CN103725704A - 控制害虫的构建体及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种控制害虫的构建体及其方法，所述构建体包括Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白。本发明控制害虫的构建体及其方法通过植物体内产生Cry1Ca和Cry1Ab/Ac蛋白来控制害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法和生物防治方法相比，本发明不仅毒力强、效果彻底，而且对植物进行全生育期、全植株的保护以防治害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定，简单、方便、经济。

Description

控制害虫的构建体及其方法

技术领域

本发明涉及一种控制害虫的构建体及其方法，特别是涉及一种用在植物中表达Cry1Ca蛋白和Cry1Ab/Ac蛋白的构建体来控制害虫为害植物的方法。

背景技术

玉米和水稻是中国重要的粮食作物，每年因植物虫害造成的粮食损失巨大，更甚者影响到当地人口的生存状况。为了防治植物虫害，人们通常使用广谱化学杀虫剂和生物杀虫制剂，但二者在实际应用中都具有局限性：化学杀虫剂会带来环境污染的问题，并导致抗药性昆虫的出现；而生物杀虫制剂在环境中容易降解，在生产上需要重复施用，大大增加了生产成本。

为了解决化学杀虫剂和生物杀虫制剂在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。Cry1Ca蛋白和Cry1Ab/Ac蛋白均为Bt毒素，是不溶性伴孢结晶蛋白，这类蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。

目前Cry1Ca蛋白和Cry1Ab/Ac蛋白大部分以单基因的形式在植物中应用，尤其是Cry1Ca蛋白，其以单基因形式存在时对二化螟和大螟的抗性不高，可能会造成二化螟和大螟对这两个基因单独抗性的产生，阻碍转基因抗性材料的推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种控制害虫的构建体及其方法，首次提供了通过产生表达Cry1Ca蛋白和Cry1Ab/Ac蛋白的构建体来控制害虫为害植物的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学防治和生物防治等技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种构建体，包括Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白。

进一步地，所述构建体包括第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包括Cry1Ca蛋白，所述第二表达盒包括Cry1A蛋白。

更进一步地，所述第一表达盒还包括与Cry1Ca蛋白有效连接的调控序列，所述第二表达盒还包括与Cry1A蛋白有效连接的调控序列。

在上述技术方案的基础上，所述Cry1Ca蛋白的氨基酸序列具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。所述Cry1Ca蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

进一步地，所述Cry1A蛋白为Cry1Ab/Ac蛋白。所述Cry1Ab/Ac蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述Cry1Ab/Ac蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述构建体的重组载体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生杀虫蛋白质的方法，包括：

获得包含所述构建体的转基因宿主生物的细胞；

在允许产生杀虫蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；

回收所述杀虫蛋白质。

进一步地，所述转基因宿主生物包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。

优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。

为实现上述目的，本发明还提供了一种用于增加昆虫靶范围的方法，包括：将所述构建体编码的杀虫蛋白质在植物中与至少一种不同于所述构建体编码的杀虫蛋白质的第三种杀虫核苷酸一起表达。

进一步地，所述第三种杀虫核苷酸可以编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。

可选择地，所述第三种杀虫核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。

在本发明中，所述构建体在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物（第1亲本）可以通过遗传工程操作表达所述构建体编码的蛋白质，第二种植物（第2亲本）可以通过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭特定基因的表达。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生抗虫植物的方法，包括：将所述构建体或所述重组载体导入植物。

为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，包括：将所述构建体或所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受昆虫害虫侵害量的杀虫蛋白质。

将所述构建体或所述重组载体导入植物，在本发明中为将外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。

为实现上述目的，本发明还提供了一种控制昆虫害虫的方法，包括：使昆虫害虫与抑制量的所述构建体编码的昆虫抑制性蛋白接触。

进一步地，所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白存在于产生其的植物细胞中，所述昆虫害虫通过摄食所述植物细胞与所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白接触。

更进一步地，所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白存在于产生其的转基因植物中，所述昆虫害虫通过摄食所述转基因植物的组织与所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白接触，接触后所述昆虫害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对昆虫害虫为害植物的控制。

