. Деякі варіанти здійснення передбачають модифіковані пестицидні поліпептиди, що мають поліпшену інсектицидну активність щодо лускокрилих порівняно з пестицидною активністю відповідного білка дикого типу. Варіанти здійснення додатково передбачають рослини та мікроорганізми, трансформовані цими новими нуклеїновими кислотами, та способи, що включають застосування таких нуклеїнових кислот, пестицидних композицій, трансформованих організмів та продуктів з них при здійсненні впливу на комах- шкідників.
Нуклеїнові кислоти та нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення можна застосовувати для трансформації будь-якого організму для продукування пестицидних білків, що кодуються ними. Передбачаються способи, які включають застосування таких трансформованих організмів для впливу на шкідників рослин або для їх контролю. Нуклеїнові кислоти та нуклеотидні послідовності згідно 3 варіантами здійснення можна також застосовувати для трансформації органел, таких як хлоропласти (МеоВгіде еї аї. (1995)
ВіоїесппоЇоду 13: 362-365 та Коїа вії а. (1999) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 96: 1840-1845).
Крім цього, варіанти здійснення відносяться до ідентифікації фрагментів та варіантів кодувальної послідовності, що зустрічається в природних умовах, які кодують біологічно активні пестицидні білки. Нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення знаходять безпосереднє застосування у способах здійснення впливу на шкідників, особливо на комах- шкідників, таких як шкідники з ряду І ерідорієга. Відповідно, варіанти здійснення передбачають нові підходи до здійснення впливу на комах-шкідників, які не залежать від застосування традиційних синтетичних хімічних інсектицидів. Варіанти здійснення передбачають виявлення біорозкладаних пестицидів, що зустрічаються в природних умовах, та генів, які їх кодують.
Варіанти здійснення додатково передбачають фрагменти та варіанти кодувальної послідовності, що зустрічається в природних умовах, які також кодують біологічно активні (наприклад, пестицидні) поліпептиди. Нуклеїнові кислоти згідно з варіантами здійснення охоплюють послідовності нуклеїнової кислоти або нуклеотидні послідовності, які були оптимізовані для експресії клітинами конкретного організму, наприклад, послідовності нуклеїнової кислоти, які були відтворені за поліпептидною послідовністю (тобто піддані "зворотній трансляції") із застосуванням переважних для рослин кодонів, виходячи з амінокислотної послідовності поліпептиду з посиленою пестицидною активністю. Варіанти здійснення додатково передбачають мутації, які надають поліпшених або змінених властивостей поліпептидам згідно з варіантами здійснення. Див., наприклад, патент США Мо 7462760.
У подальшому описі широко застосовується ряд виразів. Наступні визначення представлені для спрощення розуміння варіантів здійснення.
Одиниці вимірювання, префікси та символи можна позначити у формі, прийнятій у системі
СІ. Якщо не вказано інше, нуклеїнові кислоти записані зліва направо в орієнтації від 5'до 3; амінокислотні послідовності записані, відповідно, зліва направо у напрямку від аміногрупи до карбоксигрупи. Числові діапазони включають числа, що визначають діапазон. Амінокислоти в даному документі можуть бути названі або за їхніми загальновідомими трилітерними символами, або за однолітерними символами, рекомендованими комісією з біохімічної номенклатури ІШРАС-ІШВ. Нуклеотиди, таким же чином, можуть позначатися їх загальноприйнятими однолітерними кодами. Вищезгадані терміни більш повно визначені з посиланням на даний опис у цілому.
Як застосовується в даному документі, "нуклеїнова кислота" включає посилання на дезоксирибонуклеотидний або рибонуклеотидний полімер або в одно-, або в двонитковій формі, та, якщо термін не обмежений іншим чином, охоплює відомі аналоги (наприклад, пептидо- нуклеїнові кислоти), що мають основні властивості природних нуклеотидів, які полягають у тому, що вони гібридизуються з однонитковими нуклеїновими кислотами подібно до нуклеотидів, що зустрічаються в природних умовах.
Як застосовується в даному документі, терміни "що кодує" або "що кодується", якщо вони застосовуються в контексті певної нуклеїнової кислоти, означають, що нуклеїнова кислота містить необхідну інформацію для керування трансляцією нуклеотидної послідовності з одержанням певного білка. Інформація, якою кодується білок, визначається застосуванням кодонів. Нуклеїнова кислота, що кодує білок, може містити нетрансльовані послідовності (наприклад, інтрони) в межах трансльованих ділянок нуклеїнової кислоти або може не містити таких нетрансльованих послідовностей, що лежать між ними (наприклад, як у КкДНК). бо Використовувана у даному документі фраза "послідовність повної довжини" щодо певного полінуклеотиду або білка, що кодується ним, означає присутність повної послідовності нуклеїнової кислоти або повної амінокислотної послідовності нативної (несинтетичної) ендогенної послідовності. Полінуклеотид повної довжини кодує повнорозмірну каталітично активну форму певного білка.
Застосовуваний у даному документі термін "антисенсова" при використанні в контексті орієнтації нуклеотидної послідовності відноситься до дуплексної послідовності полінуклеотиду, яка функціонально пов'язана з промотором в орієнтації, за якої транскрибується антисенсова нитка. Антисенсова нитка значною мірою комплементарна ендогенному продукту транскрипції, так що трансляція ендогенного продукту транскрипції часто пригнічується. Таким чином, у випадках, коли термін "антисенсова" використовується в контексті конкретної нуклеотидної послідовності, термін відноситься до комплементарної нитки еталонного продукту транскрипції.
Терміни "поліпептид", "пептид" та "білок' використовуються у даному документі взаємозамінно для позначення полімеру з амінокислотних залишків. Терміни використовують щодо амінокислотних полімерів, у яких один або декілька амінокислотних залишків являють собою штучний хімічний аналог відповідної амінокислоти, що зустрічається у природних умовах, а також щодо амінокислотних полімерів, що зустрічаються у природних умовах.
Терміни "залишок", або "амінокислотний залишок", або "амінокислота" застосовуються у даному документі взаємозамінно та належать до амінокислоти, яка вбудована в білок, поліпептид або пептид (у збірному значенні "білок"'). Амінокислота може являти собою амінокислоту, що зустрічається в природних умовах, та, якщо не обмежується іншим чином, вона може охоплювати відомі аналоги природних амінокислот, які можуть функціонувати подібно до амінокислот, що зустрічаються в природних умовах.
Поліпептиди згідно з варіантами здійснення можна одержати або з нуклеїнової кислоти, розкритої у даному документі, або за допомогою застосування стандартних методик молекулярної біології. Наприклад, білок згідно з варіантами здійснення можна одержати шляхом експресії рекомбінантної нуклеїнової кислоти згідно з варіантами здійснення у відповідній клітині-хазяїні або, як альтернатива, за допомогою комбінації процедур ех мімо.
Використовувані у даному документі терміни "виділений" та "очищений" використовуються взаємозамінно та відносяться до нуклеїнових кислот, або поліпептидів, або їх біологічно
Зо активних частин, які практично або по суті не містять компонентів, що в нормі супроводжують нуклеїнову кислоту або поліпептид або взаємодіють з ними, коли вони знаходяться у їх природному оточенні. Таким чином, виділені або очищені нуклеїнова кислота або поліпептид практично не містять інший клітинний матеріал або культуральне середовище при одержанні за допомогою рекомбінантних методик або практично не містять хімічних попередників або інших хімічних продуктів, якщо вони синтезовані хімічним способом. "Виділена" нуклеїнова кислота звичайно не містить послідовностей (таких як, наприклад, послідовності, що кодують білок), які в природних умовах фланкують нуклеїнову кислоту (тобто послідовностей, розташованих на 5'- та 3'-кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого одержана нуклеїнова кислота. Наприклад, у різних варіантах здійснення виділені нуклеїнові кислоти можуть містити менше ніж приблизно 5 т.о., 4 т.0о., 3 т.0.,27.0.,1 т.0., 0,5 т.о. або 0,1 т.о. нуклеотидних послідовностей, які в природних умовах фланкують нуклеїнові кислоти в геномній ДНК клітини, з якої одержана нуклеїнова кислота.
Використовувані в даному документі терміни "виділений" або "очищений", у випадку, коли вони використовуються щодо поліпептиду згідно з варіантами здійснення, означають, що виділений білок практично не містить клітинний матеріал та включає препарати білка, що містять менше ніж приблизно 3095, 2095, 1095 або 595 (за сухою вагою) забруднюючого білка.
Якщо білок згідно з варіантами здійснення або його біологічно активна частина одержані за допомогою методик рекомбінантних ДНК, то культуральне середовище містить менше ніж приблизно 3095, 2095, 1095 або 595 (за сухою вагою) хімічних попередників або хімічних продуктів, які не є білком, що становить інтерес. "Рекомбінантна" молекула нуклеїнової кислоти (або ДНК) застосовується у даному документі для позначення послідовності нуклеїнової кислоти (або ДНК), яка знаходиться у рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. У деяких варіантах здійснення "виділена" або "рекомбінантна" нуклеїнова кислота не містить послідовностей (переважно, послідовностей, що кодують білок), які в природних умовах фланкують нуклеїнову кислоту (тобто послідовностей, розташованих на 5'- та 3-кінцях нуклеїнової кислоти) в геномній ДНК організму, з якого одержана нуклеїнова кислота. У контексті даного розкриття терміни "виділені" або "рекомбінантні" при застосуванні для позначення молекул нуклеїнової кислоти виключають виділені хромосоми. бо Застосовувані у даному документі "послідовність нуклеїнової кислоти, що відрізняється від геномної" або "молекула нуклеїнової кислоти, що відрізняється від геномної" відносяться до молекули нуклеїнової кислоти, яка має одну або декілька змін в послідовності нуклеїнової кислоти порівняно з нативною або геномною послідовністю нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах здійснення зміна щодо нативної або геномної молекули нуклеїнової кислоти включає без обмеження зміни в послідовності нуклеїнової кислоти, обумовлені виродженістю генетичного коду; оптимізацію кодонів послідовності нуклеїнової кислоти для експресії в рослинах; зміни в послідовності нуклеїнової кислоти для введення щонайменше однієї амінокислотної заміни, вставки, делеції та/або додавання порівняно з нативною або геномною послідовністю; видалення одного або декількох інтронів, асоційованих з геномною послідовністю нуклеїнової кислоти; вставку одного або декількох гетерологічних інтронів; делецію однієї або декількох регуляторних ділянок, розташованих вище або нижче, асоційованих з геномною послідовністю нуклеїнової кислоти; вставку однієї або декількох гетерологічних регуляторних ділянок, розташованих вище або нижче; делецію 5'- та/або 3'- нетрансльованої ділянки, асоційованої з геномною послідовністю нуклеїнової кислоти; вставку гетерологічної 5'- та/або 3'-сетрансльованої ділянки та модифікацію сайту поліаденілювання. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти, що відрізняється від геномної, являє собою кДНК. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти, що відрізняється від геномної, являє собою синтетичну послідовність нуклеїнової кислоти.
Буде зрозуміло, що у всій заявці вираз "що містить" або варіанти, такі як "містить" або "який містить", передбачає включення наведеного елемента, цілого числа, або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, а не виключення будь-якого іншого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій.
Використовуваний у даному документі термін "вплив на комах-шкідників" відноситься до здійснення змін щодо живлення, росту та/або поведінки комахи на будь-якій стадії розвитку, у тому числі без обмеження до знищення комахи; затримки росту; запобігання виникненню здатності до репродукції; антифідантної активності тощо.
Використовувані у даному документі терміни "пестицидна активність" та "інсектицидна активність" використовуються як синоніми та відносяться до активності організму або речовини (такої як, наприклад, білок), яку можна виміряти без обмеження за смертністю шкідника, втратою ваги шкідником, відлякуванням шкідника та іншими змінами поведінки та фізичних характеристик шкідника після живлення та впливу протягом відповідного періоду часу. Таким чином, організм або речовина з пестицидною активністю здійснює негативний вплив щонайменше на один вимірюваний параметр пристосовності шкідника. Наприклад, "пестицидні білки" являють собою білки, які проявляють пестицидну активність окремо або в комбінації з іншими білками.
Використовуваний у даному документі термін "пестицидно ефективна кількість" означає кількість речовини або організму, що має пестицидну активність, коли присутня у середовищі існування шкідника. Для кожної речовини або організму пестицидно ефективну кількість визначають емпірично щодо кожного шкідника, на якого здійснюється вплив у конкретному середовищі. Аналогічно, "інсектицидно ефективна кількість" може бути використана для позначення "пестицидно ефективної кількості", якщо шкідник являє собою шкідника-комаху.
Використовувані у даному документі терміни "рекомбінантно сконструйований" або "сконструйований" означають використання технології рекомбінантної ДНК для внесення (наприклад, при конструюванні) зміни в структуру білка, виходячи з розуміння механізму дії білка та аналізу амінокислот, які вводять, видаляють або заміняють.
Використовувані в даному документі терміни "мутантна нуклеотидна послідовність", або "мутація", або "нуклеотидна послідовність, щодо якої здійснювали мутагенез" означають нуклеотидну послідовність, піддану мутагенезу або змінену таким чином, щоб вона містила один або декілька нуклеотидних залишків (наприклад, пару основ), які не присутні у відповідній послідовності дикого типу. Такий мутагенез або зміна полягає в одному або декількох додаваннях, делеціях, або замінах, або заміщеннях залишків нуклеїнової кислоти. Якщо мутації створені шляхом додавання, видалення або заміщення амінокислоти у сайті протеолітичного розщеплення, такі додавання, видалення або заміщення можуть здійснюватись у межах мотиву протеолітичного сайту або прилягати до нього за умови досягнення мети мутації (тобто за умови зміненого протеолізу за даним сайтом).
Мутантна нуклеотидна послідовність може кодувати мутантний інсектицидний токсин, що проявляє поліпшену або знижену інсектицидну активність, або амінокислотну послідовність, що надає поліпшеної або зниженої інсектицидної активності поліпептиду, який її містить.
Використовувані у даному документі терміни "мутант" або "мутація" в контексті білка, 60 поліпептидної або амінокислотної послідовності відносяться до послідовності, яку піддавали мутагенезу або яку змінювали таким чином, щоб вона містила один або декілька амінокислотних залишків, які не присутні у відповідній послідовності дикого типу. Такий мутагенез або зміна полягає в одному або декількох додаваннях, делеціях, або замінах, або заміщеннях амінокислотних залишків. Мутантний поліпептид проявляє поліпшену або знижену інсектицидну активність або являє собою амінокислотну послідовність, що надає поліпшеної інсектицидної активності поліпептиду, який її містить. Таким чином, терміни "мутант" або "мутація" відносяться до будь-чого з мутантної нуклеотидної послідовності та амінокислот, що кодуються ними, або до них обох. Мутантів можна використовувати окремо або у будь-якій сумісній комбінації з іншими мутантами згідно з варіантами здійснення або з іншими мутантами. "Мутантний поліпептид", навпаки, може проявляти зниження інсектицидної активності. У випадку, коли більше ніж одну мутацію додають до конкретної нуклеїнової кислоти або білка, мутації можуть бути додані одночасно або послідовно; якщо послідовно, мутації можуть бути додані у будь-якому придатному порядку.
Використовувані у даному документі терміни "поліпшена інсектицидна активність" або "поліпшена пестицидна активність" відносяться до інсектицидного поліпептиду згідно з варіантами здійснення, який має посилену інсектицидну активність порівняно з активністю відповідного йому білка дикого типу, та/або до інсектицидного поліпептиду, ефективного проти більш широкого спектра комах, та/або до інсектицидного поліпептиду, який характеризується специфічністю щодо комахи, не чутливої до токсичності білка дикого типу. Для висновку про поліпшену або посилену пестицидну активність потрібна демонстрація підвищення пестицидної активності щонайменше на 1095 щодо комахи-мішені або підвищення пестицидної активності щонайменше на 2095, 2595, 3095, 3595, 4095, 4595, 5095, 6095, 7095, 10095, 15095, 20095, або 300965, або більше порівняно з пестицидною активністю інсектицидного поліпептиду дикого типу, визначеною щодо такої ж комахи.
Наприклад, поліпшена пестицидна або інсектицидна активність забезпечується у тих випадках, коли поліпептид здійснює вплив на більш широкий або більш вузький спектр комах порівняно зі спектром комах, на які впливає токсин Ві дикого типу. Більш широкий спектр впливу може бути бажаним у тих випадках, коли необхідна універсальність, тоді як більш вузький спектр впливу може бути бажаним у тих випадках, коли, наприклад, за інших обставин може
Зо здійснюватися вплив на корисних комах при застосуванні або у присутності токсину. Хоча варіанти здійснення не пов'язані з будь-яким конкретним механізмом дії, поліпшену пестицидну активність також можна забезпечити за допомогою змін однієї або декількох характеристик поліпептиду; наприклад, стабільність або тривалість існування поліпептиду у кишечнику комахи може бути збільшеною порівняно зі стабільністю або тривалістю існування відповідного білка дикого типу.
Використовуваний у даному документі термін "токсин" відноситься до поліпептиду, що проявляє пестицидну активність, або інсектицидну активність, або поліпшену пестицидну активність, або поліпшену інсектицидну активність. Токсин "Ві" або "Васійив5 Шитгіпдіепвів", як передбачається, включає більш широкий клас Сгу-токсинів, що виявляються у різних штамах Ві, який включає такі токсини, як, наприклад, Сту15, Сту25 або СтуЗзв5.
Терміни "сайт протеолітичного розщеплення" або "сайт розщеплення" відносяться до амінокислотної послідовності, що надає чутливості до класу протеаз або конкретної протеази таким чином, що поліпептид, який містить цю амінокислотну послідовність, розщеплюється класом протеаз або конкретною протеазою. Сайт протеолітичного розщеплення вважається "чутливим" до протеази(протеаз), яка(які) розпізнає(розпізнають) цей сайт. З рівня техніки відомо, що ефективність розщеплення буде варіювати та що зниження ефективності розщеплення може привести до підвищення стабільності або тривалості існування поліпептиду у кишечнику комахи. Таким чином, протеолітичний сайт може надавати чутливості до більш ніж однієї протеази або класу протеаз, але ефективність розщеплення за цим сайтом може варіювати для різних протеаз. Сайти протеолітичного розщеплення включають, наприклад, сайти для трипсину, сайти для хімотрипсину та сайти для еластази.
Дослідження показало, що протеази кишечника комахи, що відноситься до лускокрилих, включають трипсини, хімотрипсини та еластази. Див., наприклад, І еп2 єї аї. (1991) Агси. Іпзесі
Віоспет. РПузіої!. 16: 201-212 та Недедиз еї аї. (2003) Агсн. Іпзесі Віоспет. РНувіої. 53: 30-47.
Наприклад, приблизно 18 різних трипсинів було виявлено у середній кишці личинки Неїїсомегра аптідега (див. Саїєноизе єї аї. (1997) Іпзесі Віоспет. Мої. Віої. 27: 929-944). Були виявлені переважні сайти-субстрати протеолітичного розщеплення для цих протеаз. Див., наприклад,
Реїегзоп евї а!. (1995) Іпзесі Віоспет. Мо). Віо!ї. 25: 765-774.
Здійснювались спроби зрозуміти механізм дії Ві-токсинів та сконструювати токсини з 60 поліпшеними властивостями. Було показано, що протеази кишечника комахи можуть впливати на дію Стгу-білків Ві, спрямовану на комаху. Деякі протеази активують Сгу-білки за допомогою їх процесингу з форми "протоксину" у токсичну форму або "токсин." Див. Орреп (1999) Аген. Іпзесі
Віоспет. РНув. 42: 1-12 та Саттої! єї а. (1997) 9. Іплмепебгаїє Раїйоїіоду 70: 41-49. Ця активація токсину може включати видалення М- та С-кінцевих пептидів з білка, а також може включати внутрішнє розщеплення білка. Інші протеази можуть розкладати Сту-білки. Див. Орреїй, також там.
Порівняння амінокислотних послідовностей Сту-токсинівіз різною специфічністю виявило п'ять висококонсервативних блоків послідовностей. Що стосується структури, токсини містять три окремих домени, які являють собою, від М- до С-кінця: кластер із семи альфа-спіралей, який бере участь в утворенні пори (що називається "доменом 1"), три антипаралельних бета-листи, які беруть участь у зв'язуванні з клітиною (що називається "доменом 2"), та бета-сендвіч (що називається "доменом 3"). Розташування та властивості цих доменів відомі спеціалісту в даній галузі техніки. Див., наприклад, їі еї аі. (1991) Маїште, 305:815-821 та Мо!гзе еї аї. (2001) зігисішцге, 9:409-417. Якщо згадується конкретний домен, такий як домен 1, слід розуміти, що точні кінцеві характеристики домену стосовно конкретної послідовності не є вирішальними за умови, що послідовність або її частина включає послідовність, яка забезпечує щонайменше будь-яку функцію, що приписується конкретному домену. Таким чином, наприклад, при згадуванні "домену 1" передбачається, що конкретна послідовність включає кластер із семи альфа-спіралей, але точні кінцеві показники послідовності, яка використовується або згадується стосовно даного кластеру, не є вирішальними. Спеціаліст у даній галузі техніки обізнаний у визначенні таких кінцевих характеристик та оцінці таких функцій. Для того щоб краще охарактеризувати та поліпшити Ві-токсини, досліджували штами бактерії Ві. Були виявлено, що препарати кристалів, одержані з культур штамів Ві, мають пестицидну активність щодо численних лускокрилих шкідників (див., наприклад, експериментальний приклад 1).
Здійснювали спробу ідентифікувати нуклеотидні послідовності, які кодують білки кристалів з вибраних штамів, та при цьому нуклеїнові кислоти дикого типу (тобто такі, що зустрічаються в природних умовах) згідно з варіантами здійснення виділяли з цих штамів бактерій, клонували у вектор експресії та трансформували в Е. соїї. Залежно від характеристик даного препарату вважається, що для демонстрації пестицидної активності іноді потрібна попередня обробка трипсином для активації пестицидних білків. Таким чином, зрозуміло, що для деяких пестицидних білків для активації потрібне розщеплення протеазою (наприклад, трипсином, хімотрипсином тощо), тоді як інші білки є біологічно активними (наприклад, пестицидними) за відсутності активації.
Такі молекули можна змінювати за допомогою засобів, описаних, наприклад, у патенті США
Мо 7462760. Крім того, послідовності нуклеїнової кислоти можна сконструювати таким чином, щоб вони кодували поліпептиди, які містять додаткові мутації, що надають поліпшеної або зміненої пестицидної активності порівняно з пестицидною активністю поліпептиду, що зустрічається в природних умовах. Нуклеотидні послідовності таких сконструйованих нуклеїнових кислот містять мутації, які не виявляються в послідовностях дикого типу.
Мутантні поліпептиди згідно з варіантами здійснення звичайно одержують за допомогою способу, який включає стадії одержання послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид родини Сту; аналізу структури поліпептиду для ідентифікації певних сайтів- "мішеней" для мутагенезу генної послідовності, що лежить в основі, виходячи з уявлень про ймовірну функцію домену-мішені та механізму дії токсину; введення однієї або декількох мутацій у послідовність нуклеїнової кислоти з одержанням необхідної зміни в одному або декількох амінокислотних залишках поліпептидної послідовності та аналізу одержаного поліпептиду щодо пестицидної активності.
Багато інсектицидних Ві-токсинів є спорідненими з різними ступенями схожості їхніх амінокислотних послідовностей та третинної структури, та при цьому засоби для одержання кристалічних структур ВІ -токсинів є добре відомими. Ілюстративні результати розрахунку кристалічної структури з високою роздільною здатністю для поліпептидів як СтуЗА, так і СтузВ доступні в літературі. Розрахована структура гена СтуЗА (Ії єї аї. (1991) Маїште 353:815-821) забезпечує розуміння взаємозв'язку між структурою та функцією токсину. Спільний розгляд опублікованих структурних аналізів Ві-токсинів та описаної функції, пов'язаної з конкретними структурами, мотивами тощо, вказує на те, що специфічні ділянки токсину співвідносяться з конкретними функціями та окремими стадіями механізму дії білка. Наприклад, багато токсинів, виділених з Ві, зазвичай описують як такі, що містять три домени: пучок із семи спіралей, який бере участь в утворенні пори, домен з трьох листів, який бере участь у зв'язуванні з рецептором, та бета-сендвіч мотив (І і еї а!. (1991) Майшге 305: 815-821). 60 Як описано в патентах США Мо 7105332 та Мо 7462760, токсичність Сту-білків можна поліпшити шляхом цілеспрямованого впливу на ділянку, розташовану між альфа-спіралями З та 4 у домені 1 токсину. Ця теорія базується на сукупності знань, що стосуються інсектицидних токсинів, у тому числі: 1) про те, що альфа-спіралі 4 та 5 у домені 1 СтуЗА-токсинів, як повідомлялося, вбудовуються у ліпідний бішар клітин, що вистилають середню кишку чутливих комах (Са?/ії еї аіІ. (1998) Ргос. Май). Асад. бсі. ОБА 95: 12289-12294); 2) на знаннях авторів даного винаходу про розташування сайтів розщеплення трипсином та хімотрипсином в амінокислотній послідовності білка дикого типу; 3) на спостереженні, що білок дикого типу був більш активним щодо певних комах після активації іп мйго при обробці трипсином або хімотрипсином; та 4) на повідомленнях про те, що розщеплення токсинів з 3'-кінця призводило в результаті до зниженої токсичності щодо комах.
Для створення нових поліпептидів із посиленою або зміненою пестицидною активністю можна створити ряд мутацій та помістити у різні фонові послідовності. Див., наприклад, патент
США Мо 7462760. Ці мутанти включають без обмеження додавання щонайменше одного додаткового чутливого до протеази сайту (наприклад, сайту розщеплення для трипсину) в ділянку, розташовану між спіралями З та 4 у домені 1; заміщення вихідного чутливого до протеази сайту в послідовності дикого типу відмінним чутливим до протеази сайтом; додавання декількох чутливих до протеази сайтів у конкретному положенні; додавання амінокислотних залишків близько до чутливого до протеази сайту(сайтів) для зміни фолдингу поліпептиду та, таким чином, посилення розщеплення поліпептиду у чутливому до протеази сайті(сайтах); та додавання мутацій для захисту поліпептиду від руйнуючого розщеплення, яке знижує токсичність (наприклад, створення ряду мутацій, за яких амінокислота дикого типу замінюється на валін для захисту поліпептиду від розщеплення). Мутації можна використовувати окремо або в будь-якій комбінації для забезпечення поліпептидів згідно з варіантами здійснення.
Гомологічні послідовності ідентифікували за допомогою пошуку подібності в ненадлишковій (біля) базі даних Національного центру біотехнологічної інформації (МСВІ) із застосуванням
ВГАБТ та РБІ-ВІА5БТ. Гомологічні білки складалися з Стгу-токсинів переважно з Васійн5
Іигіпдієпвів.
Мутація, яка являє собою додатковий або альтернативний чутливий до протеази сайт, може бути чутливою до декількох класів протеаз, таких як серинові протеази, які включають трипсин
Зо та хімотрипсин, або ферментів, таких як еластаза. Таким чином, мутацію, яка являє собою додатковий або альтернативний чутливий до протеази сайт, можна сконструювати для того, щоб сайт легко розпізнавався та/"або розщеплювався категорією протеаз, таких як протеази ссавців або протеази комах. Чутливий до протеази сайт також можна сконструювати таким чином, щоб він розщеплювався конкретним класом ферментів або конкретним ферментом, про який відомо, що він продукується в організмі, таким як, наприклад, хімотрипсином, що продукується бавовняною совкою Неїоїнів 7єа (І еп еї аї. (1991) Агесн. Інзесі Віоспет. РНузвіо!. 16: 201-212). Мутації також можуть надавати стійкість до протеолітичного розщеплення, наприклад, до розщеплення хімотрипсином за С-кінцем пептиду.
Присутність додаткового та/або альтернативного чутливого до протеази сайту в амінокислотній послідовності поліпептиду, що кодується, може поліпшити пестицидну активність та/"або специфічність поліпептиду, що кодується нуклеїновими кислотами згідно з варіантами здійснення. Відповідно, нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення можуть бути рекомбінантно сконструйованими або з ними можуть бути здійснені маніпуляції для одержання поліпептидів із поліпшеною або зміненою інсектицидною активністю та/або специфічністю порівняно з такими у немодифікованого токсину дикого типу. Крім того, мутації, розкриті у даному документі, можна помістити в інші нуклеотидні послідовності або застосовувати у комбінації з ними для забезпечення поліпшених властивостей. Наприклад, чутливий до протеази сайт, який легко розщеплюється хімотрипсином комахи, наприклад хімотрипсином, що виявляється у совки Берта або бавовняної совки (Недедиз еї а!. (2003) Агсн.
Іпзесі Віоспет. РНувіо!ї. 53: 30-47 та | еп? єї аї. (1991) Агсн. Інзесі Віоспет. Рпузіої!. 16: 201-212), можна помістити у фонову послідовність Сту для забезпечення поліпшеної токсичності у цієї послідовності. Таким чином, варіанти здійснення передбачають токсичні поліпептиди з поліпшеними властивостями.
Наприклад, піддана мутагенезу нуклеотидна послідовність Сту може передбачати додаткові мутанти, що містять додаткові кодони, які вводять другу чутливу до трипсину амінокислотну послідовність (додатково до сайту для трипсину, що зустрічається в природних умовах) у поліпептид, що кодується. Альтернативний додатковий мутант згідно з варіантами здійснення передбачає додаткові кодони, сконструйовані для введення щонайменше одного додаткового відмінного чутливого до протеази сайту в поліпептид, наприклад, чутливого до хімотрипсину бо сайту, розташованого безпосередньо у напрямку 5 або 3 від сайту для трипсину, що зустрічається в природних умовах. Альтернативно, можна створити мутантів із заміною, у яких щонайменше один кодон нуклеїнової кислоти, який кодує чутливий до протеази сайт, що зустрічається в природних умовах, зруйнований, а альтернативні кодони введені у послідовність нуклеїнової кислоти з метою забезпечення відмінного (наприклад, заміненого) чутливого до протеази сайту. Мутант із заміщенням також може бути доданий до послідовності
Сту, у якій присутній у поліпептиді, що кодується, сайт розщеплення для трипсину, який зустрічається в природних умовах, зруйнований, а сайт розщеплення для хімотрипсину або еластази введений на його місце.
Вважається, що можна застосовувати будь-яку нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотні послідовності, які являють собою сайти протеолітичного розщеплення або передбачувані сайти протеолітичного розщеплення (наприклад, послідовності, такі як ЕК або
ГКМ), та що точна ідентичність кодонів, використовуваних для введення будь-якого з цих сайтів розщеплення у варіантний поліпептид, може варіювати залежно від застосування, тобто експресії у конкретному виді рослин. Також вважається, що будь-яку з розкритих мутацій можна ввести в будь-яку послідовність полінуклеотиду згідно з варіантами здійснення, яка містить кодони для амінокислотних залишків, що забезпечують нативний сайт розщеплення для трипсину, на який цілеспрямовано впливає модифікація. Відповідно, варіанти або токсинів повної довжини, або їхніх фрагментів можна модифікувати таким чином, щоб вони містили додаткові або альтернативні сайти розщеплення, та при цьому передбачається, що ці варіанти здійснення охоплюються обсягом варіантів здійснення, розкритих у даному документі.
Спеціаліст у даній галузі техніки зрозуміє, що будь-яку корисну мутацію можна додати до послідовностей згідно з варіантами здійснення за умови, що поліпептиди, що кодуються, зберігають пестицидну активність. Таким чином, щодо послідовностей також можна здійснювати мутагенез так, щоб поліпептиди, що кодуються, були стійкими до протеолітичного розщеплення хімотрипсином. Більше ніж один сайт розпізнавання можна додати у конкретному положенні в будь-якій комбінації, та при цьому декілька сайтів розпізнавання можна додати до токсину або видалити з нього. Таким чином, додаткові мутації можуть містити три, чотири або більше сайтів розпізнавання. Слід розуміти, що декілька мутацій можна сконструювати у будь-якій придатній послідовності полінуклеотиду; відповідно, або послідовності повної довжини, або їхні фрагменти можна модифікувати таким чином, щоб вони містили додаткові або альтернативні сайти розщеплення, а також були стійкими до протеолітичного розщеплення. Таким чином, варіанти здійснення передбачають Сгу-токсини, що містять мутації, які поліпшують пестицидну активність, а також поліпшені композиції та способи здійснення впливу на шкідників із використанням інших Ві-токсинів.
Мутації можуть захищати поліпептид від руйнування протеазою, наприклад, шляхом видалення передбачуваних сайтів протеолітичного розщеплення, таких як передбачувані сайти для серинової протеази та сайти розпізнавання для еластази, з різних ділянок. Деякі або всі такі передбачувані сайти можна видалити або змінити так, щоб знизити протеоліз у місці розташування вихідного сайту. Зміни протеолізу можна оцінити шляхом порівняння мутантного поліпептиду з токсинами дикого типу або шляхом порівняння мутантних токсинів, які відрізняються за їхньою амінокислотною послідовністю. Передбачувані сайти протеолітичного розщеплення та сайти протеолітичного розщеплення включають без обмеження наступні послідовності: КК, сайт розщеплення для трипсину; І КМ, сайт для хімотрипсину; та сайт для трипсину. Ці сайти можна змінити шляхом додавання або видалення будь-якого числа та виду амінокислотних залишків за умови, що пестицидна активність поліпептиду підвищується. Таким чином, поліпептиди, що кодуються нуклеотидними послідовностями, які містять мутації, будуть передбачати щонайменше одну зміну або додавання амінокислоти порівняно з нативною або фоновою послідовністю або 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 або 280 або більше змін або додавань амінокислоти. Пестицидну активність поліпептиду також можна поліпшити шляхом усічення нативної послідовності або послідовності повної довжини, як відомо з рівня техніки.
Композиції згідно з варіантами здійснення включають нуклеїнові кислоти, а також їхні фрагменти та варіанти, які кодують пестицидні поліпептиди. Зокрема, варіанти здійснення передбачають виділені молекули нуклеїнової кислоти, які містять нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотну послідовність, показану в 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 6,
ЗЕБЕО ІО МО: 8 та 5ЕО ІЮ МО: 10, або нуклеотидні послідовності, які кодують указану амінокислотну послідовність, наприклад нуклеотидну послідовність, викладену в 5ЕО ІЮО МО: 1,
ЗЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІО МО: 7 та 5ЕО ІО МО: 9, а також їхні фрагменти та варіанти. 60 Інтерес також становлять оптимізовані нуклеотидні послідовності, які кодують пестицидні білки згідно з варіантами здійснення. Використовувана у даному документі фраза "оптимізовані нуклеотидні послідовності" відноситься до нуклеїнових кислот, які є оптимізованими для експресії в конкретному організмі, наприклад рослині. Оптимізовані нуклеотидні послідовності можна одержати для будь-якого організму, що становить інтерес, за допомогою способів, відомих із рівня техніки. Див., наприклад, патент США Мо 7462760, у якому описана оптимізована нуклеотидна послідовність, що кодує розкритий пестицидний білок. У даному прикладі нуклеотидну послідовність одержували за допомогою "зворотної трансляції" амінокислотної послідовності білка та зміни нуклеотидної послідовності, так щоб вона містила переважні для маїсу кодони та при цьому все ще кодувала таку ж саму амінокислотну послідовність. Ця процедура детальніше описана у Митау єї аїЇ. (1989) Мисієїс Асід5 Нев. 17:477-498. Оптимізовані нуклеотидні послідовності знаходять застосування при підвищенні експресії пестицидного білка у рослині, наприклад, в однодольних рослинах родини Сгатіпеєає (Роасеає), таких як, наприклад, рослина маїсу або кукурудзи.
Варіанти здійснення додатково передбачають виділені пестицидні (наприклад, інсектицидні) поліпептиди, що кодуються або нуклеїновою кислотою, що зустрічається в природних умовах, або модифікованою нуклеїновою кислотою згідно з варіантами здійснення. Більш конкретно варіанти здійснення передбачають поліпептиди, що містять амінокислотну послідовність, викладену в ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕБЕО ІЮО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 8 та 5ЕО ІЮ МО: 10, що кодується нуклеїновими кислотами, описаними в даному документі, наприклад, викладеними в
ЗЕБЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕБЕО ІЮО МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 7 та 5ЕО ІЮ МО: 9, а також їхні фрагменти та варіанти.
У деяких варіантах здійснення передбачаються поліпептиди, що містять амінокислотну послідовність, викладену в ЗЕО ІЮ МО: 2, БЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 8 та 5ЕО ІЮ
МО: 10, а також їхні фрагменти та варіанти.
У конкретних варіантах здійснення пестицидні білки згідно з варіантами здійснення передбачають інсектицидні поліпептиди повної довжини, фрагменти інсектицидних поліпептидів повної довжини та варіантні поліпептиди, що одержані з підданих мутагенезу нуклеїнових кислот, сконструйованих для введення конкретних амінокислотних послідовностей у поліпептиди згідно з варіантами здійснення. У конкретних варіантах здійснення амінокислотні послідовності, які вводять у поліпептиди, містять послідовність, яка забезпечує сайт розщеплення для ферменту, такого як протеаза.
З рівня техніки відомо, що пестицидна активність Ві-токсинів, як правило, активується при розщепленні пептиду в кишечнику комахи різними протеазами. Оскільки пептиди не завжди можуть розщеплюватися у кишечнику комахи з повною ефективністю, фрагменти токсину повної
З5 довжини можуть характеризуватися посиленою пестицидною активністю порівняно із самим токсином повної довжини. Таким чином, деякі з поліпептидів згідно з варіантами здійснення включають фрагменти інсектицидного поліпептиду повної довжини, та деякі з фрагментів, варіантів та мутацій поліпептиду будуть характеризуватися посиленою пестицидною активністю порівняно з активністю інсектицидного поліпептиду, що зустрічається в природних умовах, з якого вони одержані, особливо, якщо інсектицидний поліпептид, що зустрічається в природних умовах, не активується іп міо протеазою перед скринінгом щодо активності. Таким чином, даною заявкою охоплюються усічені варіанти або фрагменти послідовностей.
Мутації можна помістити в будь-яку фонову послідовність, у тому числі в такі усічені поліпептиди за умови, що поліпептид зберігає пестицидну активність. Фахівець у даній галузі техніки може легко порівняти два або більше білків щодо пестицидної активності за допомогою аналізів, відомих із рівня техніки або описаних в інших місцях у даному документі. Слід розуміти, що поліпептиди згідно з варіантами здійснення можна одержати або шляхом експресії нуклеїнової кислоти, розкритої у даному документі, або шляхом застосування стандартних методик молекулярної біології.
Вважається, що пестицидні білюи можуть бути олігомерними та будуть відрізнятися за молекулярною масою, числом залишків, складовими пептидами, активністю щодо певних шкідників та іншими характеристиками. Проте за допомогою способів, викладених у даному документі, можна виділити та охарактеризувати білки, активні щодо ряду шкідників. Пестицидні білки згідно з варіантами здійснення можна застосовувати в комбінації з іншими Ві-токсинами або іншими інсектицидними білками для розширення спектра комах-мішеней. До того ж застосування пестицидних білків згідно з варіантами здійснення в комбінації з іншими Ві- токсинами або іншими інсектицидними активними компонентами відмінної природи є особливо корисним для запобігання та/(або стримування розвитку стійкості у комах. Інші інсектицидні засоби включають інгібітори протеаз (як серинового, так і цистеїнового типів), а-амілази та
Гс10) пероксидази.
Фрагменти та варіанти нуклеотидних та амінокислотних послідовностей та поліпептидів, що кодуються ними, також охоплюються варіантами здійснення. Використовуваний у даному документі термін "фрагмент" відноситься до частини нуклеотидної послідовності полінуклеотиду або до частини амінокислотної послідовності поліпептиду згідно з варіантами здійснення.
Фрагменти нуклеотидної послідовності можуть кодувати фрагменти білка, які зберігають біологічну активність нативного білка або відповідного білка повної довжини та, отже, мають пестицидну активність. Таким чином, вважається, що деякі з послідовностей полінуклеотидів та амінокислотних послідовностей згідно з варіантами здійснення можна справедливо називати як фрагментами, так і мутантами.
Слід розуміти, що термін "фрагмент" у тому значенні, у якому він використовується щодо послідовностей нуклеїнової кислоти згідно з варіантами здійснення, також охоплює послідовності, що є застосовними як гібридизаційні зонди. Нуклеотидні послідовності з цього класу зазвичай не кодують фрагменти білків, що зберігають біологічну активність. Таким чином, фрагменти нуклеотидної послідовності можуть варіювати в діапазоні від щонайменше приблизно 20 нуклеотидів, приблизно 50 нуклеотидів, приблизно 100 нуклеотидів та до нуклеотидної послідовності повної довжини, що кодує білки згідно з варіантами здійснення.
Фрагмент нуклеотидної послідовності згідно з варіантами здійснення, який кодує біологічно активну частину пестицидного білка згідно з варіантами здійснення, буде кодувати щонайменше 15, 25, 30, 50, 100, 200, 250 або 300 суміжних амінокислот або до загального числа амінокислот, що присутні у пестицидному поліпептиді згідно з варіантами здійснення (наприклад, 751 амінокислот для 5ЕО ІЮ МО: 2). Таким чином, слід розуміти, що варіантами здійснення також охоплюються поліпептиди, які являють собою фрагменти ілюстративних пестицидних білків згідно з варіантами здійснення та мають довжину щонайменше 15, 25, 30, 50, 100, 200, 250 або 300 суміжних амінокислот або до загального числа амінокислот, що присутні у пестицидному поліпептиді згідно з варіантами здійснення (наприклад, 751 амінокислот для 5ЕО ІЮО МО: 2). Для фрагментів нуклеотидної послідовності згідно з варіантами здійснення, що є застосовними як гібридизаційні зонди або ПЛР-праймери, звичайно не потрібно, щоб вони кодували біологічно активну частину пестицидного білка. Таким чином, фрагмент нуклеїнової кислоти згідно з варіантами здійснення може кодувати біологічно активну частину пестицидного білка, або він
Зо може являти собою фрагмент, який можна застосовувати як гібридизаційний зонд або ПЛР- праймер із застосуванням способів, розкритих у даному документі. Біологічно активну частину пестицидного білка можна одержати шляхом виділення частини однієї з нуклеотидних послідовностей згідно з варіантами здійснення, експресії частини пестицидного білка, що кодується (наприклад, шляхом рекомбінантної експресії іп міо), та оцінки активності частини пестицидного білка, що кодується.
