CN109068603A - 杀虫cry毒素 - Google Patents

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Abstract

描述了源自苏云金芽孢杆菌的杀虫毒素，编码此类毒素的多核苷酸，此类毒素用于防治鞘翅目植物害虫的用途，以及产生这些毒素且受这些毒素保护的转基因植物。

Description

杀虫CRY毒素
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年4月7日提交的标题为“INSECTICIDAL CRY TOXINS”的美国临时申请第62/319,428号的权益，其公开内容通过引用并入。
对以电子方式提交的序列表的引用
序列表的正式拷贝作为2017年3月7日创建的文件名为“78559-US-NP-20170328-Sequence-Listing_ST25”且大小为106千字节的ASCII格式序列表以电子方式经由电子申请系统(EFS-Web)提交，并且与本说明书同时提交。该ASCII格式文件中所含的序列表是说明书的一部分，并通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及应用于农业科学的分子生物学领域。更具体地，某些实施方案涉及使用DNA区段作为用于生产蛋白的诊断探针和模板的方法，以及蛋白、融合蛋白载体和肽用于昆虫防治及各种免疫和诊断应用中的用途。本发明还公开了制备和使用核酸区段开发含有本文所公开的DNA区段的转基因植物细胞中的植物嵌入型保护剂的方法。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性细菌，它产生称为晶体蛋白的δ-内毒素，这些内毒素对某些昆虫目和种特别具有毒性。已证实苏云金芽孢杆菌的许多不同菌株会产生杀虫晶体蛋白。包括产生杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株的组合物已经可以商购获得，并且已经用作环境可接受的杀虫剂。
大多数杀虫性苏云金芽孢杆菌菌株对鳞翅目昆虫即毛虫有活性。其他苏云金芽孢杆菌菌株对双翅目昆虫(即蝇和蚊)有活性，或对鳞翅类和双翅类两种昆虫均有活性。最近几年，还报导了几种苏云金芽孢杆菌菌株能产生对鞘翅目(Coleoptera)昆虫(即甲虫，诸如玉米根虫)有毒的晶体蛋白。此类当前利用的毒性蛋白包括Cry3Bbl(一种经修饰的Cry3A)、eCry3.1Ab和二元毒素Cry34Abl/Cry35Abl(需要针对毒活性的两种不同蛋白)。这些蛋白对于防治侵害玉米根的叶甲(Diabrotica)属有效，不论是单一利用还是呈不同组合利用以降低发展抗性的可能性。虽然这些蛋白已成功地在转基因作物中被利用为昆虫防治剂，但是可能发展出对其作用的抗性。
先前这些晶体蛋白的分类基于其目标昆虫的类型。然而，不断发现具有非常不同的氨基酸序列及杀虫活性的晶体蛋白，使得开发新的分类系统成为必要。当前所接受的命名法仅基于其氨基酸序列对晶体蛋白分组。(Crickmore,N.等人，Microbiol.andMol.Bio.Rev.(1998)第62卷:807-813；http://www.btnomenclature.info/)。
在增强抗性发展的多种情况下更可能发展出对所利用的毒素(无论是化学品还是蛋白)的抗性。一般来说，抗性的发展直接依赖于向环境中利用毒素的时间长度。在毒素剂量不足以确保消耗单次叮咬的含所述毒素的组织的害虫死亡的情况下，抗性发展还更可能增加。因此，关键是在每次叮咬时递送致死剂量的毒素，否则更可能出现对特定毒素的抗性发展。在共同地理区域内，在对共同地理区域内的相同或类似害虫敏感的多种植物之上或之中重复使用同一毒素更可能引起对所述毒素的抗性快速发展，特别是在单个生长季节内有多代特定目标害虫的气候中。出于所有上述原因，对有限数目的毒性蛋白或毒性化学品的依赖可导致对这些害虫防治剂的抗性发展。
西方玉米根虫(WCR，玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera LeConte)在整个美国玉米带中是一种主要的玉米害虫。由于昆虫适应于化学农药和表达苏云金芽孢杆菌Cry蛋白的转基因玉米杂交种的倾向，以及诸如与大豆轮作的栽培措施，可用于治理WCR的选择有限。近年来，特定地理区域的WCR已对Cry3Bb发展出显著抗性，这可能是因为不断种植Cry3Bb转基因玉米所致。已经证实以Cry3Bb选择的WCR对mCry3Aa具有交叉抗性(Gassmann等人，2014；Gassmann等人，2011)。尽管没有任何对于Cry34/35Ab1玉蜀黍性状有抗性问题的报导，但Cry34/35性状却因为种植面积较大(例如，SmartStax商业化)以及在抗Cry3的WCR群体之上选择Cry34/35Ab1的可能性，而处于不断增加的选择压力之下。玉米根虫性状市场需要具有新的作用机制(MOA)的新型杀虫基因以进行可持续玉米根虫防治(Narva等人，2013)。本领域中所公开的声称对玉米根虫表现出毒性作用的其他蛋白包括马铃薯贮藏蛋白(patatin)、TICl00/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美国专利第6,501,009号)、CrylC变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmil84、Axmi205、AxmiRl、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、eHIP(美国专利申请公开第2010/0017914号)及ω-Hex atoxin-Hv la(美国专利申请公开第US2014-0366227 Al号)。
尽管发现许多来自苏云金芽孢杆菌的选择性蛋白毒素，但仍迫切需要发现新的有效的害虫防治剂，该害虫防治剂尤其是在抵抗玉米根萤叶甲(西方玉米根虫(WCR))方面为农民提供经济利益，并且是环境可接受的。特别需要靶向用于防治广泛范围的经济上重要的虫害的药剂，所述药剂有效防治会对或可能变得对现有昆虫防治剂产生抗性的昆虫群体，以及那些与当前利用的杀虫IRDIG蛋白毒素相比具有相同或更高效力的药剂。
发明内容
本发明基于针对WCR具有杀虫活性的新型蛋白毒素的发现。这些杀虫蛋白和基因与现有技术中所有已知蛋白和基因几乎没有同源性，并且对包括但不限于鞘翅目在内的昆虫展现出惊人的杀虫活性。基于这些天然杀虫毒素的氨基酸序列，其在主要序列水平上与任何已知的苏云金芽孢杆菌蛋白家族不相关。
本发明提供了新型苏云金芽孢杆菌杀虫IRDIG蛋白毒素与编码这些蛋白毒素的基因。本发明还包括这些杀虫毒素的同源物、N-端缺失体、衍生物、类似物与突变体形式，编码要求保护的毒素的植物密码子优化核酸序列，以及用于制备、使用所述毒素和选择性结合这些毒素的抗体的方法。
本发明还涉及可以从几乎任何来源分离的DNA区段，其不含全基因组DNA且编码本文所公开的新型肽的全部或一部分。该杀虫IRDIG蛋白基因编码具有如表1所列氨基酸序列与大小的杀虫IRDIG蛋白。
表1
在特定实施方案中，本发明涉及分离的DNA区段，并入有编码所要求保护的毒素的DNA序列的重组载体，以及在以此类重组载体转化植物所产生的植物基因组中发现的功能性基因插入物。更优选地，所述DNA区段包含编码在其氨基酸序列内包括SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122的至少十个氨基酸的连续序列的蛋白或肽毒素的核酸序列。
类似地，包含经分离或纯化的蛋白编码基因的DNA区段是指除肽编码序列外，还可包括与其他天然存在的基因或蛋白编码序列大体上分离的某些其他元件(诸如调控序列)的DNA区段。在这方面，术语“基因”为了简便起见用于指功能性蛋白、多肽或肽编码单元。正如本领域人员将理解的，此功能性术语不但包括基因组序列(包括染色体外DNA序列)，而且包括操纵子序列以及表达或者可适于表达功能性蛋白、多肽或肽的工程化基因区段。
序列简述
SEQ ID NO:1为编码IRDIG28688.1毒素的苏云金芽孢杆菌DNA序列；570个核苷酸。
SEQ ID NO:2为SEQ ID NO:1所编码的苏云金芽孢杆菌IRDIG28688.1蛋白序列；189个氨基酸。
SEQ ID NO:3为编码IRDIG28686.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；564个核苷酸。
SEQ ID NO:4为来自IRDIG28686.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；187个氨基酸。
SEQ ID NO:5为来自IRDIG28684.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；564个核苷酸。
SEQ ID NO:6为来自IRDIG28684.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；187个氨基酸。
SEQ ID NO:7为来自IRDIG28682.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；564个核苷酸。
SEQ ID NO:8为来自IRDIG28682.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；187个氨基酸。
SEQ ID NO:9为来自IRDIG28680.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；333个核苷酸。
SEQ ID NO:10为来自IRDIG28680.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；110个氨基酸。
SEQ ID NO:11为来自IRDIG28674.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；555个核苷酸。
SEQ ID NO:12为来自IRDIG28674.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；184个氨基酸。
SEQ ID NO:13为来自IRDIG28672.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；555个核苷酸。
SEQ ID NO:14为来自IRDIG28672.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；184个氨基酸。
SEQ ID NO:15为来自IRDIG27642的苏云金芽孢杆菌DNA序列；555个核苷酸。
SEQ ID NO:16为来自IRDIG27642的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；184个氨基酸。
SEQ ID NO:17为来自IRDIG28678.2的苏云金芽孢杆菌DNA序列；558个核苷酸。
SEQ ID NO:18为来自IRDIG28678.2的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；185个氨基酸。
SEQ ID NO:19为来自IRDIG28678.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；558个核苷酸。
SEQ ID NO:20为来自IRDIG28678.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；185个氨基酸。
SEQ ID NO:21为来自IRDIG31125.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；576个核苷酸。
SEQ ID NO:22为来自IRDIG31125.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；191个氨基酸
SEQ ID NO:23为来自IRDIG28696.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；366个核苷酸。
SEQ ID NO:24为来自IRDIG28696.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；121个氨基酸。
SEQ ID NO:25为来自IRDIG29781.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；387个核苷酸。
SEQ ID NO:26为来自IRDIG29781.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；128个氨基酸。
SEQ ID NO:27为来自IRDIG29779.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；537个核苷酸。
SEQ ID NO:28为来自IRDIG29779.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；178个氨基酸。
SEQ ID NO:29为来自IRDIG30844.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；570个核苷酸。
SEQ ID NO:30为来自IRDIG30844.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；189个氨基酸。
SEQ ID NO:31为来自IRDIG30850.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；639个核苷酸。
SEQ ID NO:32为来自IRDIG30850.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；212个氨基酸。
SEQ ID NO:33为来自IRDIG30852.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；570个核苷酸。
SEQ ID NO:34为来自IRDIG30852.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；189个氨基酸。
SEQ ID NO:35为来自IRDIG30854.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；564个核苷酸。
SEQ ID NO:36为来自IRDIG30854.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；187个氨基酸。
SEQ ID NO:37为来自IRDIG30856.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；366个核苷酸。
SEQ ID NO:38为来自IRDIG30856.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；121个氨基酸。
SEQ ID NO:39为来自IRDIG30858.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；492个核苷酸。
SEQ ID NO:40为来自IRDIG30858.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；163个氨基酸。
SEQ ID NO:41为来自IRDIG30862.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；285个核苷酸。
SEQ ID NO:42为来自IRDIG30862.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；94个氨基酸。
SEQ ID NO:43为来自IRDIG30860.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；285个核苷酸。
SEQ ID NO:44为来自IRDIG30860.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；94个氨基酸。
SEQ ID NO:45为来自IRDIG30848.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；561个核苷酸。
SEQ ID NO:46为来自IRDIG30848.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；186个氨基酸。
SEQ ID NO:47-68为用于扩增以上所列杀虫IRDIG蛋白的部分的引物。
SEQ ID NO:69 IRDIG27642.2为使用ZmHGC策略编码IRDIG27642毒素的密码子优化的DNA序列；555个核苷酸
SEQ ID NO:70 IRDIG27642.3为使用Zm最高GC策略编码IRDIG27642毒素的密码子优化的DNA序列；555个核苷酸
SEQ ID NO:71为来自IRDIG27642.2和IRDIG27642.3的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；184个氨基酸。
SEQ ID NO:72 IRDIG27642.4为融合至IRDIG27642 Zm最高GC的TraP8；753
SEQ ID NO:73为来自IRDIG27642.4和IRDIG27642.6的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；250个氨基酸。
SEQ ID NO:74 IRDIG27642.5为融合至IRDIG27642 ZmHGC的TraP4；768
SEQ ID NO:75为来自IRDIG27642.5的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；255个氨基酸
SEQ ID NO:76 IRDIG27642.6为融合至IRDIG27642 ZmHGC的TraP8；753
SEQ ID NO:77 IRDIG27642-F1BamHI为用于PCR以及在将PCT产物克隆到Bt 4Q7中的BamI/KpnI切口pDAB101622后用于表达的正向引物序列
SEQ ID NO:78 IRDIG27642-R1KpnI为用于PCR及在将PCT产物克隆到Bt 4Q7中的BamI/KpnI切口pDAB101622后用于表达的反向引物序列
SEQ ID NO:79 IRDIG27642-00733-F2SpeI为用于PCR及在将PCT产物克隆到Pf中的SpeI/XhoI切口pDOW1169后用于表达的正向引物序列
SEQ ID NO:80 IRDIG27642-00733-R2XhoI为用于PCR及在将PCT产物克隆到Pf中的SpeI/XhoI切口pDOW1169后用于表达的反向引物序列
SEQ ID NO:81为来自IRDIG27642.1的截短的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:82为来自IRDIG27642.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:83为来自IRDIG28672.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:84为来自IRDIG28672.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:85为来自IRDIG28674.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:86为来自IRDIG28674.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:87为来自IRDIG28678.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:88为来自IRDIG28678.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:89为来自IRDIG31125.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:90为来自IRDIG31125.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:91为来自IRDIG28680.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:92为来自IRDIG28680.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:93为来自IRDIG28682.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:94为来自IRDIG28682.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:95为来自IRDIG28684.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:96为来自IRDIG28684.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:97为来自IRDIG28686.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:98为来自IRDIG28686.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:99为来自IRDIG28688.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:100为来自IRDIG28688.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:101为来自IRDIG28696.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列。