在上述技术方案的基础上，所述转基因植物可以处于任意生育期。

所述转基因植物的组织可以为叶片、茎秆、雄穗、雌穗、花药或花丝。

所述对昆虫害虫为害植物的控制不因种植地点的改变而改变。

所述对昆虫害虫为害植物的控制不因种植时间的改变而改变。

所述植物可以来自玉米、水稻、高粱、麦、粟、棉花、芦苇、甘蔗、茭白、蚕豆或油菜。

所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白的多核苷酸的植物。

在上述技术方案的基础上，所述昆虫害虫为鳞翅目昆虫害虫。优选地，所述鳞翅目昆虫害虫为大螟和/或二化螟。

为实现上述目的，本发明还提供了一种所述构建体编码的昆虫抑制性蛋白质控制昆虫害虫的用途。

本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。

本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。

本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子（密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸），其可作为开放阅读框（ORF）阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA（肽核酸）。

任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明Cry1Ca基因和/或Cry1Ab/Ac基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠（SSC）处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6×SSC、0.5%SDS溶液中，在65℃下与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5发生特异性杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

因此，具有抗虫活性并在严格条件下与本发明SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源，大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同源性。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/片段（包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失）、变体、突变体、取代物（有替代氨基酸的蛋白质）、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗鳞翅目昆虫害虫的生物活性的蛋白。

本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列（核苷酸或氨基酸）的一部分或其人工改造形式（例如适合植物表达的序列），前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保（编码）蛋白质为昆虫毒素。

使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体。例如，本领域熟知制造点突变的技术。又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用DNA重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长基因的片段，并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶诸如Bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。还可以使用多种限制性内切酶获取编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片段。

本发明可以从B.t.分离物和/或DNA文库衍生出等价蛋白和/或编码这些等价蛋白的基因。有多种方法获取本发明的杀虫蛋白。例如，可以使用本发明公开和要求保护的杀虫蛋白的抗体从蛋白质混合物鉴定和分离其它蛋白。特别地，抗体可能是由蛋白最恒定和与其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定（ELISA）或western印迹方法使用这些抗体专一地鉴定有特征活性的等价蛋白。可使用本领域标准程序容易的制备本发明中公开的蛋白或等价蛋白或这类蛋白的片段的抗体。然后可以从微生物中获得编码这些蛋白的基因。

由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。

本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。

保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸（如谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（如谷氨酰胺、天冬酰胺）、疏水性氨基酸（如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）、芳香氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸），以及小分子氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸）。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年纽约学术出版社（Academic Press）出版的《Protein》中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它们相反的互换。

对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定（如参见，Cunningham和Wells，1989，Science244：1081-1085）。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的抗虫活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定（参见，如de Vos等，1992，Science255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters309：59-64）。

在本发明中，Cry1A蛋白包括但不限于Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ab/Ac或Cry1Ah蛋白，或者与上述蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性且对大螟和/或二化螟具有杀虫活性的杀虫片段或功能区域。

因此，与序列1和/或序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60%，优选的大于75%，更优选的大于80%，甚至更优选的大于90%，并且可以大于95%。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性和/或类似性。

本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子，前导序列，内含子以及其它可操作地连接到所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1A蛋白的调节序列。

所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米Ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织（可通过常规RNA试验进行测定），如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因（pinⅠ和pinⅡ）和玉米蛋白酶抑制基因（MPI）的启动子。

所述转运肽（又称分泌信号序列或导向序列）是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。

所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列（脑心肌炎病毒5’非编码区）；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV（玉米矮缩花叶病毒）前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质（BiP）；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列（AMV RNA4）；烟草花叶病毒（TMV）前导序列。

所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒（CaMV）增强子、玄参花叶病毒（FMV）增强子、康乃馨风化环病毒（CERV）增强子、木薯脉花叶病毒（CsVMV）增强子、紫茉莉花叶病毒（MMV）增强子、夜香树黄化曲叶病毒（CmYLCV）增强子、木尔坦棉花曲叶病毒（CLCuMV）、鸭跖草黄斑驳病毒（CoYMV）和花生褪绿线条花叶病毒（PCLSV）增强子。

对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Act1内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。