Нуклеїнові кислоти, які являють собою фрагменти нуклеотидної послідовності згідно з варіантами здійснення, містять щонайменше 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 850, 900 або 950 нуклеотидів або до числа нуклеотидів, що присутні у нуклеотидній послідовності, розкритій у даному документі (наприклад, 2256 нуклеотидів для
ЗБО ІО МО: 1). Конкретні варіанти здійснення передбачають фрагменти, що походять із (наприклад, одержані з) першої нуклеїнової кислоти згідно з варіантами здійснення, де фрагмент кодує усічений токсин, що має пестицидну активність. Усічені поліпептиди, що кодуються полінуклеотидними фрагментами згідно з варіантами здійснення, мають пестицидну активність, яка є або еквівалентною, або поліпшеною порівняно з активністю відповідного поліпептиду повної довжини, що кодується першою нуклестовою кислотою, з якої походить фрагмент. Передбачається, що такі фрагменти нуклеїнової кислоти згідно з варіантами здійснення можуть бути усіченими за 3'-кінцем нативної кодувальної послідовності або відповідної кодувальної послідовності повної довжини. Фрагменти нуклеїнової кислоти також можуть бути усіченими як за 5-, так і за 3-кінцем нативної кодувальної послідовності або відповідної кодувальної послідовності повної довжини.
Термін "варіанти" використовується у даному документі для позначення значною мірою схожих послідовностей. Для нуклеотидних послідовностей консервативні варіанти включають ті послідовності, які через виродженість генетичного коду кодують амінокислотну послідовність одного з пестицидних поліпептидів згідно з варіантами здійснення. Спеціалісти в даній галузі техніки легко зрозуміють, що внаслідок виродженості генетичного коду існує багато нуклеотидних послідовностей, що кодують білки згідно з даним винаходом. Таблиця 1 являє собою таблицю кодонів, у якій представлені синонімічні кодони для кожної амінокислоти.
Наприклад, усі кодони АСА, АСО, СОА, СОС, бос та СО кодують амінокислоту аргінін. Таким чином, у кожному положенні в нуклеїнових кислотах згідно з даним винаходом, у якому аргінін 60 позначений кодоном, кодон може бути змінений на будь-який із відповідних кодонів, описаних вище, без зміни поліпептиду, що кодується. Зрозуміло, що І в послідовності РНК відповідає Т в послідовності ДНК.
Таблиця 1
Аланін Аа А аСбА сбб аба асиу
Цистеїн Сув (0; раб а
Аспарагінова кислота Азр р БАС ад
Глутамінова кислота Сп Е пАА аа
Фенілаланін Рпе Е Об ОО
Гліцин спіу (Є) сад саб ас аци
Гістидин Нів Нн САС СА)
Ізолейцин Пе Ї АОА АОС АЄ
Лізин Гуз К АДА дда
Лейцин Ї еи Іщ ОА 04 СА Сб баб СО
Метіонін Меї М дув
Аспарагін Авп М ААС о ААДИ
Пролін Рго Р ССА соб бба сб)
Глутамін Сип (Ф) САА САСЙбі
Аргінін Ага в АдаА дас СОА баб бай Са
Серин зег З да Аа ОСА Обб ба Си
Треонін Тие т АСА АСС Аба АСИ
Валін маї У аМрА сб сабо а
Триптофан Тр М ува
Тирозин Туг У САС Од
За необхідності нуклеїнову кислоту можна оптимізувати для посилення експресії в організмі- хазяїні. Таким чином, якщо організм-хазяїн є рослиною, для поліпшення експресії можна синтезувати синтетичні нуклеїнові кислоти із застосуванням кодонів, переважних для рослин.
Див., наприклад, Сатрбей апа Сом/лі, (1990) Ріапі РНувзіоЇ. 92:1-141 стосовно обговорення застосування кодонів, переважних для хазяїна. Наприклад, хоча послідовності нуклеїнової кислоти згідно з варіантами здійснення можуть експресуватися як у видів однодольних, так і дводольних рослин, послідовності можна модифікувати з урахуванням специфічних переваг щодо кодонів та переваг за вмістом зС у однодольних або дводольних, якщо було показано, що переваги відрізняються (Миїгтау еї аї. (1989) Мисівіс Асідб5 Нев. 17:477-498). Таким чином, кодон, переважний для маїсу, для конкретної амінокислоти можна встановити з відомих генних послідовностей маїсу. Дані про частоту використання кодонів у маїсу для 28 генів із рослин маїсу наведені в таблиці 4 в Миггау єї аї!., вище. З рівня техніки доступні способи синтезу генів, переважних для рослин. Див., наприклад, патенти США МоМо 5380831 та 5436391, та Миггау, єї а!., (1989) Мисієїс Асіа5 Нев. 17:477-498, та Гіи Н еї аІ. Мої Віо Нер 37:677-684, 2010, включені в даний документ за допомогою посилання. Таблицю використання кодонів 7еа таїге також можна знайти на сайті Кагиза.ог.|р/содоп/сді-біп/5пом/содоп.сді?зресіез-4577, доступ до якого можна одержати із застосуванням префікса м/млу. У таблиці 2 показаний аналіз оптимальних кодонів маїсу (адаптовано з І іш Н еї аІ. Мої Віо Кер 37:677-684, 2010).
Таблиця 2 . Висока Низька . Висока Низька кислота Й Н кислота Й ' чальність чальність альність чальність (0007) 5269 |1,96| 1485 |078| ос) 8057 | 216 | 1136 | 0,55 Зег (ОСО| 176 |о0и3| 2498 |148| |сСА| з69 | 0 | 2872 | 149 (000 з489 |248| 1074 |063| осо") 5835 | 157| 630 |093
ОСА 104 |007| 2610 |154| Ту, ОА! 71 /|0,04| 1632 | 122 (Оса | 1975 | 14 | 670 | 04 | |ОАС| зва! | 196| то41 | 078
ГТ АбОЇ 77 0051 1788 |1,06| Ні СА) 131 /|009| 1902 | 1,96
ТАС 2617 |1,86| 1514 |089| САС") 2800 | 191| 897 |0,64
Га | 174 |009| 2306 |1,37| ос") 2291 | 196| 963 | 088
І 1600) 223 |о0л1| 2396 |143| Сп |САА| 99 )/|0,05| 2312 | 1.04
Таблиця 2
Аміно- Висока Низька Аміно- Висока Низька кислота Кодон Зустрі- ВС) Зустрі- вс кислота Кодон Зустрі- вс Зустрі- вс чальність чальність альність чальність (сс 5979 |308| 1109 |066| САС") 3557 | 195| 2130 | 0,96
СОА| лоб |005| 1280 |0,76| Аю |сСо0)| 153 |012| 751 |074 (сс; 561 |266| 1646 |098| сСос")| 4278 | 325| 466 |О46
Ро |ССО| 427 |0г2| 1900 |147| |СсА| 92 /|007| 659 |065 (со 3035 |159| 601 |047| сСос"| 1793 | 136| 631 |06г
ССА| зі |016| 2140 |166| |АСА| 83 /|006| 1948 | 191 (са | з846 |202| 5Із | 04 | сс") 1493 | 114 | 1652 | 1,62
Ме ГАЇ 138 /|0,09| 2388 | 1,3 | Авп | ААШІ 131 10,07 | 3074 | 1.26
ТА ОСІ 4380 |285)| 1353 |074| |ААС"| З81і4 | 193| 1807 | 0,74
ІТ АСОАЇ| 88 1006 1756 |096| ув | ААА| 130 /|0,05| З215 | 0,98
Ти ГТАСОЇ 136 |009| 1990 |143| ААС"| 5047 | 195 3340 | 1.02 / ТАССІ| 3398 |225| 991 |071| Авр ІСАЇ 312 /|0,09| 4217 | 1,38 / ФЇАСАЇ| 133 |009| 2075 | 75 | |сАС"| 6729 | 191 | 1891 | 0,62 / ТАСО"| 2378 |1,57| 495 |036| су (сс) з63 |0и3| 2301 | 1,55
Ма |с00| 182 10,07 | 2595 | 1,51| бос) 7842 | 291 | 1282 | 0,75 (ас 4584 |1,82| 1096 |064| (сбА| 397 |015| 2044 | 1195 (| арА| 74 |003| 1325 |077| ссс"| 2186 | 081| 1215 | ол (вс | 5257 |208| 1842 |1,07| Си |САА| 193 |006| 4080 | 14 11111111 бле) бот | 194 з307 | 09
Частоту використання кодонів порівнювали із застосуванням критерію узгодженості хі- квадрат для ідентифікації оптимальних кодонів. Кодони, які зустрічаються статистично частіше (РО,01), позначені зірочкою
Таблиця використання кодонів Сіусіпе тах показана у вигляді таблиці 3, та її також можна знайти на сайті Кагиза.ог.|р/содоп/сді-ріп/5пожсодоп.сді?в5ресієз-38478аа-1 б51уіїе-М, доступ до якого можна одержати із застосуванням префікса м/млиу.
Таблиця З ст 1717-1239 | (18293 | сСт | Р | 7189 | (9358) ст 171-171 | (84793 | сос | Р | лом | (5010)
СТА 177-185 | (42160 | ССА | Р | 191 | (946)
Ста 1-1 | 7127 | (63040 | сса | Р | 47 | (2312)
АТО 17171 25 | па) | ст | то | 171 | (8490)
АТС 1/1 | 7163 | (807) | СС | т | 743 | (700)
АТА 1 | 129 | (63863), | АСА | т | 7149 | (739)
ТАС 177 М | 7149 | (7367) | тос | с | 80 | (3980) ТАА 17777 | 109 | (463) | таА | " | 10 | (480)
САТ 17 но | 7140 | (6933 | сот | в | 66 | (3297
САС 17 но | 7116 | (57599, | СОС | в | 62 | (з093)
САА | 0 | 205 | пот62 | СОА | в | 41 | (2018)
Таблиця З сла | 0 | 162 | (80385) | соб | в | з1 | (510)
АКА | Ко | 26,9, | (133394) | АБбА | В | 148 | (7337)
АЛ | Кк | 359 | (17797) | лоб | я | 133 | (6574) / вАТ | 0 | 324 | (16040, | сот | с | 209 | (10353) / бАС | 0 | 204 | (0097) | сос | с | 134 | (6650)
До того ж фахівець у даній галузі зрозуміє, що зміни можна вводити шляхом мутування послідовностей нуклеїнової кислоти, що призводить до змін в амінокислотній послідовності поліпептиду, що кодується, без зміни біологічної активності білків. Таким чином, варіантні молекули нуклеїнових кислот можна створювати шляхом введення однієї або декількох нуклеотидних замін, додавань та/або делецій у відповідну послідовність нуклеїнової кислоти, розкриту у даному документі, так що одна або декілька амінокислотних замін, додавань або делецій вводяться у кодований білок. Мутації можна вводити за допомогою стандартних методик, таких як сайт-спрямований мутагенез та ПЛР-опосередкований мутагенез. Такі варіантні послідовності нуклеїнової кислоти також охоплюються даним винаходом.
Алельні варіанти, що зустрічаються в природних умовах, такі як ці, можна ідентифікувати із застосуванням добре відомих методик молекулярної біології, таких як, наприклад, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) та методики гібридизації, як викладено у даному документі.
У деяких варіантах здійснення полінуклеотид, що кодує поліпептид із ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІО
МО: 4, 5ЕБЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІО МО: 8 та 5ЕО ІО МО: 10, являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, що відрізняється від геномної.
Варіантні нуклеотидні послідовності також включають синтетично одержані нуклеотидні послідовності, такі як одержані, наприклад, за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу, але які все ще кодують пестицидний білок згідно з варіантами здійснення, такий як мутантний токсин. Загалом варіанти конкретної нуклеотидної послідовності згідно з варіантами здійснення будуть мати послідовність, щонайменше на приблизно 70 95, 7595, 80 95, 85 95, 86 90, 87 95, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або більше ідентичну конкретній нуклеотидній послідовності при визначенні за допомогою програм для вирівнювання послідовностей, описаних в інших місцях у даному документі, із використанням параметрів за замовчуванням. Варіант нуклеотидної послідовності згідно з варіантами здійснення може відрізнятися від даної послідовності лише 1-15 нуклеотидами, лише 1-10, як, наприклад, 6-10, лише 5, лише 4, 3, 2 або навіть 1 нуклеотидом.
Варіанти конкретної нуклеотидної послідовності згідно з варіантами здійснення (тобто ілюстративної нуклеотидної послідовності) також можна оцінювати шляхом порівняння відсоткової ідентичності послідовності для поліпептиду, що кодується варіантною нуклеотидною послідовністю, та поліпептиду, що кодується еталонною нуклеотидною послідовністю. Таким чином, наприклад, розкриті виділені нуклеїнові кислоти, які кодують поліпептид із даною відсотковою ідентичністю послідовності щодо поліпептиду із ФЕО ІЮ МО 2, ЗЕО ІЮО МО: 4, ЗЕО
ІО МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 8 та 5ЕО ІЮ МО: 10. Відсоткову ідентичність послідовності для будь-яких двох поліпептидів можна розрахувати за допомогою програм для вирівнювання послідовностей, описаних в інших місцях у даному документі, із застосуванням параметрів за замовчуванням.
При оцінці будь-якої заданої пари полінуклеотидів згідно з варіантами здійснення шляхом порівняння відсоткової ідентичності послідовності, спільної для двох поліпептидів, які вони кодують, послідовності двох поліпептидів, що кодуються, ідентичні щонайменше на приблизно 40 96, 45 96, 50 96, 55 о, 60 в, 65 У, 70 96, зазвичай щонайменше на приблизно 75 95, 80 Об, 8595, щонайменше на приблизно 90 95, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 97 95 або щонайменше на приблизно 98 95, 99 95 або більше.
Використовуваний у даному документі термін "варіантний білок" охоплює поліпептиди, що одержані з нативного білка: шляхом делеції (так званого усічення) або додавання однієї або декількох амінокислот на М-кінці та/або С-кінці нативного білка; делеції або додавання однієї або декількох амінокислот в одному або декількох сайтах у нативному білку або заміни однієї або декількох амінокислот в одному або декількох сайтах у нативному білку. Відповідно, термін "варіантний білок" охоплює біологічно активні фрагменти нативного білка, які містять достатнє число суміжних амінокислотних залишків для збереження біологічної активності нативного білка, тобто для того, щоб він мав пестицидну активність. Така пестицидна активність може бути відмінною або поліпшеною порівняно з нативним білком, або вона може бути незмінною за умови, що пестицидна активність зберігається.
Варіантні білки, що охоплюються варіантами здійснення, є біологічно активними, тобто вони продовжують мати необхідну біологічну активність нативного білка, тобто пестицидну активність, як описано у даному документі. Такі варіанти можуть бути результатом, наприклад, генетичного поліморфізму або маніпуляції, яку здійснює людина. Біологічно активні варіанти нативного пестицидного білка згідно з варіантами здійснення будуть мати послідовність, щонайменше на приблизно 60 95, 65 У, 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 86 95, 87 Зо, 88 95, 89 о, 90 Об, 91 965, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше ідентичну амінокислотній послідовності для нативного білка при визначенні за допомогою програм для вирівнювання послідовностей, описаних в інших місцях у даному документі, із використанням параметрів за замовчуванням. Біологічно активний варіант білка згідно з варіантами здійснення може відрізнятися від даного білка лише 1-15 амінокислотними залишками, лише 1-10, як, наприклад, 6-10, лише 5, лише 4, 3, 2 або навіть 1 амінокислотним залишком.
У деякому варіанті здійснення інсектицидний поліпептид має послідовність, щонайменше на бО Фо, 65 95, 70 Ув, 75 95, 80 У, 85 9, 86 9о, 87 95, 88 9Уо, 89 Ус, 90 У, 91 Ус, 92 У, 93 Ус, 94 У, 95 У, 96 95, 97 9», 98 90, 99 95 або більше ідентичну амінокислотній послідовності із ЗЕО ІЮ МО: 2.
У деякому варіанті здійснення інсектицидний поліпептид має послідовність, щонайменше на бО Фо, 65 95, 70 Ув, 75 95, 80 У, 85 9, 86 9о, 87 95, 88 9Уо, 89 Ус, 90 У, 91 Ус, 92 У, 93 Ус, 94 У, 95 У, 96 95, 97 9», 98 90, 99 95 або більше ідентичну амінокислотній послідовності із ЗЕО ІЮ МО: 4.
У деякому варіанті здійснення інсектицидний поліпептид має послідовність, щонайменше на бО Фо, 65 95, 70 Ув, 75 95, 80 У, 85 9, 86 9о, 87 95, 88 9Уо, 89 Ус, 90 У, 91 Ус, 92 У, 93 Ус, 94 У, 95 У, 96 95, 97 9», 98 90, 99 95 або більше ідентичну амінокислотній послідовності із ЗЕО ІЮ МО: 6.
У деякому варіанті здійснення інсектицидний поліпептид має послідовність, щонайменше на бО Фо, 65 95, 70 Ув, 75 95, 80 У, 85 9, 86 9о, 87 95, 88 9Уо, 89 Ус, 90 У, 91 Ус, 92 У, 93 Ус, 94 У, 95 У, 96 95, 97 9», 98 90, 99 95 або більше ідентичну амінокислотній послідовності із ЗЕО ІЮ МО: 8.
У деякому варіанті здійснення інсектицидний поліпептид має послідовність, щонайменше на бО Фо, 65 95, 70 Ув, 75 95, 80 У, 85 9, 86 9о, 87 95, 88 9Уо, 89 Ус, 90 У, 91 Ус, 92 У, 93 Ус, 94 У, 95 У,
Зо 96 9», 97 9», 98 90, 99 95 або більше ідентичну амінокислотній послідовності із ЗЕО ІЮ МО: 10.
У деяких варіантах здійснення поліпептид характеризується модифікованою фізичною властивістю. Використовуваний у даному документі термін "фізична властивість" відноситься до будь-якого параметра, який є придатним для опису фізико-хімічних характеристик білка.
Використовувані в даному документі терміни "фізична властивість, що становить інтерес" та "властивість, що становить інтерес" застосовуються взаємозамінно для позначення фізичних властивостей білків, які досліджуються та/або модифікуються. Приклади фізичних властивостей включають без обмеження сумарний поверхневий заряд та розподілення зарядів на поверхні білка, сумарну гідрофобність та розподілення гідрофобних залишків на поверхні білка, щільність поверхневого заряду, щільність гідрофобності поверхні, загальну кількість поверхневих груп, здатних до іонізації, поверхневий натяг, розмір білка та його розподілення у розчині, температуру плавлення, теплоємність та другий віріальний коефіцієнт. Приклади фізичних властивостей також включають без обмеження розчинність, фолдинг, стабільність та засвоюваність. У деяких варіантах здійснення поліпептид характеризується підвищеною перетравністю фрагментів, одержаних у результаті протеолітичного розщеплення, у кишечнику комахи. Моделі для перетравлювання за допомогою штучного шлункового соку відомі спеціалісту в даній галузі техніки (Рисп5, К.Г. апа 9.0. Азімосод. Роса ТесппоІоду 50: 83-88, 1996;
Авімооді, .0., еї а! Маїштге ВіоїєесНпоіоду 14: 1269-1273, 1996; Ри ТУ єї аї У. Адііс Роса Снет. 50: 7154-7160, 2002).
Крім того, варіантами здійснення охоплюється мікроорганізм, трансформований щонайменше однією нуклеїновою кислотою згідно з варіантами здійснення, касетою експресії, яка містить нуклеїнову кислоту, або вектором, який містить касету експресії. У деяких варіантах здійснення мікроорганізм являє собою мікроорганізм, що розмножується на рослинах. Варіант здійснення даного винаходу відноситься до інкапсульованого пестицидного білка, який міститься у трансформованому мікроорганізмі, здатному до експресії щонайменше одного пестицидного білка згідно з варіантами здійснення.
Варіанти здійснення передбачають пестицидні композиції, що містять трансформований мікроорганізм згідно з варіантами здійснення. У таких варіантах здійснення трансформований мікроорганізм звичайно присутній у пестицидній композиції в пестицидно ефективній кількості разом із придатним носієм. Варіантами здійснення також охоплюються пестицидні композиції, 60 що містять виділений білок згідно з варіантами здійснення, окремо або в комбінації з трансформованим організмом згідно з варіантами здійснення, та/або інкапсульований пестицидний білок згідно з варіантами здійснення в інсектицидно ефективній кількості разом з придатним носієм.
Варіанти здійснення додатково передбачають спосіб розширення спектра комах-мішеней шляхом застосування пестицидного білка згідно з варіантами здійснення в комбінації щонайменше з одним іншим або "другим" пестицидним білком. У способах згідно з варіантами здійснення можна використовувати будь-який пестицидний білок, відомий з рівня техніки. Такі пестицидні білки включають без обмеження Ві-токсини, інгібітори протеаз, а-амілази та пероксидази.
Варіантами здійснення також охоплюються трансформовані або трансгенні рослини, що містять щонайменше одну нуклеотидну послідовність згідно з варіантами здійснення. У деяких варіантах здійснення рослина стабільно трансформована нуклеотидною конструкцією, яка містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність згідно з варіантами здійснення, функціонально пов'язану з промотором, який керує експресією в рослинній клітині.
Використовувані в даному документі терміни "трансформована рослина" та "трансгенна рослина" відносяться до рослини, яка містить гетерологічний полінуклеотид у своєму геномі.
Загалом гетерологічний полінуклеотид стабільно інтегрований у геном трансгенної або трансформованої рослини таким чином, що полінуклеотид передається наступним поколінням.
Гетерологічний полінуклеотид може бути інтегрований у геном окремо або як частина рекомбінантної касети експресії.
Слід розуміти, що використовуваний у даному документі термін "трансгенний" включає будь- яку клітину, клітинну лінію, калюс, тканину, частину рослини або рослину, генотип якої був змінений у результаті присутності гетерологічної нуклеїнової кислоти, у тому числі такі трансгенні об'єкти, які спочатку були зміненими таким чином, а також такі трансгенні об'єкти, які були створені шляхом статевих схрещувань або нестатевого розмноження з вихідного трансгенного об'єкта. Використовуваний у даному документі термін "трансгенний" не охоплює зміну геному (хромосомного або позахромосомного) за допомогою традиційних способів селекції рослин або трансгенних об'єктів, що зустрічаються в природних умовах, наприклад, випадкове перехресне запилення, інфекцію, спричинену нерекомбінантним вірусом, трансформацію нерекомбінантними бактеріями, нерекомбінаційну транспозицію або спонтанну мутацію.
Використовуваний у даному документі термін "рослина" включає цілі рослини, органи рослин (наприклад, листя, стебла, корені тощо), насіння, рослинні клітини та потомство таких.
Частини трансгенних рослин знаходяться у межах обсягу варіантів здійснення та передбачають, наприклад, рослинні клітини, рослинні протопласти, тканинні культури рослинних клітин, з яких можна регенерувати рослини, рослинні калюси, скупчення рослинних клітин та рослинні клітини, які є інтактними у рослинах або частинах рослин, таких як зародки, пилок, сім'ябруньки, насіння, листя, квітки, гілки, плоди, зерна, колоски, стрижні качанів, лушпиння, стебла, корені, верхівки коренів, пиляки тощо, що походять зі трансгенних рослин або їхнього потомства, раніше трансформованих молекулою ДНК згідно з варіантами здійснення та, таким чином, щонайменше частково складаються з трансгенних клітин. Клас рослин, які можна застосовувати в способах згідно з варіантами здійснення звичайно настільки широкий, як клас вищих рослин, які піддають методикам трансформації, що включає як однодольні, так і дводольні рослини.
Хоча варіанти здійснення не залежать від конкретного біологічного механізму підвищення стійкості рослини до шкідника рослин, експресія нуклеотидних послідовностей згідно з варіантами здійснення у рослині може приводити в результаті до продукування пестицидних білків згідно з варіантами здійснення та до підвищення стійкості рослини до шкідника рослин.
Рослини згідно з варіантами здійснення знаходять застосування у сільському господарстві у способах здійснення впливу на комах-шкідників. Певні варіанти здійснення передбачають трансформовані культурні рослини, такі як, наприклад, рослини маїсу, які знаходять застосування в способах здійснення впливу на комах-шкідників рослини, таких як, наприклад, лускокрилі шкідники. "Досліджувана рослина або рослинна клітина" являють собою рослину або рослинну клітину, в яких генетична зміна, така як трансформація, зачепила ген, що становить інтерес, або являють собою рослину або рослинну клітину, які походять від рослини або клітини, змінених таким чином, та які містять зміну. "Контроль", або "контрольна рослина", або "контрольна рослинна клітина" надають точку відліку для вимірювання змін фенотипу досліджуваної рослини або рослинної клітини.
Контрольна рослина або рослинна клітина можуть являти собою, наприклад, (а) рослину бо або клітину дикого типу, тобто з таким самим генотипом, що й у вихідного матеріалу для генетичної зміни, з використанням якого одержали в результаті досліджувану рослину або клітину; (Б) рослину або рослинну клітину з таким самим генотипом, що й у вихідного матеріалу, але які були трансформовані нуль-конструкцією (тобто конструкцією, яка не здійснює відомого впливу на ознаку, що становить інтерес, такою як конструкція, яка містить маркерний ген); (с) рослину або рослинну клітину, які є нетрансформованим сегрегантом серед потомства досліджуваних рослини або рослинної клітини; (4) рослину або рослинну клітину, які генетично ідентичні досліджуваній рослині або рослинній клітині, але які не зазнавали впливу умов або стимулів, які будуть індукувати експресію гена, що становить інтерес, або (є) досліджувану рослину або рослинну клітину як такі в умовах, за яких ген, що становить інтерес, не експресується.
Фахівець у даній галузі техніки легко зрозуміє, що досягнення в галузі молекулярної біології, такі як сайт-специфічний та неспецифічний мутагенез, методики полімеразної ланцюгової реакції та методики білкової інженерії, забезпечують багатий набір інструментів та протоколів, придатних для застосування для зміни або конструювання як амінокислотної послідовності, так і генних послідовностей, які лежать в основі білків, що становлять інтерес із точки зору сільського господарства.
Таким чином, білки згідно з варіантами здійснення можна змінювати різними способами, включаючи амінокислотні заміни, делеції, усічення та вставки. Способи здійснення таких маніпуляцій, як правило, відомі з рівня техніки. Наприклад, варіанти амінокислотних послідовностей пестицидних білків можна одержати шляхом введення мутацій у синтетичну нуклеїнову кислоту (наприклад, молекулу ДНК). Способи мутагенезу та внесення змін у нуклеїнову кислоту добре відомі з рівня техніки. Наприклад, сконструйовані зміни можна вводити із використанням методики опосередкованого олігонуклеотидами сайт-спрямованого мутагенезу. Див., наприклад, КипКе! (1985) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 82:488-492; Кипкеї еї аї. (1987) Меїнодз іп Епгутої!. 154:367-382; патент США Мо 4873192; МаїКег апа Саазіга, вед». (1983)
Тесппідиез іп Моїесшіаг Віооду (МасМіїйап Рибіїзєпіпя Сотрапу, Мем/ МоїКк) та джерела, процитовані в цих документах.
Піддані мутагенезу нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення можна модифікувати так, щоб змінити приблизно 1, 2, 3, 4, 5,6, 8, 10, 12 або більше з амінокислот, що
Зо присутні у первинній послідовності поліпептиду, що кодується. Альтернативно можна вводити навіть ще більшу кількість змін щодо нативної послідовності таким чином, щоб у білка, що кодується, щонайменше приблизно 1 95 або 2 95, або приблизно З 95, 4 90, 5 о, б о, 7 90, 8 Убо, 99, 10 90, 11 90, 12 95, або навіть приблизно 13 95, 14 95, 15 905, 16 95, 17 90, 18 9, 19 У, або 20 96, 21 96, 22 90, 23 о, 24 Ую, або 25 95, З0 Ус, 35 Ус, або 40 95 або більше кодонів могли бути зміненими або іншим чином модифікованими порівняно з відповідним білком дикого типу. Таким же чином, у білка, що кодується, може бути щонайменше приблизно 195, або 2 95, або приблизно З 95, 495, 595, бю, 7 о, 895, З о, 10 90, 11 95, 12 У, або навіть приблизно 13 95, 1495, 1595, 16 95, 17 Ую, 18 9», 19 95, або 20 зо, 21 0, 226, 23 о, 24 о, або 25 сь, ЗО Зо, 35 9о, або 40 95, або більше додаткових кодонів порівняно з відповідним білком дикого типу. Слід розуміти, що піддані мутагенезу нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення, як передбачається, охоплюють біологічно функціональні еквівалентні пептиди, які мають пестицидну активність, таку як поліпшена пестицидна активність, яку визначають за антифідантними властивостями щодо личинок вогнівки кукурудзяної. Такі послідовності можуть виникнути внаслідок надлишковості кодонів та функціональної еквівалентності, які, як відомо, зустрічаються в природних умовах у послідовностях нуклеїнової кислоти та білках, що кодуються таким чином.
Фахівець у даній галузі зрозуміє, що додавання амінокислот та/або амінокислотні заміни звичайно базуються на відносній подібності замісників у боковому ланцюзі амінокислот, наприклад, їхній гідрофобності, заряді, розмірі тощо. Ілюстративні групи амінокислотних замін, у яких беруться до уваги різні з вищевикладених характеристик, добре відомі фахівцю в даній галузі техніки та включають: аргінін та лізин; глутамат та аспартат; серин та треонін; глутамін та аспарагін; а також валін, лейцин та ізолейцин.
Вказівки, що стосуються придатних амінокислотних замін, які не впливають на біологічну активність білка, що становить інтерес, можна знайти в моделі Юауйоїї еї аї. (1978) Айав5 ої
Ргоївєїп Зедиєпсе апа Зігисіиге (Май. Віотей. Ке5. Еоипа., УМазпіпдюп, О.С.), включеній у даний документ за допомогою посилання. Можуть бути здійснені консервативні заміни, такі як заміщення однієї амінокислоти іншою з аналогічними властивостями.
Таким чином, гени та нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення включають як послідовності, що зустрічаються в природних умовах, так і мутантні форми. Аналогічно білки бо згідно з варіантами здійснення охоплюють як білки та варіанти, що зустрічаються в природних умовах (наприклад, усічені поліпептиди), так і їхні модифіковані (наприклад, мутантні) форми.
Такі варіанти будуть зберігати необхідну пестицидну активність. Очевидно, що мутації, які будуть здійснені у нуклеотидній послідовності, що кодує варіант, не повинні виводити послідовність із рамки зчитування та загалом не будуть створювати комплементарні ділянки, які можуть утворювати вторинну структуру мРНК. Див. публікацію заявки на європейський патент
Мо 75444.
Очікується, що делеції, вставки та заміни у білкових послідовностях, охоплені даним документом, не будуть призводити до радикальних змін характеристик білка. Проте, якщо важко передбачити точний ефект заміни, делеції або вставки перед її здійсненням, фахівець у даній галузі зрозуміє, що даний ефект будуть оцінювати за допомогою звичайних скринінгових аналізів, таких як аналізи з живленням комах. Див., наприклад, Ма!їтопе еї аї. (1985) 9. Есоп.
Епіюотої. 78: 290-293 та Сларіа апа Гапд (1990) 9). Есоп. Епіотої. 83: 2480-2485, включені в даний документ за допомогою посилання.
Варіантні нуклеотидні послідовності та білки також охоплюють послідовності та білки, одержані в результаті мутагенної та рекомбіногенної процедури, такої як ДНК-шафлінг. У випадку такої процедури можна здійснювати маніпуляції з однією або декількома різними кодувальними послідовностями для створення нового пестицидного білка, що має необхідні властивості. Таким чином, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів створюють із популяції споріднених за послідовностями полінуклеотидів, що містять ділянки послідовностей, які характеризуються значною ідентичністю послідовності та можуть піддаватися гомологічній рекомбінації іп мій або іп мімо. Наприклад, із застосуванням цього підходу кодувальні послідовності повної довжини, мотиви у послідовностях, які кодують домен, що становить інтерес, або будь-який фрагмент нуклеотидної послідовності згідно з варіантами здійснення можна перетасувати між нуклеотидними послідовностями згідно з варіантами здійснення та відповідними частинами інших відомих нуклеотидних послідовностей Сту з одержанням нового гена, який кодує білок із поліпшеною властивістю, що становить інтерес.
Властивості, що становлять інтерес, включають без обмеження пестицидну активність на одиницю пестицидного білка, стабільність білка та токсичність щодо видів, що не є мішенню, особливо людини, свійської худоби, а також рослин та мікробів, які експресують пестицидні поліпептиди згідно з варіантами здійснення. Варіанти здійснення не обмежуються конкретною стратегією шафлінгу, потрібно тільки, щоб щонайменше одна нуклеотидна послідовність згідно з варіантами здійснення або її частина була задіяна у такій стратегії шафлінгу. У шафлінгу можуть бути задіяні тільки нуклеотидні послідовності, розкриті у даному документі, або він може додатково передбачати шафлінг інших нуклеотидних послідовностей, відомих із рівня техніки.
Стратегії ДНК-шафлінгу відомі з рівня техніки. Див., наприклад, 5іеттег (1994) Ргос. Маї!. Асад.
Зсі. ОСОБА 91:10747-10751; Зіеттег (1994) Маїште 370:389-391; Статегі єї аї. (1997) Майшге
Віотеси. 15:436-438; Мооге еї аї. (1997) У. Мої. Віої. 272:336-347; 7папа еї а. (1997) Ргос. Маї!.
Асайд. сі. ОБА 94:4504-4509; Статег!і еї аІ. (1998) Майте 391:288-291; та патенти США МоМо 5605793 і 5837458.
Нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення також можна застосовувати для виділення відповідних послідовностей з інших організмів, зокрема з інших бактерій та більш конкретно з інших штамів Васін5. Таким чином, такі способи, як ПЛР, гібридизація тощо, можна застосовувати для ідентифікації таких послідовностей з урахуванням гомології їхньої послідовності з послідовностями, викладеними у даному документі. Варіантами здійснення охоплюються послідовності, вибрані на основі ідентичності послідовності повним послідовностям, викладеним у даному документі, або їхнім фрагментам. Такі послідовності включають послідовності, які є ортологами розкритих послідовностей. Термін "ортологи" відноситься до генів, що походять від спільного предкового гена та виявляються у різних видів унаслідок видоутворення. Гени, які виявляються у різних видів, вважаються ортологами, якщо їхні нуклеотидні послідовності та/або білкові послідовності, що кодуються ними, мають значний ступінь ідентичності, як визначено в інших розділах у даному документі. Функції ортологів часто є висококонсервативними серед видів.
У підході, основаному на ПЛР, олігонуклеотидні праймери можна сконструювати для застосування у ПЛР-реакціях для ампліфікації відповідних послідовностей ДНК з кКДНК або геномної ДНК, екстрагованих з будь-якого організму, що становить інтерес. Способи конструювання ПЛР-праймерів та ПЛР-клонування загалом відомі з рівня техніки та розкриті в затбргооК еї аї. (1989) Моїесшіаг Сіопіпда: А ІГарогаїгту Мапиа! (24 єд., Соїй 5рііпд Нагбог
І арогаїогу Ргез5, Ріаїпмієм, Мем МогКк), надалі "Затргоок". Див. також Іппів еї аї., ед5. (1990) РСВ
Ргогосоїв: А Сшціде о Меїнодз апа Арріїсайоп5 (Асадетіс Рге55, Мем/ МогкК); Іппів апа СеїГапа), ев. 60 (1995) РСВ 5інагедієз (Асадетіс Ргев55, Мем Мої) та Іппіз апа Сеїгапа, ев. (1999) РОСА Меїноадз
Мапиаї (Асадетіс Ргез5, Мем Моїк). Відомі способи ПЛР включають без обмеження способи із застосуванням парних праймерів, гніздових праймерів, окремих специфічних праймерів, вироджених праймерів, ген-специфічних праймерів, вектор-специфічних праймерів, праймерів, що частково не збігаються тощо
У випадку гібридизаційних методик усю відому нуклеотидну послідовність або її частину застосовують як зонд, який вибірково гібридизується з іншими відповідними нуклеотидними послідовностями, що присутні у популяції клонованих фрагментів геномної ДНК або фрагментів
КДНК (тобто геномні бібліотеки або бібліотеки КДНК) з вибраного організму. Гібридизаційні зонди можуть являти собою фрагменти геномної ДНК, фрагменти кКДНК, фрагменти РНК або інші олігонуклеотиди, та їх можна помітити групою, яку можна виявити, такою як З2Р, або будь- яким іншим маркером, який можна виявити. Таким чином, наприклад, зонди для гібридизації можна одержати за допомогою мічення синтетичних олігонуклеотидів з урахуванням послідовностей згідно з варіантами здійснення. Способи одержання зондів для гібридизації та для створення бібліотек кКДНК та геномних бібліотек, як правило, відомі з рівня техніки та розкриті в затрьгоок.
Наприклад, повну послідовність, розкриту в даному документі, або одну або декілька її частин можна застосовувати як зонд, здатний специфічно гібридизуватися з відповідними послідовностями та матричними РНК. Для забезпечення специфічної гібридизації у різних умовах такі зонди включають послідовності, що є унікальними щодо послідовностей згідно з варіантами здійснення та зазвичай мають довжину щонайменше приблизно 10 або 20 нуклеотидів. Такі зонди можна застосовувати для ампліфікації відповідних послідовностей Стгу з вибраного організму за допомогою ПЛР. Цю методику можна застосовувати для виділення додаткових кодувальних послідовностей з потрібного організму або як діагностичний аналіз для визначення присутності кодувальних послідовностей в організмі. Методики гібридизації включають гібридизаційний скринінг висіяних на чашку Петрі бібліотек ДНК (бляшок або колоній; див., наприклад, ЗатрбгоокК).
Гібридизацію таких послідовностей можна проводити в жорстких умовах. Використовувані у даному документі терміни "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" відносяться до умов, за яких зонд буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю у явно більшій мірі, ніж з
Зо іншими послідовностями (наприклад, щонайменше у 2 рази, у 5 разів або у 10 разів більше порівняно з фоном). Жорсткі умови залежать від послідовності та будуть відрізнятися за різних обставин. Шляхом регулювання жорсткості умов гібридизації та/лабо промивання можна ідентифікувати цільові послідовності, які на 100 95 комплементарні зонду (гібридизація з гомологічним зондом). Альтернативно умови жорсткості можна регулювати для забезпечення деякого помилкового спарювання в послідовностях, щоб виявляти більш низькі ступені подібності (гібридизація з гетерологічним зондом). Зазвичай зонд має довжину менше ніж приблизно 1000 або 500 нуклеотидів.
Як правило, жорсткі умови будуть такими, за яких концентрація солі становить менше ніж приблизно 1,5 М іонів Ма, як правило, концентрація іонів Ма (або інших солей) становить приблизно 0,01-1,0 М при рН 7,0-8,3, а температура становить щонайменше приблизно 30 "С для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) та щонайменше приблизно 60 "С для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорсткі умови також можуть бути досягнуті за допомогою додавання дестабілізуючих засобів, таких як формамід. Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином 30-35 956 формаміду, 1 М Масі, 1 95
ЗОЗ (додецилсульфат натрію) при 37 "С та відмиванням 1Х-2Х 55С (20Х 5502-3,0 М Масі/0,З М тринатрію цитрат) при 50-55"С. Ілюстративні умови помірної жорсткості включають гібридизацію у 40-45 95 формаміді, 1,0 М Масі, 1 95 505 при 37 "С та відмивання у 0,5Х-1Х 550 при 55-60 "С. Ілюстративні умови високої жорсткості включають гібридизацію у 50 95 формаміді, 1 М Масі, 195 505 при 37 "С та кінцеве відмивання у 0,1Х 55С при 60-65 протягом щонайменше приблизно 20 хвилин. Необов'язково буфери для відмивання можуть містити від приблизно 0,1 95 до приблизно 1 95 505. Тривалість гібридизації загалом становить менше ніж приблизно 24 години, звичайно від приблизно 4 до приблизно 12 годин.
Специфічність, як правило, залежить від відмивання після гібридизації, причому ключовими факторами є іонна сила та температура кінцевого розчину для відмивання. Для гібридів ДНК-
ДНК Тл (температуру плавлення) можна апроксимувати з рівняння в Меїпкоїп апа Умайі! (1984)
Апаї. Віоспет. 138:267-284: Тят-81,5 "Ся16,6 (09 М) ж 0,41 (дос) - 0,61 (96 форм.) - 500/л; де М являє собою молярність одновалентних катіонів, 95 (з3С являє собою відсоток гуанозинових та цитозинових нуклеотидів в ДНК, "о форм." являє собою відсотковий вміст формаміду в гібридизаційному розчині та Ї являє собою довжину гібрида в парах основ. Тт являє собою бо температуру (за визначеної іонної сили та рН), за якої 50 96 комплементарної послідовності-
мішені гібридизуються з зондом, що ідеально збігається. Процедури відмивання, як правило, здійснюють щонайменше доти, доки не буде досягнута рівновага та доки не буде досягнутий низький фоновий рівень гібридизації, як, наприклад, протягом 2 годин, 1 години або 30 хвилин.