SEQ ID NO:102为来自IRDIG28696.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:103为来自IRDIG29779.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:104为来自IRDIG29779.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:105为来自IRDIG29781.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:106为来自IRDIG29781.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:107为来自IRDIG30844.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:108为来自IRDIG30844.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:109为来自IRDIG30848.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:110为来自IRDIG30848.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:111为来自IRDIG30850.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:112为来自IRDIG30850.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:113为来自IRDIG30852.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:114为来自IRDIG30852.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:115为来自IRDIG30854.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:116为来自IRDIG30854.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:117为来自IRDIG30856.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:118为来自IRDIG30856.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:119为来自IRDIG30858.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列
SEQ ID NO:120为来自IRDIG30858.1的截短的苏云金芽孢杆菌蛋白序列
SEQ ID NO:121为来自IRDIG28676.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；624个核苷酸。
SEQ ID NO:122为来自IRDIG28676.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；207个氨基酸。
SEQ ID NO:123为来自IRDIG28692.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；579个核苷酸。
SEQ ID NO:124为来自IRDIG28692.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；192个氨基酸
SEQ ID NO:125为来自IRDIG28694.1的苏云金芽孢杆菌DNA序列；366个核苷酸。
SEQ ID NO:126为来自IRDIG28694.1的苏云金芽孢杆菌蛋白序列；121个氨基酸。
SEQ ID NO:127-132为用于扩增杀虫IRDIG蛋白的部分的引物。
具体实施方式
以下词语和短语具有如下所示的含义。除非特别指示，否则如本文所用的术语“一”、“一种(个)”和“所述(该)”表示“至少一个”。
“杀虫IRDIG蛋白”定义为与包括衍生物、类似物和突变体形式在内的前述任一种具有至少70％序列同一性的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124和126蛋白毒素。杀虫IRDIG蛋白更优选的类别由与前述任一序列具有至少80％序列同一性的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124和126蛋白毒素组成。杀虫IRDIG蛋白的另一优选类别由与前述任一序列具有至少90％序列同一性的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124和126蛋白毒素组成。杀虫IRDIG蛋白的另一优选类别由与前述任一序列具有至少95％序列同一性的SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124和126蛋白毒素组成。杀虫IRDIG蛋白的另一优选类别由与前述任一序列具有至少99％序列同一性的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124和126蛋白毒素组成。杀虫IRDIG蛋白的最优选类别由SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124和126组成。
“配制的杀虫IRDIG蛋白”意指经纯化或分离的杀虫IRDIG蛋白，其已表达或放置到适于农业应用的合成组合物内，包括但不限于转基因植物、喷雾式液体制剂、粉末状固体制剂或颗粒制剂。
“DNA区段”是指已经分离的不含特定物种的全基因组DNA的DNA分子。因此，编码蛋白或肽的DNA区段是指，含有已从获得该DNA区段的物种的全基因组DNA中分离或纯化的蛋白编码序列的DNA区段，在当前情况下，其为革兰氏阳性菌芽孢杆菌属(Bacillus)并且尤其是称为苏云金芽孢杆菌的种的基因组。包括在术语“DNA区段”中的有DNA区段和此类区段的小片段，还有重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等。
“大体上与其他编码序列分离”意指目标基因，在这种情况下，是编码细菌杀虫IRDIG蛋白的基因，构成了该DNA区段编码区的重要部分，并且意指该DNA区段不含大部分天然存在的编码DNA，诸如大染色体片段或者其他功能性基因或操纵子编码区。当然，这指的是原本已分离的DNA区段，且不排除后来通过人工添加到此区段的基因、重组基因、合成接头或编码区。
“基本上如SEQ ID NO:2中列出的序列”意指该序列大体上与SEQ ID NO:2的一部分序列相对应，并且有相对少的氨基酸不同于任何这些序列的氨基酸，或有相对少的氨基酸是任何这些序列的氨基酸的生物学功能等效物。术语“生物学功能等效物”是本领域中所熟知的。因此，与SEQ ID NO:2的氨基酸具有约70％至约80％之间，或更优选地约81％至约90％之间，或甚至更优选地约91％至99％之间的氨基酸序列同一性或功能等效性的序列，将会是“基本上如SEQ ID NO:2中列出的”序列。
“表达”意指细胞内过程的组合，包括编码DNA分子(诸如结构基因)产生多肽所经历的转录和翻译过程。
“遗传物质”意指所有的基因、核酸、DNA和RNA。术语“dsRNA”是指双链RNA。对于多核苷酸、DNA、RNA、寡核苷酸和引物的核苷酸残基的名称以及对于蛋白氨基酸残基的名称，在本文件中通篇采用标准IUPAC缩写。核酸序列以标准的5'至3'方向呈现，而蛋白序列以标准的氨基(N)端至羧基(C)端方向呈现。
“启动子”意指一个DNA序列或一组DNA序列上的识别位点，其为结构基因提供了表达控制元件，且RNA聚合酶与之特异性结合并启动该基因的RNA合成(转录)。
“核酸构建体”为人造基因序列，其包含结构基因诸如IRDIG基因序列和异源调控元件诸如启动子、终止子、增强子或经设计用于在适当宿主中引起结构基因转录或翻译的其他遗传元件。
“再生”意指由植物细胞(例如，植物原生质体或外植体)长成植物的过程。
“结构基因”意指表达产生多肽的基因。
“转化”意指将外源性DNA序列(例如载体、重组DNA分子)引入细胞或原生质体的过程，其中该外源性DNA并入染色体内，或者能够自主复制。
“转化细胞”意指已通过向该细胞引入外源性DNA分子内而使其DNA改变的细胞。
“转基因细胞”意指由转化细胞衍生或再生或者由转基因细胞衍生的任何细胞。示例性转基因细胞包括衍生自转化植物细胞的植物愈伤组织，以及从转基因植物获得的特定细胞，诸如叶、根、茎(例如，体细胞)或生殖(胚)细胞。
“转基因植物”意指衍生自转化植物细胞或原生质体的植物或其后代，其中该植物DNA含有最初不存在于相同品系的天然非转基因植物中的经引入的外源性DNA分子。术语“转基因植物”和“转化植物”在本领域中有时作为同义词使用，以定义其DNA含有外源性DNA分子的植物。然而，认为将由转化植物细胞或原生质体获得的再生植物或愈伤组织称为转基因植物在科学上更正确，并且本文将照此使用。
“载体”意指能够在宿主细胞中复制，和/或另一DNA区段可与之可操作地连接，以便使附连区段复制的DNA分子。质粒是一种示例性载体。
还应理解，氨基酸和核酸序列可包括附加残基，诸如附加的N-端或C-端氨基酸，或者5'或3'序列，但仍是基本上如同本文公开的序列之一中所列的，只要该序列满足上面列举的标准即可，包括在涉及蛋白表达时，保持蛋白生物活性。添加末端序列特别适用于这样的核酸序列：例如其可包括在编码区5'或3'部分的侧翼的各种非编码序列，或者可包括已知存在于基因中的各种内部序列(即内含子)。
不论编码序列本身的长度如何，本发明的核酸区段可与其他DNA序列组合(诸如启动子、聚腺苷酸化信号序列、附加限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码区等)，使其总长度可以大大改变。因此考虑到，可以采用几乎任何长度的核酸片段，且其总长度最好限制在易于在预期重组DNA方案中制备和使用的范围内。例如，可以制备这样的核酸片段：其包括编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124和126中公开的整个或部分肽序列的短连续延伸序列，或其与编码SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124和126中公开的肽的DNA序列，并且尤其是SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、69、70、72、74、76、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123和125中公开的DNA区段相同或互补。例如，还考虑到如下长度的DNA序列是有用的，诸如约14个核苷酸，以及多达约10,000、约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50和约14个碱基对(包括全部中间长度)。
应容易理解的是，“中间长度”在这些上下文中意指所示范围之间的任何长度，诸如14、15、16、17、18、19、20等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1,000、1,000-2,000、2,000-3,000、3,000-5,000的全部整数；以及多达并包括约10,000个核苷酸的序列等等。
还应理解到，本发明不限于编码本发明的肽，或编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124和126的氨基酸序列的特定核酸序列，包括SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、69、70、72、74、76、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123和125中特别公开的DNA序列。重组载体和分离的DNA区段因此可以不同地包括肽编码区本身，编码区在基础编码区内带有经选择的改变或修饰，或者它们虽然包括这些肽编码区但也可编码较大的多肽，或者可编码具有变体氨基酸序列的生物功能等效的蛋白或肽。
本发明的DNA区段涵盖生物功能等效肽。可能由于已知在核酸序列及这样编码的蛋白中天然存在的密码子冗余及功能等效性而产生此类序列。替代地，功能等效蛋白或肽可经由应用重组DNA技术而产生，其中可基于对被交换的氨基酸特性的考虑来设计蛋白结构的变化。可通过应用定点诱变技术引入人工设计的变化，例如，以改进蛋白的抗原性或检测突变体，以便在分子水平上检查活性。
重组载体构成本发明的其他方面。据考虑，特别有用的载体是其中不论是编码全长蛋白还是较小肽的DNA区段编码部分都处于启动子的控制之下的那些载体。所述启动子可以是与编码本发明的肽的基因自然缔合的形式，因为其可通过分离位于编码区段或外显子上游的5'非编码序列而获得，例如使用与本文公开的组合物有关的重组克隆技术和/或PCRTM技术。
除其在指导本发明杀虫IRDIG蛋白或肽的表达中的用途以外，本文中所考虑的核酸序列还具有多种其他用途。例如，其在核酸杂交实施方案中还可以用作探针或引物。因而，考虑到，包含由至少14个核苷酸的长连续序列组成的序列区域的核酸区段将会有特定实用性，所述连续序列具有与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、69、70、72、74、76、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123和125中14个核苷酸的长连续DNA区段相同的序列或与之互补。较长的连续的相同或互补序列，例如约20、30、40、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000等(包括所有居间长度并且达到和包括全长序列)的那些序列在某些实施方案中也将会是有用的。
此核酸探针与蛋白编码序列特异性杂交的能力将使其能够用于检测给定样品中互补序列的存在。然而，还可设想到其他的用途，包含将序列信息用于制备突变种的引物，或将引物用于制备其他遗传构建体的用途。
具有由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、69、70、72、74、76、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123和125的DNA序列相同或互补的约10-14、15-20、30、50或甚至100-200个核苷酸的连续核苷酸延伸序列组成的序列区域的核酸分子被特别考虑作为例如Southern和Northern印迹法中使用的杂交探针。较小片段通常将用于杂交实施方案中，其中连续互补区域的长度可以改变，诸如在约10-14到约100或200个核苷酸之间，但根据想要检测的互补序列长度也可以使用较长的连续互补延伸序列。
使用长度约14个核苷酸的杂交探针允许形成既稳定又具有选择性的双链体分子。但是，为了增加杂种的稳定性和选择性，并因此改善所得特异性杂交分子的质量和数量，通常优选在延伸序列上具有长度多于14个碱基的连续互补序列的分子。通常将优选设计具有15至20个连续核苷酸或需要时甚至可以更长的基因互补延伸序列的核酸分子。
当然，还可以通过其他技术获得片段，诸如通过机械剪切或限制性酶消化。小核酸区段或片段可以通过例如用化学手段直接合成片段而容易地制备，这通常用自动化寡核苷酸合成仪来实施。同样，可以通过应用核酸复制技术获得片段，诸如美国专利第4,683,195和4,683,202号的PCRTM技术(其各自通过引用并入本文)，通过将选定序列引入重组载体来重组产生，以及通过分子生物学领域的技术人员通常已知的其他重组DNA技术。
因此，本发明的核苷酸序列因其能与DNA片段的互补延伸序列选择性形成双链体分子而可被使用。根据预期应用，将期望采用不同的杂交条件来达到探针对靶序列不同程度的选择性。通常，严格条件将是下述那些条件：在pH 7.0至pH 8.3下盐浓度小于约1.5MNa离子，通常为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，且对于短探针(例如10至50个核苷酸)而言温度为至少约30℃而对于长探针(例如大于50个核苷酸)而言温度为至少约60℃。还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现严格条件。示例性的低严格性条件包括于37℃下用含有30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并于50℃至55℃在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中度严格性条件包括于37℃在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并于55℃至60℃在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格性条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并于60℃至65℃在0.1X SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％的SDS。杂交持续时间一般小于约24小时，通常为约4至约12小时。此类选择性条件只容许在探针和模板或目标链之间有很少的错配(若有)，并且特别适于分离编码蛋白的DNA区段。经由杂交检测DNA区段是本领域技术人员熟知的，而美国专利第4,965,188和5,176,995号(其各自通过引用并入本文)的教导是杂交分析的示例。
特异性通常与杂交后的洗涤相关，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA/DNA杂种，热解链温度(Tm)为50％互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。每有1％错配，Tm减小约1℃；因此，可调整Tm、杂交条件和/或洗涤条件以促进具有所需同一性的序列退火。例如，若寻求>90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。通常，在限定的离子强度和pH下会选择低于特定序列及其互补序列的Tm约5℃的严格条件。然而，高度严格条件可利用在比Tm低1℃、2℃、3℃或4℃下的杂交和/或洗涤；中度严格性条件可利用在比Tm低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下的杂交和/或洗涤，并且低严格性条件可利用在比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下的杂交和/或洗涤。
Tm(以℃计)可以实验方式测定或可通过计算来估计。对于DNA-DNA杂交，Tm可由下式估计：
Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；
其中M为单价阳离子摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺为杂交溶液中甲酰胺的百分比(w/v)，而L为按碱基对计的杂交长度。
替代地，通过下式描述Tm(Beltz等人，1983)。
Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-600/L；
其中[Na+]为钠离子摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺为杂交溶液中甲酰胺的百分比(w:v)，而L为按碱基对计的杂交长度。
使用等式、杂交和洗涤组合物以及所需Tm，普通技术人员将理解本质上描述了杂交严格性和/或洗涤溶液的改变。若所需程度的错配导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以便可以使用较高温度。对于核酸杂交的大量指导见于Tijssen(1993)。还参见Sambrook等人(1989)。
当然，对于一些应用，例如当希望采用与基础模板杂交的突变引物链来制备突变体或设法从相关种类、功能等效物等等分离出蛋白编码序列时，为了形成异源双链体通常将需要较不严格的杂交条件。在这些情况下，人们可能希望采用诸如约0.15M到0.9M的盐，约20℃至约55℃范围的温度的条件。因此，相对于对照杂交，交叉杂交的种类可容易鉴定为阳性杂交信号。无论如何，通常认为可以通过添加逐渐增加量的甲醛而致使条件更为严格，甲醛是用于随着温度的增加而以相同的方式使杂交双链体变得不稳定。因此，可以容易地对杂交条件进行操纵，并因此通常将是根据所需结果选择的方法。
在某些实施方案中，与适当手段(例如标记)组合，采用本发明的核酸序列用于测定杂交将会是有利的。在本领域中已知多种适当的指示剂手段，包括荧光指示剂、放射性指示剂、酶指示剂或其他配体指示剂，诸如亲合素/生物素，其能够给出可检测的信号。在优选实施方案中，人们将很可能希望采用荧光标记或酶标签，诸如尿素酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶来取代放射性或其他对环境不利的试剂。在酶标签的情况下，已知量热指示剂底物可用于提供人眼可见的手段或分光光度法手段来鉴定与含有互补核酸的样品的特异性杂交。
一般而言，可预想到本文所述的杂交探针将既可作为试剂用于溶液杂交中，又可用于采用固相的实施方案中。在涉及固相的实施方案中，试验DNA(或RNA)被吸附到或以其他方式被固定到所选基质或表面上。然后在所需条件下使这种固定的单链核酸与所选探针进行特异性杂交。所选条件将取决于基于所要求的特定标准的特定环境(取决于例如G+C含量、靶核酸类型、核酸来源、杂交探针的大小等)。在清洗杂交表面以去除非特异性结合的探针分子之后，通过标记手段检测特异性杂交，或甚至进行定量。
本发明还公开并要求保护一种包含杀虫IRDIG蛋白的组合物。所述组合物可包含于可溶性部分中表达杀虫IRDIG蛋白的细菌宿主细胞，含有所述杀虫IRDIG蛋白的包含体或晶体，培养物上清液、破碎细胞、细胞提取取物、裂解产物及匀浆等。所述组合物可呈含水形式，或替代地，呈干燥、半湿或类似形式(诸如细胞浆、细胞团块)，或替代地经冷冻干燥、制粉、冻干、蒸发或其他类似方法制成干燥形式。此类制备杀虫IRDIG蛋白的手段是细菌蛋白分离与纯化领域中技术人员所熟知的。在某些实施方案中，所述蛋白可经纯化、浓缩，与其他试剂混合，或者加工成所需最终形式。优选地，该组合物将包含按重量计约1％至约90％的蛋白，更优选地按重量计约5％至约50％的蛋白。
在一个优选实施方案中，本发明的蛋白组合物可按包括以下步骤的方法制备：在有效生成这种蛋白的条件下培养表达杀虫IRDIG蛋白的苏云金芽孢杆菌细胞，然后从所述细胞中获得所述蛋白。这种蛋白的获得还可包括纯化、浓缩、加工或将所述蛋白与一种或多种试剂混合。优选地，杀虫IRDIG蛋白毒素获得的量按重量计为约1％至约90％，且更优选地按重量计为约5％至约50％。
本发明还涉及制备杀虫IRDIG蛋白组合物的方法。这种方法通常包括在有效生成所述蛋白的条件下培养表达杀虫IRDIG蛋白毒素的苏云金芽孢杆菌细胞，然后获得这样生成的蛋白的步骤。在一个优选实施方案中，苏云金芽孢杆菌细胞是含有杀虫IRDIG蛋白基因区段的任何苏云金芽孢杆菌细胞。替代地，可使用本发明的重组质粒载体转化其他合适的细菌或真核细胞以生成本发明的蛋白。据考虑，包括革兰氏阴性细胞(诸如大肠杆菌(E.coli)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)及相关肠杆菌科(Enterobacteraceae))或革兰氏阳性细胞(诸如芽孢杆菌属(Bacillusspp.)(包括巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和苏云金芽孢杆菌)等等)的原核宿主细胞都可用于制备本发明的杀虫IRDIG蛋白。特别优选常用的大肠杆菌和荧光假单胞菌表达菌株。