所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）胭脂碱合成酶（NOS）基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂Ⅱ（pinⅡ）基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白（α-tubulin）基因的多聚腺苷酸化信号序列。

本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列（即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子）、提供DNA转移和/或整合功能的序列（即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点）、提供选择性功能的序列（即抗生素抗性标记物、生物合成基因）、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列（即多接头序列、位点特异性重组序列）和提供复制功能的序列（即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列）。

本发明中所述的“杀虫”是指对农作物害虫是有毒的。更具体地，目标昆虫是大螟和/或二化螟害虫。

本发明中的植物，特别是水稻和玉米，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含编码Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白的核苷酸序列，昆虫害虫通过摄食植物组织与该蛋白接触，接触后大螟和/或二化螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制是指致死或亚致死。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要。

植物材料中杀虫晶体蛋白（ICP）的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mRNA进行定量，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。

可以应用不同的试验测定植物中ICP的杀虫效果。本发明中目标昆虫主要为大螟和/或二化螟。

本发明中，所述Cry1Ca蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述Cry1Ab/Ac蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。除了包含Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白的编码区外，也可包含其他元件，例如编码转运肽的编码区或编码选择性标记的蛋白质。

此外，包含编码本发明Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白的构建体在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因（如bar基因、pat基因）、苯敌草抗性基因（如pmph基因）、草甘膦抗性基因（如EPSPS基因）、溴苯腈（bromoxynil）抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂（如PPT）的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。

本发明提供了一种控制害虫的构建体及其方法，具有以下优点：

1、毒力强、效果彻底。由于本发明所述构建体包含两种不同杀虫机制的Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白，使得包含本发明所述构建体的转基因植物的杀虫毒力强，尤其是大螟和二化螟，对初孵幼虫的防治效果几乎为百分之百，极个别存活幼虫也基本上停止发育，3天后幼虫基本仍处于初孵状态，且已停止发育，使得转基因植物大体上只受到轻微损伤。

2、内因防治。现有技术主要是通过外部作用即外因来控制昆虫害虫的为害，如农业防治、化学防治和生物防治；而本发明是通过植物体内产生能够杀死大螟和二化螟的Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白来控制害虫的，即通过内因来防治。

3、无污染、无残留。现有技术使用的化学防治方法虽然对控制害虫的为害起到了一定作用，但同时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发明控制害虫的构建体及其方法，可以消除上述不良后果。

4、全生育期防治。现有技术使用的控制害虫的方法都是阶段性的，而本发明是对植物进行全生育期的保护，转基因植物（Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白）从发芽、生长，一直到开花、结果，都可以避免遭受害虫的侵害。

5、全植株防治。现有技术使用的控制害虫的方法大多是局部性的，如叶面喷施；而本发明是对整个植株进行保护，如转基因植物（Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白）的叶片、茎秆、雄穗、雌穗、花药、花丝等都是可以抵抗害虫侵害的。

6、效果稳定。现有技术使用的生物杀虫剂需要直接喷施到作物表面，因此造成有活性的结晶蛋白（包括Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白）在环境中被降解；本发明是使所述Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白在植物体内进行表达，有效地避免了生物杀虫剂在自然界不稳定的缺陷，且本发明转基因植物（Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白）的防治效果在不同地点、不同时间、不同遗传背景也都是稳定一致的。

7、简单、方便、经济。现有技术使用的生物杀虫剂在环境中易被降解，因此需要重复生产和重复应用，并为在农业生产上的实际应用带来困难，大大地增加了成本；本发明只需种植能够表达Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白的转基因植物即可，而不需要采用其它措施，从而节省了大量人力、物力和财力。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明控制害虫的构建体及其方法的重组克隆载体DBN01-T构建流程图；

图2为本发明控制害虫的构建体及其方法的重组表达载体DBN100323构建流程图；

图3为本发明控制害虫的构建体及其方法的转基因玉米植株接种大螟的抗虫效果图；

图4为本发明控制害虫的构建体及其方法的转基因水稻植株接种大螟的抗虫效果图；

图5为本发明控制害虫的构建体及其方法的转基因水稻植株接种二化螟的抗虫效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明控制害虫的构建体及其方法的技术方案。