Тт знижується приблизно на 1 "С для кожного 1 95 неспівпадіння; таким чином, Тт, умови гіоридизації та/"або відмивання можна регулювати для гібридизації послідовностей з бажаною ідентичністю. Наприклад, якщо здійснюють пошук послідовностей з ідентичністю 290 95, Тт можна знизити на 10 "С. Зазвичай жорсткі умови вибирають таким чином, щоб температура була на приблизно 5 "С нижче, ніж Ття для конкретної послідовності та комплементарної їй послідовності при визначеній іонній силі та рН. Проте за умов високої жорсткості можна проводити гібридизацію та/або відмивання при температурі на 1, 2, З або 4 "С нижче, ніж Тт; за умов помірної жорсткості можна проводити гібридизацію та/або відмивання при температурі на б, 7, 8, 9 або 10 "С нижчій, ніж Тт; в умовах низької жорсткості можна проводити гібридизацію та/або відмивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 "С нижчій, ніж Тт.
Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що варіації жорсткості розчинів для гібридизації та/або відмивання по суті описані за допомогою рівняння, складів розчинів для гіоридизації та відмивання та бажаної Тяж. Якщо необхідний ступінь незбігів призводить у результаті до Тят нижче 45 "С (водний розчин) або 32 "С (розчин формаміду), то концентрацію
З5ЗС можна підвищити для того, щоб можна було використовувати вищу температуру.
Вичерпний посібник із гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти у Тііззеп (1993) І абогаюгу
Тесппіднев5 іп Віоспетівігу апа МоїІесшаг Віоїоду--Нубргіаігайоп м/їй Мисівїс Асій Ргобез, Рай І,
Спар'тег 2 (ЕІземівг, Мем Моїк) та А!йзибеї еї аї., дв. (1995) Ситепі Ргоїосоїв іп МоїІесшіаг Віоіоду,
СНарієг 2 (Стеєпе Рибіїзпіпу апа УМіеу-Іпіегзсіепсе, Мем МоїКк). Див. також ЗатьгоокК. Таким чином, виділені послідовності, які кодують білок Сту згідно з варіантами здійснення та гіоридизуються у жорстких умовах з послідовностями Сту, розкритими у даному документі, або з їхніми фрагментами, охоплюються варіантами здійснення.
Наступні терміни застосовують для опису спорідненості послідовностей між двома або більше нуклеїновими кислотами або полінуклеотидами: (а) "еталонна послідовність", (р) "вікно порівняння", (с) "ідентичність послідовності", (4) "відсоткова ідентичність послідовності" та (є) "значна ідентичність".
Зо (а) Використовувана в даному документі "еталонна послідовність" являє собою задану послідовність, застосовувану як основа для порівняння послідовностей. Еталонна послідовність може являти собою скорочену версію або повну форму визначеної послідовності; наприклад, являти собою сегмент повнорозмірної КДНК або послідовності гена або всю кКДНК або послідовність гена. (Б) Використовуване в даному документі "вікно порівняння" відноситься до неперервного та точно визначеного сегмента в послідовності полінуклеотиду, причому послідовність полінуклеотиду у вікні порівняння може передбачати додавання або делеції (тобто гепи) порівняно з еталонною послідовністю (яка не передбачає додавань або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Як правило, довжина вікна порівняння становить щонайменше 20 суміжних нуклеотидів та необов'язково може становити 30, 40, 50, 100 або більше. Фахівці в даній галузі техніки зрозуміють, що аби уникнути високої подібності з еталонною послідовністю внаслідок включення гепів в послідовність полінуклеотиду, як правило, вводиться штраф за геп, та його віднімають від кількості збігів.
Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі з рівня техніки. Таким чином, визначення відсоткової ідентичності послідовностей між будь-якими двома послідовностями можна виконувати із застосуванням математичного алгоритму.
Необмежувальними прикладами подібних математичних алгоритмів є алгоритм за Муег5 апа
МіПег (1988) САВІО5 4:11-17; алгоритм локального вирівнювання за Зтійй еї аї. (1981) Адаму. Аррі.
Майн. 2:482; алгоритм глобального вирівнювання за Мееадіеєтап апа Умип5сй (1970) У). Мо!. Віо!. 48:443-453; спосіб пошуку локального вирівнювання за Реагзоп апа Ііртап (1988) Ргос. Маї!.
Асад. 5сі. 85:2444-2448; алгоритм за Каїпіп апа Айвениї! (1990) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 872264, який модифікований у Каїпіїп апа АїЇївспиі! (1993) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 90:5873-5877.
Для порівняння послідовностей можна використовувати комп'ютерні впровадження цих математичних алгоритмів, щоб визначити ідентичність послідовностей. Такі реалізації включають без обмеження СІ ШБ5ТАЇ в програмі РС/Ссепе (доступна від Іпіеідепеїїйсв5, Маунтін-
В'ю, Каліфорнія); програму АГІСМ (версія 2.0) та САР, ВЕБТРЇІТ, ВІ А5Т, ЕАЗТА та ТЕАЗТА в ска М/івсопвіп Сепеїїсв 5опмаге РасКаде, версія 10 (доступні від Ассеїгу5 Іпс., 9685 Зстгапіоп
Воадй, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Вирівнювання за допомогою цих програм можна виконувати із застосуванням параметрів за замовчуванням. Програма СІ О5ЗТАЇ добре описана в Ніддіпв єї бо аІ. (1988) Сепе 73:237-244; та ЮОштепрегдег єї аі. (1989) ЕМВО 5:151-153; Аїрапі єї аї. (1988)
Мисієїс Асід5 Вев. 16:10881-90; Ниапод еї аї. (1992) САВІО5 8:155-65 та Реагзоп еї аї. (1994)
Меїй. Мої. ВіоїІ. 24:307-331. Програма АГПСМ базується на алгоритмі з Муєг5 апа МіїПегк (1988), згаданому вище. При порівнянні амінокислотних послідовностей у програмі АГІСМ можна застосовувати таблицю ваги замін залишків РАМ120, штраф за подовження гепу 12 і штраф за відкриття гепу 4. Програми ВІ АТ з АїЇївспиЇ, єї аї!., (1990) У. Мої. Віої. 215:403 базуються на алгоритмі з Капіп апа Аїїв5спиї, (1990), згаданому вище. Пошуки нуклеотидних послідовностей у
ВІГАЄТ можна виконувати за допомогою програми ВІ А5ТМ за параметрів вага вирівнювання - 100, довжина слова - 12 з одержанням нуклеотидних послідовностей, гомологічних нуклеотидній послідовності, яка кодує білок згідно з варіантами здійснення. Пошуки білкових послідовностей в ВІ А5ЗТ можна виконувати за допомогою програми ВІ А5ЗТХ за параметрів вага вирівнювання - 50, довжина слова - З з одержанням амінокислотних послідовностей, гомологічних білку або поліпептиду згідно з варіантами здійснення. Для одержання вирівнювань з гепами з метою порівняння можна використовувати Сарреа ВІ А5Т (в ВІ А5Т 2.0), як описано в
Айвспи! єї аї. (1997) Мисієїс Асідб5 Невз. 25:3389. Альтернативно, можна застосовувати РБІ-
ВІ АТ (в ВІ АТ 2.0) для здійснення ітераційного пошуку, який виявляє віддалені зв'язки між молекулами. Див. Айвспиі еї аіІ. (1997) вище. При використанні ВІ А5Т, Сарред ВІ А5Т, РБІ-
ВІ АЄТ можна застосовувати параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад,
ВІГА5ЄТМ для нуклеотидних послідовностей, ВІ АЄТХ для білків). Див. веб-сайт Національного центру біотехнологічної інформації в мережі Інтернет за адресою пебі.піІт.пій.дох.
Вирівнювання можна проводити вручну шляхом огляду.
Якщо не зазначено інше, значення ідентичності/подібності послідовностей, наведені у даному документі, відносяться до значення, одержаного за допомогою САР версії 10 із застосуванням наступних параметрів: 95 ідентичності ідо подібності для нуклеотидної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа 50, і штрафу за продовження гепа 3, і матриці замін пууздарапа.стр; 95 ідентичності та 95 подібності для амінокислотної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа 8, і штрафу за продовження гепа 2, і матриці замін
ВГОБИМб2; або будь-якої еквівалентної до неї програми. Використовуваний у даному документі термін "еквівалентна програма" відноситься до будь-якої програми для порівняння послідовностей, в якій для будь-яких двох розглянутих послідовностей існують вирівнювання з ідентичними збігами нуклеотидних або амінокислотних залишків та ідентичною відсотковою ідентичністю послідовності порівняно 3 відповідним вирівнюванням, здійснюваним за допомогою САР версії 10.
У САР використовується алгоритм за Меедіеєтап апа Уусп5сп (1970), вище, для виявлення вирівнювання двох повних послідовностей, який максимально збільшує число збігів та зводить до мінімуму кількість гепів. ЗАР розглядає всі можливі варіанти вирівнювання та положення гепів та створює вирівнювання з найбільшою кількістю основ, що збіглися, та найменшим числом гепів. Вона дозволяє призначити штраф за відкриття гепу та штраф за продовження гепу в одиницях основ, що збіглися. У ЗАР необхідно додавати число штрафів за відкриття гепу до збігів для кожного гепу, який вводиться. Якщо вибраний штраф за продовження гепу більше нуля, у СЗАР необхідно, крім цього, додавати для кожного введеного гепу довжину гепу, помножену на штраф за продовження гепу. Значення за замовчуванням для штрафу за відкриття гепу та значення за замовчуванням для штрафу за подовження гепу в С Умізсопвіп
Сепеїйіс5 Зоймаге РасКаде версії 10 для білкових послідовностей становлять 8 та 2, відповідно.
Для нуклеотидних послідовностей штраф за відкриття гепу за замовчуванням становить 50, у той час як штраф за подовження гепу за замовчуванням становить 3. Штрафи за відкриття гепу та за подовження гепу можуть бути виражені у вигляді цілого числа, вибраного з групи, що складається з цілих чисел від 0 до 200. Таким чином, наприклад, штрафи за відкриття гепу та за подовження гепу можуть становити 0, 1,2, 3,4,5,6, 7,8, 9,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 або більше.
САР є одним представником родини найкращих засобів вирівнювання. Існує безліч представників цієї родини, але жоден інший представник не характеризується кращою якістю.
САР відображує чотири числові показники для вирівнювань: якість, співвідношення, ідентичність і подібність. Якість являє собою показник, який максимально збільшують для вирівнювання послідовностей. Співвідношення являє собою якість, поділену на число основ у більш короткому сегменті. Відсоткова ідентичність являє собою відсоток символів, які фактично збігаються. Відсоткова подібність являє собою відсоток символів, які є подібними. Символи, які знаходяться навпроти гепів, ігнорують. Подібність зараховують, якщо значення матриці замін для пари символів більше або рівне 0,50, що є порогом подібності. Матриця замін, що застосовується в версії 10 пакету програмного забезпечення СО М/ізсопвіп Сепеїїс5 5оймаге (510) Раскаде, являє собою ВІ О5ИМб2 (див. Непікої апа Непікоїї (1989) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА
89:10915). (с) Як застосовується у даному документі, " ідентичність послідовностей" або "ідентичність" в контексті двох послідовностей нуклеїнової кислоти або поліпептидних послідовностей стосується залишків у двох послідовностях, які є однаковими при вирівнюванні для максимальної відповідності в межах визначеного вікна порівняння. Якщо відсоткову ідентичність послідовностей застосовують щодо білків, розуміють, що положення залишків, які не є ідентичними, часто відрізняються за консервативними амінокислотними замінами, при цьому амінокислотні залишки замінені на інші амінокислотні залишки з аналогічними хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю) та, внаслідок цього, не змінюють функціональні властивості молекули. Якщо послідовності відрізняються консервативними замінами, то відсоткову ідентичність послідовностей можна підвищити з тим, щоб внести поправку на консервативну природу заміни. Кажуть, що послідовності, які відрізняються за такими консервативними замінами, характеризуються "подібністю послідовностей" або "подібністю". Засоби для здійснення такої корекції добре відомі фахівцям у даній галузі техніки.
Як правило, це передбачає оцінку в балах консервативної заміни як часткового, а не повного незбігу, що, таким чином, збільшує відсоткову ідентичність послідовностей. Таким чином, наприклад, якщо ідентичній амінокислоті присвоюють бал 1, а неконсервативній заміні присвоюють бал нуль, то консервативній заміні присвоюють бал від нуля до 1. Оцінку консервативних замін у балах розраховують, наприклад, як реалізовано в програмі РС/ЗЕМЕ (Іпсеїдепеїйс5, Маунтін-В'ю, Каліфорнія). (4) Як використовується в даному документі, "відсоткова ідентичність послідовностей" означає значення, визначене за допомогою порівняння двох послідовностей з опгимальним вирівнюванням у межах вікна порівняння, де частина послідовності полінуклеотиду у вікні порівняння може передбачати додавання або делеції (тобто гепи) порівняно з еталонною послідовністю (яка не передбачає додавань або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток розраховують шляхом визначення числа положень, в яких ідентична основа нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок зустрічаються в обох послідовностях, з одержанням числа положень, що збігаються, шляхом ділення кількості положень, що збігаються, на загальну кількість положень в інтервалі порівняння та множення результату на 100 з одержанням відсоткової ідентичності послідовності. (е)дї) Термін "значна ідентичність" послідовностей полінуклеотидів означає, що полінуклеотид містить послідовність, яка щонайменше на 70 95, 80 9», 90 95 або 95 95 або більше ідентична при порівнянні з еталонною послідовністю за допомогою однієї з описаних програм для вирівнювання з використанням стандартних параметрів. Фахівець у даній галузі зрозуміє, що дані значення можна відповідним чином відкоригувати для визначення відповідної ідентичності білків, кодованих двома нуклеотидними послідовностями з урахуванням виродженості кодону, амінокислотної подібності, розташування рамки зчитування тощо. Значна ідентичність амінокислотних послідовностей для даних цілей зазвичай означає, що послідовності ідентичні щонайменше на 60 95, 70 95, 80 Фо, 90 95 або 95 95 або більше.
Іншим показником того, що нуклеотидні послідовності мають значний ступінь ідентичності, є те, що дві молекули гібридизуються одна з одною за жорстких умов. Зазвичай жорсткі умови вибирають так, щоб температура була приблизно на 5"С нижчою за Тт для конкретної послідовності за певної іонної сили та рН. Однак жорсткі умови охоплюють температури в діапазоні від приблизно 1 "С до приблизно 20 "С нижче за Тт залежно від необхідного ступеню жорсткості, що в іншому випадку зазначено в даному документі. Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються одна з одною в жорстких умовах, все ще є значно ідентичними, якщо поліпептиди, які вони кодують, є значно ідентичними. Це може бути у випадку, наприклад, якщо копія нуклеїнової кислоти створена з використанням максимальної виродженості кодона, допустимої генетичним кодом. Одним показником того, що дві послідовності нуклеїнової кислоти значно ідентичними, є те, що поліпептид, який кодується першою нуклеїновою кислотою, є імунологічно перехресно-реагуючим із поліпептидом, кодованим другою нуклеїновою кислотою. (еХії) Термін "значна ідентичність" у контексті пептиду вказує на те, що пептид містить послідовність, щонайменше на 70 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95 або більше ідентичну еталонній послідовності в межах певного вікна порівняння. Оптимальне вирівнювання для даних цілей можна провести із застосуванням алгоритму глобального вирівнювання за МееаІєтап апа умипзей (1970), вище. Ознакою того, що дві пептидні послідовності є значно ідентичними, є те, що один пептид є імунологічно реактивним із антитілами, виробленими до другого пептиду.
Отже, пептид є значно ідентичним до другого пептиду, наприклад, у випадку, коли два пептиди 60 відрізняються лише консервативною заміною. Пептиди, які є "значною мірою подібними", мають загальні послідовності, як відзначалося вище, за винятком того, що положення залишків, які не є ідентичними, можуть відрізнятися за консервативними амінокислотними змінами.
Застосування терміну "нуклеотидні конструкції"! у даному документі не призначене обмежувати варіанти здійснення нуклеотидними конструкціями, які містять ДНК. Фахівці в даній галузі зрозуміють, що нуклеотидні конструкції, зокрема полінуклеотиди та олігонуклеотиди, які складаються з рибонуклеотидів та комбінацій рибонуклеотидів та дезоксирибонуклеотидів, також можна застосовувати в способах, розкритих у даному документі. Нуклеотидні конструкції, нуклеїнові кислоти та нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення додатково охоплюють усі комплементарні форми таких конструкцій, молекул та послідовностей. Крім того, нуклеотидні конструкції, нуклеотидні молекули та нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення охоплюють усі нуклеотидні конструкції, молекули та послідовності, які можна використовувати в способах згідно з варіантами здійснення для трансформації рослин, у тому числі без обмеження, які складаються з дезоксирибонуклеотидів, рибонуклеотидів та їх комбінацій. Такі дезоксирибонуклеотиди та рибонуклеотиди передбачають як молекули, що трапляються в природі, так і синтетичні аналоги. Нуклеотидні конструкції, нуклеїнові кислоти та нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення також охоплюють усі форми нуклеотидних конструкцій, у тому числі без обмеження однониткові форми, двониткові форми, шпильки, структури "стебло-та-петля" тощо.
Додатковий варіант здійснення відноситься до трансформованого організму, такого як організм, вибраний із групи, що складається з рослинних клітин та клітин комах, бактерій, дріжджів, бакуловірусів, найпростіших, нематод та водоростей. Трансформований організм містить молекулу ДНК згідно з варіантами здійснення, касету експресії, яка містить вказану молекулу ДНК, або вектор, який містить вказану касету експресії, які можуть бути стабільно вбудованими в геном трансформованого організму.
Послідовності згідно з варіантами здійснення передбачені у складі конструкцій ДНК для експресії в організмі, який становить інтерес. Конструкції будуть включати 5'- та 3'-регуляторні послідовності, функціонально пов'язані з послідовністю згідно з варіантами здійснення.
Використовуваний у даному документі термін "функціонально пов'язані" відноситься до функціонального зв'язку між промотором та іншою послідовністю, де послідовність промотора
Зо ініціює та опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, що відповідає другій послідовності.
Зазвичай функціонально пов'язаний означає, що послідовності нуклеїнової кислоти, які пов'язані, є суміжними, та у випадку, коли необхідно з'єднати дві білок-кодувальні ділянки, вони є суміжними та знаходяться у одній рамці зчитування. Конструкція може додатково містити щонайменше один додатковий ген, який підлягає введенню в організм шляхом котрансформації. Альтернативно додатковий ген(гени) може забезпечуватися у декількох ДНК- конструкціях.
Така ДНК-конструкція забезпечена декількома сайтами рестрикції для вставки послідовності
Сту-токсину, транскрипція якої буде регулюватися регуляторними ділянками. ДНК-конструкція може додатково містити гени селективних маркерів.
У напрямку транскрипції 5' - 3" ДНК-конструкція буде включати ділянку ініціації транскрипції та трансляції (тобто промотор), послідовність ДНК згідно з варіантами здійснення та ділянку термінації транскрипції та трансляції (тобто ділянку термінації), які функціонують в організмі, який слугує хазяїном. Ділянка ініціації транскрипції (тобто промотор) може бути нативною, аналогічною, чужорідною або гетерологічною щодо організму-хазяїна та/або послідовності згідно з варіантами здійснення. Крім того, промотор може бути природною послідовністю або, як альтернатива, синтетичною послідовністю. Використовуваний у даному документі термін "чужорідний" вказує на те, що промотор не знайдений у нативному організмі, в який введений промотор. Якщо промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" щодо послідовності згідно з варіантами здійснення, вважається, що промотор не є нативним або промотором, який зустрічається в природі, для функціонально пов'язаної послідовності згідно з варіантами здійснення. Як використовується в даному документі, химерний ген містить кодувальну послідовність, функціонально пов'язану з ділянкою ініціації транскрипції, яка є гетерологічною для кодувальної послідовності. Якщо промотор є нативною або природною послідовністю, експресія функціонально пов'язаної послідовності змінена порівняно з експресією дикого типу, що приводить до зміни фенотипу.
Ділянка термінації може бути нативною щодо ділянки ініціації транскрипції, може бути нативною щодо функціонально зв'язаної послідовності ДНК, що становить інтерес, може бути нативною щодо рослини-хазяїна або може бути одержана з іншого джерела (тобто чужорідна або гетерологічна для промотора, послідовності, що становить інтерес, рослини-хазяїна або 60 будь-якої їх комбінації).
Придатні ділянки термінації доступні з Ті-плазміди А. Штегїасієпв5, такі як ділянки термінації генів октопінсинтази та нопалінсинтази. Див. також Спегіпеацй єї а. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагоої (1991) Сеї! 64:671-674; Запіасоп єї аі. (1991) Сепе5 Юем. 5:141-149;
Модеп еї аї. (1990) Ріапі Сеї! 2:1261-1272; Мипгое еї аї. (1990) Сепе 91:151-158; Ваїйаз еї аї. (1989) Мисієїс Асіа5 Нев. 17:7891-7903 та довні єї а!. (1987) Мисієїс Асіа Нев. 15:9627-9639.
За необхідності нуклеїнову кислоту можна оптимізувати для посилення експресії в організмі- хазяїні. Таким чином, якщо організм-хазяїн є рослиною, для поліпшення експресії можна синтезувати синтетичні нуклеїнові кислоти із застосуванням кодонів, переважних для рослин.
Див., наприклад, Сатрреї! апа Сюомлті (1990) Ріапі РНувіоЇ. 92:1-1411 стосовно обговорення застосування кодонів, переважних для хазяїна. Наприклад, хоча послідовності нуклеїнової кислоти згідно з варіантами здійснення можуть експресуватися як у видів однодольних, так і дводольних рослин, послідовності можна модифікувати з урахуванням специфічних переваг щодо кодонів та переваг за вмістом С у однодольних або дводольних, якщо було показано, що переваги відрізняються (Митау еї аї. (1989) Мисівїс Асід5 Нев. 17:477-498). Таким чином, кодон, переважний для маїсу, для конкретної амінокислоти можна встановити з відомих генних послідовностей маїсу. Дані про частоту використання кодонів у маїсу для 28 генів із рослин маїсу наведені в таблиці 4 в Миггау єї аї!., вище. З рівня техніки доступні способи синтезу генів, переважних для рослин. Див., наприклад, патентьї США МоМо 5380831 та 5436391; та Миттау єї а!. (1989) Мисівїс Асіаз Нев. 17:477-498, включені в даний документ за допомогою посилання.
Відомі додаткові модифікації послідовності для посилення експресії гена у клітинного хазяїна. Вони включають вилучення послідовностей, що кодують хибні сигнали поліаденілювання, сигнали сайту сплайсингу екзонів та інтронів, транспозон-подібні повтори та інші добре вивчені послідовності, які можуть здійснювати шкідливий вплив на експресію гена.
Вміст С в послідовності можна відкорегувати до рівнів, середніх для даного клітинного хазяїна, розрахованих з урахуванням відомих генів, експресованих у клітині-хазяїні. Використовуваний у даному документі термін "клітина-хазяїн" відноситься до клітини, яка містить вектор та яка підтримує реплікацію та/або експресію передбачуваних векторів експресії. Клітини-хазяїни можуть бути прокаріотичними клітинами, такими як Е. соїї, або еукаріотичними клітинами, такими як клітини дріжджів, комах, амфібій або ссавців, або клітинами однодольних або дводольних рослин. Прикладом клітини-хазяїна, яка відноситься до однодольної рослини, є клітина-хазяїн маїсу. Якщо можливо, послідовність модифікують, аби запобігти утворенню прогнозованих шпилькових вторинних структур мРНК.
Касети експресії можуть додатково містити 5'-лідерні послідовності. Такі лідерні послідовності можуть сприяти посиленню трансляції. Трансляційні лідерні послідовності відомі з рівня техніки та включають лідерні послідовності пікорнавірусів, наприклад лідерну послідовність ЕМСМ (5'-нсекодуюча ділянка геному вірусу енцефаломіокардиту) (ЕІгоу-еїеїп еї аї. (1989) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 86: 6126-6130); лідерні послідовності потівірусів, наприклад лідерну послідовність ТЕМ (вірусу гравіювання тютюну) (Саїйе єї аі. (1995) Сепе 165(2): 233- 238), лідерну послідовність МОММ (вірусу карликової мозаїки кукурудзи), білка, який зв'язує важкий ланцюг імуноглобуліну людини (ВіР) (Масе)ак еї аї. (1991) Майте 353: 90-94); лідерну послідовність МРНК білка оболонки вірусу мозаїки люцерни, що не транслюється (РНК-4 АМУ) (Чобіїпо еї аї. (1987) Маїшге 325: 622-625); лідерну послідовність вірусу тютюнової мозаїки (ТММ) (Саїе еї аї. (1989) в МоіІесшаг Віоіоду ої АМА, єд. Сесй (Гів5, Мем Мо), рр. 237-256) та лідерну послідовність вірусу хлоротичної плямистості маїсу (МСМУ) (Готтеї еї аї. (1991) Мікоіоду 81: 382-385). Див. також ОеїПа-Сіорра еї а. (1987) Ріапі Рпузіої. 84: 965-968.
Під час одержання касети експресії з різноманітними фрагментами ДНК можна проводити маніпуляції так, щоб одержати послідовності ДНК в належній орієнтації та за необхідності в належній рамці зчитування. З цією метою для з'єднання фрагментів ДНК можна використовувати адаптери або лінкери, або можна залучати інші маніпуляції для забезпечення прийнятних сайтів рестрикції, видалення надлишкової ДНК, видалення сайтів рестрикції тощо.
Для цього можна задіяти мутагенез іп міго, репарацію за допомогою праймерів, рестрикцію, гібридизацію, повторні заміни, наприклад, транзиції та трансверсії.
При практичному здійсненні варіантів здійснення можна застосовувати низку промоторів.
Промотори можна вибирати з урахуванням необхідного результату. Нуклеїнові кислоти можна об'єднати з конститутивними, тканинопереважними, індуковними або іншими промоторами для експресії в організмі-хазяїні. Придатні конститутивні промотори для застосування в рослинній клітині-хазяїні включають, наприклад, коровий промотор промотора Кзуп7 та інші конститутивні промотори, розкриті в документі УМО 99/43838 та патенті США Мо 6072050; коровий промотор 355 Самумр с(саеїї еї аї. (1985) Маїшге 313: 810-812); промотор гена актину рису (МеЕїЇгоу еї аї. бо (1990) Ріапі Сеї! 2: 163-171); убіквітиновий промотор (СпПгізіепзеп еї аї. (1989) Ріапі Мо!. Віо!. 12:
619-632 та СНгівієпвзеп сеї аї. (1992) Ріапі Мої. ВіоІ. 18: 675-689); промотор РЕМИ (І аві еї аї. (1991) Тнеог. Аррі. Сепеї. 81: 581-588); промотор гена МА5 (Мепцеп евї а. (1984) ЕМВО 9. 3:2723- 2730); промотор гена А! 5 (патент США Мо 5659026) тощо. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, такі, що обговорюються в патентах США МоМо 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 та 6177611.
Залежно від необхідного результату може бути корисно експресувати ген за допомогою індуковного промотора. Особливий інтерес для регуляції експресії нуклеотидних послідовностей згідно з варіантами здійснення у рослин становлять промотори, що індукуються пораненням. Такі промотори, що індукуються пораненням, можуть реагувати на пошкодження, спричинене живленням комахи, та вони включають промотор гена інгібітора протеїнази картоплі (ріп ІІ) (ВАуап (1990) Апп. Нем. Рпуюраїйй. 28: 425-449; Юцап еї аї. (1996) Маїшге Віотесппоіоду 14: 494-498); промотори генів мип1 та мип2, патент США Мо 5428148; промотори генів м/п1 та м/іп2 (Єтаптога еї аї. (1989) Мої. Сеп. Сепеї. 215: 200-208); промотор гена системіну (Меси! еї аї. (1992) бсієпсе 225: 1570-1573); промотор гена УМІР1 (Коптеїег єї аї. (1993) Ріапі Мої. Віої. 22: 783-792; ЕсКеІКатр еї аІ. (1993) РГЕВ5 І ейеге 323: 73-76); промотор гена МРІ (Согаегок еї аї. (1994) Ріапі У. 6(2): 141-150); тощо, включені в даний документ за допомогою посилання.
Крім того, у способах та нуклеотидних конструкціях згідно з варіантами здійснення можна використовувати промотори, що індукуються патогеном. Такі промотори, що індукуються патогеном, включають промотори з генів, пов'язаних із патогенезом білків (РК білків), які індукуються після інфікування патогеном; наприклад, РЕ. білків, БАК білків, бета-1,3-глюканази, хітинази тощо. Див., наприклад, Неодоїїї еї а!. (1983) Мей. У. РіІапі Раїйої. 89: 245-254; ОКпез вї аї. (1992) Ріапі СеїІ 4: 645-656 та Мап І ооп (1985) Ріапі Мої. МігоЇ. 4: 111-116. Див. також УУО 99/43819, включену в даний документ за допомогою посилання.
Становлять інтерес промотори, які експресуються локально в місці зараження патогеном або поруч із ним. Див., наприклад, Магіпеаи сеї аї. (1987) Ріапі Мої. Віої. 9:335-342; Мацоп еї а). (1989) Моїесшіаг Ріапі-Місторе Іпіегасіюп5 2:325-331; 5отвівсп еї а!. (1986) Ргос. Маї!. Асай. 5сі.
БА 83:2427-2430; 5отвівсп еї аі. (1988) Мої. Сеп. Сепеї. 2:93-98 та Мапу (1996) Ргос. Маї).
Асад. 5сі. ОБА 93:14972-14977. Див. також СНеп еї аї. (1996) Ріапі У. 10:955-966; 7Напо еї аї. (1994) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 91:2507-2511; Матег єї а!. (1993) Ріапі У. 3:191-201; бівебені? еї
Ко) аім. (1989) Ріапі СеїЇ 1:961-968; патент США Мо 5750386 (індукований нематодами); а також джерела, цитовані в цих документах. Особливий інтерес становить індукований промотор для гена маїсу РКтв5, експресія якого індукується патогеном Ризагійт топіїйогте (див., наприклад,
Согаего евї а!. (1992) РНузіої. Мої. Ріапі Рай. 41:189-200).
Регульовані хімічними речовинами промотори можна застосовувати для модуляції експресії гена в рослині за допомогою внесення екзогенного хімічного регулятора. Залежно від мети промотор може бути промотором, що індукується хімічною речовиною, в даному випадку застосування хімічної речовини індукує експресію гена, або репресованим хімічною речовиною промотором, у даному випадку застосування хімічної речовини пригнічує експресію гена.
Промотори, що індукується хімічними речовинами, відомі з рівня техніки та включають без обмеження промотор гена Іп2-2 маїсу, який активується антидотами до бензолсульфонамідних гербіцидів, промотор гена О5Т маїсу, який активується гідрофобними електрофільними сполуками, які застосовуються як досходові гербіциди, та промотор гена РЕ-1а тютюну, який активується саліциловою кислотою. Інші регульовані хімічними речовинами промотори, які становлять інтерес, включають чутливі до стероїдів промотори (див., наприклад, промотор, що індукується глюкокортикоїдами, в Зспепа еї а!. (1991) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 88:10421-10425 та МемМеїїїв5 еї аї!. (1998) Ріапі 9. 14(2):247-257) та промотори, що індукуються тетрацикліном та репресуються тетрацикліном (див., наприклад, Саїх еї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 227:229-237 та патенти США МоМо 5814618 та 5789156), включені в даний документ за допомогою посилання.
Тканинопереважні промотори можна використовувати для цілеспрямованого посилення експресії пестицидного білка в межах конкретної тканини рослини. Тканинопереважні промотори включають промотори, що обговорюються в Хататоїйо еї аї!. (1997) Ріапі 9. 12(2)255- 265; Каматаїа с! а!. (1997) Ріапі Сеї! Ріузіої!. 38(7):792-803; Напзеп еї а!. (1997) Мої. Сеп Сепеї. 254(3):337-343; Нивбзеї! еї аї. (1997) Ттапздепіс Нев. 6(2):157-168; Віпепап еї аї. (1996) Ріапі
РНузіої. 112(3):1331-1341; Мап Сатр еї а!. (1996) Ріапі РНузіої!. 112(2):525-535; Сапемавсіпі еї аї. (1996) Ріапі РНувзіої. 112(2):513-524; Мататой еї аї. (1994) Ріапі Сеї! Ріузіої!. 35(5):773-778; | ат (1994) Везийв Ргобі. Сеїї ОйШег. 20:181-196; Ого2со єї а!. (1993) Ріапі Мої Віої. 23(6):1129-1138;
Маїзиока єї аї. (1993) Ргос Маї). Асад. 5сі. ОБА 90(20):9586-9590 та СПемага-Сагсіа єї аї. (1993)
Ріапі У. 4(3):495-505. У разі потреби такі промотори можна модифікувати з одержанням слабкої експресії. 60 Промотори, активні переважно у листі, відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Хататоїйо єї а!. (1997) Ріапі 9. 12(2):255-265; Куоп еї аї. (1994) Ріапі Рпувіої. 105:357-67; Мататоїо еї аї. (1994) Ріапі Сеї! Рнузіої. 35(5):773-778; Сиюїог єї аї. (1993) Ріапі У. 3:509-18; Ого2со еї аї. (1993)
Ріапі Мої. Віої!. 23(6):1129-1138 та МаїзиокКа еї а!. (1993) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 90(20):9586- 9590.
Відомими є промотори, активні переважно в коренях, або промотори, специфічні щодо кореня, та їх можна вибирати з багатьох доступних з літератури або виділених де помо з різноманітних сумісних видів. Див., наприклад, Ніге сеї аї. (1992) Ріапі Мої. Віої. 20(2):207-218 (специфічний щодо кореня ген глутамінсинтетази сої); КеПег апа Ваштданйнег (1991) Ріапі Сеї 3(10):1051-1061 (специфічний щодо кореня регуляторний елемент у гені СВАР 1.8 квасолі звичайної); Запдег еї аї. (1990) Ріапі Мої. Віої. 14(3):433-443 (специфічний щодо кореня промотор гена манопінсинтази (МА5) з Адгобасієгійт Кштегасіеп5) та Міао єї а!. (1991) Ріапі СеїЇ
З(1):11-22 (кКДНК-клон повної довжини, який кодує цитозольну глутамінсинтетазу ((5), яка експресується в коренях та кореневих бульбочках сої). Див. також Водив7 вї а!. (1990) Ріапі Сеї! 2(7):633-641, де описані два специфічних щодо кореня промотори, виділені з генів гемоглобіну азотфіксуючої рослини Рагазропіа ападегзопії, яка не належить до бобових, та спорідненої рослини, яка не належить до азотфіксуючих та яка не відноситься до бобових, Тгета Юютепіоза.
Промотори цих генів були пов'язані з репортерним геном ДВ-глюкуронідази та введені як у
Місоїапа їарасит, яка не належить до бобових, так і у бобову рослину І оїи5 сопісціацв, та при цьому в обох випадках активність промотора, специфічна щодо кореня, зберігалася. І єасй та
Асуаді (1991) описують свій аналіз промоторів, які забезпечують високий рівень експресії генів гоЇС та го10 Адгобасіейцйт гПпігодепев, які індукують розростання коренів (див. Ріапі бсієпсе (Сітегіск) 79(1):69-76). Автори дійшли висновку, що в цих промоторах енхансер та тканинопереважні ДНК-детермінанти розділені. Теегі єї аї. (1989) застосовували злиття гена з
Іас2 для того, щоб показати, що ген із Т-ДНК Аагорасієтішт, який кодує октопінсинтазу, є особливо активним в епідермісі кінчика кореня та що ген ТА2" є специфічним щодо кореня в інтактній рослині та стимулюється при пораненні тканини листа, що є особливо бажаною комбінацією характеристик для застосування з інсектицидним або ларвіцидним геном (див.
ЕМВО 3. 8(2):343-350). Ген ТК, злитий з прі! (неоміцинфосфотрансфераза І), продемонстрував аналогічні характеристики. Додаткові переважні для кореня промотори
Зо включають промотор гена МЕМОО-СВАРЗ (Кивіег єї аї. (1995) Ріапі Мої. Віої. 29(4):759-772) та промотор гоіІВ (Сарапа єї а!. (1994) Ріапі Мої. Віої. 25(4):681-691. Див. також патенти США МоМое 5837876; 5750386; 5633363; 5459252; 5401836; 5110732 та 5023179.
Промотори, "активні переважно в насінні"? включають як промотори, "специфічні щодо насіння" (промотори, які активні під час розвитку насіння, такі як промотори запасних білків насіння), а також промотори "проростання насіння" (промотори, які активні під час проростання насіння). Див. Тпотрзоп еї аї. (1989) ВіоЕззауз 10:108, включену в даний документ за допомогою посилання. Такі промотори, активні переважно в насінні, включають без обмеження промотори генів Сіт! (транскрипт, який індукований цитокініном); с21981 (19 кДа зеїн маїсу) та тіїр5 (міо-інозитол-1-фосфатсинтаза); (див. патент США Мо 6225529, включений у даний документ за допомогою посилання). Промотори генів гамма-зеїну та б5ІоБ-1 являють собою промотори, специфічні щодо ендосперму. У дводольних рослин промотори, специфічні щодо насіння, включають без обмеження промотори генів ВД-фазеоліну квасолі, напіну, В-конгліциніну, лектину сої, круциферину тощо. В однодольних рослин промотори, специфічні щодо насіння, включають без обмеження промотори генів 15 кДа зеїну, 22 кДа зеїну, 27 кДа зеїну, д-зеїну, жаху, зпгипКеп 1, 5пгипКкеп 2, глобуліну 1 маїсу тощо. Див. також включений у даний документ за допомогою посилання документ М/О 00/12733, де розкриті промотори, активні переважно в насінні, з генів епа! та епа2. Промотор, що характеризується "переважною" експресією у конкретній тканині, експресується в такій тканині більшою мірою, ніж щонайменше у одній іншій рослинній тканині. Для деяких промоторів, активних переважно у певній тканині, показана експресія майже виключно в конкретній тканині.
Якщо потребується низький рівень експресії, будуть застосовуватися слабкі промотори.
Зазвичай використовуваний у даному документі термін "слабкий промотор" стосується промотора, який керує експресією кодувальної послідовності на низькому рівні. Під низьким рівнем експресії мають на увазі рівні від приблизно 1/1000 транскриптів до приблизно 1/100000 транскриптів, до приблизно 1/500000 транскриптів. Альтернативно зрозуміло, що термін "слабкі промотори" також охоплює промотори, які керують експресією лише в деяких клітинах та не керують в інших, що призводить до загального низького рівня експресії. Якщо промотор керує експресією з неприйнятно високими рівнями, частини промоторної послідовності можна видаляти або модифікувати для зниження рівнів експресії. бо Такі слабкі конститутивні промотори включають, наприклад, коровий промотор промотора
Е5зуп7 (документ УУО 99/43838 та патент США Мо 6072050), коровий промотор 355 Самм тощо.
Інші конститутивні промотори включають, наприклад, розкриті в патентах США МоМо 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 та 6177611, включені у даний документ за допомогою посилання.
Зазвичай касета експресії буде містити ген селективного маркера для відбору трансформованих клітин. Гени селективних маркерів застосовують для відбору трансформованих клітин або тканин. Гени маркерів включають у себе гени, які відповідають за стійкість до антибіотиків, такі як гени, що кодують неоміцин-фосфотрансферазу І! (МЕО) та гігроміцин-фосфотрансферазу (НРТ), а також гени, які забезпечують стійкість до гербіцидних сполук, таких як глуфосинат амонію, бромоксиніл, імідазолінони та 2,4-дихлорфеноксиацетат (24-03. Додаткові приклади придатних генів селективних маркерів включають без обмеження гени, які кодують ознаку стійкості до хлорамфеніколу (Неггега ЕзігтеПйа єї аІ. (1983) ЕМВО .. 2:987-992); метотрексату (Не!тега Евігеїа сеї а!. (1983) Маїште 303:209-213 та Меїег еї а. (1991)
Ріапі Мої. Віої. 16:807-820); стрептоміцину (Чопе5 еї аї. (1987) Мої. Сеп. Сепеї. 210:86-91); спектиноміцину (Вгеїадпе-Задпага еї аї. (1996) Тгтапздепіс Нев. 5:131-137); блеоміцину (Нійе єї а!. (1990) Ріапі Мої. Віо!. 7:171-176); сульфонаміду (Спшегіпеаи єї а!. (1990) Ріапі Мо)!. Вісі. 15:127- 136); бромоксинілу (еїаїЇКег єї аї. (1988) 5сівєпсе 242:419-423); гліфосату (5Нпам/ єї аї. (1986)
Зсіепсе 233:478-481; і патенти США МоМо 7709702 та 7462481); фосфінотрицину (Оевіоск еї аї. (1987) ЕМВО 9. 6:2513-2518). Див. загалом Матапіоп (1992) Си. Оріп. Віоїесн. З: 506-511;
СПгівіорнегзоп еї а!. (1992) Ргос. Маї). Асад. сі. БА 89: 6314-6318; Мао еї а!. (1992) Сеї! 71: 63- 72; Вегпікоїї (1992) Мої. Містобіо!. 6: 2419-2422; Важівєу еї аї. (1980) у Тне Орегоп, рр. 177-220;
Ни єї аї. (1987) СеїІ 48: 555-566; Вгоулп вї а)ї. (1987) Сеї! 49: 603-612; Рідде сеї аї. (1988) Сеї! 52: 713-722; ОєизсеНіе еї аї. (1989) Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 86: 5400-5404; Риегві еї а. (1989) Ргос.
Май. Асад. 5сі. БА 86: 2549-2553; ЮеизсНіє сеї а. (1990) бсіепсе 248: 480-483; Сов5з5еп (1993)
РИ.О. Тнезів, Опімегейу ої Неїдеїбега; Веїпез єї аІ. (1993) Ргос. Майї). Асад. сі. ОБА 90: 1917- 1921; І арому єї аї. (1990) Мої. Сеї. Віої!. 10: 3343-3356; гатрьгенйі еї аї. (1992) Ргос. Маї!. Асад. зсі.