在此类实施方案中，据考虑，通过使DNA编码区段处于重组或异源启动子的控制之下将会获得某些优势。如本文中所用，重组或异源启动子意指通常在其自然环境中不与编码蛋白或肽的DNA区段相缔合的启动子。此类启动子可包括通常与其他基因相缔合的启动子，和/或分离自任何细菌、病毒、真核或植物细胞的启动子。当然，重要的是采用在选择用于表达的细胞类型、生物体或甚至是动物中有效指导DNA区段表达的启动子。使用启动子和细胞类型组合用于蛋白表达对于分子生物学领域中的技术人员通常是已知的，例如，参见Sambrook等人，1989。所采用的启动子可以为组成型或诱导型的，并且可在适当条件下用于指导引入的DNA区段的高水平表达，这在大规模生产重组蛋白或肽中是有利的。考虑用于高水平表达的适当启动子系统包括但不限于毕赤酵母(Pichia)表达载体系统(PharmaciaLKB Biotechnology)。
关于制备重组蛋白和肽的表达实施方案，考虑将最常使用较长的DNA区段，其中最优选编码完整肽序列的DNA区段。然而，应了解使用较短的DNA区段来指导肽或表位核心区的表达，正如可用于产生抗蛋白抗体一样，也落在本发明的范围内。考虑到编码长度约8至约50个氨基酸，或更优选地长度约8至约30个氨基酸，或甚至更优选地长度约8至约20个氨基酸的肽抗原的DNA区段会特别有用。此类肽表位可以是包含来自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124或126的连续氨基酸序列的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明提供了用于产生转基因细胞，尤其是表达编码本发明的新型杀虫IRDIG蛋白的核酸区段的植物细胞的方法。产生转基因细胞的方法是本领域熟知的。一般而言，所述方法包括用含有与编码杀虫IRDIG蛋白毒素的编码区可操作地连接的启动子的DNA区段转化合适的宿主细胞。这种编码区通常与转录终止区可操作地连接，从而使启动子能够驱动细胞中该编码区的转录，并因此为细胞提供在体内产生重组蛋白的能力。替代地，当需要控制、调节或减少特定转基因细胞中所表达的特定重组蛋白的量时，本发明也提供了蛋白反义mRNA的表达。使用反义mRNA作为控制或减少细胞中给定目标蛋白的量的手段在本领域中是熟知的。
在一个优选实施方案中，本发明涵盖了已用本发明的核酸区段转化，并且表达编码本文所公开的一种或多种新型多肽组合物的基因或基因区段的植物细胞。如本文中所用，术语“转基因植物细胞”意指具有所并入的DNA序列的植物细胞，所述DNA序列包括但不限于或许是不正常存在的基因，不正常转录成RNA或翻译成蛋白(“表达”)的DNA序列，或者是希望引入非转化植物内的任何其他基因或DNA序列，诸如可正常存在于非转化植物中但期望进行基因工程改造或已改变了表达的基因。
考虑到在一些情况下，通过稳定地引入表达杀虫IRDIG蛋白毒素的转基因，将增强本发明的转基因植物的基因组。在一些情况下，可以将多于一个转基因并入到被转化的宿主植物细胞的基因组内。将多于一个编码蛋白的DNA区段并入这种植物的基因组时就是这样。在某些情形下，可能理想的是有一个、二个、三个、四个或甚至更多个苏云金芽孢杆菌晶体蛋白或其他杀虫IRDIG蛋白或核酸并入经转化的转基因植物中并稳定地表达。在优选实施方案中，将转基因引入植物细胞的基因组导致稳定的整合作用，其中此类植物的后代的基因组中也含有该转基因的拷贝。最初已引入所述基因的植物后代对这种遗传元件的遗传性是本发明的优选方面。
编码本发明的杀虫IRDIG蛋白的基因可使用熟知的方法稳定地引入植物细胞的基因组内，然后再生到整个可育植物内。此类植物是种植者所高度期望的，以防御鞘翅目(尤其是WCR)摄食所造成的作物损害。
转化植物细胞和制备转基因细胞系的手段是本领域中熟知的(如在美国专利第5,550,318、5,508,468、5,482,852、5,384,253、5,276,269和5,225,341号中举例说明的，其通过引用明确并入本文)，且在本文中有简单讨论。当然，用于转化此类细胞的载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)和DNA区段通常将包括本发明的操纵子、基因或基因衍生序列(天然的或合成衍生序列)，特别是编码所公开的蛋白的那些序列。这些DNA或核酸构建体还可包括诸如启动子、增强子、多聚接头等结构，或者甚至是根据需要对特定目标基因具有正向或负向调节活性的基因序列。DNA区段或基因可编码天然的或经修饰的蛋白，其将在所得重组细胞中表达，和/或将对再生植物赋予改良表型。
通过将编码对昆虫有毒性的杀虫IRDIG蛋白的转基因DNA区段并入植物而增加单子叶或双子叶植物的杀虫抗性的此类转基因植物是期望的。特别优选的植物包括玉米、小麦、大豆、棉花、草皮草、观赏植物、果树、灌木、蔬菜、谷物、豆科植物等，或是期望向其中引入杀虫IRDIG蛋白转基因的任何植物。
在一个相关方面中，本发明还涵盖由转化植物产生的种子，由这种种子产生的后代，以及由根据上述方法产生的原始转基因植物的后代所产生的种子。此类后代和种子将具有稳定并入其基因组内的蛋白编码转基因，且此类后代植物将按孟德尔方式遗传通过引入稳定的转基因所赋予的性状。所有此类已将编码杀虫IRDIG蛋白毒素的转基因DNA区段并入其基因组内的转基因植物均为本发明的方面。
在特定实施方案中，本发明人考虑到了
与本文所公开的蛋白结合的单克隆或多克隆抗体的用途。制备和表征抗体的手段是本领域熟知的。
本发明还提供了用于筛选怀疑含有杀虫IRDIG蛋白毒素或编码这种毒素的基因的样品的组合物、方法和试剂盒。可以对如下样品进行这种筛选：经转化的宿主细胞、转基因植物及其后代或种子，或怀疑含有或产生这种多肽或核酸区段的实验室样品。试剂盒可含有本发明的新型核酸区段或抗体。该试剂盒含有用于检测样品与本发明的核酸或抗体之间的相互作用的试剂。所提供的试剂可以经放射性标记、荧光标记或酶标记。该试剂盒可含有能够与本发明的核酸或抗体结合或相互作用的已知放射性标记的试剂。
该试剂盒的试剂可以作为液体溶液提供，附着到固体支持物上或作为干粉形式提供。优选地，当该试剂以液体溶液形式提供时，液体溶液为水溶液。优选地，当所提供的试剂附着到固体支持物上时，该固体支持物可以是层析介质、具有多个孔的试验板或显微镜载玻片。当所提供的试剂为干粉时，可以通过添加可提供的合适溶剂而使粉末复原。
在另一些实施方案中，本发明涉及免疫检测法及相关试剂盒。建议可将本发明的蛋白或肽用于检测与其有反应性的抗体，或替代地，可将根据本发明制备的抗体用于检测蛋白或含有蛋白相关表位的肽。一般而言，这些方法将包括首先获得怀疑含有这种蛋白、肽或抗体的样品，再视情况，在有效形成免疫复合物的条件下，使该样品与根据本发明的抗体或肽接触，然后检测免疫复合物的存在。
一般而言，检测免疫复合物的形成在本领域中是相当熟悉的并且可通过应用多种方法来实现。例如，本发明考虑到应用ELISA、RIA、免疫印迹法(例如斑点印迹法)和间接免疫荧光技术等。通常，将通过使用标记来检测免疫复合物的形成，所述标记例如放射性标记或酶标签(诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶等)。当然，如本领域中所知，可通过使用二级结合配体诸如第二抗体或生物素/亲合素配体的结合配置而发现其他益处。
为了测定目的，已提出可以利用根据实际情况怀疑包含要检测的蛋白或肽或者蛋白相关的肽或抗体的几乎任何样品。考虑到此类实施方案可以应用在抗原或抗体样品滴定、杂交瘤筛选等等中。在相关实施方案中，本发明考虑了制作可用于检测样品中的蛋白或相关肽和/或抗体的存在的试剂盒。样品可包括怀疑含有蛋白或肽的细胞、细胞上清液、细胞悬浮液、细胞提取物、酶部分、蛋白提取物或其他不含细胞的组合物。一般来说，根据本发明的试剂盒将包括合适的蛋白、肽或针对这种蛋白或肽的抗体，连同免疫检测试剂及用于容纳所述抗体或抗原和试剂的装置。免疫检测试剂通常将包含与所述抗体或抗原相关或与二级结合配体相关的标记。示例性配体可能包括针对第一抗体或具有相关标记的抗原或生物素或亲合素(或链霉亲和素)的二抗。当然，如上所述，许多示例性标记在本领域中是已知的并且所有此类标记均可连同本发明一起使用。
容器通常将包括其中可放置抗体、抗原或检测试剂且优选适当分装的小瓶。本发明的试剂盒通常还将包括为了商业销售用于以密闭方式容纳所述抗体、抗原和试剂容器的装置。此类容器可包括保持所需小瓶于其中的注塑成型或吹塑成型的塑料容器。
ELISA与免疫沉淀法
ELISA可与本发明联合使用。在ELISA测定中，将掺入蛋白抗原序列的蛋白或肽固定于选定表面上，优选展现出蛋白亲和力的表面，诸如聚苯乙烯微量滴定板的小孔。在洗涤去除未完全吸附的物质后，最好用非特异性蛋白结合或涂覆该测定板的小孔，已知所述非特异性蛋白在抗原性上对于该试验抗血清(诸如牛血清蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液)是中性的。这样便阻断了该固定表面上的非特异性吸附位点，且因此降低因抗血清非特异性结合到该表面上所产生的背景。
在抗原物质结合到小孔上，涂覆非反应性物质以降低背景，并且洗涤去除未结合的物质后，以有利于免疫复合物(抗原/抗体)形成的方式使固定表面与待试验的抗血清或临床或生物学提取物接触。此类条件优选包括以诸如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲液表面活性剂(ICI Americas,Inc.,Wilmington,Del.)的稀释剂来稀释所述抗血清。这些添加的试剂往往也有助于降低非特异性背景。然后使分层的抗血清优选在约25℃至约27℃级别的温度下孵育约2至约4小时。孵育之后，洗涤与抗血清接触的表面以去除非免疫复合物质。优选的洗涤程序包括用诸如表面活性剂或硼酸缓冲液等溶液洗涤。
所述试验样品与结合的抗原之间形成特异性免疫复合物并随后洗涤之后，通过使对该第一抗体有特异性的第二抗体经受同样处理可测定免疫复合物形成的出现和甚至其量。为提供检测手段，该第二抗体将优选具有将会在与适当的显色底物一起孵育后产生显色的相关酶。因此，例如需要使抗血清结合表面与尿素酶或过氧化酶偶联的抗人IgG接触并孵育一段时间，并且是在有利于发生免疫复合物形成的条件下进行(例如，于室温下在诸如表面活性剂等含PBS的溶液中孵育2小时)。
与第二酶标记抗体一起孵育后并且继洗涤去除未结合的物质之后，在过氧化物酶作为酶标记的情况下，通过与显色底物诸如尿素和溴甲酚紫或2,2'-联氮-双-(3-乙基-苯噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)和H2O2一起孵育对标记的量进行定量。然后通过例如使用可见光谱分光光度计测定生色程度而完成定量。
本发明的抗蛋白抗体对于通过免疫沉淀分离其他蛋白抗原特别有用。免疫沉淀包括从复合混合物中分离靶抗原组分，并且用于区分或分离微量的蛋白。对于膜蛋白的分离，必须将细胞溶解到去污剂胶粒中。优选非离子盐，因为其他试剂(诸如胆盐)在酸性pH或在二价阳离子存在下沉淀。
在一个替代性实施方案中，本发明的抗体对于两个抗原的紧密并联有用。这对于增加抗原(例如酶-底物对)的局部浓度特别有用。
本发明的组合物在免疫印迹或western印迹分析方面十分有用。所述抗肽抗体可用作高亲和力的主要试剂，用于鉴定固定在固体支持基质诸如硝酸纤维素、尼龙或其组合上的蛋白。连同免疫沉淀，接着进行凝胶电泳，可将这些用作单一步骤试剂用于检测抗原，其中用于检测抗原的次要试剂会产生不良背景。当所研究的抗原是免疫球蛋白时(排除了使用结合细菌细胞壁组分的免疫球蛋白)，这尤其有用，所研究的抗原与所述检测剂交叉反应，或其以与交叉反应信号相同的相对分子量迁移。
用于连同Western印迹法使用的基于免疫学的检测方法包括针对在这方面被视为有特殊用途的抗毒素部分的酶标记的、放射标记的或荧光标记的二抗。
本发明还涉及不含完整细胞和其他肽的蛋白或肽组合物，其包括并入有与一种或多种抗蛋白抗体免疫性交叉反应的表位的纯化蛋白或肽。具体而言，本发明涉及衍生自杀虫IRDIG蛋白或肽的表位核心序列。
如本文中所用，术语“并入有与一种或多种抗蛋白抗体免疫性交叉反应的表位”意指肽或蛋白抗原包括与位于蛋白或多肽内的表位相似的一级、二级或三级结构。相似性程度通常将达到针对蛋白或多肽的单克隆或多克隆抗体也会与交叉反应性肽或蛋白抗原结合，与其反应或以其他方式对其进行识别的程度。可连同此类抗体采用各种免疫测定方法，诸如例如Western印迹法、ELISA、RIA等，其全部对于本领域中的技术人员是已知的。
Cry免疫显性表位或其功能等效物的鉴定是相对简单的事情。例如，可采用美国专利第4,554,101号(通过引用并入本文)所教导的Hopp方法，其教导了基于亲水性由氨基酸序列鉴定和制备表位。其他几篇论文中描述的方法以及基于这些方法的软件程序也可用于鉴定表位核心序列(参见例如，美国专利第4,554,101号)。然后可通过应用肽合成或重组技术容易地将这些“表位核心序列”的氨基酸序列并入到肽中。
根据本发明优选使用的肽通常长度将为约8至约20个氨基酸的级别，且优选地长度为约8至约15个氨基酸的级别。已提出较短的抗原蛋白衍生肽将在某些情况下，例如在免疫学检测测定的准备中具有优势。示例性优势包括易于制备和纯化，成本相对较低且生产重复性提高，以及有利的生物分布。
已提出本发明的特定优势可通过制备合成肽而实现，该合成肽包括经修饰或延伸的表位/免疫原性核心序列，其产生针对蛋白，且尤其是杀虫序列及杀虫相关序列的“通用”表位肽。这些表位核心序列在本文的特定方面中被鉴定为特定多肽抗原的亲水性区域。已提出这些区域代表最有可能促进T-细胞或B-细胞刺激，并因此引发特异性抗体产生的那些区域。
如本文中所使用，表位核心序列是相对短的氨基酸延伸序列，其与本文公开的蛋白定向抗体上的抗原结合位点“互补”且因此将与其结合。另外或替代地，表位核心序列是将会引发与针对本发明的肽组合物的抗体起交叉反应的抗体的序列。应理解在本公开的上下文中，术语“互补”是指相互间显示出吸引力的氨基酸或肽。因此，可根据与相应的蛋白定向抗血清竞争结合所需蛋白抗原或者是代替结合所需蛋白抗原的能力而操作性地限定本发明的某些表位核心序列。
一般而言，只要其至少足够大以携带鉴定出的一个或多个核心序列，那么认为该多肽抗原的大小不是特别重要。本公开所预期的最小的有用核心序列通常长度将为约8个氨基酸的级别，其中优选10至20个级别的序列。因此，这个大小通常将会与根据本发明制备的最小肽抗原相对应。然而，只要其含有基本的表位核心序列，那么该抗原的大小在需要时可以更大。
表位核心序列的鉴定对于本领域的技术人员是已知的，例如美国专利第4,554,101号(通过引用并入本文)所述，其教导了基于亲水性由氨基酸序列鉴定和制备表位。而且，许多计算机程序可用于预测蛋白的抗原部分。计算机化肽序列分析程序(例如，software,DNAStar,Inc.,Madison,Wis.)也可用于设计根据本发明的合成肽。
在其序列内部包括抗原表位的表位序列或肽的合成易于使用常规合成技术实现，诸如固相方法(例如，通过使用商购获得的肽合成仪，诸如Applied Biosystems 430A型肽合成仪)。然后将以这种方式合成的肽抗原分装成预定的量并以常规方法储存，诸如呈水溶液或甚至更优选地呈粉末或冻干状态储存备用。
一般而言，由于肽相对稳定，若需要它们可容易地以水溶液形式储存相当长的时间，例如以几乎任何水溶液形式储存长达六个月或更长时间而没有可觉察到的降解或抗原活性丧失。然而，当考虑到长时间含水储存时，通常将需要包括含有缓冲液诸如Tris或磷酸盐缓冲液的试剂以将pH维持在约7.0至约7.5。而且，可能需要包括将会抑制微生物生长的试剂，诸如叠氮化钠或硫柳汞。为在含水状态下长时间储存，将需要将该溶液储存在约4℃下，或更优选地进行冷冻。当然，呈冷冻或粉末状态储存所述肽时，其实际上可例如以定量等份无限期储存，在使用前以预定量的水(优选蒸馏水)或缓冲液使其再水合。
本发明人考虑到本文公开的蛋白组合物作为局部或系统施用至田间作物、草、果树及蔬菜以及观赏植物的杀虫剂将会特别实用。在一个优选实施方案中，所述生物杀虫剂组合物包括表达本文公开的新型蛋白的油性可流动细菌细胞悬液。优选地，所述细胞为苏云金芽孢杆菌，然而，据考虑，表达本文公开的新型核酸区段并产生蛋白的任何这种细菌宿主细胞都是有用的，包括但不限于巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或假单胞菌。
在另一个重要实施方案中，该生物杀虫剂组合物包括水分散性粒剂。这种粒剂包含表达本文公开的新型蛋白的细菌细胞。优选的细菌细胞为苏云金芽孢杆菌细胞，然而，考虑到经本文公开的DNA区段转化并表达该蛋白的细菌也是有用的，诸如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或假单胞菌细胞。
在第三个重要实施方案中，该生物杀虫剂组合物包括可湿性粉末、粉剂、团块或胶态浓缩物。这种粉末包含表达本文公开的新型蛋白的细菌细胞。优选的细菌细胞为苏云金芽孢杆菌细胞，然而，考虑到经本文公开的DNA区段转化并表达该蛋白的细菌也是有用的，诸如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或假单胞菌细胞。可配制此类干燥形式的杀虫组合物从而在润湿时立即溶解，或替代地以控释、缓释或其他时间依赖性方式溶解。
在第四个重要实施方案中，所述生物杀虫剂组合物包括诸如上述表达所述蛋白的细菌细胞的水性悬浮液。此类水性悬浮液可作为在施用前稀释的浓缩储备液提供，或替代地作为即用型稀释液提供。
对于涉及施用细菌细胞的这些方法，含有所述蛋白基因的细胞宿主可以在任何方便的营养培养基中生长，其中DNA构建体提供了选择优势，从而提供选择性培养基使得基本上所有或所有细胞均带有苏云金芽孢杆菌基因。然后根据常规方式收获这些细胞。替代地，可在收获之前处理这些细胞。
当所述杀虫组合物包含表达目标蛋白的完整苏云金芽孢杆菌细胞时，可以多种方式配制这种细菌。通过与各种惰性材料诸如无机矿物质(页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(粉末状玉米穗轴、稻壳、板栗壳等)混合，它们可作为可湿性粉末、颗粒剂或粉剂使用。这些制剂可包括分散-粘着佐剂、稳定剂、其他杀虫添加剂或表面活性剂。液体制剂可以是水基或非水性的并作为泡沫、悬浮液、可乳化浓缩物等使用。各成分可包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
替代地，所述新型杀虫IRDIG蛋白或杀虫IRDIG蛋白衍生的毒素可通过天然或重组细菌表达系统在体外制备并分离以供随后田间施用。这种蛋白可存在于粗细胞裂解液、悬浮液、胶体等之中，或替代地可在配制成活性生物杀虫制剂之前纯化、提炼、缓冲和/或进一步加工。同样，在某些情况下，可能会期望从表达所述蛋白的细菌培养物中分离出晶体和/或孢子，并将此类晶体和/或孢子的溶液、悬浮液或胶体制剂作为活性生物杀虫剂组合物施用。
无论施用方法如何，以杀虫有效量施用一定量的活性组合物，这将根据诸如待防治的特定昆虫、待处理的特定植物或作物、环境条件及施用杀虫活性组合物的方法、速度和量等因素而改变。
可通过所需的农业上可接受的载体配制细菌细胞、晶体及/或孢子悬浮液或分离的蛋白组分而制成所述杀虫剂组合物。该组合物可在施用之前以适当手段配制，诸如冻干、冷冻干燥、脱水，或配制于水性载体、介质或合适的稀释剂，诸如盐水或其他缓冲液中。所配制的组合物可呈粉剂或颗粒物质形式，或于油(植物油或矿物油)中的悬浮液形式，或水或油/水乳剂形式，或可湿性粉末形式，或与任何其他适于农业施用的载体材料组合的形式。合适的农业载体可为固体或液体且在本领域中是熟知的。术语“农业上可接受的载体”包括所有佐剂，例如通常用于杀虫剂配制技术中的惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些对于杀虫剂配制的技术人员来说是熟知的。该制剂可与一种或多种固体或液体佐剂混合，并使用常规配制技术通过各种方式，例如通过均匀混合、共混和/或研磨该杀虫组合物与合适佐剂而制备。
本发明的杀虫组合物施用至目标昆虫的环境中，通常通过常规方法(优选地通过喷洒)施用到要保护的植物或作物的叶上及根际(植物根部周围的土壤)中。杀虫剂施用的强度和持续时间将依据待处理的特定害虫、作物的具体状况和特定的环境条件来设定。活性成分与载体的比例自然将取决于杀虫组合物的化学性质、溶解性和稳定性以及所考虑的特定制剂。
在某些情况下，诸如例如昆虫导致根部或茎部感染或向纤弱植被或观赏植物施用，其他施用技术例如喷粉、喷淋、浸泡、土壤注射、种子包衣、幼苗涂覆、喷洒、充气、喷雾、雾化等，也是可行的并且可能是必要的。这些施用程序对于本领域中的技术人员也是熟知的。
本发明的杀虫组合物可以单独用于本发明方法中或者与其他化合物(包括但不限于其他杀虫剂)组合使用。本发明方法也可连同其他处理方案诸如表面活性剂、去污剂、聚合物或缓释制剂一起使用。本发明的杀虫组合物可以配制成用于系统或局部使用。
用于环境、系统或土壤应用的杀虫组合物浓度将依据特定制剂的性质、施用方式、环境条件及生物杀灭活性的程度而广泛变化。通常，所述生物杀虫组合物将按重量计以至少约1％的浓度存在于施用的制剂中，且按重量计可高达并包括约99％。所述组合物的干燥制剂按组合物重量计可为约1％至约99％，而液体制剂按重量计通常可包含约1％至约99％或更多的活性成分。
杀虫制剂可以根据需要向特定植物或目标区域施用一次或多次，每公顷的典型田间施用量在约50g至约500g活性成分范围，或者约500g至约1000g，或者约1000g至约5000g或更多的活性成分范围。
可在本发明毒素的一级结构上进行修饰及改变，以产生编码它们并且仍获得有杀虫功能的分子的衍生物、类似物及突变体以及DNA区段，所述分子编码具有所需特征的蛋白或肽。在本发明的特定实施方案中，考虑到突变蛋白可用于增强蛋白的杀虫活性，因而增强植物细胞中重组转基因的杀虫活性或表达。氨基酸变化可以通过根据表2给出的密码子而改变核酸序列的密码子来实现。
表2
例如，在蛋白结构中某些氨基酸可以用其他氨基酸置换而没有可觉察到的与诸如例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点等结构相互结合的能力丧失。由于正是蛋白的相互作用能力和性质定义了该蛋白的生物学功能活性，所以可以在蛋白序列，和(当然)其基本DNA编码序列中产生某些氨基酸序列置换，仍然获得具有同样特性的蛋白。因此，发明人考虑到可在公开的组合物的肽序列中，或在编码所述肽的相应DNA序列中，做出各种变化而其生物学效用或活性没有可觉察到的丧失。
在做出此类变化时，可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白相互作用生物功能中的重要性在本领域中已得到一致认同。现已接受氨基酸的相对亲水特征促成所得蛋白的二级结构，其反过来又限定了该蛋白与其他分子间的相互作用，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。
已根据其疏水性和电荷特征，为每种氨基酸指定亲水指数，其为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
在本领域中已知某些氨基酸可被具有类似亲水指数或评分的其他氨基酸置换并且仍产生具有类似生物学活性的蛋白，即仍然获得生物功能等效的蛋白。在做出此类改变时，优选置换其亲水指数在±2以内的氨基酸，特别优选置换其亲水指数在±1以内的氨基酸，并且甚至更特别优选置换那些亲水指数在±0.5以内的氨基酸。