第一实施例、Cry1Ca基因和Cry1Ab/Ac基因的获得和合成

1、获得Cry1Ca和Cry1Ab/Ac核苷酸序列

Cry1Ca杀虫蛋白质的氨基酸序列（630个氨基酸），如序列表中SEQ ID NO:1所示；编码相应于所述Cry1Ca杀虫蛋白质的氨基酸序列（630个氨基酸）的Cry1Ca-01核苷酸序列（1896个核苷酸），如序列表中SEQ ID NO:3所示，Cry1Ca-02核苷酸序列（1896个核苷酸）如序列表中SEQ ID NO:4所示。

Cry1Ab/Ac杀虫蛋白质的氨基酸序列（609个氨基酸），如序列表中SEQ IDNO:2所示；编码相应于所述Cry1Ab/Ac杀虫蛋白质的氨基酸序列（609个氨基酸）的Cry1Ab/Ac核苷酸序列（1830个核苷酸），如序列表中SEQ ID NO:5所示。

2、合成上述核苷酸序列

所述Cry1Ca-01核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO:3所示）、所述Cry1Ca-02核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO:4所示）和所述Cry1Ab/Ac核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO:5所示）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述Cry1Ca-01核苷酸序列（SEQ ID NO:3）的5’端还连接有SpeI酶切位点，所述Cry1Ca-01核苷酸序列（SEQ ID NO:3）的3’端还连接有PvuI酶切位点；合成的所述Cry1Ca-02核苷酸序列（SEQ ID NO:4）的5’端还连接有SpeI酶切位点，所述Cry1Ca-02核苷酸序列（SEQ ID NO:4）的3’端还连接有PvuI酶切位点；合成的所述Cry1Ab/Ac核苷酸序列（SEQ ID NO:5）的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述Cry1Ab/Ac核苷酸序列（SEQ ID NO:5）的3’端还连接有KpnI酶切位点。

第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有Cry1Ca基因和Cry1Ab/Ac基因的重组克隆载体

将合成的Cry1Ca-01核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T（Promega，Madison，USA，CAT：A3600）上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；Cry1Ca-01为Cry1Ca-01核苷酸序列（SEQ ID NO:3）；MCS为多克隆位点）。

然后将重组克隆载体DBN01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞（Transgen，Beijing，China，CAT：CD501），其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组克隆载体DBN01-T），42℃水浴30秒；冰浴细胞1-2分钟；37℃在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5）中振荡培养1小时（100rpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的氨苄青霉素（100毫克/升）的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I（25mM Tris-HCl，10mM EDTA（乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8.0）悬浮；加入200μl新配制的溶液II（0.2M NaOH，1%SDS（十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒5次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III（3M醋酸钾，5M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，取适量上清，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V）为70%的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase（20μg/ml）的TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0）溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经EcoRV和SmaI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的所述Cry1Ca-01核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，即Cry1Ca-01核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述Cry1Ca-02核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN02-T，其中，Cry1Ca-02为Cry1Ca-02核苷酸序列（SEQ ID NO:4）。酶切和测序验证重组克隆载体DBN02-T中所述Cry1Ca-02核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述Cry1Ab/Ac核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN03-T，其中，Cry1Ab/Ac为Cry1Ab/Ac核苷酸序列（SEQ ID NO:5）。酶切和测序验证重组克隆载体DBN03-T中所述Cry1Ab/Ac核苷酸序列正确插入。

2、构建含有Cry1Ca基因和Cry1Ab/Ac基因的重组表达载体

用限制性内切酶SpeI和PvuI分别酶切重组克隆载体DBN01-T和表达载体DBNBC-01（载体骨架：pCAMBIA2301（CAMBIA机构可以提供）），将切下的Cry1Ca-01核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-01的SpeI和PvuI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100323，其构建流程如图2所示（Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；Ubi：玉米Ubiquitin（泛素）基因启动子（SEQ ID NO:6）；Cry1Ca-01：Cry1Ca-01核苷酸序列（SEQ ID NO:3）；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQ ID NO:7）；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因（SEQ ID NO:8）；LB：左边界）。