ИБА 89: 3952-3956; Ваїт еї аї. (1991) Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА 88: 5072-5076; М/урогекі евї аї. (1991) Мисівїс Асід5 Нез. 19: 4647-4653; НіПепапа-м/ізвтап (1989) Торісв Мої. 5ігис. Віої. 10: 143- 162; Оедепкоїь еї а!. (1991) Апіітістор. Адепів СпетоїНег. 35: 1591-1595; КіІвіпзсейпіаї еї а!. (1988)
Зо Віоспетівігу 27: 1094-1104; Вопіп (1993) РИ.О. Тневзів, Опімегейу ої НеїдеІрегу; Соззеп еї аї. (1992) Ргос. Маїй!. Асад. 5сі. ОБА 89: 5547-5551; Оїїма еї а!. (1992) Апіїтістоб. Адепів СпетоїНег. 36: 913-919; НіамКа єї а!. (1985) Напаросок ої Ехрегітепіа! Рнаптасоіоду, Мої. 78 (ргіпдег-Мепад,
Вепіп) та СІ еї аі. (1988) Маїште 334: 721-724. Такі розкриття включені в даний документ за допомогою посилання.
Вищенаведений перелік генів селективних маркерів не призначений для обмеження. Будь- який ген селективного маркера можна застосовувати у варіантах здійснення.
Способи згідно з варіантами здійснення включають введення поліпептиду або полінуклеотиду в рослину. Передбачається, що "введення" означає надання рослині полінуклеотиду або поліпептиду таким чином, що послідовність потрапляє всередину клітини рослини. Способи згідно з варіантами здійснення не залежать від конкретного способу введення полінуклеотиду або поліпептиду в рослину, потрібно тільки, щоб полінуклеотид або поліпептиди потрапляли всередину щонайменше однієї клітини рослини. З рівня техніки відомі способи введення полінуклеотиду або поліпептидів у рослини, включаючи без обмеження способи стабільної трансформації, способи тимчасової трансформації та способи трансформації, опосередкованої вірусами.
Передбачається, що "стабільна трансформація" означає, що нуклеотидна конструкція, що введена в рослину, інтегрується в геном рослини та може успадковуватися її потомством.
Передбачається, що "тимчасова трансформація" означає, що полінуклеотид вводиться в рослину та не інтегрується в геном рослини, або в рослину вводиться поліпептид.
Протоколи трансформації, а також протоколи для введення нуклеотидних послідовностей в рослини можна змінювати залежно від типу рослини або рослинної клітини, тобто однодольної або дводольної рослини, що призначена для трансформації. Придатні способи введення нуклеотидних послідовностей в рослинні клітини та подальшої вставки в геном рослини включають мікроін'єкцію (Стоззулау 6вї аї. (1986) Віотеснпіднев 4: 320-334), електропорацію (Віда еї а). (1986) Рос. Май. Асай. осі. ОБА 83: 5602-5606), Адгобасіепт-опосередковану трансформацію (патенти США МоМо 5563055 та 5981840), пряме перенесення генів (Рабз2КомувкКі еї аі. (1984) ЕМВО 3. 3: 2717-2722) та балістичне прискорення частинок (див., наприклад, патенти США МоМо 4945050; 5879918; 5886244 та 5932782; Тоте5 єї а. (1995) в Ріапі Сеї,
Тіввиє, апа Огдап Сийиге: Еипдатепіа! Меїйподе, сад. Сатрогу апа РнНійїре (брііпдег/-Мепад, 60 Вепіп); та МеСабе евї а!. (1988) Віоїєснппоіоду 6: 923-926); а також трансформацію за допомогою
Їесі (М/О 00/28058). Стосовно трансформації картоплі див. Ти єї аЇ. (1998) Ріапі Моїесшаг
Віоїоду 37: 829-838 та Спопад еї аї. (2000) Ттапздепіс Везеєагси 9: 71-78. Додаткові методики трансформації можна знайти у М/єїззіпдег еї а. (1988) Апп. НеуУ. Сепеї. 22: 421-477; Запіога єї а!І. (1987) Рапісшагйе 5сіепсе апа Тесппоіоду 5: 27-37 (цибуля); Спгізіои евї а!. (1988) Ріапі РНузіо|. 87: 671-674 (соя); МеСаье вї а). (1988) Віо/Тесппоіоду 6: 923-926 (соя); Ріпег апа МеМиПеп (1991)
Іп Міїго Сеї! Оєм. Віої. 27Р: 175-182 (соя); 5іпоунй еї аї. (1998) Тнеог. Аррі. Сепеї. 96: 319-324 (соя);
Баца еї аї. (1990) Віотесппоіоду 8: 736-740 (рис); КіІвєїп єї аі. (1988) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 85: 4305-4309 (маїс); Кієїп єї а). (1988) Віоїесппоіоду 6:559-563 (маїс); у патентах США МоеоМо 5240855; 5322783 та 5324646; Ківєїп сеї аї. (1988) Ріапі Рнузіої. 91: 440-444 (маїс); Еготт еї аї. (1990) ВіотесппоЇоду 8: 833-839 (маїс); Носукааз-Мап 5іодієгеп еї аї. (1984) Майшге (І опдоп) 311: 763-764; в патенті США Ме 5736369 (зернові); Вуїебієг еї аї!. (1987) Ргос. Маїй!. Асад. Зсі. ОБА 84: 5345-5349 (І асєає); Оє МУ/еї єї а). (1985) у Те Ехрептепаї! Мапіршіайоп ої Омшіе Тіввцев, єдй.
Спартагп еї а. (Гопдтап, Мем МогК), рр. 197-209 (пилок); Каеррієг еї аї. (1990) Ріапі Сеї! Верогів 9: 415-418 та Каеєррієї єї аЇ. (1992) Треог. Аррі. Сепеї. 84: 560-566 (опосередкована ниткоподібними кристалами трансформація); О'НаїйшШіп єї а). (1992) Ріапі СеїЇ 4: 1495-1505 (електропорація); І і єї а. (1993) Ріапі Сеї! Неропв 12: 250-255 та Спгівіои апа Рога (1995) Аппаїв ої Воїапу 75: 407-413 (рис); Овіода еї а!. (1996) Маште ВіотесппоЇоду 14: 745-750 (трансформація маїсу за допомогою Адгобрасієгйт Іїштеїасіеп5); всі з яких включені в даний документ за допомогою посилання.
У конкретних варіантах здійснення послідовності згідно з варіантами здійснення можна надавати рослині із застосуванням ряду способів тимчасової трансформації. Такі способи тимчасової трансформації включають без обмеження введення білка Сту-токсину або його варіантів та фрагментів безпосередньо в рослину або введення транскрипту Стгу-токсину в рослину. Такі способи включають, наприклад, мікроіїн'єкцію або бомбардування частинками.
Див., наприклад, Сто55улау вї а!. (1986) Мої Сеп. Сепеї. 202: 179-185; Мотига єї аї. (1986) Ріапі зЗсі. 44: 53-58; Нерієг еї аї. (1994) Ргос. Маї). Асад. 5сі. 91: 2176-2180 та Низ еї аї. (1994) Тне
Чоштпа! ої СеїЇ бсієпсе 107: 775-784, всі з яких включені в даний документ за допомогою посилання. Альтернативно рослину можна тимчасово трансформувати полінуклеотидом Стгу- токсину із застосуванням методик, відомих із рівня техніки. Такі методики включають
Зо застосування вірусної векторної системи та осадження полінуклеотиду в такий спосіб, який виключає подальше вивільнення ДНК. Таким чином, може відбуватися транскрипція ДНК, пов'язаної з частинками, але частота, з якою вона вивільняється для інтеграції в геном, значною мірою знижена. Такі способи включають у себе застосування частинок, вкритих поліетиленіміном (РЕЇ; Мо за кат. Зідта РЗ143).
З рівня техніки відомі способи націленої вставки полінуклеотиду в специфічне місце розташування в геномі рослини. В одному варіанті здійснення вставку полінуклеотиду в необхідне місце розташування в геномі здійснюють із застосуванням системи сайт-специфічної рекомбінації. Див., наприклад, УУО99/25821, УУО99/25854, УМО99/25840, УО99/25855 та
УМО99/25853, всі з яких включені в даний документ за допомогою посилання. Коротко, полінуклеотид згідно з варіантами здійснення може міститися в касеті для перенесення, фланкованій двома неідентичними сайтами рекомбінації. Касету для перенесення вводять у рослину, яка має в своєму геномі стабільно вбудований цільовий сайт, фланкований двома неідентичними сайтами рекомбінації, які відповідають сайтам касети для перенесення.
Забезпечують придатну рекомбіназу, та касета для перенесення інтегрується в цільовий сайт.
Полінуклеотид, який становить інтерес, таким чином, інтегрується у конкретне хромосомне положення в геномі рослини.
З клітин, які були трансформовані, можна вирощувати рослини згідно з традиційними способами. Див., наприклад, МеСоптіск еї а!. (1986) Ріапі Сеї! Веропіз 5: 81-84. Ці рослини потім можна вирощувати та або запилювати з використанням такої ж трансформованої лінії або інших ліній та ідентифікувати одержаний гібрид із конститутивною або індуковною експресією необхідної фенотипічної характеристики. Можна виростити два або більше поколінь для того, щоб переконатися у тому, що експресія необхідної фенотипічної характеристики стабільно підтримується та успадковується, а потім зібрати насіння, щоб переконатися у тому, що експресія необхідної фенотипічної характеристики була досягнута.
Нуклеотидні послідовності згідно з варіантами здійснення можна забезпечити в рослині за допомогою контакту рослини з вірусом або вірусними нуклеїновими кислотами. Зазвичай такі способи передбачають вбудовування нуклеотидної конструкції, що становить інтерес, у вірусну молекулу ДНК або РНК. Зрозуміло, що рекомбінантні білки згідно з варіантами здійснення можуть попередньо синтезуватися як частина вірусного поліпротеїну, який пізніше може бо процесуватися шляхом протеолізу іп мімо або іп міго з утворенням необхідного пестицидного білка. Також зрозуміло, що такий вірусний поліпротеїн, який містить щонайменше частину амінокислотної послідовності пестицидного білка згідно з варіантами здійснення, може мати необхідну пестицидну активність. Такі вірусні поліпротеїни та нуклеотидні послідовності, які їх кодують, охоплені варіантами здійснення. Способи забезпечення рослин нуклеотидними конструкціями та одержання білків, що кодуються, у рослинах, які включають вірусні молекули
ДНК або РНК, відомі з рівня техніки. Див., наприклад, патенти США МоМо 5889191; 5889190; 5866785; 5589367 та 5316931; включені в даний документ за допомогою посилання.
Варіанти здійснення додатково відносяться до матеріалу для розмноження трансформованої рослини згідно з варіантами здійснення, у тому числі без обмеження насіння, бульб, бульбоцибулин, цибулин, листя та живців коренів та пагонів.
Варіанти здійснення можна застосовувати для трансформації будь-яких видів рослин, включаючи без обмеження однодольні та дводольні. Приклади рослин, які становлять інтерес, включають без обмеження кукурудзу (7еа таубх), Вгазвіса 5р. (наприклад, В. паривх, В. гара, В. )шпсеа), зокрема ті види Вгабзіса, які є придатними як джерела олії із насіння, люцерну (Медісадо заїїма), рис (Огула заїїма), жито (ЗесаЇе сегеаїє), сорго (ЗБогдапит бБісоїог, зогдапит миЇдаге), просо (наприклад, пенісетум рогозовидний (Реппізейшт діаисит), просо посівне (Рапісит тіїйасецийт), щетинник італійський (зеїагіа Маїїса), просо пальчасте (ЕІвивіпе согасапа)), соняшник (Неїїапіпи5 аппии5), сафлор (Саппатиз (псіогпи5), пшеницю (Тгйісчт аевзіїмит), сою (СіІусіпе тах), тютюн (Місойапа їарасит), картоплю (Зоіїапит шбБегозит), різновиди арахісу (Агаспіз пуродаєа), бавовник (Соззурійт Багбадепзе, Соззурішт Вігешщит), солодку картоплю (Протоеєа бБаїайш5), маніок (Мапіпої езсцшіепіа), кавове дерево (СоПеа 5рр.), кокосову пальму (Сосо5 писіїега), ананас (Апапазх сотозив5), цитрусові дерева (Сйги5 5рр.), шоколадне дерево («Теобгота сасао), чайний кущ (Сатеїйа віпеп5іб), банан (Миза 5рр.), авокадо (Регзеа атегісапа), інжир (Ріси5 савзіса), гуаву (Рзідішт диа)ама), манго (Мапоїїега іпаїіса), оливу (ОїІєа еигораєа), папаю (Сагіса рарауа), кешю (Апасагдішт оссідепіаіє), макадамію (Масадатіа іптедгігоїїа), мигдаль (Ргипи5 атудаа!рй5), різновиди цукрового буряка (Веїа миїЇдагіх), цукрову тростину (Засспагит 5рр.), різновиди вівса, ячмінь, овочі, декоративні рослини та хвойні рослини.
Овочі включають різновиди томата (І усорегвзісоп езсцепійт), латук (наприклад, І асіиса
Зо ваїма), різновиди зеленої квасолі (Рпазеоїи5 миїдагі5), різновиди лімської квасолі (Рпазеоїи5
Ітепвів), різновиди гороху (Іаїйугив 5рр.) та представників роду Сиситів, таких як огірок (С. займи5), канталупа (С. сапіаїйрепвії) та диня мускусна (С. тео). Декоративні рослини включають азалію (АПододепагоп 5рр.), гортензію (Масторнпуїа Нуагапдєа), гібіскус (Нірізси5 гозазапепвів), троянди (Ноза 5рр.), тюльпани (Тиїїра 5рр.), нарциси (Магсібззив5 5рр.), петунії (Реїшпіа Пубгіда), гвоздику (Оіапійи5 сагуорпуПив5), пуансетію (Еиорпоїбіа риіспегтіта) та хризантему. Хвойні, які можуть бути використані при здійсненні на практиці варіантів здійснення, включають, наприклад, види сосни, такі як сосна ладанна (Ріпив5 іаєда), сосна
Еліота (Ріпих еїоїїй), сосна жовта (Ріпиб5 ропдегоза), сосна скручена (Ріпи5 сопіопа) та сосна промениста (Ріпиз гадіаіа); псевдотсуга Мензиса (Рзейдоївида тепгієвії); тсуга західна (Т5!ида сападеп5ії); ялина сиза (Рісєеєа діайса); каліфорнійське мамонтове дерево (5бедиоіа зетрегмігеп5); справжні ялини, такі як ялиця біла (Абріє5 атабіїв) та ялиця бальзамічна (Абієб
Баізатеа); та кедри, такі як туя (Тиша ріїсаїа) та жовтий кедр (Спатаєсурагі5 пооїкаїепвів).
Рослини згідно з варіантами здійснення включають культурні рослини, у тому числі без обмеження кукурудзу, люцерну, соняшник, Вгаззіса 5рр., сою, бавовник, сафлор, арахіс, сорго, пшеницю, просо, тютюн, цукрову тростину тощо.
Різновиди газонної трави включають без обмеження: тонконіг однорічний (Роа аппиа); райгас однорічний (І оїйшт тийПйогит); тонконіг стисний (Роа сотргезза); вівсяницю червону змінену (Ревіиса гибга); мітлицю тонку (Адговіїв їепиі5); мітлицю болотяну (Аагозіїв раїЇивінв); житняк пустельний (Аагоругоп дезепогит); житняк гребінчастий (Аагоругоп сгізїайт); кострицю довголисту (Резіиса Іопаїйоїіа); тонконіг лучний (Роа ргаїепвів); грястицю збірну (Оасіуїїв5 діотегаїа); пажитницю багаторічну (І оїїшт регеппе); кострицю червону (Резійса гибга); мітлицю білу (Адговії5 аіІба); тонконіг звичайний (Роа ігіміаів); кострицю овечу (ЕРезійса оміпа); стоколос безостий (Вготизв іпептів); кострицю очеретяну (Резійса агпипаіпасеа); тимофіївку лучну (Рнієит ргаїєпзе); мітлицю собачу (Аагозіїз сапіпа); покісницю розставлену (РиссіпеїПа аівїапв); пирій
Сміта (Адгоругоп 5тіїйії); свинорий (Суподоп 5рр.); августинову траву (5ієпоїарпгит весипаайт); зойсію (7оувзіа 5рр.); гречку помітну (Разраїшт поїаїшт); аксонопус афінський (Ахопориб5 айіпіз);х еремохлою змієхвосту (Егетоспіоа орПіигоіїде5); кийкую (Реппізейшт сіападезіпит); паспалум піхвовий (Разраїшт мадіпаїшт); москітний злак (Вошеїоца дгасіїїв); бізонову траву (Висніоє дасіуіоїдв); граму (ВошцівіІоца сипірепаціа). 60 Рослини, які становлять інтерес, включають зернові рослини, які дають насіння, яке становлять інтерес, олійні рослини та бобові рослини. Насіння, яке становить інтерес, включає насіння зернових культур, таких як кукурудза, пшениця, ячмінь, рис, сорго, жито, просо тощо.
Олійні рослини включають бавовник, сою, сафлор, соняшник, Вгаззіса, маїс, люцерну, пальму, кокосову пальму, льон, рицину, оливу тощо. Бобові рослини включають різновиди бобів та різновиди гороху. Різновиди бобів включають гуар, ріжкове дерево, гуньбу, сою, різновиди квасолі звичайної, вігну китайську, золотисту квасолю, лімську квасолю, стручкову квасолю, різновиди сочевиці, турецький горох тощо.
У певних варіантах здійснення послідовності нуклеїнових кислот згідно з варіантами здійснення можна пакетувати з будь-якою комбінацією послідовностей полінуклеотидів, що становлять інтерес, для створення рослин із необхідним фенотипом. Наприклад, полінуклеотиди згідно з варіантами здійснення можна пакетувати з будь-якими іншими полінуклеотидами, які кодують поліпептиди з пестицидною та/або інсектицидною активністю, такими як інші токсичні білки Ві (описані в патентах США МоМо 5366892; 5747450; 5736514; 5723756; 5593881 та Сеїізег єї аІ. (1986) Сепе 48:109), пентин (описаний у патенті США Мо 5981722) тощо. Одержані комбінації також можуть включати декілька копій будь-якого полінуклеотиду, який становить інтерес. Полінуклеотиди згідно з варіантами здійснення можна також пакетувати з будь-яким іншим геном або комбінацією генів для одержання рослин із різноманітними комбінаціями необхідних ознак, в тому числі без обмеження з ознаками, бажаними для використання для харчування тварин, такими як гени, які зумовлюють високий вміст олії (наприклад, патент США Мо 6232529); збалансований вміст амінокислот (наприклад, хордотіоніни (патенти США МоМо 5990389; 5885801; 5885802 та 5703049); ячмінь із високим вмістом лізину (У/Шіатвоп еї а!. (1987) Єиг. 9. Віоспет. 165: 99-106 та документ УМО 98/20122) та білки з високим вмістом метіоніну (Редегзеп еї аї. (1986) у. Віої. Спет. 261: 6279; КіпНага еї аї. (1988) Сепе 71: 359 та Мизитига єї а!. (1989) Ріапі Мої. Віої. 12: 123)); підвищену засвоюваність (наприклад, модифіковані запасні білки (патент США Мо 6858778) та гени тіоредоксинів (патент
США Мо 7009087), розкриття яких включені в даний документ за допомогою посилання.
Полінуклеотиди згідно з варіантами здійснення також можна пакетувати з ознаками, бажаними для стійкості до захворювань або гербіцидів (наприклад, гени детоксикації фумонізину (патент США Ме 5792931); гени авірулентності та стійкості до захворювань (Чопез єї аї. (1994) бсіепсе 266:789; Мапіп еї аї. (1993) бсівєпсе 262: 1432 та Міпагпоз єї аї. (1994) Сеї 78:1089); мутанти за ацетолактат-синтазою (АЇ 5), які призводять до стійкості до гербіцидів, як, наприклад, мутації 54 та/або Нга; стійкості до інгібіторів глутамінсинтази, таких як фосфінотрицин або бБавзіа (наприклад, ген баї); та такі, що зумовлюють стійкість до гліфосату (ген ЕРБР5 та ген САТ, які розкриті в патентах США МоМо 7709702 та 7462481; та з ознаками, бажаними для обробки або переробки продуктів, як, наприклад, високий вміст олії (наприклад, патент США Мо 6232529); модифіковані олії (наприклад, гени десатурази жирних кислот (патент
США Мо 5952544; МО 94/11516)); модифіковані крохмалі (наприклад, АОРСІ-пірофосфорилази (АСтРаза), крохмаль-синтази (55), крохмаль-розгалуджувальні ферменти (ЗВЕ) та крохмаль- дерозгалуджувальні ферменти (5ОВЕ)); та з полімерами або біопластмасами (наприклад, патент США Мо 5602321; бета-кетотіолаза, полігідроксибутиратсинтаза та ацетоацетил-Сод- редуктаза (Зспибет еї а!. (1988) У. Васієгіо!. 170: 5837-5847), з ознаками, що сприяють експресії полігідроксиалканоатів (РНА)), розкриття яких включені в даний документ за допомогою посилання. Також можна комбінувати полінуклеотиди згідно з варіантами здійснення з полінуклеотидами, які забезпечують агрономічні ознаки, такі як чоловіча стерильність (наприклад, див. патент США Мо 5583210), міцність стебла, час цвітіння, або ознаки, пов'язані з технологією трансформації, такі як регуляція клітинного циклу або цілеспрямований вплив на гени (наприклад, документи УМО 99/61619; УМО 00/17364; УМО 99/25821), розкриття яких включені в даний документ за допомогою посилання.
У деяких варіантах здійснення пакетована ознака може являти собою ознаку або трансгенний об'єкт, який одержав дозвіл контролюючих органів, у тому числі без обмеження є трансгенним об'єктом із таблиці 4А-Е.
Таблиця 4А
Соя Сіусіпе тах Ї. до704-12 Сас епсе Соя з переносимістю гербіциду глуфосинату амонію, до704-21 (дуегів одержана за допомогою вставки гена, що кодує
АББА7-35 й Стообсівпсе модифіковану фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ), з до Емо грунтової бактерії бігеріотусевз мігідоспготодепезв.
Сас епсе Соя з переносимістю гербіциду глуфосинату амонію,
АББАТ-127 (дуегів одержана за допомогою вставки гена, що кодує
Стообсівпсе модифіковану фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ), з до їмо грунтової бактерії бігеріотусевз мігідоспготодепезв.
Введений ген с5г1-2 з Агарідорбвів Іпайійапа кодує білок синтазу ацетогідроксикислот, який забезпечує
ВРЗ-СМ127-9 ВАБЕ пс переносимість імідазолінонових гербіцидів унаслідок
І точкової мутації, яка приводить до заміни однієї амінокислоти, при якій залишок серину в положенні 653 заміщений аспарагіном (5653М).
Соя з високим вмістом олеїнової кислоти, одержана за
ОР-305423 Ріопеег Ні-Вгєд | допомогою вставки додаткових копій частини гена, що
Іптегпайопаї Іпс. | кодує омега-б-десатуразу, дт-Тад2-1, що приводить до сайленсингу гена ендогенної омега-6-десатурази (ЕАО2-1).
Трансгенний об'єкт сої з двома генами переносимості ! НІ гербіцидів: геном гліфосат-М-ацетилтрансферази, яка рРЗ5б6О43 прлове Не Нес нейтралізує гліфосат, та геном модифікованої "| ацетолактатсинтази (АЇ 5), яка є не сприйнятливою до
А 5-інгібуючих гербіцидів.
ПбиРопі Сапада Соя з високим вмістом олеїнової кислоти, одержана за са494-1, 94-19, Аайсикига! допомогою вставки другої копії гена, що кодує десатуразу ссьл1вв РИСЬ жирної кислоти (зтРаад2-1), із сої, що приводить до "сайленсингу" ендогенного гена хазяїна.
Сорт сої з переносимістю гліфосату, одержаний за сте 40-3-2 Мопзапіо допомогою вставки гена, що кодує модифіковану 5-
Сотрапу енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтазу (ЕРБР5Б), із грунтової бактерії Адгорасієегішт іштптегтасієпв.
Бас епсве Соя з переносимістю гербіциду глуфосинату амонію, сугво (дуегів одержана за допомогою вставки гена, що кодує
Стообсівпсе модифіковану фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ), з до їмо грунтової бактерії бігеріотусевз мігідоспготодепезв.
Мопзапо Стійкість до лускокрилих шкідників сої, у тому числі до
МОМм87701 Сотрап гусені оксамитових бобів (Апіїсагзіа деттаїйаїї5) та соєвої рапу совки (Рзецйдоріивіа іпсійдепв).
Переносимість гербіциду гліфосату завдяки експресії гена, що кодує ЕРБР5, зі штаму СРА А. ішпегасієп5 та стійкість
МОМ87701 х Мопзапо до лускокрилих шкідників сої, у тому числі до гусені
МмОМм89788 Сотрапу оксамитових бобів (Апіїсагзіа деттагаїї5) та соєвої совки (Рзепдорішивіа іпсішдепв) завдяки експресії гена, що кодує
СтутАс, з В. ІШПигіпдіепвів.
Соя з переносимістю гліфосату, одержана за допомогою
МОМ89788 Мопзапо вставки гена агоА (ерзрз5), що кодує модифіковану 5-
Сотрапу енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (ЕРБР5Б), з
Адгобрасієгіт іштеїасівп5 СРА.
Таблиця 4А
Соя Сіусіпе тах Ї.
Соя з низьким вмістом ліноленової кислоти, одержана
Адіісиниге 4 завдяки традиційному кросбридингу, для введення нової
ОтТ96-15 Адіі-боса ознаки, зумовленої мутантом гена Тап1, що зустрічається в
Сапада природних умовах, який відбирали щодо низького вмісту ліноленової кислоти.
Бас епсве Соя з переносимістю гербіциду глуфосинату амонію, рос одержана за допомогою вставки гена, що кодує мМ62, М98 (Амепіїб й й
Сторбсієпсе модифіковану фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ), з грунтової бактерії Бігеріотусев пуагозсорісив.
АдгЕмМо
Таблиця 48
Пшениця Тгййсит аевімит
Відбір щодо підданої мутагенезу версії ферменту синтази
АР2гОБСІ ВАБЕ Іпс. ацетогідроксикислот (АНАФ5), також відомої як ацетолактатсинтаза (АЇ 5) або ацетолактат-піруват-ліаза.
Відбір щодо підданої мутагенезу версії ферменту синтази
АРбО2ОЇ. ВАБЕ Іпс. ацетогідроксикислот (АНА5), також відомої як ацетолактатсинтаза (АЇ 5) або ацетолактат-піруват-ліаза. вму/255-2 Відбір щодо підданої мутагенезу версії ферменту синтази ' ВАБЕ Іпс. ацетогідроксикислот (АНА5), також відомої як вм238-3 і . ацетолактатсинтаза (АЇ 5) або ацетолактат-піруват-ліаза.
Переносимість імідазолінонових гербіцидів, індукована за вВМ/7 ВАБЕ пс. допомогою хімічного мутагенезу гена синтази ацетогідроксикислот (АНА) із застосуванням азиду натрію.
Сорт пшениці з переносимістю гліфосату, одержаний за
МОМм71800 Мопзапіо допомогою вставки гена, що кодує модифіковану 5-
Сотрапу енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (ЕРБР5), з грунтової бактерії Адгорасієгішт Кшптеїасіеєп5 штаму СР. ! Відбір щодо підданої мутагенезу версії ферменту синтази
ЗМУ РОБбБОО Суапатіа Стор ацетогідроксикислот (АНА5), також відомої як
Ргоїесііоп і . ацетолактатсинтаза (АГ 5) або ацетолактат-піруват-ліаза.
Відбір щодо підданої мутагенезу версії ферменту синтази
Теа! ТА ВАБЕ Іпс. ацетогідроксикислот (АНА5), також відомої як ацетолактатсинтаза (АЇ 5) або ацетолактат-піруват-ліаза.
Таблиця 4С
Маїс 2еа таузх І.
Маїс зі стійкістю до комах, одержаний за допомогою 176 Зупдепіа б5еєдв, | вставки гена СгуТАБ з Васійи5 (пигіпдіепві5, зхир5р. Кигеіакі.
Іпс. Генетична модифікація надає стійкості до нападу вогнівки кукурудзяної (ЕСВ). 3751І8 Ріопеег Ні-Вгєд | Відбір сомаклональних варіантів шляхом культивування
Іпієтпайопаї! Іпс. | зародків на середовищі, яке містить імідазолінон.
Таблиця 4С
Маїс 2еа таузх І.
Маїс із чоловічою стерильністю та переносимістю
Ріопвег Ні-Вгей гербіциду глуфосинату амонію, одержаний за допомогою 676, 678, 680 Іптегпайопаї Іпс вставки генів, що кодують ДНК-аденін-метилазу та 7 фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ) з ЕвсПегіспіа соїї та 5Бігеріотусез міідоспготодепез відповідно.
Маїс із переносимістю гербіциду глуфосинату амонію,
Вів (00125) Река Сепеїййсв5 | одержаний за допомогою вставки гена, що кодує
Согрогаїйоп фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ), зі зігеріотусев
Нуагозсорісив.
Маїс зі стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів,
ВТ11 супдета Звесдв5 одержаний за допомогою вставки гена СтуТтАБ з Васі (х4334СВВ, й 9 "| игіпдіепві5, зиБ5р. Кигеїакі, та гена, що кодує ха473асВвВ) І фосфінотрицин-М-ацетилтрансферазу (РАТ), з 5. міпідоспготодепезв.
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного
ВТ11 х СА2І1 вупдепа Зеводв, кросбридингу батьківських ліній ВТ11 (унікальний
І ідентифікатор ОЕСО: 5УМ-ВТО11-1) та СА21 (унікальний ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ООО21-9).
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного кросбридингу батьківських ліній ВТ11 (унікальний ідентифікатор ОЕСО: 5УМ-ВТО11-1) та МІК162 (унікальний ідентифікатор ОЕСО: 5УМ-ІНІ162-4). Стійкість до вогнівки кукурудзяної та переносимість гербіциду глуфосинату
ВТ11 х МІВ162 вупдепа Зевдв, | амонію (і ірепу) одержують від ВТ11, яка містить ген
І СтутАБ з Васіййи5 ІпПигіпдіепві5 зирз5р. Кигеїакі та ген, який кодує фосфінотрицин-М-ацетилтрансферазу (РАТ), із 5. мігідоспготодепев. Стійкість до інших лускокрилих шкідників, у тому числі Н. 7еа, 5. їтидірегаа, А. ірзіоп та 5. аібісоба, одержують від МІК162, яка містить ген мірзАа зі штаму АВ88 Васіїи5 ІПигіпдіепвів.
Стійкість до твердокрилих шкідників, зокрема до шкідників кукурудзяних жуків (Оіабгоїїса 5рр.) та до деяких лускокрилих шкідників кукурудзи, у тому числі до вогнівки
ВТІ11 х МІВ162 х | З5упдепіа бееавв, | кукурудзяної (ЕСВ, О5ігіпіа пибіїаі|ї5), бавовняної совки
МІНО6БОЯ4 х СА21 Іпс. (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа), кукурудзяної листової совки (ЕАМУ, зродоріега Ігидірегаа) та совки-іпсилон (ВСМ/, Адгоїі5 ірхіоп); переносимість гербіцидів, які містять гліфосат та глуфосинат-амонію.
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного кросбридингу батьківських ліній ВТ11 (унікальний ідентифікатор ОЕСО: 5УМ-ВТО11-1) та МІКб6О4 (унікальний ідентифікатор ОЕСО: 5УМ-ІНБОБ-5). Стійкість до вогнівки вт Зупдепіа б5еєдв, | кукурудзяної та переносимість гербіциду глуфосинату х МІНбОЇ4 : . . .
Іпс. амонію (Гірепу) одержують від ВТ11, яка містить ген
СтутАБ з Васійи5 ІпПигіпдіепві5 зирз5р. Кигеїакі та ген, який кодує фосфінотрицин-М-ацетилтрансферазу (РАТ), із 5. мігідоспготодепев. Стійкість до кукурудзяного жука одержують від МІКбО4, яка містить ген тсСтгузА з Васійи5
Тигіпдієпвів.
Таблиця 4С
Маїс 2еа таузх І.
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного кросбридингу батьківських ліній ВТ11 (унікальний ідентифікатор ОЕСО: 5УМ-ВТО11-1), МІКб6О4 (унікальний ідентифікатор ОЕСО: 5УМ-ІНБОБ-5) та СА21 (унікальний ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО0О21-9). Стійкість до вогнівки кукурудзяної та переносимість гербіциду глуфосинату
В до х МІНБОЯ х вупдепа Зевс, амонію (І ібепу) одержують від ВТ11, яка містить ген
І СтутАБ з Васіййи5 ІпПигіпдіепві5 зирз5р. Кигеїакі та ген, який кодує фосфінотрицин-М-ацетилтрансферазу (РАТ), із 5. мігідоспготодепев. Стійкість до кукурудзяного жука одержують від МІКбО4, яка містить ген тсСтгузА з Васійи5
ІШигіпдіепві5. Переносимість гербіциду гліфосату одержують від СА21, яка містить ген модифікованої
ЕРЗРЗ з маїсу.
Маїс зі стійкістю до комах та переносимістю гербіциду
Амепіїв5 глуфосинату амонію, розроблений за допомогою вставки
Ссвн-351 Сторбсієпсе генів, які кодують білок Сту9С, з Васійн5 (пигіпдіепвів, зурзр. їоїмогівпі, та фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ) із Зігеріотусе5 Пудгозсорісив5.
Маїс зі стійкістю до лускокрилих комах та переносимістю ром гербіциду глуфосинату амонію, одержаний шляхом вставки рдБ-06275-8 Адгобсіепсев5 гена СтуїЕ з ВасШив Шигіпдіепві5 маг аі7гам/аі та
Що; фосфінотрицин-ацетилтрансферази (РАТ) зі 5ігеріотусев
Ппуагозсорісив. ром Маїс зі стійкістю до кукурудзяного жука, одержаний за
Адгобсівепсев5 допомогою вставки генів СтуЗзаАбБІ1 та СтузбБАБІ зі штаму радБ-59122-7 ГІ С та Ріопеег РБ14981 Васійиз игіпдієпвів. Ген, який кодує РАТ, зі
Ні-Вгєд зпгеріотусез мігідоспготодепез вводили як селективний
Іпієгпайопаї! Іпс. | маркер.
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного ром кросбридингу батьківських ліній ОА5-59122-7 (унікальний рА5-59122-7 х Адгобсівепсев5 ідентифікатор ОЕСО: ОА5Б-59122-7) з МКбОЗ (унікальний
МКвОоЗ ЇЇ С та Ріопеєег | ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО6О3-6). Стійкість до
Ні-Вгейд кукурудзяного жука одержують від ОА5-59122-7, яка
Іпіегпайопаї! Іпс. | містить гени СтуЗ4АБІ та СтузбБАБІ зі штаму РЬ14981
Васійив игіпдієпвзіз. Переносимість гербіциду гліфосату одержують від МКбО3.
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного кросбридингу батьківських ліній ОА5-59122-7 (унікальний рому ідентифікатор ОЕСО: ОВА5Б-59122-7) та ТС1507 (унікальний
Адгобсівпсев ідентифікатор ОЕСО: ОА5Б-0О1507-1) з МКбОЗ (унікальний рдБ-59122-7 х ІС та Ріопеег ідентифікатор ОЕЄСО: МОМ-ОО603-6). Стійкість до
ТО1507 х МКбОЗ Ні-Вгва кукурудзяного жука одержують від ОА5-59122-7, яка
Іптегпайопаї! Іпс містить гени СтузаАбБІ та Стузб5АБІ зі штаму Р5О14981 "| Васійи5 Іигпдієпвів. Стійкість до лускокрилих та переносимість гербіциду глуфосинату амонію одержують від ТС1507. Переносимість гербіциду гліфосату одержують від МКбО3.
Таблиця 4С
Маїс 2еа таузх І.
Маїс зі стійкістю до комах та переносимістю гербіциду ! глуфосинату амонію, розроблений за допомогою вставки
Орвтаїв8 Сокаю сепеїсв генів, які кодують білок СтутАС з Васіїив іІпигіпдієпвів,
Р зуирз5р. Кигаіакі, та фосфінотрицин-ацетилтрансферазу
РАТ) із Зігеріотусез Ппудгозсорісив.
Сомаклональні варіанти з модифікованою ацетил-Сод- ркао458 ВАБЕ пс. карбоксилазою (АССазою) відбирали за допомогою культивування зародків на середовищі, збагаченому сетоксидимом.
Лінія маїсу, яка експресує ген термостабільної альфа- - амілази ату797Е для застосування у способі одержання
Траногенний Зупдепіа Зееов, етанолу із застосуванням сухого помелу. Ген об'єкт 3272 Іпс. й : . фосфоманозо-ізомерази від Е.соїї застосовували як селективний маркер.
Трансгенний об'єкт маїсу, який експресує переносимість - ! ! гербіциду гліфосату, шляхом експресії модифікованої
Траногенний Ріопеег Ні-Вгей бактеріальної гліфосат-М-ацетилтрансферази та АЇ 5- об'єкт 98140 Іпієтпайопа! Іпс. |. . . й Як й . інгібуючих гербіцидів, шляхом експресії модифікованої форми ферменту ацетолактатсинтази маїсу.
Переносимість імідазолінонового гербіциду, імазетапіру, зупдепіа Зеесв, індукована хімічним мутагенезом фермену, щі
ЕХР1910ІТ Іпс. (у минулому й 7епеса беесв) ацетолактатсинтази (АЇ 5) із застосуванням етилметансульфонату (ЕМ5).
Введення за допомогою бомбардування частинками
Зупдепіа 5еєдв, | модифікованої 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази пА2г1 Іпс. (у минулому | (ЕРБРБ), ферменту, залученого у біохімічний 7епеса беєдв) метаболічний шлях шикімату, для одержання ароматичних амінокислот.
Гібрид кукурудзи з пакетованою стійкістю до комах та
Мопзапо переносимістю гербіцидів, одержаний у результаті аА2г1 х МОМ810 Сотрап традиційного кросбридингу батьківських ліній ЗА21 рапу (ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО0О21-9) та МОМ81О (ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО810-6). «0000 дме дурне нен
ІТ | : одержували за допомогою відбору іп міт сомаклональних піегпайопаї Іпс. НАД варіантів.
Змінений амінокислотний склад, специфічно підвищені
І у038 Мопзапіо рівні лізину завдяки введенню гена согдарА, одержаного
Сотрапу від Согупебасіегічт дішатісит, що кодує фермент дигідродипіколінат-синтазу (СОНОР5Б). вупдепіа беесв Трансгенний об'єкт маїсу зі стійкістю до комах, який
МІНІ62 пс "| експресує білок МірзА з Васіййи5 (игіпдіепвіб5 та " селективний маркер РМІ з ЕзсПегіспіа соїї.
Маїс зі стійкістю до кукурудзяного жука, одержаний шляхом
МІВбОХ4 Зупдепіа б5еєдв, | трансформації модифікованим геном СгузА. Ген
Іпс. фосфоманозо-ізомерази від Е.соїї застосовували як селективний маркер.
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного кросбридингу батьківських ліній МІКб6О4 (унікальний
МІВбО4 х СА Зупдепіа 5еєдз, | ідентифікатор ОЕСО: ЗУМ-ІНБВОБ-5) та сА21 (унікальний
Іпс. ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО0О21-9). Стійкість до кукурудзяного жука одержують від МІКбО4, яка містить ген тегузА з ВасШи5 Шигіпдіепві5. Переносимість гербіциду гліфосату одержують від ЗА21.
Таблиця 4С
Маїс 2еа таузх І.
Маїс зі стійкістю до комах, одержаний за допомогою
МОМм8О100 Мопзапюо вставки гена СтутАБ з Васійи5 ІПигіпдієпвів, зиб5р. Кигеїакі.
Сотрап Генетична модифікація надає стійкості до нападу вогнівки рапу д Ц д д ду кукурудзяної (ЕСВ).
Маїс зі стійкістю до комах та переносимістю гербіциду
Мопвато гліфосату, одержаний за допомогою вставки генів, які
МмОмМ8о2 Сотрапу кодують білок СтутАб з Васіййи5 (игіпдіепвів та 5- енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (ЕРБР5Б) зі штаму
СРА А. Шштеїасієпв.
Стійкість до вогнівки кукурудзяної (Овігіпіа пибіїа!йів) за
Ріопвег Ні-Вгей допомогою введення синтетичного гена СтуТАБб. Стійкість
МОМ809 | . до гліфосату за допомогою введення бактеріальної версії піегпайопаї Іпс. т. - рослинного ферменту, 5-енолпірувілшикімат-3- фосфатсинтази (ЕРБРБ).
Маїс зі стійкістю до комах, одержаний за допомогою
МОМм810 Мопзапо вставки усіченої форми гена СгутАБ з Васійнв5 ІпПигіпдіепвів
Сотрапу 5иБрзр. Китеїакі НО-1. Генетична модифікація надає стійкості до нападу вогнівки кукурудзяної (ЕСВ).
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та збільшеним
Мопзапо умістом лізину, одержаний у результаті традиційного
МОМ810 х І МО38 Сотрап кросбридингу батьківських ліній МОМ810 (ідентифікатор рапу ОЕСО: МОМ-ОО810-6) та І 038 (ідентифікатор ОЕСО:
ВЕМ-О0О38-3).
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гліфосату, одержаний у результаті традиційного кросбридингу батьківських ліній МОМ810 (ідентифікатор
ОЕСО: МОМ-00810-6) та МОМ88017 (ідентифікатор
ОЕСО: МОМ-88017-3). Стійкість до вогнівки кукурудзяної (ЕСВ) одержана завдяки усіченій формі гена СтутАБ з
МОМВ810 х Мопзапюо Васіив5 игіпдієпвів зиб5р. Китеїакі НО-1, присутнього в
МО М88017 Сотрапу МОМа810. Стійкість до кукурудзяного жука одержують завдяки гену СтуЗВЬ!1 зі штаму ЕбС4691 Васійи5 ІПигіпдіепвів зирзресіеє5 Китатоїйоепбвзіз, присутньому в МОМ88017.