在本领域中还应理解类似氨基酸的置换可根据亲水性而有效进行。通过引用并入本文的美国专利第4,554,101号陈述受其相邻氨基酸亲水性控制的蛋白的最大局部平均亲水性与该蛋白的生物学特性相关。
如美国专利第4,554,101号中所述，已为氨基酸残基指定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-5+1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
应理解氨基酸可由具有类似亲水性值的另一氨基酸置换并且仍然获得生物学上等效的并且尤其是免疫学上等效的蛋白。在此类改变中，优选置换其亲水性值在±2以内的氨基酸，特别优选置换其亲水性值在±1以内的氨基酸，并且甚至更特别优选置换那些亲水性值在±0.5以内的氨基酸。
如上面所总结的，因此氨基酸置换通常是根据氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。将前述各种特征都纳入考虑的示例性置换是本领域技术人员熟知的并且包括：精氨酸与赖氨酸；谷氨酸与天冬氨酸；丝氨酸与苏氨酸；谷氨酰胺与天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸。
另一方面，由本发明提供的DNA序列信息允许制备具有与本文公开的选定多核苷酸基因序列特异性杂交的能力的相对较短的DNA(或RNA)序列。在这些方面中，基于对选定蛋白基因序列，例如，诸如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、69、70、72、74、76、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119及121中所示的序列的考虑来制备适当长度的核酸探针。此类核酸探针与编码蛋白的基因序列特异性杂交的能力赋予其在多个实施方案中的特定效用。更为重要的是，所述探针可用于多种测定中，用于检测给定样品中互补序列的存在。
在某些实施方案中，使用寡核苷酸引物是有利的。使用本发明的多核苷酸来设计此类引物序列，使用PCRTM技术检测、扩增或突变来自苏云金芽孢杆菌的蛋白基因的限定区段。来自其他物种的相关蛋白基因的区段也可使用此类引物通过PCRTM扩增。
本发明考虑到一种包含本发明的多核苷酸的表达载体。因此，在一个实施方案中，表达载体是包含可操作地连接到编码本发明多肽的编码区上的启动子的经分离和纯化的DNA分子，所述编码区可操作地连接到转录终止区，从而该启动子驱动编码区的转录。
如本文中所用，术语“可操作地连接”意指启动子以使得该编码区的转录受该启动子控制和调节的方式连接到编码区上。用于可操作地连接启动子与编码区的手段在本领域中是熟知的。
在一个优选实施方案中，编码本发明蛋白的DNA的重组表达优选是在芽孢杆菌宿主细胞中。优选的宿主细胞包括苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和相关芽孢杆菌，而苏云金芽孢杆菌宿主细胞是非常优选的。在细菌中作用的启动子在本领域中是熟知的。芽孢杆菌晶体蛋白的示例性优选启动子包括已知晶体蛋白基因启动子中的任一种，包括杀虫IRDIG蛋白基因启动子，以及对苏云金芽孢杆菌σ因子(诸如σE和σK)具有特异性的启动子。替代地，编码诱变或重组晶体蛋白的基因启动子可通过人工进行工程改造，并用于促进本文公开的新型基因区段的表达。
在一个替代实施方案中，编码本发明蛋白的DNA重组表达是使用经转化的革兰氏阴性细菌(诸如大肠杆菌或假单孢菌属宿主细胞)来进行的。在大肠杆菌和其他革兰氏阴性宿主细胞中在靶多肽的高水平表达中起作用的启动子也是本领域中熟知的。
本发明的表达载体用于转化植物时，选择在植物中具有驱动表达的能力的启动子。在植物中作用的启动子也是本领域中熟知的。可用于在植株中表达所述多肽的启动子为诱导型、病毒、合成、组成型启动子，以及时间调控、空间调控、时空调控型启动子。
还因其将转化植物细胞或转基因植物的转录活性引向编码区的能力来选择启动子。结构基因可通过植物组织中的各种启动子来驱动。启动子可以是近组成型(诸如CaMV35S启动子)，或影响双子叶或单子叶植物的组织特异性或发育特异性启动子。
与转化技术无关，优选将基因并入到通过在载体中包含植物启动子而适于在植物细胞中表达苏云金芽孢杆菌杀虫毒素基因和变体的基因转移载体中。除植物启动子外，来自多种来源的启动子也可以在植物细胞中有效用于表达外来基因。例如，可使用细菌来源的启动子，诸如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子；病毒来源的启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S启动子，等等。植物来源的启动子包括但不限于核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-伴大豆球蛋白启动子、菜豆球蛋白启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、热休克启动子、ADF(肌动蛋白解聚因子)启动子和组织特异性启动子。启动子还可含有某些可提高转录效率的增强子序列元件。典型的增强子包括但不限于ADH1-内含子1和ADH1-内含子6。可使用组成型启动子。组成型启动子在几乎所有细胞类型中并且在几乎所有时间指导连续基因表达(例如，肌动蛋白、泛素、CaMV 35S)。组织特异性启动子负责在特定细胞或组织类型中的基因表达，诸如种子(例如，玉米蛋白、油质蛋白、凝集素、油菜籽蛋白(napin)、ACP(酰基载体蛋白))，并且也可以使用这些启动子。也可以使用在植物发育的某一阶段期间有活性以及在特定植物组织和器官中有活性的启动子。此类启动子的实例包括但不限于根特异性、花粉特异性、胚特异性、玉米穗丝特异性、棉纤维特异性、种子内胚乳特异性、韧皮部特异性启动子等。
示例性的组织特异性启动子为玉米蔗糖合成酶1、玉米乙醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、豌豆小亚基RuBP羧化酶、Ti质粒甘露聚醣合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查耳酮异构酶、大豆富甘氨酸蛋白1、CaMV 35S转录物和马铃薯贮藏蛋白。优选的启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)启动子和S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
在某些情况下，可能需要使用诱导型启动子。诱导型启动子负责响应于诸如以下的特定信号的基因表达：物理刺激(例如热休克基因)；光(例如RUBP羧化酶)；激素(例如糖皮质激素)；抗生素(例如四环素)；代谢物；以及胁迫(例如干旱)。可使用在植物中起作用的其他所需转录和翻译元件，诸如5'非翻译前导序列、RNA转录终止序列和聚腺苷酸添加信号序列。许多植物特异性基因转移载体是本领域已知的。
将含有编码目标多肽的编码区的表达载体工程改造为处于凝集素启动子的控制下，并且使用例如原生质体转化方法将该载体引入植物中。该多肽的表达特别针对转基因植物的种子。
由经组织特异性启动子转化的植物细胞产生的本发明的转基因植物可与由经不同组织特异性启动子转化的植物细胞发育成的第二转基因植物杂交，产生在一种以上特定组织中显示出转化效应的杂交转基因植物。
表达载体及最终多肽编码区可操作地连接的启动子的选择直接取决于所需的功能特性，例如蛋白表达的位置和时间，以及待转化的宿主细胞。这些是在构建重组DNA分子领域中熟知的固有限制。然而，可用于实践本发明的载体能够指导与之可操作地连接的多肽编码区的表达。
可用于高等植物中的基因表达的典型载体在本领域中是熟知的，并且包括源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体。然而，已知几种其他植物整合载体系统在植物中起作用，包括pCaMVCN转移控制载体。pCaMVCN(可得自Pharmacia,Piscataway,N.J.)包括花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子。
在优选实施方案中，用于表达多肽的载体包括在植物细胞中有效的选择标记，优选为药物抗性选择标记。一个优选的药物抗性标记是其表达导致卡那霉素抗性的基因；即含有胭脂碱合酶启动子、Tn5新霉素磷酸转移酶II(npt II)与胭脂碱合酶3'非翻译区的嵌合基因。
RNA聚合酶通过发生聚腺苷酸化的位点来转录编码DNA序列。通常，位于聚腺苷酸化位点下游数百个碱基对处的DNA序列用于终止转录。那些DNA序列在本文中称为转录终止区。这些区域对于转录的信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化是必需的。
用于制备表达载体的手段在本领域中是熟知的。用于转化植物的表达(转化载体)以及制备那些载体的方法在美国专利第4,971,908、4,940,835、4,769,061及4,757,011中有描述，它们的公开内容通过引用并入本文。那些载体被修饰为包括根据本发明的编码序列。
已开发出多种通过互补粘性末端或平端而可操作地将DNA连接到载体上的方法。例如，将互补均聚物束添加到待插入的DNA区段上和载体DNA上。然后载体与DNA区段通过互补均聚物尾部之间的氢键连接形成重组DNA分子。
编码具有赋予细胞杀虫活性的多肽的编码区优选为编码杀虫IRDIG蛋白毒素的基因。
也考虑到了用本发明的表达载体转化的细菌、酵母细胞、植物细胞或植物。也考虑到了源自这种转化细胞或转基因细胞的转基因细菌、酵母细胞、植物细胞或植物。转化细菌和酵母细胞的手段在本领域中是熟知的。通常，转化手段与那些熟知的用于转化其他细菌或酵母(诸如大肠杆菌或啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的手段类似。
用于植物细胞DNA转化的方法包括农杆菌(Agrobacterium)介导的植物转化、原生质体转化、基因转移至花粉、注射至生殖器、注射至未成熟胚胎及粒子轰击。这些方法中的每一种都具有不同的优点和缺点。因此，一种将基因引入特定植物品系中的特定方法可能不一定对于另一植物品系是最为有效的，但熟知该方法对于特定植物品系是有用的。
有许多种将转化DNA区段引入细胞中的方法，但并不都适于将DNA递送至植物细胞中。认为合适的方法包括可将DNA引入细胞中的几乎任何方法，诸如农杆菌感染、DNA直接递送，例如通过PEG介导的原生质体转化、脱水/抑制介导的DNA摄入、电穿孔、碳化硅纤维搅拌、DNA包被粒子加速等。在某些实施方案中，加速方法是优选的并且包括例如微弹轰击等。
用于将DNA引入到细胞中的技术对于本领域中的技术人员是熟知的。已描述了四种将基因递送至细胞内的常用方法：(1)化学方法；(2)物理方法，诸如显微注射、电穿孔和基因枪；(3)病毒载体；以及(4)受体介导的机制。
更为优选的是对于添加的结构基因而言为纯合子的转基因植物；即含有两个添加基因，在染色体对的每条染色体上的相同位点各具一个基因的转基因植物。纯合子转基因植物可通过以下方法获得：使含有单个添加基因的独立分离的转基因植物性交配(自交)，使一些产生的种子萌发并且分析所产生的植物相对于对照(天然、非转基因)或独立分离的转基因植物增强杀虫活性。
应理解也可使两种不同的转基因植物交配以产生含有两种独立分离添加的外源基因的子代。适当后代的自交可以产生对于添加的编码目标多肽的两个外源基因而言为纯合子的植物。也考虑到了与亲本植物的回交以及与非转基因植物的异型杂交。
植物原生质体的转化可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法完成。
将这些系统应用于不同的植物品系取决于由原生质体再生出该特定植物的能力。已描述了由原生质体再生出禾谷类的说明性方法(WO1997/013843A1)。
为了转化无法由原生质体成功再生的植物品系，可以利用其他将DNA引入完整细胞或组织的方法。例如，可以实现禾谷类由未成熟胚或外植体的再生。另外，可以利用“粒子枪”或高速微弹技术。
用后一项技术，将DNA经细胞壁带入小金属粒子表面上的原生质体中。该金属粒子穿透细胞的多个层并因而允许对组织外植体内的细胞进行转化。
通过用含有重组杀虫IRDIG蛋白编码基因的区段来转化合适的宿主细胞(诸如植物细胞)，所编码的蛋白(即针对鞘翅目具有杀虫活性的细菌蛋白或多肽)的表达可导致形成昆虫抗性植物。
举例而言，使用诸如粒子轰击的方法可利用含有苏云金芽孢杆菌蛋白编码区和适当选择性标记的表达载体来转化植物胚细胞(诸如小麦或玉米细胞)的悬浮液，以将包被在微弹上的DNA递送至受体细胞内。然后由转化的表达杀虫IRDIG蛋白的胚性愈伤组织再生出转基因植物。
用本领域已知的其他细胞转化法，诸如农杆菌介导的DNA转移，也可实现转基因植物的形成。替代地，可通过直接将DNA转移至花粉，通过将DNA注射至植物生殖器，或通过直接注射DNA注射至未成熟胚，接着通过脱水干燥胚再水化，将DNA引入植物内。
由单个植物原生质体转化株或由各种转化的外植体再生、发育和栽培植物是本领域中熟知的。这个再生和生长过程通常包括以下步骤：选择转化细胞，培养那些个体化细胞通过通常的胚胎发育阶段到生根小植株阶段。转基因胚胎和种子同样被再生。之后将所产生的转基因生根幼芽被种植在适当的植物生长培养基，诸如土壤中。
由叶片外植体发育或再生出含编码由农杆菌引入的目标多肽的外来、外源基因的植物可通过本领域中熟知的方法来完成。在该程序中，转化株被培养在选择剂存在下并且在诱导所述植物品系中的幼芽再生的培养基中。
该程序通常在两到四个月内产生幼芽，然后将那些幼芽转移到含选择剂和抗生素的适当根诱导培养基以防止细菌生长。然后将在选择剂存在下生根形成小植株的幼芽移植到土壤或其他培养基以使根产生。这些程序根据所采用的特定植物品系而改变，此类改变是本领域熟知的。
优选地，再生植物自花授粉以提供纯合转基因植物，如前所述。此外，使得自再生植物的花粉与农业上重要的种子生长植物(优选近交系)杂交。相反，来自那些重要品系植物的花粉用于对再生植物授粉。使用本领域技术人员所熟知的方法栽培含所需多肽的本发明的转基因植物。
因此，本发明的转基因植物具有增加量的编码目标多肽的编码区(例如杀虫基因)。优选的转基因植物是独立分离株并能将该基因及其活性传给其后代。更优选的转基因植物对于该基因而言为纯合子，并且在性交时将该基因传给其所有子代。可将来自转基因植物的种子种植在田间或温室，并且所得性成熟的转基因植物自花受粉以产生真正的育种植物。来自这些植物的后代成为真正的育种系，举例而言，评价育种系在一系列环境条件下，优选在田间对昆虫增加的杀虫能力。发明人考虑到本发明在创造商业目的的转基因植物，包括玉米和各种草皮草、小麦、玉米、水稻、大麦、燕麦、各种观赏植物和蔬菜以及多种坚果和水果树和植物方面将特别实用。
本文提及或引用的全部专利、专利申请、临时申请和公开通过引用整体并入，并入的程度不与本说明书的明确教导不一致。
应了解本文所述的实施例和实施方案仅出于说明的目的，并且将对本领域技术人员建议鉴于此的各种修改或变化且包括在本申请的精神和范围内及所附权利要求的范围内。这些实施例不应视为限制。
除非另外指出，否则所有百分比均按重量计并且所有溶剂混合物比例均按体积计。所有温度均以摄氏度计。
实施例1
编码杀虫IRDIG蛋白的基因的分离
编码杀虫IRDIG蛋白的核酸分离自不同的苏云金芽孢杆菌菌株。设计聚合酶链反应(PCR)的正向和反向引物并用于扩增编码全长杀虫IRDIG蛋白的核苷酸序列(表3)。扩增片段亚克隆到蛋白表达载体骨架中。针对NCBI、Pfam及GenomeQuest数据库进行这些基因序列的BLAST搜索并未返回任何有重大意义的发现。这些序列搜索结果表明这些基因在所有已知的蛋白序列中是新型的。
使用标准克隆方法构建经工程改造以产生由天然和植物优化编码区(如下所述)编码的全长杀虫IRDIG蛋白毒素的荧光假单胞菌(Pf)表达质粒。从New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)获得限制性内切核酸酶，并将T4DNA连接酶(NEB；Ipswich,MA)用于DNA连接。在琼脂糖Tris-乙酸盐凝胶电泳之后，使用凝胶提取试剂盒(Qiagen,Venio,Limburg)纯化DNA片段。使用质粒试剂盒(Macherey-NagelInc,Bethlehem,PA)，按照供货商对于低拷贝质粒纯化的说明书，或使用Qiagen Plasmid PlusMidi (Qiagen,Hilden,Germany)进行质粒制备。
全部杀虫IRDIG蛋白经系统发育分析，并选择非冗余的代表性蛋白进行WCR活性验证。鉴定独特代表性杀虫IRDIG蛋白的开放读取框架(ORF)。使用分离自含有靶杀虫IRDIG蛋白的野生型苏云金芽孢杆菌菌株的基因组DNA作为模板，并使用表3中列出的引物，通过PCR扩增这些ORF。
表3
用于PCR以扩增在苏云金芽孢杆菌(Bt)或荧光假单胞菌(Pf)中克隆和表达的杀虫IRDIG蛋白的开放阅读框的引物
实施例2
植物密码子优化的杀虫毒素基因的设计
植物分子生物学领域的技术人员应理解，可设计多个DNA序列来编码单个氨基酸序列。增加目标蛋白编码区表达的常见手段是以一定方式定制编码区，使其密码子组成类似于基因注定会在其中表达的宿主的整体密码子组成。关于合成基因的设计和产生的指导可见于例如WO1997013402、美国专利第6166302号及美国专利第5380831号中。
设计并合成具有玉蜀黍密码子偏倚的DNA序列以在转基因单子叶植物中产生杀虫IRDIG蛋白。玉蜀黍(Zea mays L.)的密码子使用表由从GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中寄存的序列获得的数百个蛋白编码序列计算得到。在略去使用少于该氨基酸总密码子使用的约10％的任何同义密码子后，计算重新调整的玉蜀黍密码子集合。
对序列进行进一步改进以消除不合需要的限制酶识别位点、潜在植物内含子剪接位点、A/T或C/G残基的长序列(long run)以及可能干扰植物细胞内编码区的mRNA稳定性、转录或翻译的其他基序。进行其他变化以引入所需限制酶识别位点并消除长的内部开放阅读框(除+1以外的框架)。这些变化全部在保持玉蜀黍偏倚的重新调整的密码子组成的约束条件下进行。编码杀虫毒素的玉蜀黍优化的DNA序列作为SEQ ID NO:69、70、72、74和76而公开。
上文提供了几个根据本发明的经分离多核苷酸的实施方案，包括经密码子优化用于表达本发明的杀虫毒素多肽的多核苷酸。
实施例3
细菌宿主中编码杀虫IRDIG蛋白毒素的表达质粒的构建
使用标准克隆方法构建经工程改造以产生由天然和玉蜀黍优化编码序列编码的杀虫IRDIG蛋白毒素的荧光假单胞菌(Pf)表达质粒。从New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)获得限制性内切核酸酶，并将T4DNA连接酶(Invitrogen)用于DNA连接。使用质粒试剂盒(Macherey-Nagel Inc,Bethlehem,PA)，按照供货商说明书进行质粒制备。在琼脂糖Tris-乙酸盐凝胶电泳之后，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化DNA片段。线性化载体用南极磷酸酶(NEB)进行处理以增加重组分子的形成。
所产生的缺少天然调控元件序列的PCR产物分别克隆到pDAB122775中用以在B.t.宿主4Q7中表达以及pDOW1169中用以在Pf宿主中表达。用于B.t.和Pf系统的克隆位点为XbaI/XhoI或SpeI/XhoI。B.t.表达载体pDAB122775包括Cry1Ac晶体蛋白基因起动子(在B.t.细胞孢子形成期间表达)、核糖体结合位点(RBS)和Cry1Ac终止子，而在pDOW1169中这些靶基因表达由Ptac启动子和IPTG诱导所驱动。pDOW1169是一种低拷贝质粒，其具有RSF1010复制起点、pyrF基因以及在限制酶识别位点前的核糖体结合位点，含有蛋白编码区的DNA片段可引入至该限制酶识别位点内(美国专利第7618799号)。若在B.t.或Pf中不表达，则将其克隆到大肠杆菌表达载体内，诸如pET280(Kan)的SpeI/XhoI处。使用本领域中熟知的标准分子克隆程序产生构建体。
通过电穿孔将表达质粒(pDAB121093、127479、127480、127481、127482、127484、127485、127486、127487、127488、127489、127490、127491)转化至DC454(具有ΔpyrF和lsc::lacIQI突变的近野生型荧光假单胞菌菌株)或其衍生株内，在SOC大豆水解产物培养基中回收，并接种于选择性培养基(缺少尿嘧啶的M9葡萄糖琼脂，Sambrook等人，同上)上。
这些杀虫IRDIG蛋白的蛋白表达实验先在4Q7B.t.宿主中进行，接着在DPf10Pf宿主中进行。简言之，重组B.t.培养物于250-ml带挡板烧瓶中的50ml促进B.t.细菌孢子形成的Dow AgroSciences专有培养基肉汤中，在28℃/180-200rpm下生长24-32小时。通过在4℃下以6,000g离心15分钟，接着以10ml的1M NaCl、0.1％Triton X-100溶液洗涤，然后以35ml去离子水洗涤，收获晶体与内孢子的混合物。使最终团块悬浮于2ml去离子水中用于WCR摄食试验。经空载体pDAB122775转化的B.t.4Q7作为阴性对照被包括在内。
转化和选择方法一般在美国专利申请第20060008877号、美国专利第7681799号和美国专利申请第20080058262号中有描述，这些专利通过引用并入本文。通过小量制备质粒DNA的限制消化来鉴定重组菌落。
实施例4
杀虫IRDIG蛋白样品的制备
用于表征及昆虫生物测定的杀虫IRDIG蛋白的生产通过摇瓶生长的携带表达构建体菌株DPf46314、48284、48285、48286、48287、48289、48290、48291、48292、48293、48294、48295、48296的荧光假单胞菌菌株来实现。储存的菌株甘油原液用于接种成分确定的具有9.5％甘油的培养基(Teknova目录号3D7426,Hollister,CA)。于30℃振荡下初始培养24小时后，通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导杀虫基因的表达。在诱导时及诱导后的不同时间对培养物进行取样。通过在600nm的光密度(OD600)来量测细胞密度。也可以利用适于荧光假单胞菌生长的其他培养基，例如，如美国专利申请第20060008877号所述。分析诱导前及诱导后的样品在裂解和提取程序之后，在细胞可溶性和不溶性部分中的靶蛋白表达。为了估计表达程度，使用GE Image Scanner III(GE Healthcare)进行光密度测定分析。使用ImageQuant TL软件(GE Healthcare)并以BSA作为标准品来检测蛋白条带并定量。杀虫IRDIG蛋白作为包含体(IB)积聚于裂解细胞的不溶性部分中。细胞在液氮中速冻并储存于-80℃。
杀虫IRDIG蛋白的包含体(IB)制备。表达全长杀虫IRDIG蛋白的Pf源细胞浆从-80℃储存环境转移至室温下。取出各约10g并且按20％w/v重悬于冷的裂解缓冲液(40mL的50mM Tris、200mM NaCl、10％甘油、0.5％Triton X-100、20mM EDTA、1mM DTT，pH 7.5)中。再悬浮的团块在与0.4mg/ml的溶菌酶一起摇动的同时于室温下孵育20分钟。之后添加0.1mg/mL的DNA酶与0.1M MgCl2，并进一步于30℃下在水浴中孵育20分钟。使用Branson超声波仪对样品进行超声处理1分钟(占空比-60、输出控制4)，随后于JA-17转子中以16,000rpm离心30分钟。使团块于20％w/v含金属珠粒的冷的裂解缓冲液中再次再悬浮2次。最后的两次洗涤使用不存在triton-x-100的裂解缓冲液进行，上清液为无色且IB团块变得结实且颜色变成灰白色。将包含体重悬于含有10mM EDTA的pH 8.0的无菌过滤蒸馏水中，等分为1.5mL并冷冻于-80℃直至需要时。