将重组表达载体DBN100323用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组表达载体DBN100323），42℃水浴30秒；冰浴细胞1-2分钟；37℃在LB液体培养基中振荡培养1小时（100rpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB固体平板上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶EcoRV和SmaI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100323在SpeI和PvuI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，即Cry1Ca-01核苷酸序列。

按照上述构建重组表达载体DBN100323的方法，将SpeI和PvuI酶切重组克隆载体DBN02-T切下的所述Cry1Ca-02核苷酸序列插入表达载体DBNBC-01，得到重组表达载体DBN100060。酶切和测序验证重组表达载体DBN100060含有序列表中SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，即Cry1Ca-02核苷酸序列，所述Cry1Ca-02核苷酸序列可以连接所述Ubi启动子和Nos终止子。

按照上述构建重组表达载体DBN100323的方法，将NcoI和KpnI酶切重组克隆载体DBN03-T切下的所述Cry1Ab/Ac核苷酸序列插入表达载体DBNBC-01，得到重组表达载体DBN100056。酶切和测序验证重组表达载体DBN100056含有序列表中SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，即Cry1Ab/Ac核苷酸序列，所述Cry1Ab/Ac核苷酸序列可以连接所述Ubi启动子和Nos终止子。

按照上述构建重组表达载体DBN100323的方法，将SpeI和PvuI、NcoI和KpnI分别酶切重组克隆载体DBN01-T和DBN03-T切下的所述Cry1Ca-01核苷酸序列和Cry1Ab/Ac核苷酸序列插入表达载体DBNBC-01，得到重组表达载体DBN100062。酶切和测序验证重组表达载体DBN100062含有序列表中SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，即Cry1Ca-01核苷酸序列和Cry1Ab/Ac核苷酸序列，所述Cry1Ca-01核苷酸序列和Cry1Ab/Ac核苷酸序列可以连接所述Ubi启动子和Nos终止子。

3、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体DBN100323、DBN100060、DBN100056和DBN100062用液氮法转化到农杆菌LBA4404（Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015）中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA（重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin）和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin）的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶AhdI和EcoRV对重组表达载体DBN100323、DBN100060、DBN100056和DBN100062酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100323、DBN100060、DBN100056和DBN100062结构完全正确。

第三实施例、转入Cry1Ca-01和Cry1Ab/Ac基因的玉米植株的获得及验证

1、获得转入Cry1Ca-01和Cry1Ab/Ac基因的玉米植株

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31（Z31）的幼胚与第二实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100323、DBN100060、DBN100056和DBN100062中的T-DNA（包括玉米Ubiquitin基因的启动子序列、Cry1Ca-01核苷酸序列、Cry1Ca-02核苷酸序列、Cry1Ab/Ac核苷酸序列、PMI基因和Nos终止子序列）转入到玉米染色体组中，获得了转入Cry1Ca-01核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株和转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株；同时以野生型玉米植株作为对照。

对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将Cry1Ca-01核苷酸序列、Cry1Ca-02核苷酸序列和/或Cry1Ab/Ac核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞（步骤1：侵染步骤），在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液（OD660=0.4-0.6，侵染培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L，pH5.3））中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤2：共培养步骤）。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢霉素），不添加植物转化体的选择剂（步骤3：恢复步骤）。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂（甘露糖）的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织（步骤4：选择步骤）。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物（步骤5：再生步骤），优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基（MS分化培养基和MS生根培养基）上培养以再生植物。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。

2、用TaqMan验证转入Cry1Ca和Cry1Ab/Ac基因的玉米植株

分别取转入Cry1Ca-01核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株和转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Cry1Ca基因和Cry1Ab/Ac基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测Cry1Ca基因和Cry1Ab/Ac基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取转入Cry1Ca-01核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop2000（Thermo Scientific）测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测Cry1Ca-01核苷酸序列：