Переносимість гліфосату одержують завдяки гену, який кодує 5-енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтазу (ЕРБР5Б), зі штаму СРА Адгорасіегіит іштегасієп5, присутньому в
МОМ88017.
Введення за допомогою бомбардування частинками
Мопзапо гліфосатоксидази (С5ОХ) та модифікованої 5-
МмОМм832 Сотоап енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (ЕРБРБ), ферменту, рапу залученого у біохімічний метаболічний шлях шикімату, для одержання ароматичних амінокислот. зеею ХУ оон
МО М863 с допомогою вставки гена СтуЗВЬ1 з Васійиз (Пигіпдієпвіб отрапу ! 5ир5р. Китатоїоепвів.
Гібрид кукурудзи з пакетованою стійкістю до комах, одержаний у результаті традиційного кросбридингу ух х Сотвалу батьківських ліній МОМ863 (ідентифікатор ОЕСО: МОМ- 0О863-5) та МОМ810 (ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО810- б
Гібрид кукурудзи з пакетованою стійкістю до комах та
МОМ863 х Мопзапо переносимістю героїдидів, одержаний у результаті
МОМВ810 х МКбОЗ| Сотрапу традиційного кросбридингу гібриду з пакетованими генами
МОМ-00863-5 х МОМ-0О0О810-6 та МКбО3 (ідентифікатор
ОЕСО:МОМ-00О603-6).
Зб
Таблиця 4С
Маїс 2еа таузх І.
Гібрид кукурудзи з пакетованою стійкістю до комах та
Мопзапо переносимістю гербіцидів, одержаний у результаті
МОМ863 х МКбОЗ Сотрап традиційного кросбридингу батьківських ліній МОМ86З3 рапу (ідентифікатор ОЕСО:МОМ-0О863-5) та МКбОЗ ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО6О3-6).
МОМ 87460 розробляли для забезпечення зниження
Мопзапо втрати врожаю в умовах обмеженої кількості води щодо
МмОМм87460 Сотоап традиційного маїсу. Ефективність щодо МОМ 87460 рапу одержують за допомогою експресії вставленого білка холодового шоку В (СзрВ) Васійив 5,ирійів.
Маїс зі стійкістю до кукурудзяного жука, одержаний за допомогою вставки гена СтуЗВр1 зі штаму ЕС4691 з
МОМм88017 Мопзапо Васійи5 «пигіпдіепзі5 зир5р. Китатоїоепвів. Переносимість
Сотрапу гліфосату одержують за допомогою вставки гена, що кодує
Б-енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтазу (ЕРБР5), зі штаму
СРА Адгорасієтит штеїасієпв.
Мопзапо Трансгенний об'єкт маїсу, який експресує два різні
МОМм89034 Сотрапу інсектицидні білки з Васійи5 (пигіпдіепві5, що забезпечує стійкість до ряду лускокрилих шкідників.
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гліфосату, одержаний у результаті традиційного кросбридингу батьківських ліній МОМ89034 (ідентифікатор
ОЕСО: МОМ-89034-3) та МОМ88017 (ідентифікатор
МОМ89034 х Мопзапо ОЕСО:МОМ-88017-3). Стійкість до лускокрилих комах
МОМ88017 Сотрапу одержують завдяки двом генам Сгу, присутнім у
МОМ89043. Стійкість до кукурудзяного жука одержують завдяки одному гену Сгу та переносимість гліфосату одержують завдяки гену, який кодує 5-енолпірувілшикімат-
З-фосфатсинтазу (ЕРБР5Б) з Адгобасієегіит (шптегасіепв5, присутньому в МОМ88017.
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного кросбридингу батьківських ліній МОМ89034 (ідентифікатор
МОМ89034 х Мопзапо ОЕСО: МОМ-89034-3) з МКбО3 (унікальний ідентифікатор
МКкбоЗ Сотрапу ОЕСО: МОМ-00О603-6). Стійкість до лускокрилих комах одержують завдяки двом генам Сгу, присутнім у
МОМ89043. Переносимість гербіциду гліфосату одержують від МКбО3.
Мопзапіо Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю
МОМ89034 х Сотрапу та гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного
ТС1507 х Мусодеп беєдз | кросбридингу батьківських ліній: МОМ89034, ТС1507,
МОМ88017 х с/о Обом МОМ88017 та ОА5-59122. Стійкість до наземних та радБ-59122-7 Адгобсіепсев5 підземних комах-шкідників та переносимість гербіцидів
ІЩ що; гліфосату та глуфосинату амонію. с бсівпое Чоловіча стерильність, викликана експресією гена
МеЗ (Ауепіїв рибонуклеази барнази з Васіїн5 атуіоїїдиетасієепв; стійкість
Сторбсієпсе до РРТ була присутньою завдяки РРТ-ацетилтрансферазі
А (РАТ). 9гЕМО
Вауеєг Ч . . .
Сторзсієпсе оповіча стерильність, викликана експресієюгенад /-/
Мав (Амепіїв рибонуклеази барнази з Васійн5 атупоїЇїдиегтасієпв; стійкість
Сторбсієпсе до РРТ була присутньою завдяки РРТ-ацетилтрансферазі
А (РАТ). 9гЕМО
Таблиця 4С
Маїс 2еа таузх І.
Введення за допомогою бомбардування частинками
Мопзапо модифікованої 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази
МКкбоЗ Сотрапу (ЕРБР5Б), ферменту, залученого у біохімічний метаболічний шлях шикімату, для одержання ароматичних амінокислот.
Гібрид кукурудзи з пакетованою стійкістю до комах та
Мопзапо переносимістю гербіцидів, одержаний у результаті
МКбОоЗ х МОМ81О Сотрап традиційного кросбридингу батьківських ліній МКбОЗ рапу (ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО6О03-6) та МОМ810О (ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО810-6).
Гібрид маїсу з пакетованою переносимістю гербіциду
Мопзапо глуфосинату амонію та гліфосату, одержаний у результаті
МКбОЗ х Т25 Сотрапу традиційного кросбридингу батьківських ліній МКбОЗ (ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО603-6) та Т25 (ідентифікатор ОЕСО: АСЗ-2МО003-2).
Ваує! Маїс із переносимістю гербіциду глуфосинату, одержаний
Сторбсієпсе за допомогою вставки гена, що кодує фосфінотрицин-М-
Т14, Т25 (Амепії5 ацетилтрансферазу (РАТ) з Зперіотусев
Сторбсієпсе мігідоспготодепев, що належить до аеробних
АдгЕмМо актиноміцетів.
Ваує! Гібрид кукурудзи з пакетованою стійкістю до комах та
Сторбсієпсе переносимістю гербіцидів, одержаний у результаті
Т25 х МОМ810 (Амепіїб традиційного кросбридингу батьківських ліній Т25
Сторбсієпсе (ідентифікатор ОЕСО: АС5З-2МОО03-2) та МОМ810
АдтЕмо ідентифікатор ОЕЄСО: МОМ-ОО810-6).
Мусодеп (с/о Маїс зі стійкістю до комах та переносимістю гербіциду ром глуфосинату амонію, одержаний за допомогою вставки
ТС1507 Адгобсіепсев); | гена СтуїЕ з Васійи5 ІПигіпдієпвів маг. аі7-"амаї та гена, що
Ріопеег (с/о кодує фосфінотрицин-М-ацетилтрансферазу, із
БиРопі зігеріотусез мігідоспготодепев.
Маїс із пакетованою стійкістю до комах та переносимістю гербіцидів, одержаний за допомогою традиційного кросбридингу батьківських ліній ТО1507 (унікальний ідентифікатор ОЕСО: ОА5Б-0О1507-1) з ОА5-59122-7 ром (унікальний ідентифікатор ОЕСО: ВОАБ-59122-7). Стійкість
ТС1507 х ОД5- Адгобсіепсев5 до лускокрилих комах одержують від ТС1507 унаслідок 5О122-7 Ї/С та Ріопеег | присутності гена СтуїЕ з Васіїи5 ІПигіпдіепвів маг. аігам/аі.
Ні-Вгейд Стійкість до кукурудзяного жука одержують від ОА5Б-59122-
Іпіеєгпайопаї Іпс. | 7, яка містить гени СтуЗ4АБІ та Стуз5БАБІ зі штаму
РБ14981 Васійиз игіпдіеєпзіз. Переносимість гербіциду глуфосинату амонію одержують від ТС1507 завдяки гену, який кодує фосфінотрицин-М-ацетилтрансферазу із зігеріотусез мігідоспготодепев.
Гібрид кукурудзи з пакетованою стійкістю до комах та ром переносимістю гербіцидів, одержаний у результаті
ТС1507 х МКбОЗ | Адгобсіепсев традиційного кросбридингу батьківських ліній 1507
Що; (ідентифікатор ОЕСО: ОВА5Б-01507-1) та МКбОЗ (ідентифікатор ОЕСО: МОМ-ОО603-6).
Таблиця 40
Рис Огула заїїма
Переносимість імідазолінонового гербіциду, імазетапіру,
СІ 121, СІ 141, ВАБЕ пс індукована хімічним мутагенезом ферменту
СЕХ5БІ1 І ацетолактатсинтази (А! 5) із застосуванням етилметансульфонату (ЕМ5).
Переносимість імідазолінонових гербіцидів, індукована
ІМІМТА-1 «ТЕ
ІМІМТА-А ВАБЕ Іпс. хімічним мутагенезом ферменту ацетолактатсинтази (АГ 5) із застосуванням азиду натрію.
Рис із переносимістю гербіциду глуфосинату амонію,
І АВІСЕОб, Амепії5 одержаний за допомогою вставки гена, що кодує
І ВІСЕб2 Сторбсієпсе модифіковану фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ), із грунтової бактерії Зігеріотусев пудгозсорісив.
Сас епсе Рис із переносимістю гербіциду глуфосинату амонію, рос одержаний за допомогою вставки гена, що кодує
ГГ ВІСЕбО1 (Амепіїб : :
Сторбсієпсе модифіковану фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ), дагЕМО із грунтової бактерії бігеріотусез пудгозсорісив.
Переносимість імідазолінонового гербіциду, імазетапіру, індукована хімічним мутагенезом ферменту
РЖУСТ6 ВАЗЕ Іпе. ацетолактатсинтази (АГ! 5) із застосуванням етилметансульфонату (ЕМ5).
Таблиця 4Е
Соняшник Неїїапіпи5 аппии5
Переносимість імідазолінонових гербіцидів за х81359 ВАБЕ Іпс. допомогою відбору мутанта, що зустрічається в природних умовах.
Таблиця 4Е
Люцерна Меадісадо займа
Люцерна (люцерна посівна) з переносимістю
Мопзапю Сотрапу та | гербіциду гліфосату, одержана за допомогою 101, 9163 Еогаде Сепеїісв5 вставки гена, що кодує фермент 5-
Іпіегпайопаї! енолпірувілшикімат-3З-фосфатсинтазу (ЕРБРБ) зі штаму СРА Адгобрасієтгійт їштеїасієпв.
Інші трансгенні об'єкти, дозволені контролюючими органами, добре відомі фахівцю в даній галузі, та їх можна знайти на сайті Центру оцінки ризику для навколишнього середовища (сега- дтес.огд/?асноп-дт сгор дагаразе, доступ до якого можна отримати із застосуванням префікса мимлм) та на сайті Міжнародної служби з придбання агробіотехнологічних додатків (ізааа.огоа/дтарргомаІдагаразе/деташказр, доступ до якого можна отримати із застосуванням префікса м/млм).
Дані пакетовані комбінації можна створювати будь-яким способом, у тому числі без обмеження перехресним схрещуванням рослин за допомогою будь-якої традиційної методики, або методики ТОРСНО559, або генетичної трансформації. Якщо ознаки пакетовані за допомогою генетичної трансформації рослин, то послідовності полінуклеотидів, що становлять інтерес, можна комбінувати в будь-який час та в будь-якому порядку. Наприклад, трансгенну рослину, яка містить одну або декілька необхідних ознак, можна застосовувати як мішень для введення додаткових ознак за допомогою послідовної трансформації. Ознаки можна вводити одночасно в протоколі котрансформації з полінуклеотидами, що становлять інтерес, які представлені будь-якою комбінацією касет трансформації. Наприклад, якщо будуть вводитися дві послідовності, то ці дві послідовності можуть міститися в окремих касетах для трансформації (транс) або міститися в одній касеті для трансформації (цис). Експресія цих послідовностей може керуватися тим же самим промотором або різними промоторами. У певних випадках може потребуватися введення касети для трансформації, яка буде пригнічувати експресію полінуклеотиду, що становить інтерес. Її можна комбінувати з будь-якою комбінацією інших касет для супресії або касет для надекспресії для одержання необхідної комбінації ознак у рослині. Крім того, вважається, що полінуклеотидні послідовності можна пакетувати в необхідному місці розташування в геномі із застосуванням системи для сайт- специфічної рекомбінації. Див., наприклад, УМО99/25821, УО99/25854, У/099/25840,
УМО99/25855 та ММО99/25853, всі з яких включені в даний документ за допомогою посилання.
Композиції згідно з варіантами здійснення знаходять різноманітні застосування в захисті рослин, насіння та рослинних продуктів. Наприклад, композиції можна застосовувати у способі, який передбачає поміщення ефективної кількості пестицидної композиції в середовище проживання шкідника за допомогою процедури, вибраної з групи, що складається з обприскування, обпилювання, розкидання або нанесення покриття на насіння.
Перед продажем матеріалу для розмноження рослин (плода, бульби, цибулини, бульбоцибулин, зерен, насінина), особливо насінини як комерційного продукту, його в звичайному порядку обробляють з застосуванням захисного покриття, яке містить гербіциди, інсектициди, фунгіциди, бактерициди, нематоциди, молюскоциди або суміші деяких з цих препаратів, за необхідності, разом із додатковими носіями, поверхнево-активними речовинами або допоміжними речовинами, що сприяють нанесенню, зазвичай застосовуваними в галузі отримання складів для забезпечення захисту від пошкодження, спричиненого бактеріальними, грибковими шкідниками або тваринами-шкідниками. Для того, щоб обробити насінину, захисне покриття можна застосовувати щодо насіння або шляхом просочення бульб або зерен рідким складом, або шляхом нанесення на них покриття з комбінованого вологого або сухого складу.
Крім того, в особливих випадках можливі інші способи застосування щодо рослин, наприклад обробка, спрямована на бруньки або плоди.
Насінина рослини згідно з варіантами здійснення, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує пестицидний білок згідно з варіантами здійснення, можна обробляти захисним покриттям для насіння, яке містить сполуку для обробки насіння, таку як, наприклад, каптан, карбоксин, тирам, металаксил, піриміфос-метил та інші, які зазвичай застосовують в обробці насіння. В одному варіанті здійснення захисне покриття для насіння, яке містить пестицидну композицію згідно з варіантами здійснення, застосовують окремо або в комбінації з одним із захисних покриттів для насіння, зазвичай застосовуваних в обробці насіння.
Вважається, що гени, які кодують пестицидні білки, можна застосовувати для трансформації організмів, патогенних для комах. Такі організми включають бакуловіруси, гриби, найпростіших, бактерій та нематод.
Ген, який кодує пестицидний білок згідно з варіантами здійснення, можна вводити за допомогою придатного вектора в мікроорганізм-хазяїна, а вказаного хазяїна застосовувати щодо навколишнього середовища, або рослин, або тварин. Термін "введений" у контексті вставки нуклеїнової кислоти в клітину означає "трансфекцію", або "трансформацію", або "гтрансдукцію" та включає посилання на вбудовування нуклеїнової кислоти в еукаріотичну або прокаріотичну клітину, де нуклеїнова кислота може вбудовуватися в геном клітини (наприклад, хромосому, плазміду, пластидну або мітохондріальну ДНК), перетворюватися на автономний реплікон або тимчасово експресуватися (наприклад, трансфікована мРНК).
Можуть бути вибрані мікроорганізми-хазяїни, які, як відомо, заселяють "фітосферу" (філоплан, філосферу, ризосферу та/або ризоплан) однієї або декількох сільськогосподарських культур, які становлять інтерес. Дані мікроорганізми вибирають таким чином, щоб вони могли успішно конкурувати в конкретному середовищі з мікроорганізмами дикого типу, забезпечувати стабільне підтримання та експресію гена, який експресує пестицидний білок, та, бажано, забезпечувати поліпшений захист пестициду від руйнування та інактивації в навколишньому середовищі.
Такі мікроорганізми включають бактерії, водорості та гриби. Особливий інтерес становлять мікроорганізми, такі як бактерії, наприклад, Рзейдотопав, Егміпіа, Зеїтайа, КіервзієїЇа,
Хапіпотопаз, Зігеріотусеб5, ВПігобішт, АпПодорзепдотопах, Меїнуїйи5, Адгобасівелит,
Асеїйобасівєг, І асіобасіїшв5, АйНгобасієг, Агоіобасієг, І еисоповіос та АїІсаїдепев, гриби, зокрема дріжджі, наприклад, засспаготусев, Стуріососсив, Кіпухеготусев, ЗрогоБоіотусевз, АПодоюгиїа бо та Ашгеобазідінт. Особливий інтерес становлять такі види бактерій фітосфери, як Рзендотопав зупіпдає, Реепдотопавз ПЯпогебзсеп5, Зеїтайа тагсевзсеп5, Асеїорасієї хуїїпит, Адгобасіевгіа,
АПпПодорзепдотопа5 5рпегоїде5, Хапійотопа5 сатребвігіх, НПігобішт теїоїї, АїІсаЇїдепев5 епігорпи5, Сіамібасієг хуїї та А7оїобасіег міпеїІапаїйї, а також види дріжджів фітосфери, такі як
АПподоїогціа гибга, А. дішіпів, А. таїгіпа, А. айгапііаса, Стуріососсив аїрідиб5, С. айиепв, б.
Іашгепії, Засснаготусез гозеї, 5. ргефогіепві5, 5. сегемівіає, 5рогороіотусев гозеив, 5. одогив,
Кісуухеготусе5 мегопає та Ашеобравзідіит роїїшапе. Особливий інтерес становлять пігментовані мікроорганізми.
Доступний ряд способів для введення гена, який експресує пестицидний білок, в мікроорганізм-хазяїн в умовах, які створюють можливість для стабільного підтримання та експресії даного гена. Наприклад, можна конструювати касети експресії, які містять нуклеотидні конструкції, які становлять інтерес, функціонально пов'язані з сигналами регуляції транскрипції та трансляції для експресії нуклеотидних конструкцій, та нуклеотидну послідовність, гомологічну послідовності в організмі-хазяїні, за допомогою якої буде відбуватися інтеграція, та/або систему реплікації, що функціонує в хазяїні, за допомогою якої буде відбуватися інтеграція або стабільне підтримання.
Сигнали регуляції транскрипції та трансляції включають в себе без обмеження промотори, старт-сайти ініціації транскрипції, оператори, активатори, енхансери, інші регуляторні елементи, сайти зв'язування рибосом, кодон ініціації, сигнали термінації тощо. Див., наприклад, патенти
США МоМо 5039523 та 4853331; ЕРО 0480762А2; бБатргоок; Мапіаїі5 єї аї. (Соїд 5ргіпа Натбог
Іарогаїогу Ргез5, Соїй Зргіпд Нагброг, Мем Моїк); Оамів еї аї!., єдв. (1980) Адмапсейд Вас!іегіа!
Сепеїійсв (Соїй Зргіпд Нагрог І абогаїогу Рге55, Соїй Зргіпд Нагбог, Мем/ Могк) та джерела, цитовані в цих документах.
Придатні клітини-хазяї, де клітини, які містять пестицидний білок, будуть обробляти для продовження активності пестицидних білків у клітині у випадку, коли оброблену клітину вносять у середовище проживання шкідника-мішені(шкідників-мішеней), можуть включати або прокаріотів, або еукаріотів при цьому вони зазвичай обмежені тими клітинами, які не виробляють речовин, токсичних для вищих організмів, таких як ссавці. Однак організми, які виробляють речовини, токсичні для вищих організмів, можна застосовувати в тому випадку, коли токсин є нестабільним або рівень застосування є досить низьким, щоб уникнути будь-якої
Зо можливості токсичності щодо ссавця-хазяїна. Як хазяї особливий інтерес будуть становити прокаріоти та нижчі еукаріоти, такі як гриби. Ілюстративні прокаріоти, як грамнегативні, так і грампозитивні, включають Епіегобасіегіасеає, такі як ЕвсНегісніа, Егміпіа, 5підеїМа, ЗаІтопеїа та
Ргоїєив; Васійасеає; ВПі2оріасєає, такі як ВАВНігобішт; ЗрігпМасеає, такі як РІПобобасіегійт,
Яутотопа5, Зеїтайа, Аеготопа5, Мірпо, ОЮОевиМоміргіо, Зріпййт; ІасіобасіПасеає;
Рзепдотопадасеає, такі як Роендотопах та Асеїобасієг; Агоїорасієгасєеає та Мігобасієгасеає.
Серед еукаріотів представлені гриби, такі як Рпусоптусеїез5 і Абзсотусеїе5, які включають дріжджі, такі як засспаготусез і Зспі7гозасспаготусев; та дріжджі з відділу Вазідіотусегїев5, такі як Кподоїогиа, Айгеобавідійт, ЗрогороІотусев тощо.
Характеристики, які становлять особливий інтерес при виборі клітини-хазяїна з метою вироблення пестицидного білка, включають простоту введення гена пестицидного білка в хазяїна, доступність систем експресії, ефективність експресії, стабільність білка в хазяїні та наявність супутніх генетичних можливостей. Характеристики, які становлять інтерес для застосування у вигляді пестицидної мікрокапсули, включають захисні властивості для пестициду, такі як товсті клітинні стінки, пігментація та внутрішньоклітинна упаковка або утворення тілець-включень; спорідненість до листя; відсутність токсичності для ссавців; привабливість для поглинання шкідниками; простота знищення та засвоєння без пошкодження токсину тощо. Інші аспекти включають легкість складання та здійснення маніпуляцій, економічність, стабільність під час зберігання тощо.
Організми-хазяї, що становлять особливий інтерес, включають дріжджі, такі як ВПпоадоїогиїа 5рр., Айпгеобравзідішт врр., Засспаготусе5 5рр. (такі як 5. сегемізіаеє), 5рогобоіотусев врр., організми філоплану, такі як Рзеидотопах 5рр. (такі як Р. аегидіпоза, Р. Поогебсепв), Епміпіа 5рр. та Ріамобасієтит 5рр., й інші такі організми, у тому числі ВІ, Е. соїї, Васіїив5 вибіййв тощо.
Гени, що кодують пестицидні білки згідно з варіантами здійснення, можна вводити в мікроорганізми, які розмножуються на рослинах (епіфіти) для доставки пестицидних білків до потенційних шкідників-мішеней. Епіфіти, наприклад, можуть являти собою грампозитивні або грамнегативні бактерії.
Бактерії, які колонізують корені, наприклад, можна виділяти з рослин, які становлять інтерес, за допомогою способів, відомих із рівня техніки. А саме, штам Васійи5 сегеи5, який колонізує корені, можна виділяти з коренів рослини (див., наприклад, Напаеєї5тап єї аї. (1991) Аррі. 60 Епмігоп. Містобіої. 56:713-718). Гени, які кодують пестицидні білки згідно з варіантами здійснення, можна вводити в Васіїїш5 сегеи5, яка колонізує корені, за допомогою стандартних способів, відомих з рівня техніки.
Гени, які кодують пестицидні білки, можна вводити, наприклад, в Васіїйш5, яка колонізує корені, за допомогою електротрансформації. Зокрема, гени, які кодують пестицидні білки, можна клонувати в човниковий вектор, наприклад, рРНТЗ101 (Іегесіи5 еї а). (1989) ГЕМ5
Місгобіо!. І енв. 60: 211-218. Човниковий вектор рНТЗ101, який містить кодувальну послідовність конкретного гена пестицидного білка, можна, наприклад, трансформувати в Васійн5, яка колонізує корені, за допомогою електропорації (І егесіи5 еї а). (1989) РЕМ5 Місгобіо!. І ев. 60: 211-218).
Системи експресії можна розробляти таким чином, щоб пестицидні білки секретувалися за межі цитоплазми грамнегативних бактерій, таких як, наприклад, Е. соїї. Переваги секреції пестицидних білків є наступними: (1) можливість уникнути потенційних цитотоксичних ефектів експресованого пестицидного білка та (2) поліпшення ефективності очищення пестицидного білка, у тому числі без обмеження підвищення ефективності виділення та очищення білка в розрахунку на об'єм клітинного бульйону та зниження часу та/або витрат на вилучення та очищення в перерахунку на одиницю білка.
Пестицидні білюи можна створювати таким чином, щоб вони секретувалися в Е. соїї, наприклад, шляхом злиття придатного сигнального пептиду Е. соїї з аміно-кінцем пестицидного білка. Сигнальні пептиди, що розпізнаються ЕЕ. сої, можна знайти в білках, які, як вже відомо, секретуються Е. соїї, наприклад, білок ОтрА (СпПгауерб еї а. (1984) ЕМВО ./), 3:2437-2442). ОтрА являє собою головний білок зовнішньої мембрани Е. соїі, та, таким чином, вважають, що його сигнальний пептид є ефективним у процесі транслокації. Також сигнальний пептид ОтрА не потрібно модифікувати перед процесингом, як це може бути у випадку інших сигнальних пептидів, наприклад сигнального пептиду ліпопротеїнів (Юийаца еї а!. (1987) Мей. Епгутої. 153: 492).
Пестицидні білки згідно з варіантами здійснення можна ферментувати в бактерії-хазяїні, а отримані бактерії обробляти та застосовувати у вигляді мікробних розпилюваних розчинів тим же способом, що й штами Ві, які застосовували у вигляді інсектицидних розпилюваних розчинів.
У випадку пестицидного білка(білків), які секретуються з ВасіПш5, сигнал секреції видаляють або
Зо піддають мутації із застосуванням методик, відомих із рівня техніки. Такі мутації та/або делеції попереджають секрецію пестицидного білка(білків) в середовищі для росту під час процесу ферментації. Пестицидні білки залишаються в межах клітини, та клітини потім обробляють для одержання інкапсульованих пестицидних білків. Для цієї мети можна застосовувати будь-який придатний мікроорганізм. Рзепдотопаб5 застосовували для експресії Ві-токсинів у вигляді інкапсульованих білків, а одержані клітини піддавали обробці та розпиленню як інсектицид (Саєппег єї а!. (1993), в: Адумапсей Епдіпеегеас Резіїсідев, єд. Кіт).
Альтернативно, пестицидні білки виробляються в результаті введення гетерологічного гена в клітинного хазяїна. Експресія гетерологічного гена приводить, прямо або опосередковано, до вироблення та зберігання пестициду всередині клітини. Ці клітини потім обробляють в умовах, які продовжують активність токсину, що продукується в клітині, у випадку внесення клітини в навколишнє середовище шкідника-мішені(шкідників-мішеней). Одержаний продукт зберігає токсичність токсину. Ці інкапсульовані природним чином пестицидні білки можна потім складати відповідно до традиційних методик для застосування щодо середовища проживання шкідника- мішені, наприклад, грунт, вода та листя рослин. Див., наприклад, документ ЕРО192319 та джерела, цитовані в цьому документі.
У варіантах здійснення трансформований мікроорганізм (який включає цілі організми, клітини, спору(спори), пестицидний білок(білки), пестицидний компонент(компоненти), компонент(компоненти), який здійснює вплив на шкідника, мутант(мутанти), живі або мертві клітини та клітинні компоненти, у тому числі суміші живих та мертвих клітин та клітинних компонентів і в тому числі зруйновані клітини та клітинні компоненти) або виділений пестицидний білок можна скласти з прийнятним носієм у пестицидну композицію(композиції), яка являє собою, наприклад, суспензію, розчин, емульсію, розпилюваний порошок, дисперговані гранули або пелети, змочуваний порошок та концентрат, що емульгується, аерозоль або розпилюваний розчин, просочені гранули, допоміжний засіб, пасту, яку наносять як покриття, колоїд, а також інкапсульовані форми, наприклад, у полімерних речовинах. Такі складені композиції можна одержувати за допомогою таких загальноприйнятих способів, як висушування, ліофілізація, гомогенізація, екстракція, фільтрування, центрифугування, седиментація або концентрування культури клітин, що містять поліпептид.
Такі композиції, розкриті вище, можна одержувати за допомогою додавання поверхнево- 60 активного засобу, інертного носія, консерванта, зволожувача, стимулятора харчування,
атрактанта, засобу для інкапсуляції, зв'язувальної речовини, емульгатора, барвника, захисного засобу від УФ, буфера, засобу, що підвищує плинність, або добрив, донорів поживних мікроелементів або інших препаратів, які впливають на ріст рослини. Один або декілька агрохімікатів, у тому числі без обмеження гербіциди, інсектициди, фунгіциди, бактерициди, нематоциди, молюскоциди, акарициди, регулятори росту рослин, допоміжні засоби для збору врожаю та добрива можна комбінувати з носіями, поверхнево-активними речовинами або допоміжними засобами, традиційно застосовуваними в галузі складання, або іншими компонентами для полегшення здійснення маніпуляцій з продуктом та його застосування щодо конкретних шкідників-мішеней. Придатні носії та допоміжні засоби можуть бути твердими або рідкими та відповідають речовинам, які зазвичай використовують у технології складання, наприклад природним або регенерованим мінеральним речовинам, розчинникам, диспергуючим речовинам, змочувальним засобам, речовинам, які надають клейкість, зв'язувальним речовинам або добривам. Активні інгредієнти згідно з варіантами здійснення зазвичай застосовують у вигляді композицій та їх можна застосовувати щодо оброблюваної площі, рослини або насінини, які підлягають обробці. Наприклад, композиції відповідно до варіантів здійснення можна застосовувати щодо зерна при підготовці до зберігання або під час зберігання у зерновому бункері або елеваторі тощо. Композиції згідно з варіантами здійснення можна застосовувати одночасно або послідовно з іншими сполуками. Способи застосування активного інгредієнта відповідно до варіантів здійснення або агрохімічної композиції відповідно до варіантів здійснення, які містить щонайменше один із пестицидних білків, які виробляються штамами бактерій відповідно до варіантів здійснення, включають без обмеження позакореневе застосування, нанесення покриття на насіння та застосування щодо грунту. Кількість застосувань та норма застосування залежать від інтенсивності зараження відповідним шкідником.
Придатні поверхнево-активні засоби включають без обмеження аніонні сполуки, такі як карбоксилат, наприклад, металу; карбоксилат довголанцюгової жирної кислоти; /-М- ацилсаркозинат; моно- або діестери фосфорної кислоти з етоксилатами жирних спиртів або солі таких естерів; сульфати жирних спиртів, такі як додецилсульфат натрію, октадецилсульфат натрію або цетилсульфат натрію; сульфати етоксилованих жирних спиртів; етоксиловані
Зо алкілфенолсульфати; лігнінсульфонати; нафтові сульфонати; алкіларилсульфонати, такі як алкіл-бензолсульфонати або нижчі алкілнафталінсульфонати, наприклад, бутилнафталінсульфонат; солі сульфованих нафталін-формальдегідних конденсатів; солі сульфованих фенол-формальдегідних конденсатів; більш складні сульфонати, наприклад, сульфонати амідів, наприклад сульфований продукт конденсації олеїнової кислоти та М- метилтаурину; або діалкілсульфосукцинати, наприклад, сульфонат натрію або діоктилсукцинат.
Неіїоногенні засоби включають продукти конденсації естерів жирних кислот, жирних спиртів, амідів жирних кислот або жирних алкіл- або алкенілзаміщених фенолів з етиленоксидом, естерів жирної кислоти та етерів багатоатомних спиртів, наприклад естери сорбіту та жирних кислот, продукти конденсації таких естерів з етиленоксидом, наприклад естери поліоксиетиленсорбітану та жирних кислот, блок-співполімери етиленоксиду та пропіленоксиду, ацетиленові гліколі, такі як 2,4,7,9-тетраетил-5-децин-4,7-діол, або етоксиловані ацетиленові гліколі. Приклади катіонного поверхнево-активного засобу включають, наприклад, аліфатичний моно-, ди- або поліамін, такий як ацетат, нафтенат або олеат; або амін, що містить кисень, такий як аміноксид поліоксиетиленалкіламіну; аміни з амідними зв'язками, одержані шляхом конденсації карбонової кислоти з ди- або поліаміном; або сіль четвертинного амонію.
Приклади інертних матеріалів включають без обмеження неорганічні мінеральні речовини, такі як каолін, філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати, або рослинні матеріали, такі як корок, подрібнені у порошок стрижні кукурудзяних початків, луска арахісу, луска рису та лушпиння волоських горіхів.
Композиції згідно з варіантами здійснення можуть знаходитись у формі, придатній для безпосереднього застосування, або у вигляді концентрату первинної композиції, для якого необхідно розведення відповідною кількістю води або іншого розріджувача перед застосуванням. Концентрація пестициду буде варіювати залежно від природи конкретного складу, зокрема від того, чи є він концентратом або має застосовуватися безпосередньо.
Композиція містить 1-98 95 твердого або рідкого інертного носія та 0-5095 або 0,1-50 95 поверхнево-активної речовини. Такі композиції будуть вводити з розрахунку позначеної норми для комерційного продукту, наприклад, приблизно 0,01 фунта - 5,0 фунтів на акр під час застосування в сухій формі та розрахунку приблизно 0,01 пінти - 10 пінт на акр під час застосування в рідкій формі. бо У додатковому варіанті здійснення композиції, а також трансформовані мікроорганізми та пестицидні білки згідно з варіантами здійснення можна обробляти перед складанням для подовження пестицидної активності під час застосування щодо середовища проживання шкідника-мішені за умови, що попередня обробка не здійснює шкідливий вплив на пестицидну активність. Таку обробку можна здійснювати за допомогою хімічних та/або фізичних засобів за умови, що обробка не впливає негативно на властивості композиції(композицій). Приклади хімічних реактивів включають без обмеження галогенуючі засоби; альдегіди, такі як формальдегід та глутаровий альдегід; протиінфекційні засоби, такі як зефіран хлорид; спирти, такі як ізопропанол та етанол; та фіксуючі суміші для гістологічних препаратів, такі як фіксуюча суміш Буена та фіксуюча суміш Хеллі (див., наприклад, Нитазоп (1967) Апіта! Тібвиє
Тесппідез (М.Н. Егеетап апа Со.).
В інших варіантах здійснення перевагу буде мати обробка поліпептидів Сту-токсинів протеазою, наприклад трипсином, для активації білка перед застосуванням композиції з пестицидним білком згідно з варіантами здійснення щодо середовища проживання шкідника- мішені. Способи активації протоксину серинової протеазою добре відомі з рівня техніки. Див., наприклад, СоокКзеу (1968) Віоспет. у). 6:445-454 та СатоїЇ апа ЕПаг (1989) Віоспет. у. 261:99- 105, ідеї яких включені в даний документ за допомогою посилання. Наприклад, придатний протокол активації включає без обмеження об'єднання поліпептиду, який потрібно активувати, наприклад, очищеного нового Сту-поліпептиду (наприклад, з амінокислотною послідовністю, викладеною у ЗЕО ІО МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 8 та 5ЕО ІЮ МО: 10), та трипсину у ваговому співвідношенні білок/трипсин 1/100 у 20 нМ Мансоз, при рН 8, та розщеплювання зразка при 36 "С протягом З годин.
Композиції (у тому числі трансформовані мікроорганізми та пестицидні білки згідно з варіантами здійснення) можна застосовувати щодо середовища проживання комахи-шкідника, наприклад, за допомогою обприскування, дрібнодисперсного розпилення, обпилювання, розкидання, нанесення покриття або поливання, введення в грунт або на нього, введення в поливну воду, за допомогою обробки насіння або загального застосування або обпилювання в той час, коли шкідник почав з'являтися, або перед появою шкідників як захід захисту.
Наприклад, пестицидний білок та/"або трансформовані мікроорганізми згідно з варіантами здійснення можна змішувати із зерном для захисту зерна під час зберігання. Загалом важливо
Зо забезпечувати добрий контроль шкідників на ранніх стадіях росту рослин, оскільки як раз у цей час рослина може пошкоджуватися найбільш сильно. Для зручності композиції згідно з варіантами здійснення можуть містити інший інсектицид, якщо це вважається необхідним. В одному варіанті здійснення композицію застосовують безпосередньо щодо грунту під час висаджування в гранулярній формі композиції носія та мертвих клітин штаму Васійй5 або трансформованого мікроорганізму згідно з варіантами здійснення. Іншим варіантом здійснення є гранулярна форма композиції, яка містить агрохімікат, такий як, наприклад, гербіцид, інсектицид, добриво, інертний носій та мертві клітини штаму Васіїй5 або трансформованого мікроорганізму згідно з варіантами здійснення.
Фахівцю у даній галузі техніки буде зрозуміло, що не всі сполуки однаковою мірою ефективні проти всіх шкідників. Сполуки згідно з варіантами здійснення проявляють активність щодо комах-шкідників, які можуть включати економічно важливих агрономічних, лісових, тепличних шкідників, шкідників розплідників, декоративних рослин, їжі та тканин, здоров'я людей та тварин, домашньої та комерційної інфраструктури, домашнього господарства та продуктів, що підлягають зберіганню. Комахи-шкідники включають комах, вибраних із рядів СоіІеоріега,
Бірієга, Нутепоріега, І ерідорієга, МаїІІорнада, Ноторієга, Нетірієга, Оппорієга, Тнузапорієга,
Оептаріега, Ісоріега, Апоріига, Зірпопарієга, Тгіспорієга тощо, зокрема, СоіІеоріега та
І ерідорієга.
Комахи з ряду І ерідоріега включають без обмеження совок, підгризаючих совок, п'ядунів і геліотин родини Мосіцідає Адгоїї5 ірзіоп Ниїпадеї! (совка-іпсилон); А. огіподопіа Могтізоп (совка прямокутна); А. зедейт ЮОепіз 5 ЗспшШептйПег (совка озима); А. з,ибіеітапеа РарБбгісіи5 (совка зерниста); АіІарата агудйПШасеа Ніарпег (совка бавовняна американська); Апіїсагзіа деттайаїї
Ноабрпег (гусінь оксамитових бобів); АйПпеїї5 тіпдага Вагпе5 апіа Мебиппочоуй (шорстка совка);
Еагіа5 іпбшапа Воізаима! (совка бавовняна єгипетська); Е. міНеМйа Рабгісіиє (совка плямиста);
Едіга (Хуіотудев5) сигпіарй5 Сгоїе (цитрусова совка); Еихоа тебззогіа Наїтіх (чорнобока гусінь совки); Неїїсомегра аптідега Ніибпег (совка щітинконога резедова); Н. 76а Воадіє (совка кукурудзяна або бавовняна совка); Неїоїпі5 мігезсеп5 Рабгісіи5 (тютюнова листовійка); Нурепа 5сабга Рабгісіи5 (совка конюшинова); Матезіга сопіїдигага М/аІКег (совка Берта); М. Бгазвзісає
Гіппаєеиз (совка капустяна); Меїапснпга рісіа Нагті5 (совка); Рзецйда|ена ипірипсіа Нажогій (совка лугова); Рзецйдоріизіа іпсішдеп5 УмаїЇКег (соєва совка); Кіспіа аіІрісобїа тій (личинка західної бо бобової совки); Зродоріега їгидірегда УЕ Зтійй (совка трав'яна); 5. ехідча Набпег (совка мала);
5. ІШига Рабгісіи5 (тютюнова совка, гусінь, яка поїдає суцвіття); Тгіспоріивіа пі Нарпег (совка ні); вогнівки, чохлоноски, метелики, які будують павутинні гнізда, конусні метелики та шкідники, які скелетують листя, з родин Ругаїдає та Статрідає, такі як Аспгоїа дгізеПа Рабгісіи5 (мала воскова міль); Атуеїої5 Ігапойеїа УмаїКег (гусінь, що пошкоджує рубчики цитрусових); Ападазіа КиеппівїІа 2ейПег (вогнівка вітрякова); Саага саше а УмаїКег (вогнівка сухофруктова); Спію рапейПи5 Зу/ппое (вогнівка кукурудзяна стеблова); С. 5ирргеззаїї5 УмаІКег (жовта рисова вогнівка); С. ТеггепеПи5
Радепзіеспег (вогнівка очеретяна стеблова); Согсуга серпаіопіса Зіаіпіоп (вогнівка рисова);
Статри»х саїїдіпозеПйи5 Сіетепз (вогнівка кукурудзяна); С. їеїетеїйи5 7іпсоКеп (вогнівка злакова);
Спарпайосгосіє теадіпаїїє Сцепее (листовійка рисова); Юебтіа їипегаїїє Набпег (виноградна листовійка); Оіарпапіа Ппуаїїпаца І іппаєиз (динна вогнівка); О. пійадаййв5 01 (вогнівка огірків-пікулі);
Оіаїйгаєа дгапаїозейа Оуаг (вогнівка кукурудзяна південно-західна), ЮО. зассВагаїї5 РаБбгісіи5 (очеретяна вогнівка); ЕІазтораїриз Ідпозеййи5 2еїПег (малий кукурудзяний метелик); Еогеита
Іойіпі ЮОуаг (мексиканська рисова вогнівка); Ерпезіа еїшеймйа Нобпег (вогнівка тютюнова (шоколадна)); СайПегіа теїйПопеМйа Гіппаеи5 (велика воскова міль); НеадуіІеріа ассеріа Вийег (очеретяна листовійка); Негреїодгатта Іісагвізай5 МУмМаїКег (лучний метелик); Нотоеозота еІесієйшт Ниївбії (вогнівка-трав'янка); ІГохов5іеде віфсіїса|й5 І іппаєи5 (лучний метелик); Магиса їезішаїї5 Сеуег (вогнівка акацієва); Огіпада Іпугізаїї5 УмаІКег (чайна міль); О5ігіпіа пибіїаї5 Нарпег (вогнівка кукурудзяна); Ріодіа іпіегрипсієа Набпег (міль індійська борошняна); Зсігрорпада іпсепішаз УмаїКег (вогнівка рисова стеблова); Одеа гибідаїї5 Сцепее (вогнівка іржаво-коричнева); та листовійки, листовійки-брунькоїди, плодожерки та гусені-шкідники плодів із родини ТогігісіЗає
Асієгіз діомегапа Умаївіпдапат (західна чорноголова листовійка); А. магіапа ЕРетаїй (східна чорноголова листовійка); Адохорпуе5 огапа Різспег моп Козвіегєїатт (листовійка сітчата);
Агопір5 5рр., в тому числі А. агдугозріа УмаїКег (листовійка плодових дерев) та А. гозапа
Гіппаєиз (європейська листовійка); Агдугоїаепіа 5рр.; Вопадоїа заЇшбгісоїа МеугісК (листовійка бразильська яблучна); СПпогізіопецга 5рр.; Соспуїї5 позре5 УМаізіпапат (смугаста соняшникова міль); Суаїа Іайтеггеапа Умаівіпдапат (ліщинна плодожерка); С. ротопеїйа Ііппаєи5 (яблунева плодожерка); Епдорі7а мієапа СіІетеп5 (листовійка виноградна); Еироесіїйа атбідчейа Набпег (листовійка гронова); Сгарпоїйа тоїевзіа ВизсК (плодожерка східна персикова); Гобезіа Боїгапа
Оепів 5 БспшШетптйПШег (листовійка європейська виноградна); Ріаїупоїа Памедапа СіІетеп5
Зо (листовійка мінлива); Р. бїиКапа Умаізіпдапат (листовійка всеїдна); Зріюпоїа осеМПйапа Оеєпіз 8
ЗепінептоПег (листовійка брунькова) та 5цйцівєїта Пеїїапіпапа Кіїеу (листовійка соняшникова).