包含体溶解。包含体在室温下于水浴中解冻。使包含体于0.1M CAPS pH 11中达到10mL，随后以输出控制4、占空比40％进行超声处理1分钟。溶解的蛋白于JA-17转子中以16,000rpm离心20分钟。用15mL Amicon 3K MWCO浓缩样品以得到约2mL的最终体积，并通过添加18mL 10mM CAPS pH 11进行缓冲液交换并将其浓缩至2mL。在这之后在先前已使用10mMCAPS pH 11平衡的PD10柱上脱盐。
通过SDS-PAGE分析从IB制剂纯化的杀虫IRDIG蛋白。由氨基酸序列测定分子量。通过将目标条带的光密度值与在同一凝胶上电泳以产生标准曲线的牛血清白蛋白(BSA)样品进行比较来进行这些条带的定量。
上文提供了经分离的多核苷酸，包括根据本发明的核酸构建体和经分离的杀虫多肽。
实施例5
蛋白杀虫活性
测试了杀虫IRDIG蛋白并且发现对鞘翅目昆虫西方玉米根虫(玉米根萤叶甲LeConte)的幼虫具有杀虫活性。
试验昆虫为一龄西方玉米根虫(WCR)(孵化后<24小时)，即玉米根萤叶甲。非休眠玉米根萤叶甲虫卵(Crop Characteristics,Inc.,Farmington,MN)于28℃和60％相对湿度下孵育10天。按照Pleau等人(2002)的方法用10％福尔马林(formalin)对黑头虫卵进行表面消毒。鳞翅目试验昆虫包括秋行军虫(FAW)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(J.E.Smith)、玉米穗虫(CEW)、玉米夜蛾(Heliothis zea)(Boddie)、欧洲玉米螟(ECB)、玉米螟(Ostrinia nubilalis)(Hübner)、大豆夜蛾(SBL)、黄豆银纹夜蛾(Chrysodeixisincludenss)。
使用48孔WCR生物测定形式进行蛋白生物测定。在此测定中，非滞育WCR虫卵(CropCharacteristics Inc.,Farmington,MN)于28℃下在土壤中孵育10天。用水从土壤中洗出这些虫卵，用10％甲醛进行表面消毒，并用无菌水冲洗三次。孵化这些虫卵并以DowAgroSciences专有WCR食物喂养。在48孔滴定板上进行覆盖食物生物测定，每个孔含有0.75ml人工WCR食物。每个试验等分试样按40uL/孔吸移到8孔的食物表面上(0.95cm2)，并在室温下于层流中干燥。用两只新生玉米根萤叶甲(24-48小时大)侵扰每孔中经处理的食物表面，以用于微滴定板(USA Scientific,Orlando,FL)的Breathe透气密封膜将试验昆虫封闭在生物测定场所。阴性对照为20mM柠檬酸钠缓冲液，pH 3.5；10mM CAPS缓冲液，pH 11；阳性对照是在柠檬酸钠缓冲液中的100ug/cm2Cry34/35Ab1。
将生物测定托盘保持在受控环境条件(28℃、60％相对湿度、16:8小时光照/黑暗)下5天。记录全部昆虫测定中暴露于每种蛋白样品的昆虫总数、死亡昆虫数目和存活昆虫的重量。经称重为0.1mg的幼虫被视为濒死昆虫且包括在实际死亡百分比的计算中。生长抑制作用如下计算：
GI＝[1–(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]
其中TWIT为处理中的昆虫总重量，TNIT为处理中的昆虫总数，TWIBC为背景检查(缓冲液对照)中的昆虫总重量，而TNIBC为背景检查(缓冲液对照)中的昆虫总数。生物测定在随机化完全区组设计下进行并且重复至少4次，每次重复用16只玉米根萤叶甲幼虫。用ANOVA及平均值分离，使用Tukey HSD(Pr>0.05)对数据进行分析。在进行剂量反应分析时，使用非线性逻辑3-参数模型确定生长抑制浓度-反应曲线，并估计造成50％生长抑制所需的有效浓度(GI50)。这些分析使用JMP Pro 9.0.3版软件(SAS Institute Inc.,Cary,NC)进行。使用POLO-PC(LeOra软件)进行所并合的实际死亡率数据的Probit分析，以估计浓度-反应曲线的50％致死浓度(LC50)。
与阴性对照相比，杀虫IRDIG蛋白明显有效。IRDIG28686、28684和28682在试验浓度下的功效与阳性对照Cry34/35Ab1相当(表5)。
表5示出了WCR在暴露于不同浓度的杀虫IRDIG蛋白时的实际平均死亡率百分比和平均生长抑制百分比。
表5
a根据Tukey HSD，每一列中平均值后的字母相同者差异不显著(p>0.05)。
表6示出了WCR在暴露于100μg/cm2浓度的杀虫IRDIG蛋白时的实际平均死亡率百分比和平均生长抑制百分比
表6
a根据Tukey HSD，每一列中平均值后的字母相同者差异不显著(p>0.05)。
IRDIG28682、IRDIG28686和IRDIG28688显示出最高的死亡率百分比和生长抑制百分比，并且与Cry34/35阳性对照无显著差异。与对照相比，IRDIG28684和IRDIG28642显示出显著的死亡率和生长抑制。与各个对照相比，IRDIG28674、IRDIG28672、IRDIG28692、IRDIG28694和IRDIG28676显示出显著的生长抑制。
IRDIG27642和IRDIG28686在2.6至168μg/cm2范围内的一系列浓度下进行试验，并且WCR活性提供了足够的数据用于剂量反应分析(表6和7)。在21、42、84和168μg/cm2的剂量下，IRDIG28686的实际死亡率百分比存在显著差异。对于IRDIG27642在10.5、42、84、168μg/cm2剂量下，以及对于IRDIG28686在21、42、84和168μg/cm2剂量下，确定有显著的生长抑制。
表7示出了在48孔生物测定形式中杀虫IRDIG蛋白对于WCR的剂量反应。
表7
a根据Tukey HSD，每一列中平均值后的字母相同者差异不显著(p>0.05)。
表8示出了在48孔生物测定形式中IRDIG27642和IRDIG28686杀虫IRDIG蛋白的LC50和GI50。
表8
*CI＝置信区间
表9示出了WCR在暴露于33μg/cm2浓度的IRDIG蛋白时的实际死亡率百分比和生长抑制百分比。
表9
IRDIG28686、IRDIG28682、IRDIG 28684和IRDIG 28688展现出与阳性对照类似的生长抑制。当与对照相比时，IRDIG28674和IRDIG28646在生长抑制方面显示出显著差异。IRDIG28686、IRDIG28682、IRDIG 28684和IRDIG 28688的死亡率百分比与对照有显著差异。
表10示出了WCR在暴露于11μg/cm2浓度的IRDIG蛋白时的实际死亡率百分比和生长抑制百分比。
表10
与对照相比，IRDIG28686和IRDIG28682的实际死亡率百分比显著更高。IRDIG28686和IRDIG 28684的生长抑制百分比显著更高。
对于鳞翅目，在128孔的生物测定托盘(C-D International,Pitman,NJ)中进行生物测定。将40uL蛋白样品等分试样递送至每个孔中的多种鳞翅目食物(SouthlandProducts,Lake Village,AR)的表面上。经处理的托盘经风干，并且将一只单独幼虫(孵化后24至48小时)放置在经处理的食物表面。每次重复，每份样品用八只幼虫进行试验。进行两至三次重复。然后将经侵扰的孔用带孔以容许气体交换的透明塑料胶带(C-DInternational,Pitman,NJ)密封。阴性对照是未经处理的食物表面、水、10mM CAPS缓冲液(pH 10.5)以及于CAPS缓冲液中的9ug/cm2BSA，而阳性对照是于CAPS缓冲液中的0.03ug/cm2Cry1A以及于CAPS缓冲液中的0.12μg/cm2Cry1Fa。
来自包含体的富集杀虫IRDIG蛋白对鳞翅目昆虫进行测试，对于美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)(玉米穗虫(CEW))、玉米螟(欧洲玉米螟(ECB))、草地贪夜蛾(秋行军虫(FAW))及黄豆银纹夜蛾(大豆夜蛾(SBL))，按照与上述那些类似的方法。IRDIG27642杀虫毒素活性在死亡率或生长抑制方面与阴性对照无显著差异。
上文描述了根据本发明应用经分离的杀虫多肽和防治鞘翅目害虫种群的方法。
实施例6
蛋白对Cry3Bb抗性WCR的杀虫活性
用经选择和未经选择的Cry3Bb WCR品系产生的幼虫，以及非滞育WCR对照系，对杀虫IRDIG蛋白进行生物测定。非滞育WCR对照虫卵(Crop Characteristics Inc.,Farmington,MN)、Cry3Bb选择的WCR虫卵(Meihls等人，2008和2012)和Cry3Bb未选择的WCR虫卵以与上述制备48孔WCR生物测定形式相似的方式处理。Cry3Bb未选择的WCR虫卵是源自South Dakota的尚未曝光的实验室种群。
计算实际死亡率(死亡的加上濒死的昆虫)和生长抑制百分比。对照死亡率不应超过20％。生物测定在完全随机化设计下进行并且重复3-4次，每次重复用16只玉米根萤叶甲幼虫。使用Tukey-Kramer HSD检验，用单因素方差分析(ANOVA)和平均值分离分析实际死亡率和生长抑制百分比(P>0.05)。
实施例7
WCR中肠液和玉米根汁的蛋白处理
中肠液收集。约150只西方玉米根虫(WCR)三龄幼虫购自Crop Characteristics。昆虫随玉米根一起运输。在光学显微镜下使用解剖刀移除幼虫的后端和前端。使用镊子，拉出肠管并储存于缓冲液(含有8.5％蔗糖的0.15M NaCl过滤无菌缓冲液)内并保持在冰上。
通过WCR中肠液消化蛋白的程序。西方玉米根虫(WCR)活性蛋白(IRDIG)稳定性在12μg WCR肠汁的存在下进行分析，以确定潜在裂解(活化或非活化)位点。由假单胞菌表达和纯化的蛋白与WCR肠汁或提取物于30℃下一起孵育20小时。依据蛋白酶活性试验而选择WCR浓度和7.5的pH值(由10X原液稀释成最终浓度50mM Tris pH 7.5、0.15M KCl、0.015MCaCl2)。
添加蛋白酶抑制剂终止反应。然后将30μl反应溶液与10μl的LDS缓冲液(10mMTCEP)混合，并使用MES运行缓冲液装填到4-12％PAGE凝胶上。结果表明WCR和玉蜀黍根提取物(MRE)处理显著量的WCR活性。印染相同凝胶以允许通过Edman N端测序法来鉴定裂解基序。
通过玉米根汁进行蛋白消化的程序
用WCR中肠液处理100ug/cm2杀虫IRDIG27642蛋白，并按照48孔形式的生物测定方法(如实施例5，蛋白杀虫活性中所述)而针对WCR测试玉米根汁。
实施例8
农杆菌转化
使用标准克隆方法构建二元植物转化和表达质粒。自NEB获得限制性内切核酸酶及T4DNA连接酶。使用质粒制备试剂盒或AX Xtra Midi试剂盒(均来自Macherey-Nagel)，按照生产商说明书进行质粒制备。在凝胶分离之后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒或QIAEX II凝胶提取试剂盒(均来自Qiagen)纯化DNA片段。
包含编码杀虫IRDIG蛋白的核苷酸序列的DNA由商业供应商(例如DNA2.0,MenloPark,CA)合成并且作为克隆片段于质粒载体中提供。编码其他杀虫IRDIG蛋白的其他DNA序列通过对含有适当核苷酸序列的构建体的标准分子生物学操纵而获得。
将杀虫IRDIG蛋白的全长或经修饰的编码序列(CDS)亚克隆到植物表达质粒中的适当位点。利用例如技术或标准限制酶片段克隆程序，将处于植物表达元件(例如，植物可表达启动子、3'端转录终止及聚腺苷酸添加决定簇等)的控制下的含有适当编码区的所得植物表达盒亚克隆至二元载体质粒中。若利用技术，则例如LRClonaseTM(Invitrogen)可用于将全长和经修饰的基因植物表达盒重组到二元植物转化质粒中。当质粒存在于大肠杆菌和农杆菌细胞中时，二元植物转化载体包括赋予对抗生素壮观霉素的抗性的细菌选择性标记基因。二元载体质粒还包括在所需宿主植物中具功能性的植物可表达的选择性标记基因，即编码对抗生素卡那霉素、新霉素和G418的抗性的转座子Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aphII)。
制备根癌农杆菌菌株Z707S(Z707的链霉素抗性衍生物)的电感受态细胞并使用电穿孔转化(Weigel和Glazebrook，2002)。电穿孔之后，将1mL的YEP肉汤(gm/L：酵母提取物，10；蛋白胨，10；NaCl，5)添加至比色皿中，并将细胞-YEP悬浮液转移至15mL培养管中，在28℃下于水浴中恒定搅拌孵育4小时。将细胞接种在具有壮观霉素(200μg/mL)和链霉素(250μg/mL)的YEP+琼脂(25gm/L)上，并将该板在28℃下孵育2-4天。选择很好分离的单个菌落，于具有壮观霉素和链霉素的新鲜YEP+琼脂版上划线，并在28℃下孵育1-3天。
通过使用载体特异性引物与由选定农杆菌菌落制备的模板质粒DNA，通过PCR分析确认二元植物转化载体中杀虫毒素基因插入物的存在。使用Qiagen Spin Mini Preps按照生产商说明书进行，从如前所述在具有壮观霉素和链霉素的YEP中生长的15mL过夜培养物的4mL等分试样提取细胞团块。来自用于农杆菌电穿孔转化的二元载体的质粒DNA作为对照包括在内。使用来自Invitrogen的Taq DNA聚合酶，按照生产商说明书在0.5X浓度下完成PCR反应。PCR反应在用以下条件编程的MJ Research Peltier热循环仪中进行：步骤1)94℃，3分钟；步骤2)94℃，45秒；步骤3)55℃，30秒；步骤4)72℃，每kb预期产物长度设为1分钟；步骤5)返回步骤2，29次；步骤6)72℃，10分钟。反应在循环之后维持在4℃下。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳(例如，0.7％至1％琼脂糖，w/v)分析并通过溴化乙锭染色而可视化。选择PCR产物与质粒对照一致的菌落。
通过农杆菌操纵领域中的技术人员熟知的标准分子生物学方法，对从候选农杆菌分离株制备的质粒DNA进行限制性消化指纹图谱测定，确认了另一含有杀虫毒素基因插入物的二元植物转化载体。
上文公开了包含编码根据本发明的杀虫毒素多肽的多核苷酸的核酸构建体。
实施例9
双子叶植物中杀虫毒素的产生
拟南芥属(Arabidopsis)转化使用浸花法转化阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)Col-01(Weigel和Glazebrook，2002)。使用选定农杆菌菌落接种1mL至15mL含有用于选择的适当抗生素的YEP肉汤培养物。培养物于28℃在220rpm恒定搅拌下孵育过夜。使用每种培养物接种两份500mL含有用于选择的适当抗生素的YEP肉汤培养物，且新培养物于28℃在恒定搅拌下培养过夜。细胞在室温下以大约8700x g团块化10分钟，且弃去所得上清液。将细胞团块轻轻地重悬于500mL渗透培养基中，所述培养基含有：1/2x Murashige和Skoog盐(Sigma-Aldrich)/Gamborg B5维生素(Gold BioTechnology,St.Louis,MO)、10％(w/v)蔗糖、0.044μM苯甲基氨基嘌呤(10μL/升在DMSO中的1mg/mL原液)和300μL/升的Silwet L-77。将大约1月龄的植物浸入培养基中15秒，小心确保浸没最新的花序。然后，将植物侧放且覆盖(透明或不透明)24小时，用水洗涤并竖放。使植物于22℃下在16小时光照/8小时黑暗的光周期下生长。在浸渍大约4周后采收种子。
拟南芥属的生长及选择。使新鲜采收的T1种子在干燥剂存在下于室温干燥至少7天。将种子悬浮在0.1％琼脂/水(Sigma-Aldrich)溶液中，然后在4℃下2天分层。为准备种植，将10.5英寸x21英寸发芽托盘(T.O.Plastics Inc.,Clearwater,MN)中的Sunshine MixLP5(Sun Gro Horticulture Inc.,Bellevue,WA)以细蛭石覆盖，用霍格兰(Hoagland)氏溶液分灌至湿润，然后使其排水24小时。将分层种子播种于蛭石上并用湿穹顶(KORDProducts,Bramalea,Ontario,Canada)覆盖7天。在120-150μmol/m2s光强度的长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)以及恒定温度(22℃)和湿度(40-50％)下，于ConvironTM生长箱(CMP4030或CMP3244型；Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中使种子发芽并且使植物生长。最初为植物喷淋霍格兰氏溶液且随后喷淋去离子水，以保持土壤湿润但不潮湿。
播种5-6天后移除穹顶并向植物喷洒化学选择剂，以杀伤由未转化种子发芽的植物。例如，若由二元植物转化载体提供的植物可表达的选择性标记基因为bar基因，则可通过喷洒Finale(5.78％草铵膦，Farnam Companies Inc.,Phoenix,AZ.)的1000X溶液来选择经转化的植物。间隔5-7天进行两次后续喷洒。在最终喷洒7-10天后鉴定存活者(活跃生长的植物)，并移植到准备有Sunshine Mix LP5的盆中。移植的植物用湿穹顶覆盖3-4天，并置于上述生长条件下的ConvironTM生长箱中。
双子叶植物转化领域中的技术人员应理解，当使用其他植物可表达的选择性标记基因(例如，除草剂耐受性基因)时，可用其他选择转化植物的方法。
转基因拟南芥的昆虫生物测定：证明表达杀虫毒素蛋白的转基因拟南芥品系在人工食物覆盖测定中对敏感昆虫物种具有活性。自转基因和非转基因拟南芥品系提取的蛋白通过适当方法定量并调节样品体积以使蛋白浓度归一化。如上所述对人工食物进行生物测定。非转基因拟南芥和/或缓冲液和水作为背景检验处理包括在测定中。
上文提供了制备和使用包含根据本发明的杀虫毒素多肽的转基因植物的方法。
实施例10
单子叶植物中杀虫IRDIG毒素的产生
农杆菌介导的玉蜀黍转化。在农杆菌介导的转化之后，产生了通过稳定整合至植物基因组内的嵌合基因的表达而产生一种或多种杀虫IRDIG蛋白的转基因玉蜀黍细胞、组织和植物。采用二元转化载体的玉蜀黍转化方法是本领域已知的，如例如美国专利第8,304,604号中所述，该专利通过引用整体并入本文。根据在含有吡氟氯禾灵(Haloxyfop)的培养基上生长的能力来选择经转化的组织，并视情况针对蛋白产生情况进行筛选。将部分此类经转化的组织培养物提供给昆虫幼虫以用于生物测定，基本上如实施例5中所述。
农杆菌培养开始。含有项目载体的宿主根癌农杆菌菌株DAt13192(缺少RecA的三元菌株)的甘油原液得自DAS重组培养物保存中心(RCC)。将农杆菌培养物从甘油原液中划线接种到AB基本培养基上，并在黑暗中于20℃下孵育3天。然后将农杆菌培养物划线接种到YEP培养基板上，并在黑暗中于20℃下孵育1天。
实验当天，以适于实验中的构建体数目的体积制备接种培养基和乙酰丁香酮的混合物。将接种培养基吸移到250mL一次性无菌烧瓶中。按适于使最终乙酰丁香酮浓度为200μM的体积，将溶于100％二甲亚砜的1M乙酰丁香酮储备液添加到装有接种培养基的烧瓶中。
对于每个构建体，将1-2个接种环的来自YEP平板的农杆菌悬浮于50ml无菌一次性离心管内的15ml接种培养基/乙酰丁香酮混合物中，并且在分光光度计中测定溶液在600nm下的光密度(O.D.600)。然后使用另外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬浮液稀释至0.25-0.35O.D.600。然后在使用前将农杆菌悬浮液管水平放置于设定为约75rpm、室温下的平台摇床上1至4小时。
穗消毒和胚分离。玉蜀黍栽培品种B104的穗于温室设施内产生并于授粉后10-12天采收。将采收的穗脱壳并通过浸入市售漂白剂(Ultra杀菌漂白剂，6.15％次氯酸钠)加上两滴肥皂水的20％溶液中表面灭菌20分钟，然后在层流罩内以无菌去离子水冲洗三次。将未成熟的合子胚(1.8-2.2mm长)从每个穗上无菌切除，分配到一个或多个装有2.0mL农杆菌悬浮液的微量离心管中，已向其中添加2μl的10％S233表面活性剂。
农杆菌共培养。胚分离活动一旦完成，就将含胚的管闭合并放置在摇床平台上5分钟。然后将管的内容物倒在共培养培养基平板上，用无菌的一次性移液管取出液体农杆菌悬浮液，并使用显微镜将胚定向为盾片朝上。然后将平板闭合，用3M Micropore胶带密封并放置在25℃、24小时/天光照、约60μmol m-2s-1光合作用有效辐射(PAR)的培养箱中。
转基因事件的愈伤组织选择和再生。在共培养期后，将胚转移到静息培养基。向每个平板转移不超过36个胚。将平板于27℃、24小时/天光照、约50μmol m-2s-1的PAR下孵育7-10天。然后将愈合胚转移至选择I培养基。向每个选择I平板转移不超过18个愈合胚。将平板于27℃、24小时/天光照、约50μmol m-2s-1的PAR下孵育7天。然后将愈合胚转移至选择II培养基。向每个选择II平板转移不超过12个愈合胚。将平板于27℃、24小时/天光照、约50μmolm-2s-1的PAR下孵育14天。
在此阶段，将抗性愈伤组织移到预再生培养基。向每个预再生平板转移不超过9个愈伤组织。将平板保持在27℃、24小时/天光照、约50μmol m-2s-1的PAR下7天。然后将再生性愈伤组织转移到PhytatraysTM(Sigma-Aldrich)中的再生培养基上，在28℃、每天16小时光照/8小时黑暗、约150μmol m-2s-1PAR下孵育7-14天，或直到发出芽为止。在每个PhytatrayTM中放置不超过5个愈伤组织。然后分离具有初生根的小芽并转移到芽/根培养基上。将6cm或更高的生根小植株移植到土壤中，并移出到生长箱中进行健化。
根据在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力选择的经转化的植物幼芽从PhytatraysTM移植到装满生长培养基(ProMix BX；Premier Tech Horticulture)的小盆中，用杯子或HUMI-DOMES(ARCO PLASTICS)覆盖，然后在Conviron生长箱中健化(白天27℃/夜间24℃、16小时光周期、50-70％相对湿度、200μmol m-2s-1PAR)。在一些情况下，使用设计用于检测整合到玉蜀黍基因组中的除草剂耐受性基因的引物，通过定量实时PCR测定来分析推定的转基因小植株的转基因相对拷贝数。另外，使用RNA qPCR测定检测推定转化株所表达的dsRNA中接头序列的存在。然后将选择的经转化小植株移到温室中，以便进一步生长和试验。