引物1（CF1）：CAGGACTGGATCACCTATAATCGG如序列表中SEQ IDNO:9所示；

引物2（CR1）：AAAGAACGCGGCAATGTCC如序列表中SEQ ID NO:10所示；

探针1（CP1）：CAGGCGCGATCTTACTTTGACGGTCC如序列表中SEQ IDNO:11所示；

以下引物和探针用来检测Cry1Ca-02核苷酸序列：

引物3（CF2）：CAAGGAATGGGAAGAAGATCCTAAC如序列表中SEQ IDNO:12所示；

引物4（CR2）：TTCAAGAAGTCCATCAAGGATACG如序列表中SEQ IDNO:13所示；

探针2（CP2）：CCAGCAACCAGGACCAGAGTGATCGATAG如序列表中SEQ ID NO:14所示；

以下引物和探针用来检测Cry1Ab/Ac核苷酸序列：

引物5（CF3）：TGCGTATTCAATTCAACGACATG如序列表中SEQ IDNO:15所示；

引物6（CR3）：CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC如序列表中SEQ IDNO:16所示；

探针3（CP3）：CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC如序列表中SEQ IDNO:17所示；

PCR反应体系为：

所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度的探针50μl和860μl1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。

PCR反应条件为：

利用SDS2.3软件（Applied Biosystems）分析数据。

实验结果表明，Cry1Ca-01核苷酸序列、Cry1Ca-02核苷酸序列、Cry1Ab/Ac核苷酸序列和Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列均己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入Cry1Ca-01核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株和转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株均获得了含有单拷贝Cry1Ca基因和/或Cry1Ab/Ac基因的转基因玉米植株。

第四实施例、转基因玉米植株的抗虫效果检测

将转入Cry1Ca-01核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株对大螟进行抗虫效果检测。

分别取转入Cry1Ca-01核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株（V3-V4期）的新鲜叶片（心叶），用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将玉米叶片去除叶脉，同时剪成约1cm×4cm的长条状，取1片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的大螟（初孵幼虫），虫试培养皿加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70%-80%、光周期（光/暗）16：8的条件下放置3天后，根据大螟幼虫发育进度、死亡率和叶片损伤率三项指标，获得抗性总分：总分=100×死亡率+[100×死亡率+90×（初孵虫数/接虫总数）+60×（初孵-阴性对照虫数/接虫总数）+10×（阴性对照虫数/接虫总数）]+100×（1-叶片损伤率）。转入Cry1Ca-01核苷酸序列的共3个株系（S1、S2和S3），转入Cry1Ca-02核苷酸序列的共3个株系（S4、S5和S6），转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的共3个株系（S7、S8和S9），转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的共3个株系（S10、S11和S12），经Taqman鉴定为非转基因的（NGM1）共1个株系，野生型的（CK1）共1个株系；从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。结果如表1和图3所示。

表1、转基因玉米植株接种大螟的抗虫实验结果

表1的结果表明：转入Cry1Ca-01核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的玉米植株和转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株的生测总分均在220分左右或以上，转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株的生测总分可以高达280分以上；而经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株和野生型玉米植株的生测总分一般在50分左右。图3的结果表明：与野生型玉米植株相比，转入Cry1Ca-01核苷酸序列的玉米植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的玉米植株和转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株均可以造成大螟幼虫的死亡，其叶片仍会受到20%左右的损伤，而转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株可以造成初孵幼虫的大量死亡，且对小部分存活幼虫发育进度造成极大的抑制，3天后幼虫基本仍处于初孵或介于初孵-阴性对照之间的状态，且转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株大体上只受到轻微损伤，叶片上仅为极少量针孔状损伤，其叶片损伤率在3%左右或以下。

由此证明转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的玉米植株显示出高抗大螟的活性，这种活性足以对大螟的生长产生不良效应从而使其得以控制。

第五实施例、转入Cry1Ca和Cry1Ab/Ac基因的水稻植株的获得及验证

1、获得转入Cry1Ca和Cry1Ab/Ac基因的水稻植株

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的粳稻品种日本晴的愈伤组织与第二实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100323、DBN100060、DBN100056和DBN100062中的T-DNA（包括玉米Ubiquitin基因的启动子序列、Cry1Ca-01核苷酸序列、Cry1Ca-02核苷酸序列、Cry1Ab/Ac核苷酸序列、PMI基因和Nos终止子序列）转入到水稻染色体组中，获得了转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株；同时以野生型水稻植株作为对照。