Інші вибрані сільськогосподарські шкідники з ряду І ерідоріеєга включають без обмеження
АІ5орпйа ротеїагіа Наїтіз (осінній плодовий черв'як); Апагзіа Іпеагейа 72ейПег (міль фруктова смугаста); Апізоїа 5епайогіа У.Е. Зтійй (сатурнія оранжева дубова); Апіпегаєа регпуї сиегіп-
Мепемійе (китайський дубовий шовкопряд); Вотбрух тогі Гіппаеи5 (шовковичний шовкопряд);
Виссшаїгіх ТтигбрегіеПа Ви5сК (кривовуса бавовняна міль); СоїЇїа5 ейгуїпете Воізаима! (люцернова жовтяниця); Юайапа іпіедегіта Сгоїе 85 КобБіпзоп (чубатка горіхова); Оепагоїйтив в5ібрігіси5
Т5епеїм'егіком (сибірський шовкопряд), Еппото5 5!ЇбБ5ідпагіа Ниабпег (п'ядун ільмовий); Егаппіб
Шіага Наїтіє (п'ядун липовий); Егеспійіає Памізігіага УУаїбіпдайат (міль бруньки цукрової тростини); Еиргосії5 спгузопповеа І іппаеи5 (шовкопряд золотистий); Нагтізіпа атегісапа спцегіп-
Мепемійе (піроморфіда американська); Неїйоїпіє 5ибйеха Сцепее; Нетіїеиса оїїмаеє СоскКгеїЇ (гусінь сатурнії); Нурпапігіа сипеа Огигу (американський білий метелик); Кеїега ІусорегвзісеПйа умаівіпдапат (томатна міль); І атбаїіпа їзсеїПагіа їізсеМПагіа Ниївї (п'ядун тсуговий східний); Г. тізсеМПагіа Імдибгоза Ниїві (п'ядун тсуговий західний); І еисота заїсів І іппаеиз (волнянка мулова);
Гутапігіа дізраг Гіппавиз (непарний шовкопряд); Маіасозота 5рр.; Мапдиса диіпдоетасиіаїа
Наужогій (бражник п'ятиточковий, томатний бражник); М. зехіа Намжогій (томатний бражник, тютюновий бражник); Орегорпнега Бгитаїйа І іппаєи5 (п'ядун зимовий); Огдуїа 5рр.; РаІєаста мептаїйа РескК (п'ядун весняний); Раріїо сгезрпопіе5 Статег (косатець велетенський); Рігудапіаіа саїйогпіса РасКага (коконопряд кільчастий каліфорнійській); РПпуїЇоспівії5 сйгейа Зіаїпіоп (цитрусова муха-мінер); РПпуйопогусіег Біапсагдейа Рабгісіи5 (міль-строкатка плодова нижньостороння); Ріеєгі5 ргазвісає І іппаеи5 (білан капустяний великий); Р. гарає І іппаєиз (білан капустяний малий); Р. парі Ііппаєи5 (білан бруквяний); Ріаїурійа сагацідасіуа Кіїеу (пальцекрилка артишокова); РішепПа хуїозіеїа І іппаєиз (міль капустяна); Ресііпорпога доззуріеНа
Зацйпаег5 (рожевий коробковий черв'як); Ропійа ргоїодісе Воізацймаї! 8. І есопіє (клітчастий білан); зЗаршодев аедгоїаїа сСцепее (всеїдний п'ядун); 5спігига сопсіппа У.Е. 5тйй (хохлатка); Зйоїгода сегеаїеЇйа Оїїміеег (міль ячмінна ангумуазька); Тпайтеїороєа ріуосатра 5спійептийПег (похідний шовкопряд сосновий); Тіпеоїа БіхзеїППейПна Ниттеї (міль кімнатна); Тша арзоїша МеугісК (томатна міль) та Уропотеціа радегїа І іппаєиз (горностаєва міль плодова).
Становлять інтерес личинки та імаго з ряду СоіІеорієга, у тому числі довгоносики з родин бо Апійгірічае, Вгиспідає та Сигсшіопідає, у тому числі без обмеження: Апіпопоти5 дгападіб
Вопетап (довгоносик бавовняний); Суїїпагосоріиги5 адерегзи5 ІеСопіє (довгоносик соняшниковий стебловий); Оіаргерез арргеміаси5 ІГіппаєиз (довгоносик з роду Оіаргере5); Нурега рипсіада Рабгісіи5 (довгоносик точковий); І і5огпоріги5 огугорпйи5 Кизсапеї! (довгоносик рисовий водяний); Меїатавзіиє Петірієгиє Петірієги5 Ііппаєи5 (довгоносик західноіїндійський тростинний); М. петіріегив5 зегісеи5 Оїїміег (довгоносик тростинний); Зпорпійи5 дгапагіив І іппаєив5 (довгоносик амбарний); 5. огулає ІГіппаєи5 (довгоносик рисовий); Зтісгопух їшіми5 ІГесСопіе (червоний довгоносик соняшниковий); 5. 5огаідиє ІесСопіє (сірий довгоносик соняшниковий); зЗрпепорпоги5 таїдіє СрішШепадеп (довгоносик маїсовий); НАНараовзсенв оБ5сигив5 Воізаимаї (довгоносик новогвінейський тростинний); земляні блішки, блішки, кореневі черв'яки, листоїди, картопляні жуки та листові мінери з родини СПпгузотеїїйдає, у тому числі без обмеження:
Снаєїюспета есіура Ногп (блішка стеблова хлібна); С. ршиїїсапа Меї5Ппеїтег (земляна кукурудзяна блішка); СоЇахрі5 Ббгиппеа Рабгісіи5 (листоїд виноградний); Оіабгоїїса багбрегі 5тійй 8
І ам'гепсе (північний кукурудзяний жук); Ю. ипаесітрипсіага помагаї Вагбег (блішка 11-точкова
Говарда); 0. мігдітега мігоітега ГеСопіе (західний кукурудзяний жук); І ерііпоїагза десетіїпеага Зау (колорадський жук); Ошета теїапориз Ііппаеєи5 (п'явиця червоногруда); РпуПоїгеїа сгисіТегає
Соее (блішка хрестоцвіта); 2удодгатта ехсіатаїцопів Рабгісіи5 (соняшниковий листоїд); жуки з родини Соссіпеїїдає, у тому числі без обмеження: Еріїасппа магімевії5 Миїзапі (мексиканська квасолева корівка); хрущі та інші жуки з родини 5бсагараєїдає, у тому числі без обмеження:
Апійгодив рагушив Вгйоп (личинка жука, яка поїдає цукрову тростину); Сусіосерпаїа брогеаїї5
Агтом/ (дупляк північний, хрущ); С. іттасшіаа Оїїміег (дупляк південний, хрущ); Юептоіеріда аропійишт Ууагекгпоизе (сіроспинний жук, який поїдає цукрову тростину); ЕшпеїпеєоЇїа Питіїв гидісере ІГеСопів (тростинний жук); І ерідіоїа їепспі Віаскбигп (личинка І еріадіоїа, яка поїдає цукрову тростину); Тотаги5 діррози5 ЮОе Сеег (жук морквяний); Т. зирігоріси5 ВіІаїспіеу (личинка жука, яка поїдає цукрову тростину); РіуПорпада сгіпйа Вигтеї:еїег (хрущ); Р. Іайгоп5 І еСопіє (червневий хрущ); Рорійа )|аропіса Меултап (хрущик японський); КПігоїгоди5 та/аїї5
КагоитомКу (нехрущ травневий); шкіроїди з родини ЮОегтезіідае; дротяники з родини
ЕІатегідає, ЕІеоде5 5рр., Меїапоїш5 5рр., в тому числі М. соттипіз («зуПепйа! (дротяник);
Соподегиб5 5рр.; Гітопіи5 5рр.; Адгіоїез 5рр.; Стіепісега 5рр.; Аеоїй5 5рр.; короїди з родини
Зсоуйдає та жуки з родини Тепебгіопідає; жуки з родини Сегатрусідає, такі як без обмеження
Зо Міддоїш5 їуапи5 УУезімоса (вусач); та жуки з родини Виргезійдає, в тому числі без обмеження
Арпапівіїси5 соспіпспіпає зетіпиїит ОбБепбрегдег (вузькозлатка, що мінує листя).
Становлять інтерес імаго та незрілі особини ряду Оірієга, у тому числі мінуючі мушки
Адготула рагмісопів І оєм/ (кукурудзяна мінуюча мушка); галиці, у тому числі без обмеження:
Сопіагіпіа зогопісоїа Содийей (галиця соргова); Мауєїйоїа девігисіог Зау (гессенська муха);
Меоіавзіорієта типеїаапа Ееїї, (соняшникова галиця); Зйоаіріозіз тозеЇПапа Сепіп (помаранчева зернова галиця); плодові мушки (Терпгіідає), Озсіпеїа її І іппаєи5 (плодові мушки); личинки, у тому числі без обмеження: ОеїЇйа 5рр., у тому числі ОеїЇїа ріаїшта Меїдеп (муха росткова); 0. соагсіаїа РаїІїеєп (муха озима); Раппіа сапісціатів І іппаеив, Е. Тетогаїїв 5івїп (малі кімнатні мухи);
Меготуга атетгісапа Нісп (американська мероміза); Мизса дотевіса І іппаєи5 (кімнатна муха); зіотохув саїсіїгап5 І іппаєив (жигалка осіння)); мухи польові, жигалки, мухи м'ясні, Спгувотуа 5рр.; РПогптіа 5рр.; та інші мухи-шкідники надродини Мибсоідеа, сліпні Тарапиб5 5рр.; носоглоткові оводи Сіазігторпійй5 5рр.; Оевігпив 5рр.; бичачі оводи Нуродепта 5рр.; пістряки
Спгузорз5 5рр.; Меіорпадив оміпив5 І іппаєив (рунець овечий); та інші Вгаспусега, комарі Аєдез 5рр.; Апорпеєїе5 в5рр.; Сшех 5рр.; мошки Рговітийййт врр.; Зітийшт врр.; мокреці, москіти, сціариди та інші Метаїосега.
Як комахи, що становлять інтерес, включені комахи з ряду Нептіріега, такі як без обмеження наступні родини: Ааеїдідає, АПІеугодідає, Арпідідає, А:іегоІесапідає, Сегсорідає, Сісадеїаає,
Сісадіадає, Сіхідає, Соссідає, Согеідає, Оасіуіоріїдає, Оеє!Ірнасідає, Оіазрідідає, Епіососсідає,
КНіаїйдає, Еиідогідає, Іззідає, Іудавідає, Магодагодідає, Метрбгасідає, Міпйдає, ОпНе?іїдає,
Репіаютідає, РПоепісососсідає, Рпуїохегідає, Рзепйдососсідає, Рзуїйдає, Руггпосогідає та
Тіпдідає.
Важливі з погляду сільського господарства представники ряду Неїтіріега включають без обмеження: Асгоз5іегпит Ппіаге Зау (клоп-щитник зелений); Асугіпізірпоп різхит Нагїгті5 (попелиця горохова); Адеїде5 5рр. (хермеси); Аде!Ірпосогі5 гаріди5 зау (клоп люцерновий); Апавза ігізії5 ЮОе
Сеег (клоп-ромбовик сумний); Арвпі5 сгассімога Косп (попелиця люцернова; А. Табає Зсороїї (попелиця бурякова); А. до55урії Сіомег (попелиця бавовняна, попелиця баштанна); А. таїйадігадісіє Еогре5 (попелиця кукурудзяна коренева); А. роті ЮОе Сеег (попелиця яблунева); А. 5зрігаесоїа Раїспй (попелиця зелена цитрусова); Айціасавзріє іедаІепвіє 2еппіпег (щитівка тростинна); Ашіасогійшт зоїапі Какепрасп (попелиця картопляна звичайна), Ветівзіа їабрасі 60 Сеппайдіиє (білокрилка тютюнова, білокрилка бавовняна); В. агдепійоїй ВеїПом5 4 Реггтіпд
(білокрилка магнолієва); Віїз5и5 Іеисоріеги5 Іеисоріеги5 Зау (клоп-ч-ерепашка пшеничний північноамериканський); Віобіоптаййдаеє 5рр.; Вгемісогупе Юргабззісае І іппаеи5 (попелиця капустяна); Сасорзуїа ругісоїа Роегеїег (мідяниця грушева); СаїЇосогіз погмедіси5 «теїїйп (клопик картопляний); Спаеїйозірпоп Ігадаєйоїїйї СосКегеїЇ (попелиця сунична американська); Сітісідає 5рр.; Согеідає 5рр.; Согуїписа доззурії Рабгісіи5 (клоп бавовняний); Сугпореніх тодевіа Оівіапі (клоп томатний); С. поїайшз Оі«їапі (сліпняк); Оеоів Паморісіа 58! (пінниця); ОіаІеигоде5 сіїгі
Азптеай (білокрилка цитрусова); Оіарппосогів спіогіопіз ау (клоп-шкідник гледичії); Оішгарпіб похіа Кигармтом/Могаміко (попелиця ячмінна); Юиріаспіопазріє аїмегдепе Огееп (щитівка);
Бузарпіх ріапіадіпеа Раазегіпі (попелиця яблунево-подорожникова); Юузадегсиб5 5зщшгейПи5
Нетісн-5спанег (красноклоп бавовняний); ЮОувзтісосси5 ропіпвіз Кимжапа (сірий очеретяний борошнистий червець); Етроазса ТараеНаггтіє (цикадка картопляна); Егіозхота Іапідегит
Наизтапп (попелиця кров'яна); Егуїйгопеоига 5рр. (цикадки виноградні); Ештеїоріпа Паміре5
Миїг (цикадка острівна тростинна); Еигудазіег 5рр.; Еизспічи5 зегми5 Зау (щитник коричневий);
Е. мапіоіапив Раїїбзої де Веаймоїв (клоп одноплямистий); Сгаріовієїпиз 5рр. (комплекс клопів- наземників); та НуаїЇорієги5 ргипі Сеопйгоу (попелиця борошниста сливова); Ісегуа ригойабі
Махкеї! (червець жолобчастий австралійський); І ароріадісоїа аїй Кпідні Ожук-шкідник. рослин цибулі); ІГаодеїрнах вігпіасейи5 Раїеп (темна цикадка); Іеріодіоб5и5 согоціи5 Зау (сосновий сім'яний клоп); І еріодісіїуа їабіда Негптісп-Зспаетйег (клоп тростинний); Гірарпі5 егузіті Какепрасіп (попелиця гірчична листова); Гудосогіз рариїїпи5 ІГіппаєи5 (зелений сліпняк); Гудив Іпеоїагів
Раїїзої де Веацймої5 (клоп лучний); ЇМ. Незреги5 Кпідні (клоп лучний західний); /. ргаїепвів
Ііппаєив (клоп трав'яний); Г. гидиїреппі5 Рорріи5 (клоп польовий); Масгозірпит еирпогріає
Тпотав (попелиця картопляна велика); МасговіеЇе5 диаагійпеаг5 Рогре5 (цикадка астрова);
Мадісісада зерієпдесіт Гіппаєи5 (цикада сімнадцятирічна); Манапагма їітргоіага 5І8І (пінниця тростинна); Меїапарніх зассНнагі 7еппіпег (попелиця тростинна); МеїЇапазрі5 діотегаїа Стеєп (червець чорний); МефроіІорпішт айїподит УмаїКег (попелиця розанно-злакова); Муив5 регзісає зЗцІгег (попелиця оранжерейна, попелиця персикова зелена); Мазопоміа гірбієпідгі Мо5іІеу (попелиця цикорієво-смородинова); Мерпоїейціх сіпіісер5 ОпіІег (цикадка зелена); М. підгорісіи5
Іа! (цикадка рисова); Мелага мігідшіа Гіппаєи5 (зелений овочевий клоп); Мііарагмаїа Ішдепз 5! (бура цикадка); Музіи5 егісаеє ЗспіЙйпу (нізиус вересковий); Музіи5 гарпапи5 Ноучага (нізиус);
Зо Оебраїи5 ридпах Рабгісіи5 (клоп-щитник рисовий); Опсорейиз Тазсіайшве Ваїйав (клоп молочайний);
Огпійпорзо сатревзвігіз І іппаеи5; Ретрпіди5 5рр. (попелиці кореневі та попелиці галові); Регедгіпи5 таїдіє Азптеай (цикадка кукурудзяна); РеїкКіпбвієїа 5засспагісіда Кігкаїду (дельфацида тростинна); Рпуїїохега демабзіайіх Регдапде (філоксера гікорі); Ріапососсив сімкі Вів5о (борошнистий червець цитрусовий); Ріезіосогі5 гидісоїїїє Раїеп (клоп яблуневий); Роесіосарзив5
Іпеайшх Рабгісіи5 (клоп чотирисмуговий трав'яний); Рзецйдайтобзсеїї5 зегіайшбе Кешег (бавовняний сліпняк); Рзейдососсиз 5рр. (інші борошнисті червеці); Риїміпагіа віопдаїа Мемувієай (червець пушицевий); Ругйа регрибзійа ММаїКег (цикадка тростинна); Руггпосогідає 5зрр.;
Оцаагазрідіовшв регпісіози5 СотвіоскК (щитівка каліфорнійська); Кедиміїдає зрр.; Кпораіозірпит таїідіє Бйспй (попелиця соргова); К. раді Ііппаєи5 (попелиця черемхова звичайна); зЗасспагісоссивз засспагі СосКегеї! (очеретяний борошнистий червець); Зспігарпі5 дгатіпит
Копаапі (попелиця злакова звичайна); зірпа Пама Еогре5 (попелиця цукрової тростини жовта);
ЗНоБіоп амепає Рабгісіи5 (попелиця злакова); б5одаїейПНа Тигсітега Ногмайй (цикадка білоспинна); зодайде5 огулісоїа Миїг (дельфацида рисова); Зрападопісиз аїроїтазсіаєйе Кешег (сліпняк білокрапчастий); Тпегіоарпіх тасціаба Вискіоп (плямиста люцернова попелиця); Тіпідає 5рр.;
Тохорієгта ацгапії Воуег де Еопзсоїотре (попелиця померанцева); та Т. сігісіда Кігкаїду (попелиця цитрусова); Тгіаїєнгодех5 аршйопеи5 (білокрилка смугастокрила) та Т. марогагогит
Умезімосй (білокрилка теплична); Тгіо/а діозругі Абптеай (листоблішка хурмова); та Турпіосубра ротагіа МсАїее (цикадка яблунева).
Також включені імаго та личинки з ряду Асагі (кліщі), такі як Асегіа їозіспеПа Кеїйїег (галовий кліщ пшеничний); Рапопуспи5 шіті Косп (червоний плодовий кліщ); Реїгобіа Іаїепз Маїег (петробія багатоїдна); біепеоїагеопети5 бБапсгойі Міспаєї (кліщ, який пошкоджує стебло цукрової тростини); кліщики павутинні та кліцики червоні родини Теїгапуспідає, ОЇїдопуспи5 дгуриз ВаКег 5 Ргйспага, О. іпаісиє Нігбї (кліщ листовий тростинний), О. ргасепвзі5 Вапк5 (трав'яний кліщ Бенкса), 0. 5іісКпеуї МосОгедог (кліщ павутинний тростинний); Теігапуспив ипісає
Косп (кліщ павутинний двоплямистий); Т. тесадапієї МесОгедог (кліщик МакДенієла); Т. сіппарагіпих Воізаима! (червоний павутинний кліщик); Т. їшгКевїапі Одагом 5 Мікої5Кі (туркестанський павутинний кліщик); пласкі кліщі родини Тепиіраїірідає, ВгеміраІриє5 Іем/ібі
Меогедог (помаранчевий кліщ); іржасті та брунькові кліщі родини Егіорпуїдає та інші кліщі, які годуються листям, та кліщі, важливі для здоров'я людини та тварин, тобто пилові кліщі родини бо Еріаеппоріідає, желізниці родини ЮОетодаісідає, зернові кліщі родини Сіусурпацдідає, іксодові кліщі ряду Іходідає. Іходеб5 5саршагіє Зау (чорноногий кліщ); !. ВПоЇосусіи5 Мештапп (австралійський паралітичний кліщ); Юегтасепіог магіарійє бЗау (кліщ іксодовий собачий);
Атбріуотта атегісапит Гіппаєи5 (іксодовий кліщ Атбріуотіта) та кінські та коростяні кліщі родин Рзогоріідає, Руетоїідає та Загсоріідає.
Комахами-шкідниками з ряду Тпузапига, що становлять інтерес, є, наприклад, І ерізта засспагіпа І іппаєи5 (лусочниця); Тпегтобіа дотевіїса РасКага (термобія домашня).
Додаткові охоплені шкідники-артроподи включають павуків із ряду Агапеає, таких як
ГохозсеЇе5 гесіиза Сегпізсп 5 Мшиїаік (бурий павук-відлюдник) та І аїгодесіи5 тасіап5 РаБбгісіи5 (чорна вдова), та багатоніжок із ряду Зсціідеготогрпа, таких як Зсщшіідега соіІеорігайа І іппаеив5 (звичайна мухоловка). Крім того, інтерес становлять комахи-шкідники з ряду Ізорієега, у тому числі з родини Тептййдає, такі як без обмеження СуїЇїпагоїептев погаєпвкКіовіді НоїІтагеп та
Рзецйдасапіпоїеттез тіїнагіє Надеп (тростинний терміт). Інтерес також становлять комахи з ряду
Твпузапоріега, в тому числі без обмеження трипси, такі як БіепспавіоїНгір5 тіпшщив мап ЮОємепівг (тростинний трипс).
Пестицидну активність композицій згідно з варіантами здійснення можна тестувати на комахах-шкідниках на ранніх стадіях розвитку, наприклад, у вигляді личинок або інших незрілих форм. Комах можна розводити в повній темряві при температурі від приблизно 20 С до приблизно 30 "С та за відносної вологості від приблизно 30 95 до приблизно 70 95. Біологічні аналізи можна здійснювати, як описано в С7аріа апа Гапд (1990) У. Есоп. Епютої. 83(6): 2480- 2485. Способи розведення личинок комах та проведення біологічних аналізів добре відомі фахівцю в даній галузі.
Фахівцю в даній галузі відомий широкий спектр методик біологічних аналізів. Загальні процедури включають додавання експериментальної сполуки або організму до джерела їжі в закритому контейнері. Пестицидну активність можна виміряти без обмеження за вимірюваннями смертності, втратою ваги, приваблення, відлякування, а також іншими змінами поведінки та фізичними змінами після живлення та впливу протягом відповідного періоду часу. Біологічні аналізи, описані в даному документі, можна використовувати з будь-якою комахою-шкідником, що харчується, на стадії личинки або імаго.
Наступні приклади представлені як ілюстративні, а не для обмеження. Як застосовується у даному документі, форми однини включають посилання на множину, якщо у контексті явно не вказано інше. Так, наприклад, посилання на "клітину" включає множину таких клітин, а посилання на "білок" включає посилання на один або декілька білків та їхніх еквівалентів, відомих фахівцям у даній галузі, тощо. Усі технічні та наукові терміни, що застосовуються в даному документі, мають те ж саме значення, що звичайно зрозуміле фахівцю в галузі техніки до якої належить даний винахід, якщо явно не вказано інше.
Усі публікації та заявки на патент, згадані в даному описі, орієнтовані на рівень фахівця в галузі до якої належить даний винахід. Усі публікації та заявки на патент включені в даний документ за допомогою посилання у тій же мірі, як якщо б кожна окрема публікація або заявка на патент спеціально та окремо була включена за допомогою посилання.
Хоча для ясності розуміння наведений вище винахід було достатньо докладно описано за допомогою ілюстрації та прикладу, очевидно, що на практиці можна здійснювати певні зміни та модифікації у межах обсягу варіантів здійснення.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
Приклад 1. Ідентифікація гена та експресія в Е. соїї
Ген, що кодує інсектицидний білок із 5ЕО ІО МО: 4, одержували зі штаму Васійи5
ІШигіпдіепоіх, позначеного як 02348. Вибраний штам Ві вирощували в 30 мл середовища протягом 16 годин зі струшуванням за 250 об./хв. Виділену ДНК виділяли з клітин за допомогою набору від Маспегеу-Мадеї (Ме у каталозі 740521). Потім ДНК секвенували за допомогою Питіпа
Нібед2500, збирали та описували. Потім вибирали ген, що становить інтерес.
БО Кодувальну послідовність із «ЕО ІЮ МО: 3, для інсектицидного поліпептиду із «ЕО ІЮО МО: 4 та кодувальні послідовності для варіантів зЕО ІО МО: 4, які включають ЗЕО ІЮО МО: 1, 5ЕО І
МО: 5, БЕО ІЮО МО: 7 та 5ЕО ІЮО МО: 9 синтезували та клонували у вектор рЕТ2ва (Момадепф)) та трансформували в клітини Е. соїї ВІ 21 (Іпмігодеп). Культури у збільшеному масштабі 1,0 л вирощували до 0.0. за 600 нм-0,8, а потім культури індукували 1 мМ ізопропіл-В-0-1- тіогалактопіранозидом (ІРТО) та забезпечували можливість їхнього росту протягом 16 годин за 16 "С. Клітинні осади лізували в 50 мл 500 мМ Масі/20 мМ Тгтгіз/5 мМ імідазолу/рН 7,9 з використанням 0,02 95 лізоциму (вага/об'єм) та 0,1 95 Пувеп-20 та додавали 1 таблетку повного інгібітора протеаз (Коспе). Після лізису розчини піддавали ультразвуковій обробці та лізат центрифугували при 25000 об./хв. протягом 30 хвилин. Супернатант, який містить фракцію бо розчинних білків, фільтрували через 0,45 мкм вакуумний фільтр, а потім додавали 1 мл зависі
Таїоп (СіІопіесі) та після цього інкубували для зв'язування на пристрої, що обертається при 100 об./хв. протягом 1 години. Лізат потім додавали в колонку та зв'язаний білок виділяли та промивали 20 мл 50 мМ Масі/ 20 мМ Ттгі5/ 5 мМ імідазолу/ рН 7,9, а потім елюювали 1,5 мл 50
ММ Масі/ 20 мМ Ттгіз/500 мМ імідазолу/рН 7,9. Очищений білок потім піддавали діалізу в 50 мМ буфері на основі карбонату натрію з рН 10. Очищений білок передавали для дослідження інсектицидної активності в наборі аналізів іп міго з живленням І ерідоріега.
Приклад 2. Аналізи на І ерідорієга з частково очищеними білками
Біологічні скринінг-аналізи інсектицидної активності проводили для оцінки ефектів інсектицидних білків щодо ряду видів І ерідорієга: вогнівки кукурудзяної (Об5ігіпіа пибійаїів), бавовняної совки (Неїїсомегра 7еа), совки-іпсилон (Аадгоїї5 ірзйоп), совки трав'яної (Зродоріега їпидірегаа), соєвої совки (Рзецйдоріизіа іпсішдеп5) та гусені оксамитових бобів (Апіїсагвіа деттаїаї в).
Аналізи з живленням І ерідоріега проводили на штучному раціоні, який містить очищений білок, у системі з використанням 9б-лункового планшета. Очищений білок (25 мкл) потім додавали до штучного раціону. Дві з п'яти новонароджених личинок поміщали в кожну лунку для годування ай Ірбйшит протягом 5 днів. Результати виражали як позитивні реакції щодо личинок, такі як зупинка розвитку та/або смерть. Результати виражали як негативні, якщо личинки були подібні до негативного контролю, який живиться раціоном, в який вносили тільки вищевказаний буфер. Первинний скринінг за допомогою біологічного аналізу здійснювали для кожного очищеного білка при одній концентрації з використанням вогнівки кукурудзяної (О5ігіпіа пибіїаійє), бавовняної совки (Неїїсомегра 7еа), совки-іпсилон (Адгоїї5 ірзіоп), совки трав'яної (Зродоріега Ітидірегаа), соєвої совки (Рхепдоріизіа іпсішдепе) та гусені оксамитових бобів (Апіісагзіа деттаїаїй5). Аналізи з використанням комах оцінювали наступним чином: 3-100 95 смертність; 2 - сильне уповільнення росту; 1 - уповільнення росту та 0 - відсутність активності.
Первинні результати аналізу інсектицидної активності для інсектицидних поліпептидів із
ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 8 та 5ЕО ІЮО МО: 10 представлені в таблиці 5.
Таблиця 5
ЕМО 000 застосування з . . 4 повторності для всіх комах використанням планшета
Концент-
Первинний скринінг| рація вс СЕМ ЕСВ ЕАМ/ ЗВ Увс (мкг/сме
ЗЕОІЮМО2 | 15 | 0 | 0 | 0 | 0 | 267 |мМ ж
ЗЕОІЮМО4 | 15 | 0 | 0 | 0 | 0 | 267 |мМ о КРСУЛІ
ЗЕОІЮ МОЄ | 1996 | 0 | 2 | 1 | 25 | 225 | 15
ЗЕОІЮМО8 | 229 | 0 | 2 | 0 | 0 | з | 0
ЗЕОІЮ МОТО | бле | 0 | 225 | 0 | 225 | з | 0
Для інсектицидного поліпептиду із ЗЕО ІЮО МО: 6 після первинного біологічного аналізу серію
Зо концентрацій відповідних зразків очищеного білка також досліджували щодо набору СЕМУ і РАМУ.
Для інсектицидного поліпептиду із ФЕО ІО МО: 6 розраховували серію концентрацій білка із
ЗЕО ІЮО МО: 6 та концентрацій для 50 95 смертності (І 050) або пригнічення росту 50 95 особин (ІС5О). Результати І! С50/ЛС50 для інсектицидного поліпептиду із БЕО ІЮ МО: 6 представлені в таблиці 6.
Таблиця 6
Комаха
Приклад 3. Перехресна стійкість щодо інсектицидних поліпептидів у стійкої до СтутїЕ лінії совки трав'яної (ГАМУ)
Біологічні аналізи на комахах Іерідоріеєга зі включенням стандартизованого раціону використовували для оцінювання впливу 5ЕО ІЮ МО. 6 на личинок ЕАМУ. Білок об'єднували зі специфічним штучним раціоном для І ерідорієга з одержанням раціону для біологічного аналізу.
На основі результатів аналізу з визначання діапазону тестовані концентрації становили 0,156- 40 ррт за 2-кратних розведень як чутливих, так і стійких до СтуїЕ ліній РАМУ. В аналізі у форматі 9б-лункового планшета використовували 4 групи паралельних зразків для всіх концентрацій обробок плюс буфер для контролю та 8 лунок у кожному планшеті для кожної концентрації. Одну новонароджену личинку ЕАМУ поміщали в кожну лунку в планшетах, які містять раціон для біологічного аналізу й інсектицидний білок. Усі планшети інкубували при 26,7241пПс протягом 4 днів після початку кожного біологічного аналізу. Дані щодо смертності на основі загибелі використовували для розрахунку 50 95 летальної концентрації (ІС50) на основі пробіт-аналізу. Як смертність, так і число сильних уповільнень розвитку оцінювали й об'єднували як загальну відповідь для розрахунку 50 95 інгібування в окремих особин (ІС50).
Розраховували співвідношення стійкості (КК) з урахуванням ЇС/ЛС50 білка щодо чутливої та стійкої лінії ЕАМУ:
ЕНВ-Ї С або ІС5О стійкої лінії/ С або ІС5О чутливої лінії
У таблиці 7 показано, що лінія РАМУ, стійка до Стуї1Е, не мала перехресної стійкості до Ф»ЕО
ІО МО: 6 (КК-0,4 на основі ІС50).
Таблиця 7
Лінія ЕАМУ ее ЗЕОІО МО: 6, нижче за| вище за доеедношення ррт (49) 95 9501. 95 9501. вв
Сл щЕ шшшш сшшши с шш пиши тн з - чутлива лінія
Кез :- стійка лінія
Приклад 4. Адгобасіегіит-опосередкована трансформація маїсу та регенерація трансгенних рослин
Для Адгорасіегішт-опосередкованої трансформації маїсу за допомогою полінуклеотидної послідовності (наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІОЮО МО: 3) можна застосовувати спосіб 7пао (патент США Мо 5981840 та РСТ публікація патентної заявки ММО98/32326; зміст яких включено в даний документ за допомогою посилання). Коротко, незрілі зародки виділяли з маїсу та зародки приводили в контакт із суспензією Адгобасіегішт в умовах, за яких бактерії були здатні переносити нуклеотидну послідовність токсину (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІЮО МО: 3) щонайменше в одну клітину щонайменше одного з незрілих зародків (стадія 1: стадія
Зо інфікування). На цій стадії незрілі зародки можна занурювати в суспензію Адгобасіегійт для ініціації інокуляції. Зародки протягом певного часу культивували разом з Адгобасіегічт (стадія 2: стадія сумісного культивування). Незрілі зародки можна культивувати на твердому середовищі після стадії інфікування. Після періоду спільного культивування передбачалася необов'язкова стадія "спокою". На цій стадії спокою зародки інкубували в присутності щонайменше одного антибіотика, який, як відомо, інгібує ріст Адгорасіегішт, без додавання засобу для відбору для рослинних трансформантів (стадія З: стадія спокою). Незрілі зародки можна культивувати на твердому середовищі з антибіотиком, але без засобу для відбору, для виключення
Адгорасіегішт та протягом фази спокою для інфікованих клітин. Потім інокульовані зародки культивували на середовищі, яке містить засіб для відбору, та виділяли трансформований калюс, що росте (стадія 4: стадія відбору). Незрілі зародки культивували на твердому середовищі з засобом для відбору, що приводило до вибіркового росту трансформованих клітин. Потім індукували регенерування калюсу з одержанням рослин (стадія 5: стадія регенерації) та калюси, вирощені на селективному середовищі, культивували на твердому середовищі для регенерації рослин.
Приклад 5. Трансформація зародків сої
Зародки сої піддавали бомбардуванню плазмідою, що містить нуклеотидну послідовність токсину із ФЕО ІО МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 3, функціонально пов'язану з придатним промотором, як вказано нижче. Для індукції соматичних зародків сім'ядолі довжиною 3-5 мм, вирізані з 5О0 поверхнево-стерилізованих, незрілих насінин відповідного сорту сої, культивували на світлі або в темряві при 26 "С на відповідному агаровому середовищі протягом шести-десяти тижнів.
Соматичні зародки, які дають вторинні зародки, потім вирізали та поміщали в придатне рідке середовище. Після повторного відбору щодо кластерів соматичних зародків, поділ клітин у яких уже призвів до зародків на стадії глобули, суспензії підтримували, як описано нижче.
Соєві зародкові суспензійні культури можна підтримувати в 35 мл рідкого середовища на ротаційному шейкері при 150 об./хв. при 26 "С з флуоресцентними джерелами світла відповідно до схеми день/ніч 16:8 годин. Культури пересівали кожні два тижні шляхом інокуляції приблизно 35 мг тканини в 35 мл рідкого середовища.
Соєві зародкові суспензійні культури потім можна трансформувати за допомогою способу бомбардування генною гарматою (Кіеїп, еї аї., (1987) Майшге (І опдоп) 327:70-73, патент США Мо 4945050). Для цих трансформацій можна застосовувати пристрій Віоїїзс РОБЗІ1000/НЕ від би
Ропі (гелієва модифікація).
Селективний маркерний ген, який можна застосовувати для полегшення трансформації сої, без обмеження передбачав наступне: промотор 355 із вірусу мозаїки цвітної капусти (Оаеї, еї а!., (1985) Маїшге 313:810-812), ген гігроміцин-фосфотрансферази з плазміди рук225 (з Е. соїї;
Ст, еї а!.,, (1983) Сепе 25:179-188) та 3'-ділянку з гена нопалін-синтази з Т-ДНК Ті-плазміди
Адгорасіегічт Ішптеїасіеп5. Касету експресії, що містить нуклеотидну послідовність токсину (наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 3), функціонально пов'язану з придатним промотором, можна виділяти у вигляді рестрикційного фрагмента. Цей фрагмент потім можна вставити в унікальний рестрикційний сайт вектора, який несе маркерний ген.
До 50 мкл суспензії 1 мкм золотих частинок за концентрації 60 мг/мл додавали (по черзі): 5 мкл ДНК (1 мкг/мкл), 20 мкл спермідину (0,1 М) та 50 мкл Сасі2 (2,5 М). Препарат частинок потім перемішували протягом трьох хвилин, центрифугували з застосуванням мікроцентрифуги протягом 10 секунд та видаляли супернатант. Покриті ДНК частинки потім однократно промивали в 400 мкл 70 95 етанолу та ресуспендували в 40 мкл безводного етанолу. Суспензію
ДНК/частинки можна обробляти ультразвуком три рази протягом однієї секунди. П'ять мікролітрів золотих частинок, вкритих ДНК, потім завантажували на кожний диск-макроносій.
Близько 300-400 мг двотижневої суспензійної культури поміщали в порожню 60 х 15 мм
Зо чашку Петрі та залишкову рідину видаляли з тканини за допомогою піпетки. Для кожного трансформаційного експерименту зазвичай піддавали бомбардуванню приблизно 5-10 планшетів з тканиною. Встановлювали тиск розриву мембрани 1100 фунт./кв. дюйм., та в камері створювали вакуум зі зниженням тиску до 28 дюймів ртутного стовпчика. Тканину розташовували на відстані приблизно 3,5 дюйма від затримувального екрану та бомбардували три рази. Після бомбардування тканину можна розділити навпіл, і помістити назад в рідину, і культивувати, як описано вище.
Через п'ять-сім днів після бомбардування рідке середовище можна замінити свіжим середовищем, а через одинадцять-дванадцять днів після бомбардування замінити свіжим середовищем, яке містить 50 мг/мл гігроміцину. Дане селективне середовище можна поновлювати щотижня. Через сім-вісім тижнів після бомбардування можна спостерігати зелену трансформовану тканину, яка росте з нетрансформованих некрозних зародкових кластерів.
Виділену зелену тканину відбирали та інокулювали в окремі колби для одержання нових, клонально розмножених, трансформованих зародкових суспензійних культур. Кожну нову лінію можна розглядати як незалежний об'єкт трансформації. Дані суспензії потім можна пересівати та підтримувати у вигляді кластерів незрілих зародків або регенерувати в цілі рослини шляхом визрівання та пророщування окремих соматичних зародків.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ПІОНІР ХАЙ-БРЕД ІНТЕРНЕШНЛ, ІНК.