在温室中转移并建立T0植物用于生物测定与种子生产。将植物从PhytatraysTM移植到装满生长培养基(Premier Tech Horticulture,ProMix BX,0581P)的小盆(T.O.Plastics,3.5”SVD,700022C)，并用Humidome覆盖以使植物驯化。将植物置于Conviron生长箱(28℃/24℃、16小时光周期、50-70％相对湿度、200μmol m-2s-1PAR)，直至其达到V3-V4期。这可帮助植物适应土壤和更严酷的温度。然后将植物移到温室(曝光类型：光合或同化；强光限制：1200μmol m-2s-1PAR；16小时昼长；白天27℃/夜间24℃)，并于昆虫生物测定之前从小盆移植到TINUSTM350-4(Spencer-Lemaire Industries,Acheson,Alberta,Canada)，每次每个中移植一株植物。每个构建体测试约30次。移植到约四天后，侵扰V3-V4期植物以进行生物测定，每株植物随时准备孵化150颗西方玉米根虫卵(Crop Characteristics LLC,Farmington,MN)。所述生物测定于温室中进行2周，然后按照Oleson等人(2005)所推荐且经改良后的方法对每个事件进行分级。
根部损伤评级(修改自Oleson等人，2005)
0.00＝无损伤
0.01＝只有一些轻微的摄食
0.02＝摄食痕迹明显-非常轻的掘进或凿沟&没有根部被吃掉至茎4cm内(被吃掉至茎4cm内的根部被认为是“剪除的根部”)
0.05＝严重结疤或者当只有整个根系上若干根部尖端受伤时
0.10＝一条根被剪除
0.25＝2-3条根被剪除或1/4的根被剪除
0.50＝4-5条根被剪除，在根系外侧部分上有相当多的摄食损伤；1/2的根节被剪除
0.75＝条6+根被剪除，但在根系外侧部分上有大量摄食；3/4的根节被剪除
1.00＝根部的至少一个完整根节被剪除
近交B104和7SH382阴性对照始终提供0.5至1.0的根部评级(高度损伤)。保存提供0.5单位的根部评级或更低评级的T0事件并移植到5加仑的盆内以产生种子。
通过用从非转基因近交系B104植物或其他适当的花粉供体收集的花粉对T0转基因植物的穗丝授粉并种植所得种子而获得T1代植物。在可能时进行互交。按照用于T0事件昆虫生物测定中的程序来测试选择性T1事件针对西方玉米根虫的根部保护作用。
上文提供了制备和再生包含根据本发明的杀虫毒素多肽的转基因植物的方法。
叶片采样用于Western印迹分析。植物在V-3至V-5期进行采样。将两份6mm直径的叶片样品于-80℃储存在96孔集群管架中直至分析当日。向每根管添加两个DaisyTM钢质BB和300μl提取缓冲液(含有0.05％的Tween 20和5ul/ml的Sigma蛋白酶抑制剂的PBS溶液，目录号9599)。将样品在Kelco珠磨机中以最大设置碾磨3分钟。将样品在3,000xg下离心5分钟；将100μl上清液转移到空的样品管中。将另外100μl提取缓冲液添加到植物样品中，并且再珠磨3分钟，离心并将100μl该提取物与第一次的100μl合并。合并的上清液在提取的同一天混合并分析。
Western印迹(定性方法)：将常规电泳和印迹法与InvitrogenTM装置和基本试剂一起使用。Dow AgroSciences的兔抗IRDIG27642抗体是用于检测叶片组织中的IRDIG27642的一抗。用CY-3荧光检测系统检测所有蛋白。
实施例11
转基因玉蜀黍的生物测定
通过常规生物测定方法(参见，例如Huang等人，2006)来证明植物细胞中产生的杀虫毒素的生物活性。在一项功效测定中，在受控饲养环境下将源自产生杀虫毒素的植物的各种植物组织或植物碎片喂食给目标昆虫。在另一项生物活性测定中，由源自产生杀虫毒素的植物的各种植物组织制备蛋白提取物，并将提取的蛋白并入人工食物生物测定中。将每项饲喂测定的结果与类似进行的采用来自不产生杀虫毒素的宿主植物的适当对照组织或其他对照样品的生物测定进行比较。
实施例12
包含杀虫IRDIG蛋白的转基因大豆(Glycine max)
通过农杆菌介导的转化作用产生10至20株带有包含杀虫IRDIG蛋白的核酸的表达载体的转基因T0大豆植物。用氯气将成熟大豆(Glycine max)种子消毒十六小时过夜。用氯气消毒之后，将种子置于LaminarTM层流罩内的开放容器中以驱散氯气。接着，使用黑盒，在黑暗中于24℃下使消过毒的种子吸收无菌H2O十六小时。
制备种子分裂的大豆。分裂的包含一部分胚轴的大豆种子的实验方案，需要准备大豆种子材料，使用固定在解剖刀的10号刀片沿着种子的脐纵向切开大豆种子材料以分离并去除种皮，并将种子分裂成两个子叶部分。小心地移除部分胚轴，其中约1/2–1/3的胚轴保持附着于子叶的节端。
接种。然后将分裂的包含部分胚轴的大豆种子浸入根癌农杆菌(例如，菌株EHA101或EHA 105)的溶液中约30分钟，所述根癌农杆菌含有包含杀虫IRDIG蛋白的二元质粒。在浸渍包含胚轴的子叶之前，将根癌农杆菌溶液稀释到λ＝0.6OD650的最终浓度。
共培养。接种后，使分裂的大豆种子与根癌农杆菌菌株在盖有一张滤纸的陪氏培养皿(Petri dish)中的共培养培养基(Wang,Kan.Agrobacterium Protocols.2.1.NewJersey:Humana Press,2006.Print.)上共培养5天。
幼芽诱导。在共培养5天之后，将分裂的大豆种子置于由B5盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、100mg/L TIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟(cefotaxime)和50mg/L万古霉素组成的幼芽诱导(SI)液体培养基(pH 5.7)中洗涤。然后将分裂的大豆种子置于由B5盐、B5维生素、7g/L诺布尔琼脂、28mg/L亚铁、38mg/LNa2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、50mg/L TIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素组成的幼芽诱导I(SI I)培养基(pH 5.7)上培养，其中子叶的平坦一侧朝上，而子叶的节端埋入培养基中。在培养2周之后，将来自经转化的分裂大豆种子的外植体转移到幼芽诱导II(SI II)培养基中，该培养基含有补充了6mg/L草铵膦的SI I培养基。
幼芽伸长。在SI II培养基上培养2周之后，将子叶从外植体去除，通过在子叶基部产生切开而切除含有胚轴的齐平芽垫。将分离自子叶的芽垫转移到幼芽伸长(SE)培养基上。该SE培养基由MS盐、28mg/L亚铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖和0.6g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L玉米素核苷、50mg/LTIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素、6mg/L草铵膦、7g/L诺布尔琼脂组成，(pH5.7)。每2周将培养物转移到新鲜的SE培养基上。培养物于24℃的ConvironTM生长箱中，以18小时光周期，在80-90μmol/m2s的光强度下生长。
生根。从子叶芽垫发育的伸长幼芽，通过在子叶芽垫基部切割伸长幼芽加以分离，并将伸长幼芽浸入1mg/L IBA(吲哚-3-丁酸)1-3分钟以促进生根。接着，将伸长幼芽转移到Phyta托盘中的生根培养基(MS盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L Na2EDTA、20g/L蔗糖和0.59g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、7g/L诺布尔琼脂，pH 5.6)中。
栽培。在24℃、18小时光周期的ConvironTM生长箱中培养1-2周后，将已经生根的幼芽转移至带盖圣代杯内的土壤混合物中，并放置于ConvironTM生长箱(CMP4030和CMP3244型，Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中，在长白昼条件(16小时光照/8小时黑暗)下以120-150μmol/m2s的光强度，在恒定温度(22℃)和湿度(40-50％)下使小植株驯化。生根的小植株在圣代杯中驯化数周之后，将其转移到温室中以便进一步驯化并定植健壮的转基因大豆植物。
将转基因品系的发育与形态特征与非转化植物进行比较。比较植物的根、芽、叶和繁殖特征。转基因植物和非转化植物在根长度和生长模式上没有可观察到的差异。植物幼芽特征诸如高度、叶片数和大小、开花时间、花的大小和外观都相似。一般而言，当在体外和在温室土壤中培养时，转基因品系和未表达IRDIG蛋白的那些品系之间没有可观察到的形态差异。
上文提供了制备和选择包含根据本发明的杀虫毒素多肽的转基因双子叶植物(大豆)的方法。
实施例13
转化另外的作物物种
通过利用本领域技术人员已知的方法，例如，大体上与先前在美国专利7,838,733的实例14或PCT国际专利公开第WO 2007/053482号的实例12中所描述的相同技术，用杀虫IRDIG蛋白(有或无叶绿体转运肽)转化棉花以提供对昆虫的防治。
参考文献
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<211> 570
<212> DNA
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Asn Trp Pro Thr Lys Asn Gln Asp Arg Leu Asn Ala Leu Gly Glu Arg
165 170 175
Tyr Thr Leu Lys Tyr Asp Gly Arg Ala
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<213> 苏云金芽孢杆菌
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actaatttat ttgttctaaa agaacagaaa aatacttttt ctgaatttat cgatttatta 120
aaattagatt catcagatcg atctttactc caaaaatata tccatatttt tgaaaatagc 180
ttattcaata ttgaaaacca tattgatact ttaaaaaatg aattgtcctt attggatcca 240
gctatttttg caacagttag tggatctatt caaataaaca aggttaaata tacatttgct 300
gaagttcagt acagtggaaa tgatgaaagt ggaaaaccta aaagaggaat tgaatttaaa 360
tccggtggaa atcgatatgt aatctctcct aatccacatt taaataatag atataacaat 420
ggtggacaac gagattttta taatgcttta gcattaaaag ttagcgatat aggtgatgat 480
gaaaaatggg aaaaaaatga atggccaaca aaaaatctaa cacatcttag tgcgcttggt 540
caaaaatatg atttacatta tgatggcaga gcttaa 576
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<213> 苏云金芽孢杆菌
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Met Gln Arg Ser Lys Ile Tyr Met Asn Asn Gln Leu Leu Asp Leu Leu
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Ser Lys Thr Gln Thr Asn Leu Phe Val Leu Lys Glu Gln Lys Asn Thr
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Phe Ser Glu Phe Ile Asp Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser Asp Arg Ser
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50 55 60
Glu Asn His Ile Asp Thr Leu Lys Asn Glu Leu Ser Leu Leu Asp Pro
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Ala Ile Phe Ala Thr Val Ser Gly Ser Ile Gln Ile Asn Lys Val Lys
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Tyr Thr Phe Ala Glu Val Gln Tyr Ser Gly Asn Asp Glu Ser Gly Lys
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Pro Lys Arg Gly Ile Glu Phe Lys Ser Gly Gly Asn Arg Tyr Val Ile
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Ser Pro Asn Pro His Leu Asn Asn Arg Tyr Asn Asn Gly Gly Gln Arg
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Asp Phe Tyr Asn Ala Leu Ala Leu Lys Val Ser Asp Ile Gly Asp Asp
145 150 155 160
Glu Lys Trp Glu Lys Asn Glu Trp Pro Thr Lys Asn Leu Thr His Leu
165 170 175
Ser Ala Leu Gly Gln Lys Tyr Asp Leu His Tyr Asp Gly Arg Ala
180 185 190
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Met Lys Lys Arg Phe Ser Ala Val Ser Leu Ser Leu Ile Phe Ala Leu
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Ala Val Ile Val Phe Pro Phe Ser Ala Ser Asn Val Glu Ala Lys Gly
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<213> 苏云金芽孢杆菌
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Met Lys Glu Gly Val Phe Lys Leu Lys Lys Gly Phe Leu Ala Val Ser
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Leu Ser Leu Phe Leu Ala Ile Ala Leu Ile Val Phe Pro Phe Ser Gly
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atggataata atttattata tttaatttca aaaatccaaa ccaatttatt tgttttaaaa 60
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Leu Asp Ile Asn Ser Ser Glu Arg Ser Leu Leu Glu Asn Tyr Phe Tyr
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Ile Phe Glu Asn Ser Leu Phe Asn Ile Asp Asp Asp Ile Asn Ser Leu
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ggaacaatta ttataaataa tgcaatttat gcatttacag aagtgcatta tagtcaaagt 300
gatgaatatg ggcctaaaag aggtattaaa tttacaagag gaaatgaata tttaattgat 360
ccaaatccac atgaaaatgg tcaatatcaa aaaagtgcaa gccaatttta tagcgcttta 420
gcatatggtg tacaaggtaa atcaataaca gatggacaag acggacatcc ttggaaaaaa 480
aatgattggc ccacaaaaaa cctagatcgc attaatgtgc tcggagaaag atatacttta 540
ctctatcaac atagagatta a 561
<210> 46
<211> 186
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 46
Met Asn Asn Pro Leu Leu Lys Leu Leu Ser Asn Ile Gln Lys Glu Leu
1 5 10 15
Phe Gly Leu Asn His Gln Arg Lys Thr Leu Asp Thr Phe Ile Asn Leu
20 25 30
Leu Asp Ile Asp Val Ser Asp Arg Ala Leu Leu Lys Arg Tyr Phe Ser
35 40 45
Leu Phe Asp Asn Ser Leu Glu His Ile Thr Thr His Ile Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Lys Glu Ile Leu Val Leu Asp Pro Asp Ile Phe Ala Ala Val Ser
65 70 75 80
Gly Thr Ile Ile Ile Asn Asn Ala Ile Tyr Ala Phe Thr Glu Val His
85 90 95
Tyr Ser Gln Ser Asp Glu Tyr Gly Pro Lys Arg Gly Ile Lys Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Asn Glu Tyr Leu Ile Asp Pro Asn Pro His Glu Asn Gly Gln
115 120 125
Tyr Gln Lys Ser Ala Ser Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Val
130 135 140
Gln Gly Lys Ser Ile Thr Asp Gly Gln Asp Gly His Pro Trp Lys Lys
145 150 155 160
Asn Asp Trp Pro Thr Lys Asn Leu Asp Arg Ile Asn Val Leu Gly Glu
165 170 175
Arg Tyr Thr Leu Leu Tyr Gln His Arg Asp
180 185
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 47
gtgtactagt atggataatc attttttaga tttaatctca aaag 44
<210> 48
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 48
tctcctcgag ttaagctcta ccatcataat gtaaatcata tttttgac 48
<210> 49
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 49
gtgtactagt atgaataacc agttattaga tttactgtca aaaactc 47
<210> 50
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 50
tctcctcgag ttaagctctg ccatcataat gtaaatcata tttttgac 48
<210> 51
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 51
gtgtactagt atggcaacag ttagcggaaa aataataata aatac 45
<210> 52
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 52
tctcctcgag ttaattacta ctgtcatatt ttaaaatata tttttgtcca agc 53
<210> 53
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 53
gtgtactagt atgaataata cattattgga attactttca aaaataaaaa aagaattctt 60
tgg 63
<210> 54
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 54
tctcctcgag ttaagctcta cctttgtatt gtaatgtata tctttctc 48
<210> 55
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 55
gtgtactagt atgaataata cattattgga attactttca aaaataaaaa aagaattctt 60
tgg 63
<210> 56
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 56
tctcctcgag ttaagctcta cctttgtatt gtaatgtata tctttctcc 49
<210> 57
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 57
gtgtactagt atgaataaca cattattgga attactttca aaaataaaaa aagaattctt 60
tgg 63
<210> 58
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 58
tctcctcgag ttaagcccta cctttgtatt gtaatgtata tctttctcc 49
<210> 59
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 59
gtgtactagt atgtatatga ataatacatt attggaatta ctttcaaaaa taaaaaaaga 60
attctttgg 69
<210> 60
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 60
tctcctcgag ttaagctcta cctttgtatt gtaatgtata tctttctcc 49