对于农杆菌介导的水稻转化，简要地，把水稻种子接种在诱导培养基（N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上，从水稻成熟胚诱导出愈伤组织（步骤1：愈伤诱导步骤），之后，优选愈伤组织，用农杆菌悬浮液接触愈伤组织，其中农杆菌能够将Cry1Ca-01核苷酸序列、Cry1Ca-02核苷酸序列和/或Cry1Ab/Ac核苷酸序列传递至愈伤组织上的至少一个细胞（步骤2：侵染步骤）。在此步骤中，愈伤组织优选地浸入农杆菌悬浮液（OD660=0.3，侵染培养基（N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、pH5.4））中以启动侵染。愈伤组织与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤3：共培养步骤）。优选地，愈伤组织在侵染步骤后在固体培养基（N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上培养。在此共培养阶段后，有一个“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基（N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢霉素），不添加植物转化体的选择剂（步骤4：恢复步骤）。优选地，愈伤组织在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的愈伤组织在含选择剂（甘露糖）的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织（步骤5：选择步骤）。优选地，愈伤组织在有选择剂的筛选固体培养基（N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖10g/L、甘露糖10g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物（步骤6：再生步骤），优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基（N6分化培养基和MS生根培养基）上培养以再生植物。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述N6分化培养基（N6盐、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于30℃下培养。

2、用TaqMan验证转入Cry1Ca和Cry1Ab/Ac基因的水稻植株

分别取转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Cry1Ca基因和Cry1Ab/Ac基因的拷贝数。同时以野生型水稻植株作为对照，按照上述第三实施例中2用TaqMan验证转入Cry1Ca和Cry1Ab/Ac基因的玉米植株的方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

实验结果表明，Cry1Ca-01核苷酸序列、Cry1Ca-02核苷酸序列、Cry1Ab/Ac核苷酸序列和Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列均己整合到所检测的水稻植株的染色体组中，而且转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株均获得了含有单拷贝Cry1Ca基因和/或Cry1Ab/Ac基因的转基因水稻植株。

第六实施例、转基因水稻植株的抗虫效果检测

将转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株、野生型水稻植株和经Taqman鉴定为非转基因的水稻植株对大螟和二化螟进行抗虫效果检测。

（1）大螟：分别取转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株、野生型水稻植株和经Taqman鉴定为非转基因的水稻植株（分蘖期）的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将水稻叶片去除叶脉，同时剪成约1cm×4cm的长条状，取1片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的大螟（初孵幼虫），虫试培养皿加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70%-80%、光周期（光/暗）16：8的条件下放置3天后，根据大螟幼虫发育进度、死亡率和叶片损伤率三项指标，获得抗性总分：总分=100×死亡率+[100×死亡率+90×（初孵虫数/接虫总数）+60×（初孵-阴性对照虫数/接虫总数）+10×（阴性对照虫数/接虫总数）]+100×（1-叶片损伤率）。转入Cry1Ca-01核苷酸序列的共3个株系（S13、S14和S15），转入Cry1Ca-02核苷酸序列的共3个株系（S16、S17和S18），转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的共3个株系（S19、S20和S21），转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的共3个株系（S22、S23和S24），经Taqman鉴定为非转基因的（NGM2）共1个株系，野生型的（CK2）共1个株系；从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。结果如表2和图4所示。

表2、转基因水稻植株接种大螟的抗虫实验结果

表2的结果表明：转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株的生测总分均在230分左右，转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株的生测总分低至150分左右，转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株的生测总分可以高达290分左右；而经Taqman鉴定为非转基因的水稻植株和野生型水稻植株的生测总分一般在50分左右。图4的结果表明：与野生型水稻植株相比，转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株均可以造成大螟幼虫的死亡，其叶片仍会受到10-30%左右损伤，而转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株对初孵大螟幼虫的防治效果几乎为百分之百，极个别存活幼虫也基本上停止发育，3天后幼虫基本仍处于初孵状态，且转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株大体上只受到轻微损伤，在极个别叶片中能够观察到极少量的针孔状取食痕迹，且这些痕迹只有在放大镜下观察才能看到。