АБАД, АНДРЕ Р. КРОУ, ЕНДРЮ КАРЛ ПОЛАНД, БРЕД ШИ, СЯОМЕЙ ВУЛФ, ТОМАС
ЧАД. «1205 ІНСЕКТИЦИДНІ ПОЛІПЕПТИДИ, ЩО МАЮТЬ ШИРОКИЙ СПЕКТР АКТИВНОСТІ, ТА ЇХ
ЗАСТОСУВАННЯ
«1305 6059-ЩО-РСТ (510) «1505 75 62/064848
«1515 2014-10-16 «1605 10 «1705 РасепрІп версія 3.5 «2105 1 «2115 2256 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» варіант МРОВОРІ, «4005 1 аєддадоадаа аєааєссааа Єсааєдсасба ссссасаасс деЕссаадесаа Сссгааддас (216) аєаасаєсад деЕЧдаєдааад дссадааасоі ддсаасассд Садсадасає бассеєсад4дад 120 аєЕєсдеЕСааєс басеЕдеЕсеЕсс єдадеЕСЕдьс сссодеЕЧдад дсЕЄсасасе аддаєсасед 180 чаєєсааває додоаддеЕСТтає аддеєсдЕсссс саасддддаєс сасссссдда асадаєссдаа 240 сааєсєсдаєсєса адсааадаас адаадаассс дссаддааєсєс аддсаасссс аадаєссддад Зоо 7 чдадсеаадсу аєсеЕєвсаєаа дасстаєсдсс ададсдссса дсдаєсєсддда ддсадаєссд 3З6о асєааєссад саєсаадоада адааасдсудс асбсасааєссса асдасаєдаа Садесдстаєсс 420
Зо аєаасуддсес Єсссасесеєсе гададеєсаа аасстаєдаад ЕСДСЕСЕЕЕе аєседестває 480 дЕєЄСсСаадсед сааасеєсаса ЄЕЄсаєссаєсс ссаададаєдд ССсСсадесссс соддадааада 540
Еддддаєаєд асасадсаас баєсаасаає содссасадесд асссаассад ссесбаєєссає 60 7 дЕЄсаєаста аєсаєєдеЧдеЕ ддаєасдабає аассаддадає СааддсЯяєссс ддааддессді 6бо
ЕЕЄСЕвассу аєсоодаєсєдеЕ асаєсааєсує сЕСсСсдаадас аасєаасаає Ессадсаєта 720 часаєєдеЕвуд сасєсеЕсеєсс аааєсаєдає аєссдаасає аєссааєєса аасадстасе 78о0 садссаасда дддаааєссса Сссддаєєсса ссЕсессаєта асдаааасстє ЕссеЕсСстдса 840 чдсаадстаєс ссесаєреєсеєс адаєдссдаа адедстаєаа єсаддадесс єсаєєтадвчьд 900 7 чдасЕєееєсаа агадсеЕссас гаєєсараса дасадеЕСьЬск сеЕсдаваєєсе асаседодова 960 чадсаєсддд ЄдааєсеЕстас ссудєєсадда дЕсСастасеьє єсагасааєс ассассаєває 1020 ддаадддаад даааєсдсада дсУєсЕСЕдта аєсасеєссуд саєсаєстад сдеассааєса 1080 гЕсадаасас ЄЕсССсСаваєдеЕ гасеєддссьс дасааєдсаа аєссєдсадс Еддааєсєеєдаа 1140 ччадеЕддаає Єссаааасас баєааднада адсаєссаєс деЕаааадедд Ессааєєдає 1200 7 ЄсСЕЕєсааєд аасвассасс Есаадаєдсс адсдсаєсеєс сЕЄСсааєтдуа дсасадесас 1260 сЯєЕсаєдес асдссасавє єсеадаасод аєсадеддас саадааєсддс аддеЕдеЕсвье 1320 (516) СЕСЕСсСсСєдда сасаєсдбрад Едссадсссєї ассааєдаад Єаадесєсаєс гадааєстаса 1380 саааєєссає дддсаааддс дсасасесссе дсудєсвЕддавєд ссеЕССдЕсає сааадддсесе 1440 ччаєєсасад деЕддадаєає асеаасьадд аасассеЕсад дсдаасєддд дасеЕстаада 1500 дЕаасЕєсв9уд саддаадасє ассасааадс Сассасавас дЯяєЕсеЕссуєса єдсесеЕсСсаєта 1560 дсгаасадда дЕддсасаєс гадссаєсєса садссаасст сагаєддаає Ессе ссса 1620 ааааастаєдд аєдсадаєда аєсаєсааса СсесдеЕссає Еєдсасевдсес гасасевдсе 1680 асассдссаа сссЕсадаад дсаадаадаа Сгаааєстас аааєассаєс аддсасесає 1740 асадаєсдаа ЄЕЯДЧадеЕседЕеЕ Ессадесдає дааассеєсєса саасадааєс Едаєсєсддває 1800 ададсасаас аддсдоаєдаа ЕдсудссдЕвс ассссеЕссса аєсаааєсда ссгаааааса 1860 чаєдеЕдасудд аєсаєсаває єдаєсаадера Ессааєесад содддаєєдеЕве аєсодаєдаа 1920
Есе деЕСвду аєдаааадсу адааєсдсєсс дадааадеса аасаєдсдаа дсдасеєсаде 1980 чаєдадсдда аєсвасссса адаєссааас сСЕсададдаа Есаасадаса ассадассде 2040 чаєЕддадад даадсасада баєсассаєс сааддаддад аєдасдбєаєє сааададаає 2100 басдєсасас сСассаддрас сеЕєсдаєдад Содстаєссаа судбаєєсаєса єсааааааєа 2160 чаєдадеЕсда аасгаааадс ссабасссує сСассааєсаа дадддеаває сдаадаєаде 2220 саадасеєвад аааєссаєвеє ааєєссустас ааєєсда 2256
Зо «2105 2 «2115 751 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «220» «223» варіант МР5ОВОРІ, аа «4005 2
Меє сі б1у Авп Авп Гей Авп о біп Сув І1їе Рго Туг Авп Сув Іец 5бег 1 5 10 15
Авп оРго пув Авр І1е І1е Іїецп с1у Авр бій Агд Гей сій ТБПг б1у Авп 20 25 30
Тпг Маі Аїа Авр І1їе ТПг Гецп сб1у Іїе Уаі Авп Гей Гец Роре бек с1ци 35 40 45
Рпе Маї Ркго сіу бі1у б1у Рпе Іїе Іец с1у Гей Гей Авр Гей І1їе Тгр 50 з9 бо сбі1у бек І1ї1е с1у Агуд Бек біп Тгр Авр гейш Рпе Гей сіц біп І1е с1ц 65 70 75 80 60 біп Ттешп І1ї1е пув біп Агд Іїе сій бі Рпе Аза Агд АвБп біп Аза І1е 85 90 95 зек Акад Гей біц с1у Гей бек Авр Гей Туг Гув ТПг Тук Аїа Агуд А1а 100 105 110
Рпе бек Авр Тгр б1цшц Аза АвБр Рго ТПг АБп о Рго Аза Гей Агд бій сій 115 120 125
Меє Агуд І1е біп Рбе Авзп Авр Меє Авзп бег Аза І1е І1е ТПг Аза Гей 130 135 140
Ркго Гец Робе Агд Уаі біп Авп Туг біц Маї Аїа Гей Гей бек Уа1 Туг 145 150 155 160
Ууаї біп Аза Аза Ав5п Гей Нів Гей бек Іїе Гей Агуд Авр Уа! бек Уаї 165 170 175
Рпе с1у бій Агуд Тгр б1іу Туг Авр ТПг Аза ТПг І1е АвБп Ав5п Агд Туг 180 185 190 зек Авр Гец ТПг бек ІТецп І1ї1е Ні Уаї! Тук ТПг Авп Нів Сув Уа1 Авр
Зо 195 200 205
ТПгЕ Тук Авп о біп сіу Гец Агд Акд Гей біц б1у Акд Рпе Гей ТПг Авр 210 215 220
З5
ТЕр Іїе Уа1 Тукг Авп Агуд Рбе Агуд Агуд біп їец ТПг І1е бек Уаїії Іецй 225 230 235 240
Авр І1їе Уаії Аза Рбе Рпе Рго АвБп Туг Авр І1е Агуд ТПг Тугк Рго І1е 245 250 255 сСіп ТБг Азїа ТПг обіп Гей ТБг Акуд бій І1е Тук Гей Авр Гей Рго РІе 260 265 270
І1е Авп біц АвБп о Тец бек Рго Аїа Аза бек Тук Рго Бек РПе бБег Авр 275 280 285
Аза сій бек Аза І1е І1е Агуд бек Рго Ні Гей Уаі Авр РіПе Гей Авп 290 295 300 зек Рпе ТПг І1е Туг ТПг Авр бек Іец Аза Агуд Туг Гей Тугє Тер Щ1У 305 310 315 320 60 бі1у Нів Акуд Уаі Авп Рпе ТПг Агуд Бек сіу Уа1і1 ТПг ТБг Рре І1е сіп
325 330 335 зек Рго Пец Тук б1у Акд бій б1у АБп Аї1а бій Агуд Бек Уаі І1е Пе 340 345 350 зек Аїа бБекг бек бек УМаі! Рго І1е Робе Агуд ТПг Гей бек Тук Уа1 ТЕПг 355 3З6о 365 сб1у Гей Авр АвБп Аза Ав5п Рго Уаі Аїа с1у Іїе сіц сіу Уаї бі РБе 370 375 380 біп Авп о ТпПг о І1е Бек Агуд бек Іїе Туг Агуд Ппув бек с1іу Рго І1е Авр 385 390 395 400 зек Рпе Авп бій Гей Рго Рго біп Авр Аза бек Уаі! бек Рго бек І1е 405 410 415 сбі1у Тук бек Нів Агд Гей Сув Нів Аза ТПг Рпе Гей б1цп Агд І1е 5ег 420 425 430 б1у Рго Агд Іїе Аїа сіу Уа1 Уа1і Рпе Бек Тер ТПг Нібв Агд бег А1а 435 440 445
Зо зек Рго ТПг АвБп обіц Уаї бек бек бек Агуд Ії1е ТПг сіп І1е Рго Тгр 450 455 460
З5
Уаї пув Аїа Нів ТПг Ггец Аза бек сіу Аїа бек Уаі І1е ув с1Уу Рго 465 470 475 480 сі1у Рпе ТПкг сіу с01у Авр І1їе Гецш ТПг Агуд Авп ТБбг Тец сіу сі ТГеч 485 490 495 бі1у ТПпг Гей Агуд Уаі ТПг Рпе Аза с1іу Агд Гей бек біп бек Тук Туг 500 505 510
І1е Агуд Робе Агуд Туг А1ї1а бек Уаі Аза Авп Агуд бек сіу І1е Ріе 5ег 515 520 525
Тук Бек біп Рго ТПг бек Тук сіу І1їе бек Рбе Рго Гув ТПг Меє Авр 530 535 540
Аза Авр сій бек Іец ТПг бек Агуд Бек Рпе Аїа Гей Аза ТПг Іецй Аїа 545 550 555 560 (516) ТПЕ Рго Гей ТПг Ррбе Агуд Агд біп біц бій Гей АвБп Гей сбіп І1е Рго 565 570 575 зек с1і1у ТПг Тук І1е АвБр Агуд І1е біш Рпе Уаі Рго Уаі АвБр бій ТЕГ 580 585 590
Рпе ТПг ТПг біц бек Авр Гей АБр Агд Аї1а сбіп сіп Аїа Уаі1і Авп Аї1а 595 (51048) 605
Тецп Рпе ТПг бек Бек Ап біп Іїе с1іу Гей Ппув ТПг Авр Уаї ТПг Авр 610 615 620
Тук Нів Іїе Авр біп Уаї Бек АвБп Гецп Уаі Авр Суб ІТец бек Авр с1и 625 630 635 640
Рпе Сув Гец Авр о біц Гув Агуд біц ІТец бек бій Ппув Уа1ї Ппув Нів Аї1а 645 650 655
Тпув Агкд Теип бек Авр бій Агуд Авп Гей Гей біп Авр Рго Авп Робе Агд бо бе5 670 б1у І1е АБп Агуд біп Рго Авр Агуд сб1іу Тер Агуд с1іу бек ТіПг АБр І1е 675 680 685
Зо
ТПгЕ Іїе сбіп сіу с1у Авр Авр Уа1 Рбе пув біц Авп Тук Уаї ТПг Іецй 690 695 700
Рго с1у ТБкг Ррбе АвБр бій Сув Тук Рго ТПг Тукг Гей Тук сіп Гув І1е 705 710 715 720
Авр сій бек пув ІТец Гув Аза Туг ТПг Агуд Тук біп Гей Агд с1у Туг 725 730 735
І1е біц Авр бек біп Авр Гей біцш І1е Тук Гей Іїе Агд Тук Авп 740 745 750 «2105 З «2115 3492 «212» ДНК «213» Васії1їїцв Єпигіпдієпвів «4005 З аєддадодадаа аєсааєстааа Єсааєдсавра ссеЕгасааьє дЯдеЕссаадраа ЕСсстгааддвас (216) асаасаєстад деЕдаєдчааад дсгадааасе ддаєаасассд Садсадасає гассеЕсад9ад 120 аєгсєдЕСвааєс сасеЕдеЕсеЕєсс ЕдадеЕСЕдьс сссддеєддад дсЕєсасасе аддаєсасьд 180 чаєєсааває дододдеЕСТтає аддеєсдЕсссс саасдддаєс сасссссдда асачаєсдаа 240 60 сааєсєсдаєсса адсааадаас адаадааьсе дсгаддааєс аддсааЕєеєс аадчаєєсодад Зоо чдадсеаадсу аєсеЕєвсаєаа дасстаєсдсс ададсдссса дсдаєсєсддда ддсадаєссд 3З6о асєааєссад саєсаадоада адааасдсудс асбсасааєссса асдасаєдаа Садесдстаєсс 420 й асаасуддсес ЕсссасесеЕсе гададееєсаа аастаєдаадч ЕСЕДСЕСЕЕСЕ асссдеесає 480 дЕєЄСсСаадсед сааасеєсаса ЄЕЄсаєссаєсс ссаададаєдд ССсСсадесссс соддадааада 540
Еддодасаєд абасадсаас Саєсаасаає соуоссагадесуд асеЕєаастад ссесаєссає 60 дЕЄсаєаста аєсаєєдеЕЧдеЕ ддаєасдабрає аассадоадає ЄааддсЯєес оддаадаєсає 6бо
ЕЕЄСЕвассу аєсоодаєсєдеЕ асаєагааєсує сЕСсСсдаадас аасєаасаає Ессадсаєта 720 й часаєєдеЕвд сасЕсесесс аааєсаєдає аєссдаасає аєссааєсеса аасадстасе 78о0 садссаасда доддааассса Сссддаєєса ссеЕЄевтаєта аєсдааааєст ЕЕсСЕССгдса 840 чдсаадсстаєс ссссаєссеЕс адасдссдаа адедсстасаа сСсаддадеЕсс Есастєсадвьд 900 чдасЕєееєсаа агадсеЕссас гаєєсараса дасадеЕСьЬск сеЕсдаваєєсе асаседодова 960 чадсаєсддд ЄдааєсеЕстас ссудєєсадда дЕсСастасеьє єсагасааєс ассассаєває 1020 7 чддаадддаад даааєдсада дсуєЕсСЕдса ассасеєссодд саєсаєсьад сдеассааєа 1080 гЕсадаасас ЄЕсССсСаваєдеЕ гасеєддссьс дасааєдсаа аєссєдсадс Еддааєсєеєдаа 1140
Зо чдчадеЕддаає Сссаааагас баєаадсада адсаєссаєс деаааадедда єссааєєдває 1200
ЕСЕ сааєд аасрассасс Есаадаєдсс адедваєсеЕс сеЕєСяаєсуд деаєадеЕсас 1260 сЯєЕсаєдес асдссасавє єсеадаасод аєсадеддас саадааєсддс аддеЕдеЕсвье 1320 7 гЕсеЕсСсвдда сасаєсдрад Едсбадсссєї ассааєдаад Єаадееєсаєс гадааєстаса 1380 саааєєссає дддсаааддс дсасасесссе дсудєсвЕддавєд ссеЕССдЕсає сааадддсесе 1440 чдчаєєсасад деЕддадаєає асеєаасвтадуд аасассссад дсдаассдда дассеЕсаада 1500 дЕаасЕєсвд саддаадаєсє ассасааацде Састававрас дЯдЕсЕССсСЯдЕса ЕдсЕЕСсага 1560
ЧдсЕааєсадда деЕддсасаєсе гадсвраєсса садссаасеє сасаєддаає ЕсСссЕСЕсСса 1620 7 ааававстаєдд аєдсадаєда ассаєєсааса ЕСЕСЧЯєЄЕСає сеЕдсасеЕсдс басасеЕсдсье 1680 асассдссаа сссЕсадаад дсаадаадаа Сгаааєстас аааєассаєс аддсасесає 1740 асачаєсдаа ЄСЕдадеЕсеЕдЕ Ессадессдає дааассєєса саасадааєс єдаєссодає 1800 ададсасаас аддсдуєдаа ЕдсдсЕдЕс асесссеЕссса аєсаааєсудд сЕсаааааса 1860 чаєдеЕдасудд аєсаєсаває єдаєсаадна Сссааєстад ЄддаєєдеЕсеЕ ассодаєдаа 1920 7 Есе деЕСвду аєдаааадсу адааєсдсєсс дадааадеса аасаєдсдаа дсдасеєсаде 1980 чаєдадсдда аєсвасссса адаєссааас сСЕсададдаа Есаасадаса ассадассде 2040 (516) чЧдаєЕддадад даадсасада баєсассаєс сааддаддад аєдасдаєбасє сааададаає 2100 басдєвсасас сассаддрас сЕсєдаєдад бдсвтаєссаа субаєєсаса єсааааааєа 2160 чаєдадеЕсда аасгаааадс ссаєасссує сассааєтсаа дадддеаває содддадаєбаде 2220 саадассвсад аааєссасєсє ааєссоаєсас аасодсаааас асдааасаде ааасдсасса 2280 чабасаддда дЕсСваєддас ЕСЕЄЕСсСЕдна дааааєссаа Еєддассьсд Еддадаассд 2340 ааєсдаєдсд сдссасассе Едааєддаає сссааєстад азеЕдеЕеєсьс сададаад9ад 2400 й чааавгаєдед сссаєсаєсс ссаєсарсєс сссеЕєддаса ЄЕДдаєсдсєду аєдеасадас 2460
Єгаааєдадда ассгаддеЕдЕ аєдддсдава сСЕСсаадаєса адасдсаада Еддссаєдса 2520 ачассаддаа аєссрададсє єсЕСдаадад ааассастає Єаддддаадс астадсеЕсде 2580 чЧЕЧчаааадад содадаадаа аєддададас ааасдсдааа аассддаасд ддааасааає 2640 аєєдЕсєвава аададдсааа адааєсєдса дасдсеЕстає єєдЕДдаасеіс Есааєаєдає 2700 7 ачаєсасаад сододасасудаа баєсдсдаєд аєссаєдсд садаєааасу сдЕеЕссагбада 2760 аєсададаад сасассєєсс адааєсаєсі деЕааєєссоду дЕдеаааєдс дддсасеЕсес 2820 чаачааєсад адддасдсає єсЕСсСасадсес СасеєЕссссає аєдаєдсдад аааєдесаєсе 2880 аааааєддсд авсеЕсааєаа ЕдЧдЕєсасьд содсеЕддаасе Єдаааддадса Едгадаєдка 2940 чдаадаасааа асаассаєсу Ессадессьс дЕсдссссодуд ааєдддаадс ададдєдесс Зоо щ саадаадесєс деЕдсссдЕсс аддеЕсудєддс багаєссьсс деЕдсвасадс дегасааадад З06о ччваєаєддад адддсеєдсЧдє аассаєсєссає дадасєсдаад асаасасада сдаассдааа 3120 сбЕСадсаасі деЕдсадаада ддаадсасає ссааасааса сддеаасоаєд Єааєсдаєсає 3180 асєдсдасес аадаадааса Єдадддеасд СасасеЕсєсеєс деЕааєсдадуач асаєсдасода 3240 дссраєдааа дсаасеєсьсс єдсассадсе даєсаєдсає садсссаєда адааааадсд 3300 7 басасадаєд даадаадада дааєссьсЧдс дааєстааса даддаєаєда ддаєстасдасд 3360 ссассассад ссддЕсаєдеЕ дасаааддаа Есададбрасе Есссадааас сдаєааддкеа 3420 бддаєєдада Ссддадааас ддааддааса СЕСасеєдеєдуа агадсдеєдда аєсасесессе 3480 аєгддаддаає аа 3492 «2105 4 «211» 1163 «212» Білок «213» Васії1їц5 Єпигіпдієепвів «4005 4
Меє сі б1у Авп Авп Гей Авп о біп Сув І1їе Рго Туг Авп Сув Іец 5бег 1 5 10 15 60
АвпоРго пув Авр І1е І1е Іїецп сі1у АвБр б1п Агд Гей бі ТПг с1у Авп
20 25 30
ТпПг Уаі1 Аза Авр І1ї1е ТПг Іец сіу Іїе Уаї АвБп Іїецй Іецй Рпе бек с1ци 35 40 45
Рпе Маї Ркго сіу біу б1у Рпе І1е Іец с1у Гей Гей Авр Гей І1їе Тгр 50 55 бо бі1у бек І1ї1е с1у Агуд Бек біп Тгр Авр гейш Рпе Гей сіц сбіп ІШе сі 65 70 75 80 біп Ттешп І1ї1е пув біп Агд Іїе сій бі Рпе Аза Агд АвБп біп Аза І1е 85 90 95 зек Акад Гей біц с1у Гей бек Авр Гей Туг Гув ТПг Туг Аїа Агуд А1їа 100 105 110
Рпе бек Авр Тгр б1цшц Аза АвБр Рго ТПг АБп о Рго Аза Гей Агд бій сій 115 120 125
Меє Агуд чІ1е біп Рпбе Авп Авр Меє Ап бег Аза І1їе чІ1їе ТПг Аїа Гей 130 135 140
Зо
Ркго Гец Робе Агд Уаі біп Авп Туг біц Маї Аїа Гей Гей бек Уа1 Туг 145 150 155 160
З5
Ууаї біп Аза Аїа Ап о Гец Нів Гей бБесг І1е Гей Агуд Авр Уа1і бек Уаї 165 170 175
Рпе с1у бій Агуд Тгр б1іу Туг Авр ТПг Аза ТПг І1е АвБп Ав5п Агд Туг 180 185 190 век Авр Гец ТПг бек Тецп І1їе Нів Уа1і Тук ТПг Авп Нів Сув Уа1і Авр 195 200 205
ТПгЕ Тук Авп о біп сіу Гец Агд Акд Гей біц б1у Акд Рпе Гей ТПг Авр 210 215 220
Тер Іїе Уа1 Туг Авп Агд Рпбе Агуд Агуд сбіп Гей ТПг І1їе бек Уаї Іей 225 230 235 240
Авр І1їе Уаії Аза Рбе Рпе Рго АвБп Туг Авр І1е Агуд ТПг Тугк Рго І1е 245 250 255 (516) сСіп ТБг Азїа ТрПг обіп Гей ТБг Агуд бій І1е Тук Гей Авр Гей Рго РІе 260 265 270
І1е Авп біц АвБп о Тец бек Рго Аїа Аза бек Тук Рго Бек РПе бБег Авр 275 280 285
Аза сій бек Аза І1е І1е Агуд бек Рго Ні Гей Уаі Авр РіПе Гей Авп 290 295 300 зек Рпе ТПг І1е Туг ТПг Авр бек Іец Аза Агуд Туг Гей Тугє Тер Щ1У 305 310 315 320 сі1у Нів Акуд Маі Авп Рібе ТПг Акуд бек б1у Уаї ТПг ТБг Рре І1е сіп 325 330 335 зек Рго Пец Тук б1у Акд бій б1у АБп Аї1а бій Агуд Бек Уаі І1е Пе 340 345 350 зек Аїа бек бек бек Уаі! Рго І1е Роре Агуд ТПг Гей бек Тук Уа1 ТЕГ 355 3З6о 365 сб1у Гей Авр АвБп Аза Ав5п Рго Уаі Аїа с1у Іїе сіц сіу Уаї бі РБе 370 375 380
Зо біп Авп о ТпПг о І1е Бек Агуд бек Іїе Туг Агуд Пув бек с1іу Рго І1е Авр 385 390 395 400 зек Рпе Авп бій Гей Рго Рго біп Авр Аза бек Уаі! бек Рго бек І1е 405 410 415 сбі1у Тук бек Нів Агуд Гей Сув Нів Аза ТПг Рпе Гей сій Агд І1е 5ег 420 425 430 б1у Рго Агд Іїе Аїа сіу Уа1 Уа1і Рпе Бек Тер ТПг Нібв Агд бег А1а 435 440 445 зек Рго ТПг АвБп обіц Уаї бек бек бек Агуд І1е ТПг сбіп І1їе Рго Тгр 450 455 460
Уаї пув Аїа Нів ТПг Ггец Аза бек сіу Аїа бек Уаі І1е ув с1Уу Рго 465 470 475 480 сі1у Рпе ТПкг сіу с1у Авр І1їе Гей ТПг Агуд Авп о ТПг Гей сіу сій Гей 485 490 495 бі1у ТПпг Гей Агуд Уаі ТПг Рпе Аза с1іу Агд Гей бек біп бек Тук Туг 60 500 505 510
І1е Агуд Робе Агуд Туг Аза бек Уаі Аза АБп Агуд бек с1у Іїе Ропе 5ег 515 520 525
Тук Бек біп Рго ТПг бек Тук сіу І1їе бек Рбе Рго Гув ТПг Меє Авр 530 535 540
А1а Авр сій бек Гей ТПг бек Агуд бек Рібе Аїа Гецш Аза ТПг Іецй А1а 545 550 555 560
ТПЕ Рго Гей ТПг Рбе Агд Агд сбіп бій біц Гец АвБп Те бі1іп І1е Рго 565 570 575 зек с1і1у ТПг Тук І1е АвБр Агуд І1е біш Рпе Уаі Рго Уаі АвБр бій ТЕГ 580 585 590
Рпе ТПг ТПг біц бек Авр Гей АБр Агд Аї1а біп сіп Аза Уаї АБп А1а 595 бо 605
Тецп Рпе ТПг бек Бек Ап біп Іїе с1іу Гей Ппув ТПг Авр Уаї ТПг Авр 610 615 620
Зо Тук Нів Іїе Авр біп Уаі! бек Авп Гецп Уаі Авр Сув Гей бек АБр б1ци 625 630 635 640
Рпе Сув Гец Авр о біц Гув Агуд біц ІТец бек бій Ппув Уа1ї Ппув Нів Аї1а
З5 645 650 655 пуб Агд Тецп бек Авр бій Агуд Авп Гей Гец біп Авр Рго АБп Рпе Агд 6бво 665 670 б1у І1е АБп Агуд біп Рго Авр Агуд сб1іу Тер Агуд с1іу бек ТіПг АБр І1е 675 68 685
ТПгЕ Іїе сіп сіу б1у Авр Авр Уаії Рпе Ппув бій Авп Тук Уаї Тік Іей 690 695 700
Рго с1у ТБкг Ррбе АвБр бій Сув Тук Рго ТПг Тукг Гей Тук сіп Гув І1е 705 710 715 720
Авр бій бек пув Тец Гуз Аза Туг ТПг Агуд Ту біп Гей Агд сіу Туг 725 730 735
І1е с1у Авр бек біп Авр їейп біц І1е Тук Іїейп Іїе Агуд Туг Авп Аї1а 740 745 750 60 пув Нів бій Іїе Уаі Авп Уа1і Рго сіу ТПг сіу Бек Гей Тгр ТПг Іей 755 760 765 зек Уаі бій Авп бек Іїе с1іу Рго Сув біу бій Рго Авп Акуд Сув А1а 770 775 780
Ркго Нів Гец біц Тер АБп о Рго АвБп о Тец б1іцп Сув бек Сув Агд бій Щ1У 785 790 795 800 бі гув Сув АТа Нів Нів бек Нів Нів РПе бек Гей Авр І1е Авр Уаї 805 810 815 сб1у Сув ТПг Авр Гей Авп бій Авр Ге сіу Уа1! Тгр Аїа І1е РПе Гу 820 825 830
ІТІе пув ТПг біп Авр б1у Нів Аза Агд Іїецйп б1у Авп Гей бій РПе Гей 835 840 845 січ бій пув Рго Гей Гей сіу біц Аїа еп Аза Акуд Уа1! Гув Агд А1а 850 855 860 бі ув Гпув Тер Агуд Авр о Гув Агуд бі Гпув Гей бій Тер бі ТЕ Авп
Зо 865 870 875 880
ІІе УМаї Тук пув біцшц Азїа Гуз біц бек Уаі Авр Аза Гей Ррпе Уа1і Авп 885 890 895
З5 зек біп Тут Авр Агд Іїеп сбіп Азї1а Авр ТПг АБп І1е Аїа Меє І1е Ні 900 905 910
Аза Аза Авр пуб Агд Уаі Нібв Агуд І1е Акд бій Аза Тук Гей Рго сіц 915 920 925
Тем бек УМаії Іїе Рго сіу Маі АвБп Аїа с1у Іїе Рпе сій сій Ге сі1ц 930 935 940 б1у Акд І1е Рпе ТПг Аїа Тук бек Гей Туг Авр Аза Агд АвБп Уаії! І1е 945 950 955 960
Тув Авп обіу Авр Рпе Авп Ап сіу Гей Гей Сув Тер Авп Гей пув 01У 965 970 975
Нів Уаі Авр Уаі біц біц біп Авп Авп Нібв Агуд бек Уаії Гей Уа1ї Уаї 980 9385 990 60
Рго бій Тер біц Азїа біц Уаї бек біп бій Уаі Акд Уаії Сув Рго щу
995 1000 1005
Акуд сб1і1у Тук Іїе гейш Акуд Уа! ТіПг Аза Тує їув бій с1у Ту 1У 1010 1015 1020 бі б1у Сув Уаі ТЕ І1е Ні5 сій Іїе бій Авр АБп о ТПг Ар с1ц 1025 1030 1035
Тецшп Гпув Рпе бБег Авп Сув Уаі бій бі бій УМаї Тук Рго Авп Авп 1040 1045 1050
ТпПг Уа1 ТпПг Сув Авп Авр Ту ТПг Аза ТПг біп бій бі Тук б1ц 1055 1060 1065 с1іу Тк Тук ТПг бек Агуд АБп о Агуд с1іу Туг Авр б1у Аїа Тук с1ц 1070 1075 1080 век Авп о Бек бек Уаі1 Рго Аіїа Авр Туг Аїа Бек Аіїа Тук бій с1ци 1085 1090 1095 пув Аїа Тук ТПг Авр о б1у Агд Агуд бій Авп о Рго Сув бій Бек Авп 1100 1105 1110
Зо
Акуд сб1у Тук с1іу Авр Туг Аза Рго їец Рго Аї1а бі1у Тук Уаї ТтТПг 1115 1120 1125
З5 пув бі Ггец біц Тук Рпбе Рго бій ТПг Авр пув Уаі Тгр Іе с1іц 1130 1135 1140
Іїе с01у бі ТПг сій с1у Тк Рбе І1е Уаії Авр бек Уаї бій Іец 1145 1150 1155
Тем Тїей Меє сій січ 1160 «2105 Мм5 «2115 2259 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» варіант МРОВОРІ, «4005 5 аєддааддса асаассєдаа ссадедсасс ссодбаєаасе дссеєдадсаа сссдааачває (216) аєвсаєєсьдоа дсдаєдаася Єсєддааасс ддсаасассд бддсддасбає сасссгсдддас 120 60 аєєдеЕдаасс ЄдсеЕдЕЄсад соаааєссдесд ссдддсддсу дсессасєссє доддсссдсгд 180 чаєсєЧчаєєсе доддсадсає єддссдсбадс садсдддасєс сДдЕссссдда асадаєсдаа 240 садссдаєсса аасадсдсбає Сдаадааєсс дсдсдсаасс аддсдаєстад ссдестодаа Зоо й чдассЕдадсу аєсєдсаєаа аасстаєсдсда сдсдсдаєссса дсдаєсєсддда адсдоддаєссд 3З6о ассаасссдд сдсЕєдсдеЕда адааасдсоає асссадссса асдасаєсдаа садсдсчасс 420 асстассдсудс ЕдссуссдЕЄє ЄсоєсдеЕдсад аастаєдаад ЄддсоудсеЕдсе дадсчдеєдсає 480 чЧЕдсаддсдд сдаассеєдса єсЕЧдадсасс ссдсоаєдаєдад сСдадсЯясдсс сддсдаасдаі 540
Едддодсвраєд асассдсдас саєєсаасаас сдссасадсуд асссдассад ссєдаєєссає 60 й ЧдЕДдЕаєсасса ассаєєдсЯає ддаєассстає аассадддес ЄдсаєЄсЯаєсеЕ дддааддадссає 6бо гЕєСЕєДЧдчасс аєєддваєєдеЕ десаєаассЯяє ЄСсСсЯєссЯаєсс адссдассає садсдодєсдсстд 720 часаєсдчєуд сЯессЕеЕсссс даасстаєдає аєєсдрасся асссдаєєса дассодсдасс 78о0 садссдассс десЕдаадсдса сСссддаєсьд ссдрєеєтсаєстра асдаааассє дадсссддасд 840 чдсдадстаєс сдассеЕсєсад содсоддсддаа адсдсдаєсєса ЄСссдагсадссс дсаєссдддаєд 900 7 чаєєсєєседа асадсеЕєсас саєєсасасс дасадссоддад сдсдаєссаєсдс дгсаєссддададес 960 чассаєсєдуд Єдаасадссе Есудбассддс ассассасса асседаєєсу гадсссддстд 1020
Зо баєдодссоєд ааддсаасас сдаасдєссу дсдассаєса ссдсдадссс дадсдедссд 1080 ав ссдва сссеЕдадсса баєсассддсе сеЕддаєааса дсаасссоадЕі ддсдддсаєє 1140 чааддсудєдд аасеЕссадаа сассаєвадс сусадсаєсє аєсудєаааад сддсссдаєе 1200 7 чаєадсеЕсєва дсдаасєсдсс дссдсаддає дсдадсудєда дсссддсдає сддассаєадс 1260 саєсдЕСьЬдЕ дссаєдсдас сЕЕссЕддаа сдбаєсадсуд дсссусубає сдсоддддсасс 1320 дЕДЕЄсадсе ддаасссаєсу гадсдсдадс ссдассаасу аадедадссс дадссддтаєє 1380 асссадаєєс садєдоддеЕдаа адсдсасасс ссддсдадсуд дсдсдадсудс даєссаааддс 1440 ссдддсЕЕса ссудсдудсда баєєседасс сдєаасадса Едддсдаасе доддсасссьд 1500 7 сдєЕдЕдассе Есассддсесуд ЕсЕдссдсад адсбаєсава Ессе сса сгаєдсдадс 1560 чЧдЕддсдаасс деЕадсудсас сЕЕєсЯдрсає адссадссдс сдадсвтаєду саєсадсеее 1620 ссдаааасса Єддаєдсоддда сддаассудссуд ассадссуба дсЕЕсдсодса гассассстд 1680 рЕсассссда ЄвассеЕсвад ссудєдсдсад даадааєєєсд аєсєднаває Есададсддас 1740
ЧдЕдбаваєвд аєсубаєсєда асеєвсаєьссду деЕдассдсда ссЕЕєєсдаадс ддааєаєдає 1800 7 сЕддаасучєд сдсадаааде ддєдаасусу ссдЕеЕЕсасса дсассаасса дсєдоддссед 1860 аааассдаєд Єдассудаєса саєсаєєдає садудєдадса ассеєддеЕддс дЕдсссдадс 1920 (516) чаєдааєсес дссеєддаєда аааасдєдаа седадсдааа аадесдаааса єдсдааасде 1980 сЕдадсдаєуд аасдеєаассеє дсеЕдсаддає ссудаасевєсєс дсддсаєсаа ссдесадссд 2040 чаєсдеЕддсЕ доасуєддсад сассдаваєе ассаєсєсадуда дсддсдаєда ЕДдЕДЕсСтааа 2100 чдаааасвтаєд Єдассссдсс дддсассеєєс даєсоаасдсе аєссдассса єСЕДдтгаєсад 2160 ааавєЕєдаєд ааадсааасе дааадсуєбає асссдєсаєс адседсдеЕдд ссасаєсеєдаа 2220 чаєадссадд аєсеЕддааає Есаєсєдавс суаєсвгаєаас 2259 «2105 6 «2115 753 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «220» «223» варіант МРОВОРІ, «4005 6
Меє сі б1у Авп Авп Гей Авп о біп Сув І1їе Рго Туг Авп Сув Іец 5бег 1 5 10 15
АвпоРго пув Авр І1е І1е Іїецп сі1у АвБр б1п Агд Гей бі ТПг с1у Авп 20 25 30
Зо Тпг Маі Аїа Авр І1їе ТПг Гецп сб1у Іїе Уаі Авп Гей Гец Роре бек с1ци
Рпе Маї Ркго сіу біу б1у Рпе І1е Іец с1у Гей Гей Авр Гей І1їе Тгр
З5 50 з9 бо сбі1у бек І1ї1е с1у Агуд Бек біп Тгр Авр гейш Рпе Гей сіц біп І1е с1ц 65 70 75 80 40 біп Ттешп І1ї1е пув біп Агд Іїе сій бі Рпе Аза Агд АвБп біп Аза І1е 85 90 95 45 зек Агд Гец біц біу Гей бек Авр ІТецй Тук Гув ТПг Туг Аїа Агуд Аї1а 100 105 110
Рпе бек Авр Тгр біц Аза Авр Рго ТПг Авп Рго Аїа Гей Агд бій с1ц 115 120 125
Меє Агуд І1е біп Рбе Авзп Авр Меє Авзп бег Аза І1е І1е ТПг Аза Гей 130 135 140
Ркго Гец Робе Агд Уаі біп Авп Туг біц Маї Аїа Гей Гей бек Уа1 Туг 145 150 155 160 60
Ууаї біп Аза Аза Ав5п Гей Нів Гей бек Іїе Гей Агуд Авр Уа! бек Уаї 165 170 175
Рпе с1у бій Агуд Тгр б1іу Туг Авр ТПг Аза ТПг І1е АвБп Ав5п Агд Туг 180 185 190 зек Авр Гец ТПг бек ІТецп І1ї1е Ні Уаї! Тук ТПг Авп Нів Сув Уа1 Авр 195 200 205
ТПгЕ Тук Авп о біп сіу Гец Агд Акд Гей біц б1у Акд Рпе Гей ТПг Авр 210 215 220
ТЕр Іїе Уа1 Туг Авп Агд Рпбе Агуд Агуд біп Тецй ТПг І1їе Бек Уаі1ї Іей 225 230 235 240
Авр І1їе Уаії Аза Рбе Рпе Рго АвБп Туг Авр І1е Агуд ТПг Тугк Рго І1е 245 250 255 сбіп ТБг Азїа ТрПг обіп Гей ТБг Акуд бій Уаї Тук Гей Авр Гей Рго Ріе 260 265 270
І1е Авп біц АвБп о Тец бек Рго Аїа Аза бек Тук Рго ТПг Ррпе бег Аї1а
Зо 275 280 285
А1їа сій бек Аїа І1е І1е Агуд бек Рго Ні ІГецй Уа1 Авр Ріе Гец Авп 290 295 300
З5 зек Рпе ТПг І1е Туг ТПг Авр бег Іец Аза Агуд Туг Аза Ту Тер 0Щ1У 305 310 315 320 бі1у Нів Гей Уаі Авп бек Рпе Агуд ТПг біу ТПг Тс Тс АБп Гей Ше 325 330 335
Агдуд Бек Рго ІТей Туг б1у Агд бій с1у Авп ТПг бі Агуд Рго Уа1! ТЕПг 340 345 350
І1е ТБг Аїа бек Ркго бек Уа! Рго Іїе Рпе Агуд ТПг Гец бег Туг І1е 355 360 365
ТП б1у Гей Авр Авп о бег АвБп Рго Уаі Аїа сіу І1е бі1іп с1у Уа1 с1и 370 375 380
Рпе біп Авп ТПг І1е бек Агуд Бек Іїе Туг Агуд Ппув бек б1іу Рго І1е 385 390 395 400 60
Авр Бек РіПе бек біц Тецй Рго Рго біп Авр А1ї1а бек Уа1і Бек Рго Аїа
405 410 415
ІІе сі1у Тук бек Нів Агд Гей Сув Ні Аза ТПг Рпе Гей бій Агд те 420 425 430 зек сіу Рго Акд І1е А1ї1а сі1у ТПг Уаії Рре бек Тгр ТПг Нів Агуд бег 435 440 445
А1а Бек Рго ТПг АвБп обіц Уаї бек Рго бек Агуд І1е ТПг сбіп І1е Рго 450 455 460
Тер Уа1 пув Аїа Нів ТПг ІТец Аїа бек біу А1ї1а бек Уаі І1е гув ЩУ 465 470 475 480
Рго с1у Рбе ТПг с1у б1у Авр І1їе Гей ТБг Агуд АБп бек Меє с1у с1іц 485 490 495
Тец б1у ТПпг Гей Агуд Уа1і ТПг Рпе ТПг с1у Агд Гей Рго біп бек Туг 500 505 510
Туг Іїе Акуд Рбе Агуд Туг Аза бек Уаі Аза АвБп Агд бек б1у ТПг РБІГе 515 520 525
Зо
Акуд Тук бек біп Рго Рго бек Туг біу І1е Бек Рпе Рго Ппув ТПг Меє 530 535 540
З5
Авр Аза с1у біц Ркго Іїецй ТПг бБег Агд бек Рпе Аза Нів ТПг ТПг Ієц 545 550 555 560
Рпе ТПг Ркго І1е ТПг Рре бек Агуд Аїа біп бій сбіц Рпе Авр Іецч Туг 565 570 575
І1е сіп бек біу Маї Тук І1їе АБр Акд І1е бій Рпе І1їе Рго Уа1 ТЕГ 580 585 590
Аза ТПг Робе сбіц Аза б1іцп Туг Авр Тец б1п Акуд Аїа сбіп пув Уа1! Уаї 595 бо 605
Ап Аза Ггецп Рібе ТПг бек ТПг АвБп обіп Гей сі1у Гей Ппув ТПг Авр Уаї 610 615 620
ТПЕ Авр Тук Нів І1їе Авр біп Уаі1! бек Авп їец Уаії Аза Сув Іеци 5ег 625 630 635 640 (516) Авр бій Рпе Сув Гей Авр бій пуб Агуд бій Темп бек біцш Ппув Уаї Тув 645 650 655
Нів Аїа пув Агд Гец бег Авр бій Агуд Авп о Гец ІТец біп Авр Рго Авп бо 665 670
Рпе Агуд сіу І1е АБп Агкуд біп Рго АвБр Агуд б1у Тгр Агуд с1у Бек ТЕПг 675 680 685
Авр І1ї1е ТПг І1е біп б1у б1у Авр Авр Уаі Рпе Ппув бій Авп Тук Уаї 690 695 700
ТП Гецп Рго с1у ТПг Рпе Авр бі Сув Тук Ркго ТПг Тук Гец Тук сіп 705 710 715 720
Тпув І1е Авр сій бек Ппув Гей пув Аїа Туг ТПг Агуд Туг біп Гей Агд 725 730 735 сбі1у Тук І1е сій Авр Бек біп Авр Гей бій Іїе Туг Гей І1е Агд Туг 740 745 750
Авп
Зо «2105 17 «2115 2259 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» варіант МРОВОРІ, «4005 17 асддааддса асаасссдаа ссадсдсаєє ссусаєсаасеЕ дссеЕдассаа сссдааадає (216) аєвсаєєсьдоа дсдаєдаася Єсєддааасс ддсаасассд бддсддасбає сасссгсдддас 120 аєгєєдеЕдаасс ЄдсеЕдеЕєвас сааєссдесд ссодддсоддсоа дсестаьєсеЕ доддсстдстд 180 чаєдеЕЧчаєєсє доддсадсає єддссдсадс садсдддаас СДЯсЕссссдда асадаєссдаа 240 садссдаєсса аасадсдсбає Сдаадааєсс дсдсдсаасс аддсдаєстад ссдестодаа Зоо чдассЕдадсуд аєссдеасаа аассстасдсу сочдєдсочаєсса дсдаєсоддда адсододаєссд 3З6о ассаасссдд сдсЕєдсдеЕда адааасдсоає асссадссса асдасаєсдаа садсдсчасс 420 аєсассдсдс ЕЄдссусЕдеЕЄ єСсЧдЕєдсдсад аассаєсдаад Сддсдоадссдсо дадсдадєдсає 480 чЧЕдсаддсдд сдаассеєдса єсЕЧдадсасс ссдсоаєдаєдад сСдадсЯясдсс сддсдаасдаі 540
Едддодсвраєд абассдсдас саєєсаасаас саєсаєсадсоа аєсєдассад ссєдаєєссає 60 (516) ЧдЕдвасасса ассаєєдсує ддасассстає аассадддсес ЄдсЧдєсЯаєсо ддааддсессдЧе 6бо гЕєСЕєДЧдчасс аєєддваєєдеЕ десаєаассЯяє ЄСсСсЯєссЯаєсс адссдассає садсдодєсдсстд 720 чавасєсєдчЧеЕдд се еєсс даастаєдає асссоаасассо асссдаєссса дассдсдасс 78о0 садссдассс дсдаадеЕдчеа ЕСсСддаєссд ссдєеєсаєса асдаааасся дадсссд9асд 840 чдсдадстаєс сдассеЕсєсад содсоддсддаа адсдсдаєсєса ЄСссдагсадссс дсаєссдддаєд 900 чаєєсєєседа асадсеЕєсас саєєсасасс дасадссоддад сдсдаєссаєсдс дгсаєссддададес 960 й чассаєсєдуд Єдаасадссе Есудбассуддс ассассасса асседаєеєсу гадсссддстд 1020
Баєддссудєд ааддсаасас сдаасдсссуд десдассаєсса ссдсдадссс дадсдсдссд 1080 агєеЕссєсдва ссседадсса баєсассддс сеЕддаєааса дсаасссояадЕ ддсдадсаєє 1140 чааддсудєдд аасеЕссадаа сассаєвадс сусадсаєсес аєссудєаааад соддсссдасе 1200 чаєадсеЕєсєва дсдаассдсс дссдсаддає дсдадсдеда дсссддсдає Еддстагадс 1260 7 саєсдЕСьЬдЕ дссаєдсдас сЕЕссЕддаа сдбаєсадсуд дсссусубає сдсоддддсасс 1320
ЧдЕДдЕєсадсе ддасссаєсу гадсудсдадс ссдассаасу аадеєдадссс дадссдатрацєе 1380 асссадаєреєс соосдододсдаа адсдсасасс сгддсдадсу дсдсдадсуає дассаааддс 1440 ссдддсЕЕса ссудсдудсда баєсєседасс сдєаасадса Едддсдаасе доддсасссьд 1500 сдаєЕдЕдадсеЕ Есассддсесуд ЕсЕдссдсад адсбаєсава Ессе сса сгаєдсдадс 1560 щ чЧдЕддсдаасс деассудсас сЕЕЕєсуєває адссадссдс сдадсвтаєду ссеЕдадсеке 1620 ссдаааасса бСддасдсддд сдаассудссд ассадссдтра дсЕсгдсдса гассассстд 1680
СЕсСассссда ЄвассеЕстад ссодєдсдсад даадчаасєсд аєсєдраває єсададсддсе 1740
ЧдЕдЕаваєвд аєсубсаєсєда асесаєьссду дЕдассдсда ссЕєєсдаадс ддааасаєдає 1800 сЕддаасуєд сдсадаааде ддЕдаасусу седЕесасса дсассаасса дсеЕдддссед 1860 7 аааассдаєд Єдассудаєса саєсаєєдає садудєдадса ассеєддеЕддс дЕдсссдадс 1920 чаєдааєеес дссеЕддаєда аааасдедаа сеЕдадсдааа аадедаааса Едсдааасдае 1980 сЕдадсдаєд аасдеаассє дсеєдсаддає ссдаасеЕєсс дсддсаєсаа ссддеЕСсадссд 2040 чаєсдеЕддсЕ доасуєддсад сассдаваєс ассаєсєсадуда дсддсдаєда ЕДдЕДЕсСтааа 2100 чаааагасваєд Єдасссєбдсс дддсассЕес даєдааєсдсеЕ аєссдассста ЕСЕДЯДгаєсад 2160 7 ааавВвєЕєдаєд ааадсааасе дааадсдбєає асссуєстаєс адседсдеєдда свтавгаєсдаа 2220 чаєадссадд аєсеЕддааає Есаєсєдарс суєстаєаас 2259 «2105 8 «2115 753 «212» Білок «2135 Штучна послідовність 60 «220»
«223» варіант МРОВОРІ, «4005 8
Меє біц б1у Авп Авп Гей АБп о біп Сув ІТїе Рго Туг Авп Сув Тем ТПг 1 5 10 15
АвпоРго пув Авр І1е І1е Іїецп сі1у АвБр б1п Агд Гей бі ТПг с1у Авп 20 25 30
ТпПг Уаі1 Аза Авр І1е ТПг Іец б1у Іїе Уаі Авп Гей Гей Робе ТПг сій 35 40 45
Рпе Маї Ркго сіу бі1у б1у Рпе І1е Іец сб1у Гей Гей Авр Уа1і І1е Тгр 50 55 бо сбі1у бек І1ї1е с1у Агуд Бек біп Тегр бій Гей Рпе Гей сіц біп І1е с1ц 65 70 75 80 сіп Гей І1е Ппув сбіп Акуд І1е біц бій Рбе Аїа Агуд АБп сбіп Аза Пе 85 90 95 зек Агд Гец біц біу Гей бек Авр ІТецй Тук Гув ТПг Туг Аїа Агуд Аї1а
Зо 100 105 110
Рпе бек Авр Тгр б1цшц Аза АвБр Рго ТПг АБп о Рго Аза Гей Агд бій сій 115 120 125
З5