<210> 61
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 61
gtgtactagt atgaagaaaa gattttctgc cgtatcg 37
<210> 62
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 62
tctcctcgag ttaacgcggg cttaatgtat aggttt 36
<210> 63
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 63
gtgtactagt atggataata atttattata tttaatttca aaaatccaaa cc 52
<210> 64
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 64
tctcctcgag ttattgttta gttaaagtat aattttcttt agatacctta ac 52
<210> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 65
gtgttctaga atgaaagaag gagtgtttaa attgaaaaaa gg 42
<210> 66
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 66
tctcctcgag ttagcgtgga gctaatgtat aggtttcac 39
<210> 67
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 67
gtgttctaga atggataatc atttattaga gttactttta aaagttcaaa ac 52
<210> 68
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 68
gtcactgcag ttaagctcta ccatcatatt ttaaagtata tctttctcc 49
<210> 69
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍优化的
<400> 69
atgaataatc acctgcttga cctgctgtcc aaggtgcaga ccaacctgtt cgtgctgaag 60
gagcacaaaa atatcctgag cgagttcctg gacctattaa atatcgactc ctccgacaag 120
agcctgatcc agaaccactt tcagatattc cggaacaccc tgctgaacat cgagaaccac 180
atggactccc tgaagaatga aatttccgta ataaacccag cggtgttcgc gaccgtgagc 240
ggcagcatta aaataaacaa aatcaactat acattcgccg aggtgaagta cagcgagaac 300
gacgcctccg gcaagcctaa gaggggcatc gagttcaaac cgggtggcaa cagatacgtg 360
atcagcccga acccgcacct gaataatcaa tacaacaact ccggacagag gcagttctac 420
tccgcactgg cattaaacat ctcatacaga ggcgacgacg agcactggga gaaaaataat 480
tggccgacca agacccaaga taggatcacc gcgctgggcc aaaaatatac cctgacctac 540
gacggcaagg cctga 555
<210> 70
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍优化的
<400> 70
atgaacaacc acctgcttga cctgctgtcc aaggtgcaga ccaacctgtt cgtgctgaag 60
gagcacaaga acatcctgag cgagttcctg gacctgctga atatcgactc ctccgacaag 120
agcctgatcc agaaccactt tcagatattc cggaacaccc tgctgaacat cgagaaccac 180
atggactccc tgaagaacga gatttccgtg atcaacccag cggtgttcgc gaccgtgagc 240
ggcagcatca agatcaacaa gatcaactac accttcgccg aggtgaagta cagcgagaac 300
gacgcctccg gcaagcctaa gaggggcatc gagttcaaac cgggtggcaa cagatacgtg 360
atcagcccga acccgcacct gaacaaccag tacaacaact ccggacagag gcagttctac 420
tccgcactgg cgctgaacat ctcatacaga ggcgacgacg agcactggga gaagaacaac 480
tggccgacca agacccaaga taggatcacc gcgctgggcc agaagtacac cctgacctac 540
gacggcaagg cctga 555
<210> 71
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -从合成的玉蜀黍优化的编码区翻译
<400> 71
Met Asn Asn His Leu Leu Asp Leu Leu Ser Lys Val Gln Thr Asn Leu
1 5 10 15
Phe Val Leu Lys Glu His Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Leu Asp Leu
20 25 30
Leu Asn Ile Asp Ser Ser Asp Lys Ser Leu Ile Gln Asn His Phe Gln
35 40 45
Ile Phe Arg Asn Thr Leu Leu Asn Ile Glu Asn His Met Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Glu Ile Ser Val Ile Asn Pro Ala Val Phe Ala Thr Val Ser
65 70 75 80
Gly Ser Ile Lys Ile Asn Lys Ile Asn Tyr Thr Phe Ala Glu Val Lys
85 90 95
Tyr Ser Glu Asn Asp Ala Ser Gly Lys Pro Lys Arg Gly Ile Glu Phe
100 105 110
Lys Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Val Ile Ser Pro Asn Pro His Leu Asn
115 120 125
Asn Gln Tyr Asn Asn Ser Gly Gln Arg Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala
130 135 140
Leu Asn Ile Ser Tyr Arg Gly Asp Asp Glu His Trp Glu Lys Asn Asn
145 150 155 160
Trp Pro Thr Lys Thr Gln Asp Arg Ile Thr Ala Leu Gly Gln Lys Tyr
165 170 175
Thr Leu Thr Tyr Asp Gly Lys Ala
180
<210> 72
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍优化的
<400> 72
atggctcaat ctagcagaat ctgccacggt gtgcagaacc catgtgtgat catttccaat 60
ctctccaaat ccaaccagaa caaatctcct ttctcagtca gcctcaagac tcaccagcag 120
cagcgtcgtg cttaccagat atctagctgg ggattgaaga agtcaaacaa cgggtccgtg 180
attcgtccgg ttaaggcaat gaacaaccac ctgcttgacc tgctgtccaa ggtgcagacc 240
aacctgttcg tgctgaagga gcacaagaac atcctgagcg agttcctgga cctgctgaat 300
atcgactcct ccgacaagag cctgatccag aaccactttc agatattccg gaacaccctg 360
ctgaacatcg agaaccacat ggactccctg aagaacgaga tttccgtgat caacccagcg 420
gtgttcgcga ccgtgagcgg cagcatcaag atcaacaaga tcaactacac cttcgccgag 480
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cactgggaga agaacaactg gccgaccaag acccaagata ggatcaccgc gctgggccag 720
aagtacaccc tgacctacga cggcaaggcc tga 753
<210> 73
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从合成的玉蜀黍优化的编码区翻译
<400> 73
Met Ala Gln Ser Ser Arg Ile Cys His Gly Val Gln Asn Pro Cys Val
1 5 10 15
Ile Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Asn Gln Asn Lys Ser Pro Phe Ser
20 25 30
Val Ser Leu Lys Thr His Gln Gln Gln Arg Arg Ala Tyr Gln Ile Ser
35 40 45
Ser Trp Gly Leu Lys Lys Ser Asn Asn Gly Ser Val Ile Arg Pro Val
50 55 60
Lys Ala Met Asn Asn His Leu Leu Asp Leu Leu Ser Lys Val Gln Thr
65 70 75 80
Asn Leu Phe Val Leu Lys Glu His Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Leu
85 90 95
Asp Leu Leu Asn Ile Asp Ser Ser Asp Lys Ser Leu Ile Gln Asn His
100 105 110
Phe Gln Ile Phe Arg Asn Thr Leu Leu Asn Ile Glu Asn His Met Asp
115 120 125
Ser Leu Lys Asn Glu Ile Ser Val Ile Asn Pro Ala Val Phe Ala Thr
130 135 140
Val Ser Gly Ser Ile Lys Ile Asn Lys Ile Asn Tyr Thr Phe Ala Glu
145 150 155 160
Val Lys Tyr Ser Glu Asn Asp Ala Ser Gly Lys Pro Lys Arg Gly Ile
165 170 175
Glu Phe Lys Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Val Ile Ser Pro Asn Pro His
180 185 190
Leu Asn Asn Gln Tyr Asn Asn Ser Gly Gln Arg Gln Phe Tyr Ser Ala
195 200 205
Leu Ala Leu Asn Ile Ser Tyr Arg Gly Asp Asp Glu His Trp Glu Lys
210 215 220
Asn Asn Trp Pro Thr Lys Thr Gln Asp Arg Ile Thr Ala Leu Gly Gln
225 230 235 240
Lys Tyr Thr Leu Thr Tyr Asp Gly Lys Ala
245 250
<210> 74
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍优化的
<400> 74
atgttggctc gccaaggagg atcactgaga gcctctcagt gtaacgctgg cctcgcgaga 60
cgcgtggagg tgggagcgtt ggttgttccg agacccataa gcgtcaacga cgtggttccc 120
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ctggacctat taaatatcga ctcctccgac aagagcctga tccagaacca ctttcagata 360
ttccggaaca ccctgctgaa catcgagaac cacatggact ccctgaagaa tgaaatttcc 420
gtaataaacc cagcggtgtt cgcgaccgtg agcggcagca ttaaaataaa caaaatcaac 480
tatacattcg ccgaggtgaa gtacagcgag aacgacgcct ccggcaagcc taagaggggc 540
atcgagttca aaccgggtgg caacagatac gtgatcagcc cgaacccgca cctgaataat 600
caatacaaca actccggaca gaggcagttc tactccgcac tggcattaaa catctcatac 660
agaggcgacg acgagcactg ggagaaaaat aattggccga ccaagaccca agataggatc 720
accgcgctgg gccaaaaata taccctgacc tacgacggca aggcctga 768
<210> 75
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从合成的玉蜀黍优化的编码区翻译
<400> 75
Met Leu Ala Arg Gln Gly Gly Ser Leu Arg Ala Ser Gln Cys Asn Ala
1 5 10 15
Gly Leu Ala Arg Arg Val Glu Val Gly Ala Leu Val Val Pro Arg Pro
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Ile Ser Val Asn Asp Val Val Pro His Val Tyr Ser Ala Pro Leu Ser
35 40 45
Val Ala Arg Arg Ser Cys Ser Lys Ser Ser Ile Arg Ser Thr Arg Arg
50 55 60
Leu Gln Thr Thr Val Cys Ser Met Asn Asn His Leu Leu Asp Leu Leu
65 70 75 80
Ser Lys Val Gln Thr Asn Leu Phe Val Leu Lys Glu His Lys Asn Ile
85 90 95
Leu Ser Glu Phe Leu Asp Leu Leu Asn Ile Asp Ser Ser Asp Lys Ser
100 105 110
Leu Ile Gln Asn His Phe Gln Ile Phe Arg Asn Thr Leu Leu Asn Ile
115 120 125
Glu Asn His Met Asp Ser Leu Lys Asn Glu Ile Ser Val Ile Asn Pro
130 135 140
Ala Val Phe Ala Thr Val Ser Gly Ser Ile Lys Ile Asn Lys Ile Asn
145 150 155 160
Tyr Thr Phe Ala Glu Val Lys Tyr Ser Glu Asn Asp Ala Ser Gly Lys
165 170 175
Pro Lys Arg Gly Ile Glu Phe Lys Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Val Ile
180 185 190
Ser Pro Asn Pro His Leu Asn Asn Gln Tyr Asn Asn Ser Gly Gln Arg
195 200 205
Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Asn Ile Ser Tyr Arg Gly Asp Asp
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Glu His Trp Glu Lys Asn Asn Trp Pro Thr Lys Thr Gln Asp Arg Ile
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Thr Ala Leu Gly Gln Lys Tyr Thr Leu Thr Tyr Asp Gly Lys Ala
245 250 255
<210> 76
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍优化的
<400> 76
atggctcaat ctagcagaat ctgccacggt gtgcagaacc catgtgtgat catttccaat 60
ctctccaaat ccaaccagaa caaatctcct ttctcagtca gcctcaagac tcaccagcag 120
cagcgtcgtg cttaccagat atctagctgg ggattgaaga agtcaaacaa cgggtccgtg 180
attcgtccgg ttaaggcaat gaataatcac ctgcttgacc tgctgtccaa ggtgcagacc 240
aacctgttcg tgctgaagga gcacaaaaat atcctgagcg agttcctgga cctattaaat 300
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ctgaacatcg agaaccacat ggactccctg aagaatgaaa tttccgtaat aaacccagcg 420
gtgttcgcga ccgtgagcgg cagcattaaa ataaacaaaa tcaactatac attcgccgag 480
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ggtggcaaca gatacgtgat cagcccgaac ccgcacctga ataatcaata caacaactcc 600
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<210> 77
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 78
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<210> 79
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 79
actagtagga gtaaaaacac atatgaataa tcatttatta g 41
<210> 80
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 80
ctcgagttat taagctttac catcatatgt taaagtatat ttttggcc 48
<210> 81
<211> 324
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 81
acagttagtg gatctattaa aataaacaaa atcaactata catttgctga agttaagtat 60
agtgaaaatg atgcaagtgg aaaacctaaa agaggaattg aatttaaacc tggcggaaat 120
cgatatgtaa tatctcctaa tccacatttg aataatcaat acaacaatag tggacaacga 180
caattttata gtgctttagc attaaatatt agctacagag gtgatgatga acattgggaa 240
aaaaataatt ggccaacaaa aactcaagat cgtattactg cacttggcca aaaatatact 300
ttaacatatg atggtaaagc ttaa 324
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 82
Thr Val Ser Gly Ser Ile Lys Ile Asn Lys Ile Asn Tyr Thr Phe Ala
1 5 10 15
Glu Val Lys Tyr Ser Glu Asn Asp Ala Ser Gly Lys Pro Lys Arg Gly
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Ile Glu Phe Lys Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Val Ile Ser Pro Asn Pro
35 40 45
His Leu Asn Asn Gln Tyr Asn Asn Ser Gly Gln Arg Gln Phe Tyr Ser
50 55 60
Ala Leu Ala Leu Asn Ile Ser Tyr Arg Gly Asp Asp Glu His Trp Glu
65 70 75 80
Lys Asn Asn Trp Pro Thr Lys Thr Gln Asp Arg Ile Thr Ala Leu Gly
85 90 95
Gln Lys Tyr Thr Leu Thr Tyr Asp Gly Lys Ala
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<211> 324
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 83
acagttagtg gatctattca aataaacaag gttaaatata catttgctga agttcagtac 60
agtggaaatg atgaaagtgg aaaacctaaa agaggaattg aatttaaatc cggtggaaat 120
cgatatgtaa tctctcctaa tccacattta aataatagat ataacaatgg tggacaacga 180
gatttttata atgctttagc attaaaagtt agcgatatag gtgatgatga aaaatgggaa 240
aaaaatgaat ggccaacaaa aaatctaaca catcttagtg cgcttggtca aaaatatgat 300
ttacattatg atggcagagc ttaa 324
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 84
Thr Val Ser Gly Ser Ile Gln Ile Asn Lys Val Lys Tyr Thr Phe Ala
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Glu Val Gln Tyr Ser Gly Asn Asp Glu Ser Gly Lys Pro Lys Arg Gly
20 25 30
Ile Glu Phe Lys Ser Gly Gly Asn Arg Tyr Val Ile Ser Pro Asn Pro
35 40 45
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85 90 95
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100 105
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<211> 324
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 85
gcagttagtg gatctatccc aataaataat gtaaaatata catttgctga agttcagtac 60
agtggaaatg atgacagtgg aaaacctaaa agaggaatcg aatttaaatc aggaggaaac 120
cgatacgtaa tatctcctaa tccacattta aataatcgat ataacggtgg tggacaacga 180
gatttttata atgctttagc attaaaagtt agcgatatcg gtgatgatga acattgggaa 240
aaaaacaact ggccaacaaa gaatttaacg cgtcttagtg cacttggtca aaaatatgat 300
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<213> 苏云金芽孢杆菌
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atcgaagaat ctttcggaaa aaatcgaggg attacattca atccaggcca gcatacgtac 180
aaaataaccc cgaatcctca cgacaatccc aaatacaaca aaaaacaaga gcagttttat 240
gaggaaatcg caaaaggcgt taaaactctt gtagaaaaat caggctggaa agatacgctc 300
agcaacatta cagctctggg tgaaacctat acattagctc cacgctaa 348
<210> 120
<211> 115
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 120
Ala Val Ser Leu Ser Leu Phe Leu Ala Ile Ala Leu Ile Val Leu Pro
1 5 10 15
Phe Ser Gly Thr Asn Val Asp Ala Lys Gly Val Ser Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Ile Asn Lys Glu Thr Tyr Lys Tyr Ile Glu Glu Ser Phe Gly Lys Asn
35 40 45
Arg Gly Ile Thr Phe Asn Pro Gly Gln His Thr Tyr Lys Ile Thr Pro
50 55 60
Asn Pro His Asp Asn Pro Lys Tyr Asn Lys Lys Gln Glu Gln Phe Tyr
65 70 75 80
Glu Glu Ile Ala Lys Gly Val Lys Thr Leu Val Glu Lys Ser Gly Trp
85 90 95
Lys Asp Thr Leu Ser Asn Ile Thr Ala Leu Gly Glu Thr Tyr Thr Leu
100 105 110
Ala Pro Arg
115
<210> 121
<211> 624
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 121
atgtctttct tgaactgttt ccctttaaaa tatcttatgt tggatgctcc tcactctatt 60
ttgaaaaagt ttagcttact ttcaaaaatt caaactaatt tatttgtttt aaaagaacaa 120
aaaaatactt tttcagaatt tctaaattta ttaaatatag attcatcaga ccaatctcta 180
attcaaaaat atcttcaagt ttttgaaaac agcctattta atatagagaa tcatgttgat 240
gttcttaaaa atgaaatatc agtattagat ccagatattt ttgcaacagt tagtgggtct 300
attacaataa ataatgtcaa atatacattt gctgaagttc aatacagtgg aaatgatgaa 360
agtggacgtc ctaaaagagg aattgaattt aaaccagggg gaaatcgata cgtaatatct 420
cctaatccac atttgaataa tcaatataac agcaatggac aacgacagtt ttatagtgct 480
ttagcatatg gtatacaaac caaatctata aacgatggaa atactggaca ctcttgggag 540
aaaagcaatt ggccaacaat aaatcaagat cgtataaatg cacttggggt aagatatact 600
ttgaaatatg atggtagagc ttag 624
<210> 122
<211> 207
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 122
Met Ser Phe Leu Asn Cys Phe Pro Leu Lys Tyr Leu Met Leu Asp Ala
1 5 10 15
Pro His Ser Ile Leu Lys Lys Phe Ser Leu Leu Ser Lys Ile Gln Thr
20 25 30
Asn Leu Phe Val Leu Lys Glu Gln Lys Asn Thr Phe Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asn Leu Leu Asn Ile Asp Ser Ser Asp Gln Ser Leu Ile Gln Lys Tyr
50 55 60
Leu Gln Val Phe Glu Asn Ser Leu Phe Asn Ile Glu Asn His Val Asp
65 70 75 80
Val Leu Lys Asn Glu Ile Ser Val Leu Asp Pro Asp Ile Phe Ala Thr
85 90 95
Val Ser Gly Ser Ile Thr Ile Asn Asn Val Lys Tyr Thr Phe Ala Glu
100 105 110
Val Gln Tyr Ser Gly Asn Asp Glu Ser Gly Arg Pro Lys Arg Gly Ile
115 120 125
Glu Phe Lys Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Val Ile Ser Pro Asn Pro His
130 135 140
Leu Asn Asn Gln Tyr Asn Ser Asn Gly Gln Arg Gln Phe Tyr Ser Ala
145 150 155 160
Leu Ala Tyr Gly Ile Gln Thr Lys Ser Ile Asn Asp Gly Asn Thr Gly
165 170 175
His Ser Trp Glu Lys Ser Asn Trp Pro Thr Ile Asn Gln Asp Arg Ile
180 185 190
Asn Ala Leu Gly Val Arg Tyr Thr Leu Lys Tyr Asp Gly Arg Ala
195 200 205
<210> 123
<211> 579
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 123
atggataatc atttattagg gttactttca aaaatccaaa acaatgtttt tgttctaaaa 60
gaacaaaaac gcagtgtttc agaattttta aatctattag atatagattc atctaatcaa 120
tttttaattc aacaatattt tcaaatgttt gaacacagct tatttaatat cgagaattat 180
gttgattctc ttacagatga aatatcaata ttaaaccctt ctagtttcat agcagttagt 240
ggaaatatat atgtaggtag acaacaagat aggtactcat ttgtagaaat tcagtatact 300
cagaatgata gttcgggaag acctaaaaga ggaatcacat ttacatcagg agcaattaag 360
tatgatatat cccctaatcc tcatttaagt aaagcatata ataataacgg acaacgagat 420
ttttataata gcttagcatt aaaagttcgt gattacgcca cagatcataa ttgggttaga 480
ggtggttggg attattctca gaaattaact tttaatttaa gtggatttag tggtagtgaa 540
ggtagtagat acaccttgac acctgtagct aaaacttaa 579
<210> 124
<211> 192
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 124
Met Asp Asn His Leu Leu Gly Leu Leu Ser Lys Ile Gln Asn Asn Val
1 5 10 15
Phe Val Leu Lys Glu Gln Lys Arg Ser Val Ser Glu Phe Leu Asn Leu
20 25 30
Leu Asp Ile Asp Ser Ser Asn Gln Phe Leu Ile Gln Gln Tyr Phe Gln
35 40 45
Met Phe Glu His Ser Leu Phe Asn Ile Glu Asn Tyr Val Asp Ser Leu
50 55 60
Thr Asp Glu Ile Ser Ile Leu Asn Pro Ser Ser Phe Ile Ala Val Ser
65 70 75 80
Gly Asn Ile Tyr Val Gly Arg Gln Gln Asp Arg Tyr Ser Phe Val Glu
85 90 95
Ile Gln Tyr Thr Gln Asn Asp Ser Ser Gly Arg Pro Lys Arg Gly Ile
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Gly Ala Ile Lys Tyr Asp Ile Ser Pro Asn Pro His
115 120 125
Leu Ser Lys Ala Tyr Asn Asn Asn Gly Gln Arg Asp Phe Tyr Asn Ser
130 135 140
Leu Ala Leu Lys Val Arg Asp Tyr Ala Thr Asp His Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gly Gly Trp Asp Tyr Ser Gln Lys Leu Thr Phe Asn Leu Ser Gly Phe
165 170 175
Ser Gly Ser Glu Gly Ser Arg Tyr Thr Leu Thr Pro Val Ala Lys Thr
180 185 190
<210> 125
<211> 366
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 125
atgaaaaaag gatttcttgc cgtatcattg tccctgtttt tggccattgc tttaatcgtg 60
tttcctttct ccggcactaa tgtagatgct aaaggggtaa gtggctcaat cacgatcaac 120
aaagaaacat ataaatatat cgaagaatct ttcggaaaaa atcgagggat tacattcaac 180
ccaggtcaac atacgtacaa aataactccg aatcctcacg acaatcccaa atacaacaaa 240
aaacaagagc agttctatga ggaaatcgca aaaggcgtta aaactcttgt agaaaaatca 300
ggctggaaag atactctcag caacattaca gctctgggtg aaacctatac attagctcca 360
cgttaa 366
<210> 126
<211> 121
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 126
Met Lys Lys Gly Phe Leu Ala Val Ser Leu Ser Leu Phe Leu Ala Ile
1 5 10 15
Ala Leu Ile Val Phe Pro Phe Ser Gly Thr Asn Val Asp Ala Lys Gly
20 25 30
Val Ser Gly Ser Ile Thr Ile Asn Lys Glu Thr Tyr Lys Tyr Ile Glu
35 40 45
Glu Ser Phe Gly Lys Asn Arg Gly Ile Thr Phe Asn Pro Gly Gln His
50 55 60
Thr Tyr Lys Ile Thr Pro Asn Pro His Asp Asn Pro Lys Tyr Asn Lys
65 70 75 80
Lys Gln Glu Gln Phe Tyr Glu Glu Ile Ala Lys Gly Val Lys Thr Leu
85 90 95
Val Glu Lys Ser Gly Trp Lys Asp Thr Leu Ser Asn Ile Thr Ala Leu
100 105 110
Gly Glu Thr Tyr Thr Leu Ala Pro Arg
115 120
<210> 127
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 127
gtgtactagt aggaggtaac ttatgtcttt cttgaactgt ttccctttaa aatatc 56
<210> 128
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 128
tctcctcgag ctaagctcta ccatcatatt tcaaagtata tcttac 46
<210> 129
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 129
gtgtactagt atggataatc atttattagg gttactttca aaaatcc 47
<210> 130
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 130
tctcctcgag ttaagtttta gctacaggtg tcaaggtgta tctactacc 49
<210> 131
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 131
gtgtactagt atgaaaaaag gatttcttgc cgtatcattg 40
<210> 132
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物寡核苷酸
<400> 132
tctcctcgag ttaacgtgga gctaatgtat aggtttcac 39

Claims (19)

1.一种核酸构建体，其包含编码杀虫IRDIG蛋白的核酸序列。
2.一种核酸构建体，其包含选自以下的权利要求1的核酸序列：
a.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有至少80％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白；
b.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有至少90％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白；
c.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有至少95％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白；
d.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有至少99％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白；和
e.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有100％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白。
3.一种组合物，其包含经配制的杀虫IRDIG蛋白。
4.一种组合物，其包含经配制的杀虫IRDIG蛋白，其中所述杀虫IRDIG蛋白选自：
a.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有至少80％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白；
b.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有至少90％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白；
c.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有至少95％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白；
d.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有至少99％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白；和
e.与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、71、73、75、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120和122中的任一个具有100％序列同一性的杀虫IRDIG蛋白。
5.一种植物或植物部分，其包含编码杀虫IRDIG蛋白的核酸序列，所述核酸序列包括权利要求1的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的植物部分，其中所述植物部分为种子。
7.一种植物或植物部分，其包含含有权利要求2的序列的多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的植物部分，其中所述植物部分为种子。
9.一种植物或植物部分，其包含含有权利要求3的序列的杀虫IRDIG蛋白。
10.根据权利要求9所述的植物部分，其中所述植物部分为种子。
11.一种植物或植物部分，其包含含有权利要求4的序列的杀虫IRDIG蛋白。
12.根据权利要求5所述的植物或植物部分，其中所述杀虫IRDIG蛋白针对选自鞘翅目和西方玉米根虫的昆虫具有杀虫活性。
13.根据权利要求7所述的植物或植物部分，其中所述多肽针对选自鞘翅目和西方玉米根虫的昆虫具有杀虫活性。
14.根据权利要求4所述的植物或植物部分，其中所述多肽针对选自鞘翅目和西方玉米根虫的昆虫具有杀虫活性。
15.一种用于防治敏感昆虫的方法，其包括使所述昆虫与有效量的权利要求3的杀虫IRDIG蛋白接触。
16.一种用于防治敏感昆虫的方法，其包括使所述昆虫与有效量的权利要求4的杀虫IRDIG蛋白接触。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述敏感昆虫为西方玉米根虫
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述敏感昆虫为西方玉米根虫。
19.一种用于产生具有鞘翅目耐受性的植物的方法，其包括：将非转基因植物用转基因植物育种，所述转基因植物包含稳定并入到所述植物的基因组中，能够表达杀虫IRDIG蛋白的外来DNA构建体；以及通过分析来自所述转基因植物的所述外来DNA构建体的至少一部分来筛选后代。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181221

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