Меє Агуд І1е біп Рбе Авзп Авр Меє Авзп бег Аза І1е І1е ТПг Аза Гей 130 135 140
Ркго Гец Робе Агд Уаі біп Авп Туг біц Маї Аїа Гей Гей бек Уа1 Туг 145 150 155 160
Уаї б1іп Аза Аза А5п Тецй Нів ІТецй бек Іїе Гей Агкуд Авр Уаї бек Уаї 165 170 175
Рпе с1у біц Агд Ткгр б1у Туг Авр ТПг Аза ТПг І1е АвБп А5п Агуд Туг 180 185 190 зек Авр Гец ТПг бек ІТецп І1ї1е Ні Уаї! Тук ТПг Авп Нів Сув Уа1 Авр 195 200 205
ТПгЕ Тук Авп о біп сіу Гец Агд Акд Гей біц б1у Акд Рпе Гей ТПг Авр 210 215 220 60
ТЕр Іїе Уа1 Тукг Авп Агуд Рбе Агуд Агуд біп їец ТПг І1е бек Уаїії Іецй
225 230 235 240
Авр І1їе Уаії Аза Рбе Рпе Рго АвБп Туг Авр І1е Агуд ТПг Тугк Рго І1е 245 250 255 біп Тпг Аза ТПпг обіп Гей ТБг Агуд бі Уа1! Тук Гей Авр Гец Рго РіПе 260 265 270
І1е Авп біц АвБп о Тец бек Рго Аїа Аза бек Тук Рго ТПг Ррпе бег Аї1а 275 280 285
Аза сій бек Аза І1е І1е Агуд бек Рго Ні Гей Уаі Авр РіПе Гей Авп 290 295 300 зек Рпе ТПг І1е Туг ТПг Авр бек Гей Аза Агуд Туг Аїа Туг Тегр 01Уу 305 310 315 320 бі1у Нів Гей Уаі Авп бек Рпе Агуд ТПг с1у ТПг Тбг Тс АвБп Іец І1е 325 330 335
Акуд Бек Рго Пец Тук б1у Акд біц б1у АБп ТПг бій Агуд Рго Уа1 ТЕГ 340 345 350
Зо
І1е ТБг Аїа бек Рго бек Уа! Рго І1е Рпе Агуд ТПг Гей бБег Тукг Іе 355 3З6о 365
З5
ТпПкЕ б1у Гей Авр Авп о бБег АвБп о Рго Уаі Аїа сб1у І1е сі с1у Уа1 сіц 370 375 380
Рпе сбіп Авп ТПг І1е бек Акуд бек І1їе Туг Агуд пуб бек с1у Рго І1е 385 390 395 400
Авр Бек РіПе бек біц Тец Рго Рго біп Авр А1ї1а бек Уаі бБег Рго А1а 405 410 415
ІІе сі1у Тук бек Нів Агд Гей Суб Нів Аза ТПг Рпе Гей бій Агд те 420 425 430 зек сіу Рго Акд І1е А1ї1а с1у ТПг Уаі! Рре бек Тер ТПг Нібв Агд 5ег 435 440 445
А1а Бек Рго ТПг АвБп обіц Уаї бек Рго бек Агд І1е ТПг сбіп І1е Рго 450 455 460 (516) Тер Маї Ппув Аїа Нів ТПг Гецп Аза бек с1у Аза бек Уаі Іїе Гуз Щ1У 465 470 475 480
Рго с1іу Робе ТПг бі1іу б1у Авр І1е Іецй ТПг Агуд Авп бек Меє с1у сіц 485 490 495
Тец б1у ТПпг Гей Агуд Уа1і бек Рбпе ТПг с1у Агд Іецй Рго біп бек Туг 500 505 510
Туг Іїе Акуд Рбе Агуд Туг Аза бек Уаі Аза АвБп Агд ТПг б1у ТПгс РБе 515 520 525
Агуд Тук бек біп Рго Рго бек Тук біу Гей бек Рпе Ркго Пув ТПг Меє 530 535 540
Авр Аза с1у біц Ркго Іїецй ТПг бБег Агд бек Рпе Аза Нів ТПг ТПг Ієц 545 550 555 560
Рпе ТПг Рго І1е ТПг Рпе бек Агуд Аїа біп бій сій Рпе Ар Гей Туг 565 570 575
І1е сіп бек біу Маї Тук І1їе АБр Акд І1е бій Рпе І1їе Рго Уа1 ТЕГ 580 585 590
Зо
Аза ТПг Робе сбіц Аза б1іцп Туг Авр Тец б1п Акуд Аїа сбіп пув Уа1! Уаї 595 бо 605
Авп о Аїа Гей Рібе ТПг бек ТПг Авп сбіп Те с1у Гецп Ппув ТПг Авр Уаї 610 615 620
ТПЕ Авр Тук Нів І1їе Авр біп Уаі1! бек Авп їец Уаії Аза Сув Іеци 5ег 625 630 635 640
Авр сій Рбе Сув Гец Авр біцпц пув Агуд біц Тец бек бій Ппув Уа1ї Гув 645 650 655
Нів Аїа пув Агд Гец бег Авр бій Агуд Авп о Гец ІТец біп Авр Рго Авп 6бво 665 670
Рпе Агуд сіу І1е АБп Агкуд біп Рго АвБр Агуд б1у Тгр Агуд с1у Бек ТЕПг 675 68 685
Авр чІ1е ТПг Ії1е сбіп сіу с1у Авр Авр Уа1і Рпе пуб бій Авп Туг Уаї 690 695 700
ТПЕ Гей Рго сіу ТПг Рбе Авр сій Сув Тук Рго ТПг Тук Іеч Тук сіп (516) 705 710 715 720
Тпув І1е Авр сій бек Ппув Гей пув Аїа Туг ТПг Агуд Туг біп Гей Агд 725 730 735 сбі1у Тук І1е сій Авр Бек біп Авр Гей бій Іїе Туг Гей І1е Агд Туг 740 745 750
Авп «2105 19 «2115 2259 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» варіант МР5ВОРІ, «4005 9 аєддааддса асаассєдаа ссадедсасс ссдбасаасс дсссдассаа сссдааадає (216) асстаєссьодд дсдаєдаасу СсеЕддааасс ддсаасассду гддсодасає сассстгдддс 120 аєєдеЕдаасс ЄдсеЕдЕЄєсас соаааєссдсд ссдддсддсу дсессасєссє доддсссдсгд 180 чаєдеЕЧчаєєсє доддсадсає єддссдсадс садсдддаас СДЯсЕссссдда асадаєссдаа 240 щ садссдаєсса аасадсдбає ЄдаєсдаєєсеєЕ дсдсдраасс аддсдаєтад ссдестсддаа Зоо чдассЕдадсу аєсєдсаєаа аасстаєсдсда сдсдсдаєссса дсдаєсєсддда адсдоддаєссд 3З6о ассаасссодд содссдсудєЄда адаааєдсує агєсадеЕсса асдаєсаєдаа садсдсчЧдасєсе 420 аєсассдсдс ЕЄдссусЕдеЕЄ єСсЧдЕєдсдсад аассаєсдаад Сддсдоадссдсо дадсдадєдсає 480 чЧЕдсаддсдд сдаассеєдса єсЕЧдадсаєє седсодєсдаєдад ЄСдадсЯясЯдсс сддсдаасдаі 540 7 Едддодсвраєд асассдсдас саєєсаасаас сдссасадсуд асссдассад ссєдаєєссає 60 чЧдЕДдЕаєасса ассаєєдсЯає ддаєасссаєс аассадддес бдсоаєссдЯссо ддааддссдаі 6бо
ЕсЕСЄєДдассо аєсодчассдеЕ деасаассує ЄЕЄСЯєЄСсСЯєЄсС адсеєдассає Садсодєдссд 720 чавасєдЧеЕдд сс еєсс даастаєдає асссдабассо асссдаєсса дассдсдасс 78о0 садссдассс десЕдаадсдса сСссддаєсьд ссдрєеєтсаєстра асдаааассє дадсссддасд 840 7 чдсдадстаєс сдассеЕсєсад содсоддсддаа адсдсдаєсєса ЄСссдагсадссс дсаєссдддаєд 900 чаєєєвсаєвса асадсеЕєвсас саєєсасасс дасадссоддад сдсдаєссаєсдс дгсаєссддададес 960 дассаєссду Єдаасадссе Есдсассуддс ассассасса ассєдаєсєсяа гадсссоастд 1020
Баєддссудєд ааддсаасас сдаасдсссуд десдассаєсса ссдсдадссс дадсдсдссд 1080 ав ссдва сссеЕдадсса баєсассуддс седдаєсааса дсаасссоадЕ дасоаодасаєсе 1140 7 чааддсудєдд аасеЕссадаа сассаєвадс сусадсаєсє аєсудєаааад сддсссдаєе 1200 чаєадсеЕєсєва дсдаассдсс дссдсаддає дсдадсдеда дсссддсдає Еддстагадс 1260 саєсдЕСсСьЬдЕ дссаєдсдас сЕєссЕддаа сдбаєсадсуд дсссодсддрає Едсдддсасес 1320
ЧдЕДдЕєсадсе ддасссаєсу гадсдсдадс ссдассаасу аадедадссс дадссдатраєе 1380 асссадаєєс садєдоддеЕдаа адсдсасасс ссддсдадсуд дсдсдадсудс даєссаааддс 1440 ссдддсЕЕєса ссододсддсда баєєссьєдасс судєаасадса єдоадсдаасо доадсасссед 1500 сдаєЕдЕдадсеЕ Есассддсесуд ЕСсЕдссдсад адсбаєсава Ессе сса сгаєдсдадс 1560 чЧдЕддсдаасс деассудсас сЕЕєсЯдрсає адссадссдс сдадсвтаєду ссеЕдадсеке 1620 ссдаааасса бСддасдсддд сдаассудссд ассадссдтра дсЕсгдсдса гассассстд 1680 рЕсассссда свассеЕстад ссдеЕдсудсад даадааєєстдд аєссдсасає ссададсддс 1740 дЕЯДєасаєвєуд аєсосасєда асеєсаєєссу деЕдассдсда ссЕєсдаадс додаатєаєдає 1800 сЕддаасуєд сдсадаааде ддЕдаасусу седЕесасса дсассаасса дсеЕдддссед 1860 аааассдаєд Єдассудаєса Єсаваєєдає саддєдадса ассеЕддсддс дЕДдссеЕдадс 1920 чаєдааєеес дссеЕддаєда аааасдедаа сеЕдадсдааа аадедаааса Едсдааасдае 1980 сЕдадсдаєуд аасдеєаассеє дсеЕдсаддає ссудаасевєсєс дсддсаєсаа ссдесадссд 2040
Зо чаєсдєЕддсс доасодсддсад сассдаваєс ассасєсадуда дсддсдаєда ЄЕдДдЕДЕСЕтааа 2100 чаааагасваєд Єдасссєбдсс дддсассЕєс даєдааєсдсеЕ аєссдассста ЕСЕДЯДгаєсад 2160 ааавєЕєдаєд ааадсааасе дааадсуєбає асссдєсаєс адседсдеЕдд ссасаєсеєдаа 2220
З5 чаєадссадд аєсеЕддааає Есаєсєдарс суєстаєаас 2259 «2105 10 40 «2115 753 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «220» 45 «223» варіант МР5ВОРІ, «4005 10
Меє сі б1у Авп Авп Гей Авп о біп Сув І1їе Рго Туг Авп Сув ТГецп ТПг 50 1 в) 10 15
Авп оРго пув Авр І1е І1е Іецйп с1іу АвБр б1цш Агд Те сій ТПг С1у Авп 20 25 30 55
ТпПг Уаі1 Аза Авр І1ї1е ТПг Іец сіу Іїе Уаї АвБп Іїецй Іецй Рпе ТПг сі1ци 60
Рпе Маї Ркго сіу бі1у б1у Рпе І1е Іец б1у Гей Гей Авр Уаї І1е Тгр
50 55 бо сбі1у бек І1ї1е с1у Агуд Бек біп Тгр бій гейш Рпе Гей сіц біп І1е с1ц 65 70 75 80 біп Гей І1е пув сбіп Агуд Іїе Авр Авр Рпе Аза Агд АБп біп Аза Ше 85 90 95 зек Агд Гец біц біу Гей бек Авр ІТецй Тук Гув ТПг Туг Аїа Агуд Аї1а 100 105 110
Рпе бек Авр Тгр б1іцш Аза АвБр Рго ТПг Ав5п Рго Аза Гей Агд сбіц бій 115 120 125
Меє Агуд І1їе сбіп Рбе Авп Авр Мес АБп бек Аза Ії1е І1е ТПг Аїа Гей 130 135 140
Ркго Гей Робе Агд Уаі біп Авп Ту бі Уаі Аїа Гей Гей бек Уа1ї! Туг 145 150 155 160
Ууаї біп Аза Аза Ав5п Гей Нів Гей бек Іїе Гей Агуд Авр Уа! бек Уаї 165 170 175
Зо
Рпе с1у біц Агд Ткгр б1у Туг Авр ТПг Аїа ТПг І1е АвБп А5п Агд Туг 180 185 190
З5 зек Авр Гец ТПг бек ІТецп І1ї1е Ні Уаї! Тук ТПг Авп Нів Сув Уа1 Авр 195 200 205
ТПЕ Тук Авп сбіп біу Гец Агуд Агд Гецп сій с1у Акуд Рбе Гей ТПг Авр 210 215 220
ТЕр Іїе Уа1 Тукг Авп Агуд Рбе Агуд Агуд біп їец ТПг І1е бек Уаїії Іецй 225 230 235 240
Авр І1їе Уаії Аза Рбе Рпе Рго АвБп Туг Авр І1е Агуд ТПг Тугк Рго І1е 245 250 255 біп Тпг Аза ТПпг обіп Гей ТБг Агуд бі Уа1! Тук Гей Авр Гец Рго РіПе 260 265 270
І1е Авп біц АвБп о Тец бек Рго Аїа Аза бек Тук Рго ТПг Ррпе бег Аї1а 275 280 285 (516) А1ї1а сій бек Аїа І1е І1їе Агуд Бек Рго Нів ІТецй Уаі Авр Рпе І1е Авп 290 295 300 зек Рпе ТПг І1е Туг ТПг Авр бег Іец Аза Агуд Туг Аза Ту Тер 0Щ1У 305 310 315 320 бі1у Нів Гей Уаі Авп бек Рпе Агуд ТПг с1у ТПг Тбг Тс АвБп Іец І1е 325 330 335
Акуд Бек Рго Пец Тук б1у Акд біц б1у АБп ТПг бій Агуд Рго Уа1 ТЕГ 340 345 350
І1їе ТПг Аїа бек Рго бек Уаі Рго І1їе Рбе Агу ТПг Гей бек Туг І1е 355 3З6о 365
ТП б1у Гей Авр Авп о бег АвБп Рго Уаі Аїа сіу І1е бі1іп с1у Уа1 с1и 370 375 380
Рпе біп Авп ТПг І1е бек Агуд бек І1е Туг Агд Ппув Бек с1у Рго І1е 385 390 395 400
Авр Бек РіПе бек біц Тецй Рго Рго біп Авр А1ї1а бек Уа1і Бек Рго Аїа 405 410 415
Зо
ІІе сі1у Тук бек Нів Агд Гей Суб Нів Аза ТПг Рпе Гей бій Агд те 420 425 430
Ззек б1у Рго Агуд І1е Аїа сіу ТПкг Уаії Рібе бек Тгр ТПг Нів Акд 5ег 435 440 445
А1а Бек Рго ТПг АвБп обіц Уаї бек Рго бек Агд І1е ТПг сбіп І1е Рго 450 455 460
Тер Уа1 пув Аїа Нів ТПг ІТец Аїа бек біу А1ї1а бек Уаі І1е гув ЩУ 465 470 475 480
Рго с1іу Робе ТПг бі1іу б1у Авр І1е Іецй ТПг Агуд Авп бек Меє с1у сіц 485 490 495
Тец б1у ТПпг Гей Агуд Уа1і бек Рпе ТПг с1у Агд Гей Рго біп бек Туг 500 505 510
Тук Іїе Агуд Рпе Агу Туг Аза бек Уаі Аза Авп Агуд ТПг с1у ТПкК РБре 515 520 525
Акуд Тук бек біп Рго Рго бек Тук біу Гей бек Рпе Рго Ппув ТПг Меє (516) 530 535 540
Авр Аза с1і1у біц Ркго Іїецй ТПг бБег Агд бек Рпе Аза Нів ТПг ТіПг Іей 545 550 555 560
Рпе ТПг Рго І1е ТПг Рре бег Агд Аї1а біп бій сій Рпе Ар Гей Туг 565 570 575
І1їе сіп бек сбіу Маії Тук Іїе Авр Акуд І1е бій Рпе І1е Рго Уаї Тіг 580 585 590
Аза ТПг Робе сбіц Аза б1іцп Туг Авр Тец б1п Акуд Аїа сбіп пув Уа1! Уаї 595 бо 605
Ап Аза Гей Рібе ТПг бек ТПг Авп обіп Ге сіу Гей пуб ТПг Авр Уаї 610 615 620
ТПЕ Авр Тук Нів І1їе Авр біп Уаі1! бек Авп їец Уаії Аза Сув Іеци 5ег 625 630 635 640
Авр сій Рбе Сув Іец Авр бій пув Агуд бі Гей бек біц Гуз Уаї Гув 645 650 655
Зо Нів Аза Ппув Акуд Гей бБег Авр бі1ц Агд Ап Гей Тецй сбіп Авр Рго Авп 6бво 665 670
Рпе Агуд біу І1е АБп Агкд біп Рго Авр Агуд сб1іу Тер Агуд біу бек ТЕПг 675 680 685
Авр І1ї1е ТПг І1е біп б1у б1у Авр Авр Уаі Рпе Ппув бій Авп Тук Уаї 690 695 700
ТПЕ Гей Рго сіу ТПг Рбе Авр біцш Сув Тук Ркго ТПг Тук Іеч Тук сіп 705 710 715 720
Тпув І1е Авр сій бек Ппув Гей пув Аїа Туг ТПг Агуд Туг біп Гей Агд 725 730 735 сіу Тук І1ї1е бій Авр бек біп Авр тей сбіцш Іїе Тук Гей І1е Агд Туг 740 745 750
Авп

Claims (21)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, вибрана із групи, що складається 3: (а) молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що 60 складається з 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 7 та 5ЕО ІЮО МО: 9, або комплементарну їй послідовність повної довжини;
(б) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 8 та ЗЕО ІЮ МО: 10; (с) молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, який містить амінокислотну послідовність яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 8 та 5ЕО ІЮ МО: 10; та (4) молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, де вказаний білок є біологічно активним варіантом білка, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІО МО: 2, і послідовність вказаного варіанта відрізняється від 5ЕО ІЮО МО: 2 1-3 амінокислотними залишками.
2. Виділена молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де вказана нуклеотидна послідовність являє собою синтетичну послідовність, що була сконструйована для експресії в рослині.
3. ДНК-конструкція, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1.
4. ДНК-конструкція за п. З, яка додатково містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує гетерологічний поліпептид.
5. Клітина-хазяїн, яка містить ДНК-конструкцію за п. 3.
6. Клітина-хазяїн за п. 5, яка являє собою бактеріальну клітину.
7. Клітина-хазяїн за п. 5, яка являє собою рослинну клітину.
8. Трансгенна рослина, яка містить клітину-хазяїна за п. 7.
9. Трансгенна рослина за п. 8, де вказана рослина вибрана з групи, що складається з маїсу, сорго, пшениці, капусти, соняшника, томата, хрестоцвітих, різновидів перцю, картоплі, бавовнику, рису, сої, цукрового буряка, цукрової тростини, тютюну, ячменю та олійного ріпаку.
10. Трансформована насінина рослини за п. 9, де насінина містить ДНК-конструкцію.
11. Виділений поліпептид, вибраний із групи, що складається 3: (а) поліпептиду, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 2, БЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 8 та 5ЕО ІЮО МО: 10; (б) поліпептиду, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що складається з ЗЕО ІО МО: 1, 5ЕО І МО: 3, 5БЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 7 та ЗЕО ІЮ МО: 9; (с) послідовності поліпептиду, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 8 та 5ЕО ІЮ МО: 10; та (4) біологічно активного варіанта білка, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2, і послідовність вказаного варіанта відрізняється від ЗЕБЕО ІО МО: 2 1-3 амінокислотними залишками.
12. Інсектицидна композиція, яка містить поліпептид за п. 11.
13. Композиція за п. 12, де вказана композиція вибрана з групи, що складається з порошку, дусту, пелети, гранули, розпилюваного розчину, емульсії, колоїдної речовини та розчину.
14. Композиція за п. 13, де вказана композиція одержана шляхом висушування, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, осадження або концентрування культури клітин Васійив Іпиппдіепвів.
15. Композиція за п. 13, яка містить від 1 до 99 95 за вагою вказаного поліпептиду.
16. Спосіб контролю популяції лускокрилого або твердокрилого шкідника, який передбачає згодовування вказаній популяції пестицидно ефективної кількості поліпептиду за п. 11.
17. Спосіб знищення лускокрилого шкідника, який передбачає згодовування вказаному шкіднику пестицидно ефективної кількості поліпептиду за п. 11.
18. Спосіб одержання поліпептиду з пестицидною активністю, який передбачає культивування клітини-хазяїна за п. 5 в умовах, за яких експресується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, причому вказаний поліпептид вибраний із групи, що складається з: (а) поліпептиду, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що складається з ЗБО ІО МО: 1, 5ЕБЕО ІЮ МО: 3, 5БО ІЮО МО: 5, 5ЕБО І МО: 7 та 5ЕО ІЮО МО: 9, або комплементарною їй послідовністю повної довжини; (Б) поліпептиду, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 2, БЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 8 та 5ЕО ІЮО МО: 10; (с) послідовності поліпептиду, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 8 та 5ЕО ІЮ МО: 10, де поліпептид має інсектицидну активність; та (4) біологічно активного варіанта білка, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2, і послідовність вказаного варіанта відрізняється від ЗЕБЕО ІО МО: 2 1-3 амінокислотними (516) залишками.
19. Рослина зі стабільно вбудованою в її геном ДНК-конструкцією, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, який має пестицидну активність, де вказана нуклеотидна послідовність вибрана з групи, що складається 3: (а) молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 7 та 5ЕО ІЮО МО: 9, або комплементарну їй послідовність повної довжини; (б) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 8 та 5ЕО ІЮ МО: 10; (с) молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, який містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 8 та 5ЕО ІЮ МО: 10; та (4) молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, де вказаний білок є біологічно активним варіантом білка, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІО МО: 2, і послідовність вказаного варіанта відрізняється від 5ЕО ІЮО МО: 2 1-3 амінокислотними залишками, де поліпептид має інсектицидну активність; де вказана нуклеотидна послідовність функціонально пов'язана з промотором, який керує експресією кодувальної послідовності в рослинній клітині.
20. Рослина за п. 19, де вказана рослина являє собою рослинну клітину.
21. Спосіб захисту рослини від лускокрилого шкідника, який передбачає введення у вказану рослину або її клітину щонайменше одного вектора експресії, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує пестицидний поліпептид, де вказана рослина продукує згаданий пестицидний поліпептид, що має інсектицидну активність щодо лускокрилого шкідника, і де вказана нуклеотидна послідовність вибрана з групи, що складається з: (а) молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 7 та 5ЕО ІЮО МО: 9, або комплементарну їй послідовність повної довжини; Зо (б) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 6, ЗЕО ІО МО: 8 та ЗЕО ІЮ МО: 10; (с) молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, який містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 8 та 5ЕО ІО МО: 10; та (4) молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, де вказаний білок є біологічно активним варіантом білка, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІО МО: 2, і послідовність вказаного варіанта відрізняється від 5ЕО ІЮ МО: 2 1-3 амінокислотними залишками.
UAA201704588A 2014-10-16 2015-10-09 Інсектицидний поліпептид проти лускокрилого або твердокрилого шкідника та його застосування UA124757C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462064848P 2014-10-16 2014-10-16
PCT/US2015/054869 WO2016060949A1 (en) 2014-10-16 2015-10-09 Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124757C2 true UA124757C2 (uk) 2021-11-17

Family

ID=55747163

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201704588A UA124757C2 (uk) 2014-10-16 2015-10-09 Інсектицидний поліпептид проти лускокрилого або твердокрилого шкідника та його застосування

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10480008B2 (uk)
EP (1) EP3207126A4 (uk)
CN (1) CN106852153B (uk)
BR (1) BR112017007818B1 (uk)
CA (1) CA2963550A1 (uk)
MX (1) MX369364B (uk)
PH (1) PH12017500665A1 (uk)
RU (1) RU2750459C2 (uk)
UA (1) UA124757C2 (uk)
WO (1) WO2016060949A1 (uk)
ZA (1) ZA201702168B (uk)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8839920B2 (en) 2008-04-17 2014-09-23 Levant Power Corporation Hydraulic energy transfer
EP3954202A1 (en) * 2016-07-01 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
WO2019178042A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
CA3092075A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
CN108795975B (zh) * 2018-07-04 2021-10-22 中国农业科学院油料作物研究所 野生大豆相关蛋白在提高植物抗虫性中的应用
US20230235352A1 (en) 2020-07-14 2023-07-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0192319B1 (en) 1985-01-22 1992-07-15 Mycogen Corporation Cellular encapsulation of biological pesticides
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US4853331A (en) 1985-08-16 1989-08-01 Mycogen Corporation Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene toxic to beetles of the order Coleoptera
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
EP0647711B1 (en) 1988-09-06 2003-06-04 Bayer BioScience N.V. Plants transformed with a DNA sequence from bacillus thuringiensis lethal to lepidoptera
US5039523A (en) 1988-10-27 1991-08-13 Mycogen Corporation Novel Bacillus thuringiensis isolate denoted B.t. PS81F, active against lepidopteran pests, and a gene encoding a lepidopteran-active toxin
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
EP0400246A1 (en) 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Prevention of Bt resistance development
US5188960A (en) * 1989-06-27 1993-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5246852A (en) 1989-06-27 1993-09-21 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
ES2187497T3 (es) 1990-04-12 2003-06-16 Syngenta Participations Ag Promotores preferentemente en tejidos.
ATE212667T1 (de) 1990-04-26 2002-02-15 Aventis Cropscience Nv Neuer bacillusthuringsiensis stamm und sein für insektentoxin kodierendes gen
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
CA2051562C (en) 1990-10-12 2003-12-02 Jewel M. Payne Bacillus thuringiensis isolates active against dipteran pests
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
KR100241117B1 (ko) 1991-08-02 2000-02-01 코헤이 미쯔이 신규한 미생물 및 살충제
DE69230290T2 (de) 1991-08-27 2000-07-20 Novartis Ag, Basel Proteine mit insektiziden eigenschaften gegen homopteran insekten und ihre verwendung im pflanzenschutz
CA2112999C (en) 1991-10-04 2007-04-24 Mark A. Conkling Pathogen-resistant transgenic plants
TW261517B (uk) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
JPH07501701A (ja) 1991-12-04 1995-02-23 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
US5273746A (en) 1992-01-29 1993-12-28 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates active against phthiraptera pests
US5428148A (en) 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
US5401836A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Pioneer Hi-Bre International, Inc. Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression
AU670316B2 (en) 1992-07-27 1996-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of (agrobacterium)-mediated transformation of cultured soybean cells
DE69333025T2 (de) 1992-11-17 2004-04-29 E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington Für mikrosom delta 12 fettsäuredesaturase kodierende gene und verwandte enzyme von pflanzen
CA2127807A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 John Maliyakal Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
EP0745126B1 (en) 1993-01-13 2001-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. High lysine derivatives of alpha-hordothionin
US5583210A (en) 1993-03-18 1996-12-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for controlling plant development
US5849870A (en) 1993-03-25 1998-12-15 Novartis Finance Corporation Pesticidal proteins and strains
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
US5530195A (en) 1994-06-10 1996-06-25 Ciba-Geigy Corporation Bacillus thuringiensis gene encoding a toxin active against insects
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US5736514A (en) 1994-10-14 1998-04-07 Nissan Chemical Industries, Ltd. Bacillus strain and harmful organism controlling agents
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
WO1996038563A1 (en) 1995-06-02 1996-12-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. HIGH METHIONINE DERIVATIVES OF α-HORDOTHIONIN
BR9609200A (pt) 1995-06-02 1999-05-11 Pioneer Hi Bred Int Derivados de alta treonina de alpha-hordotionina
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
US5981722A (en) 1995-11-20 1999-11-09 Board Of Regents For The University Of Oklahoma Trypsin inhibitors with insecticidal properties obtained from PENTACLETHRA MACROLOBA
US5703049A (en) 1996-02-29 1997-12-30 Pioneer Hi-Bred Int'l, Inc. High methionine derivatives of α-hordothionin for pathogen-control
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
JP3441899B2 (ja) 1996-11-01 2003-09-02 理化学研究所 完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成方法
US6232529B1 (en) 1996-11-20 2001-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
DE69841438D1 (de) 1997-11-18 2010-02-25 Pioneer Hi Bred Int Mobilisierung eines viralen genoms aus t-dna durch ortsspezifische rekombinationssysteme
CA2306184C (en) 1997-11-18 2007-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for genetic modification of plants
ATE317440T1 (de) 1997-11-18 2006-02-15 Pioneer Hi Bred Int Neuartige methode zur integration von fremd-dna ins eukaryotische genom
CA2309719A1 (en) 1997-11-18 1999-05-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of genes in plants
WO1999043819A1 (en) 1998-02-26 1999-09-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Family of maize pr-1 genes and promoters
DE69933713T2 (de) 1998-02-26 2007-08-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mais alpha-tubulin 3-18 Promoter
EP1080197A2 (en) 1998-05-22 2001-03-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cell cycle genes, proteins and uses thereof
EP1104469B1 (en) 1998-08-20 2005-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters
AU5788299A (en) 1998-08-28 2000-03-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters from (end) genes
US6518487B1 (en) 1998-09-23 2003-02-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof
US6489542B1 (en) * 1998-11-04 2002-12-03 Monsanto Technology Llc Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids
WO2000028058A2 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activator lec1 nucleic acids, polypeptides and their uses
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
US6858778B1 (en) 2000-11-07 2005-02-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plants transformed with a DNA construct comprising a nucleic acid molecule encoding an 18 kD α-globulin
US7009087B1 (en) 2000-12-01 2006-03-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for altering the disulfide status of proteins
US20040091505A1 (en) 2002-06-26 2004-05-13 E.I Du Pont De Nemours And Company Genes encoding proteins with pesticidal activity
US7462760B2 (en) 2002-06-26 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use
US7449552B2 (en) * 2006-04-14 2008-11-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis cry gene and protein
CA2711440C (en) * 2008-01-10 2015-02-24 Andre R. Abad Bacillus thuringiensis gene with coleopteran inhibitory activity
US8269069B1 (en) * 2008-07-30 2012-09-18 Dow Agrosciences, Llc Modified Bacillus thuringiensis cry proteins that inhibit coleopterans
BR112012011222A2 (pt) * 2009-11-12 2015-09-15 Pioneer Hi Bred Int molécula de ácido nucleico isolada, contruto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição e métodos para controlar uma população de praga de lepidópteros, para matar uma praga de lepidóptero e para proteger uma planta contra uma praga
AU2012214420B2 (en) * 2011-02-11 2017-03-02 Monsanto Technology Llc Pesticidal nucleic acids and proteins and uses thereof
EP2698379A4 (en) * 2011-03-18 2015-04-29 Shanghai Inst Biol Sciences INSECTROSIVE PREPARATION AND METHODS BASED ON RNAI TECHNOLOGY
AR090274A1 (es) * 2012-03-08 2014-10-29 Athenix Corp Gen de la toxina axmi335 de bacillus thuringiensis y sus metodos de empleo
CN112400900A (zh) 2012-03-09 2021-02-26 韦斯塔隆公司 毒肽产生、植物中的肽表达和富含半胱氨酸的肽的组合
CA2886787A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 Dow Agrosciences Llc Use of cry1ea in combinations for management of resistant fall armyworm insects
US10077171B2 (en) * 2012-10-17 2018-09-18 Grant C. Chustz Safety barrier for vehicles and cranes
RU2020105862A (ru) 2013-03-07 2020-02-28 Атеникс Корп. Гены токсинов и способы их применения
CN103333230B (zh) 2013-07-09 2016-02-17 福建农林大学 苏云金芽孢杆菌基因cry1Da3及其应用
AR099800A1 (es) 2014-03-21 2016-08-17 Agrigenetics Inc Cry1d para controlar el gusano de la mazorca del maíz
CN104673706B (zh) 2014-12-20 2018-03-06 东北农业大学 苏云金芽胞杆菌fh21、杀虫基因，表达蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017116797A (ru) 2018-11-16
CN106852153A8 (zh) 2017-07-14
RU2017116797A3 (uk) 2018-12-13
CN106852153A (zh) 2017-06-13
BR112017007818B1 (pt) 2022-12-13
ZA201702168B (en) 2018-05-30
RU2750459C2 (ru) 2021-06-28
EP3207126A1 (en) 2017-08-23
BR112017007818A2 (pt) 2017-12-19
CN106852153B (zh) 2023-06-06
US10480008B2 (en) 2019-11-19
US20170233759A1 (en) 2017-08-17
MX369364B (es) 2019-11-06
CA2963550A1 (en) 2016-04-21
WO2016060949A1 (en) 2016-04-21
MX2017004744A (es) 2017-07-27
EP3207126A4 (en) 2018-04-04
PH12017500665A1 (en) 2017-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107635396B (zh) 杀昆虫蛋白及其使用方法
KR101841295B1 (ko) 곤충 내성 관리를 위한 ＣＲＹ１Ｃａ 및 ＣＲＹ１Ｆａ 단백질의 조합 용도
CN101686705B (zh) 来自Bacillus thuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白
CN103328637B (zh) 具有抗鳞翅目昆虫活性的新型苏云金芽孢杆菌基因
UA125168C2 (uk) ВАРІАНТНИЙ ПОЛІПЕПТИД Cry1B
HU228699B1 (hu) Fedelesszárnyúak elleni peszticid aktivitású fehérjéket kódoló gének
EA032560B1 (ru) Инсектицидные полипептиды с широким спектром активности и их применения
UA124757C2 (uk) Інсектицидний поліпептид проти лускокрилого або твердокрилого шкідника та його застосування
KR20170138549A (ko) 살곤충 유전자 및 사용 방법
EA020327B1 (ru) Гены токсинов и способы их применения
CN106795525B (zh) 具有广谱活性的杀昆虫多肽及其用途
UA120608C2 (uk) Очищений поліпептид ptip-83 та спосіб його застосування
TW200900008A (en) Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
CN101133079A (zh) 来自苏云金芽孢杆菌的分泌的杀虫蛋白质和基因组合物及其用途
WO2001021821A2 (en) Insect-resistant rice plants
US9879056B2 (en) Insecticidal protein
KR20190045293A (ko) 살충 유전자 및 사용 방법
KR20180091096A (ko) 살충 유전자 및 사용 방법
CN111630061A (zh) 杀昆虫多肽及其用途
CN109068603A (zh) 杀虫cry毒素
Voisey et al. Release of transgenic white clover plants expressing Bacillus thuringiensis genes: an ecological perspective
JP2018501798A (ja) 害虫の防除に有用な改変Ｃｒｙ１Ｃａ毒素
RU2742467C2 (ru) Пестицидные гены и способы применения
KR20170101247A (ko) 살충 유전자 및 사용 방법
CN111727195A (zh) 杀有害生物基因及使用方法