由此证明转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株显示出高抗大螟的活性，这种活性足以对大螟的生长产生不良效应从而使其得以控制。

（2）二化螟：分别取转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株、转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株、野生型水稻植株和经Taqman鉴定为非转基因的水稻植株（分蘖期）的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将水稻叶片去除叶脉，同时剪成约1cm×4cm的长条状，取1片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的二化螟（初孵幼虫），虫试培养皿加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70%-80%、光周期（光/暗）16：8的条件下放置3天后，根据二化螟幼虫发育进度、死亡率和叶片损伤率三项指标，获得抗性总分：总分=100×死亡率+[100×死亡率+90×（初孵虫数/接虫总数）+60×（初孵-阴性对照虫数/接虫总数）+10×（阴性对照虫数/接虫总数）]+100×（1-叶片损伤率）。转入Cry1Ca-01核苷酸序列的共3个株系（S13、S14和S15），转入Cry1Ca-02核苷酸序列的共3个株系（S16、S17和S18），转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的共3个株系（S19、S20和S21），转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的共3个株系（S22、S23和S24），经Taqman鉴定为非转基因的（NGM2）共1个株系，野生型的（CK2）共1个株系；从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。结果如表3和图5所示。

表3、转基因水稻植株接种二化螟的抗虫实验结果

表3的结果表明：转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株的生测总分均在200分左右或以上，转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株的生测总分可以高达290分以上；而经Taqman鉴定为非转基因的水稻植株和野生型水稻植株的生测总分一般在55分左右。图5的结果表明：与野生型水稻植株相比，转入Cry1Ca-01核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ca-02核苷酸序列的水稻植株均可以造成二化螟幼虫的死亡，其叶片仍会受到10-30%左右损伤，而转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株对初孵二化螟幼虫的防治效果几乎为百分之百，极个别存活幼虫也基本上停止发育，3天后幼虫基本仍处于初孵状态，且转入Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株和转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株大体上只受到轻微损伤，叶片上仅为极少量针孔状损伤，其叶片损伤率均在2%以下。

由此证明转入Cry1Ca-01-Cry1Ab/Ac核苷酸序列的水稻植株显示出高抗二化螟的活性，这种活性足以对二化螟的生长产生不良效应从而使其得以控制。

综上所述，本发明控制害虫的构建体及其方法通过植物体内同时产生Cry1Ca和Cry1Ab/Ac蛋白来控制害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法和生物防治方法相比，本发明不仅毒力强、效果彻底，而且对植物进行全生育期、全植株的保护以防治害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定，简单、方便、经济。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (29)

1.一种构建体，其特征在于，包括Cry1Ca蛋白和Cry1A蛋白。

2.根据权利要求1所述构建体，其特征在于，所述构建体包括第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包括Cry1Ca蛋白，所述第二表达盒包括Cry1A蛋白。

3.根据权利要求2所述构建体，其特征在于，所述第一表达盒还包括与Cry1Ca蛋白有效连接的调控序列，所述第二表达盒还包括与Cry1A蛋白有效连接的调控序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述构建体，其特征在于，所述Cry1Ca蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述构建体，其特征在于，所述Cry1Ca蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1-5任一项所述构建体，其特征在于，所述Cry1A蛋白为Cry1Ab/Ac蛋白。

7.根据权利要求6所述构建体，其特征在于，所述Cry1Ab/Ac蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述构建体，其特征在于，所述Cry1Ab/Ac蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

9.一种包含权利要求1-8任一项所述构建体的重组载体。

10.一种产生杀虫蛋白质的方法，其特征在于，包括：

获得包含权利要求1-8任一项所述构建体的转基因宿主生物的细胞；

在允许产生杀虫蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；

回收所述杀虫蛋白质。

11.根据权利要求10所述产生杀虫蛋白质的方法，其特征在于，所述转基因宿主生物包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。

12.根据权利要求11所述产生杀虫蛋白质的方法，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。

13.一种用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，包括：将权利要求1-8任一项所述构建体编码的杀虫蛋白质在植物中与至少一种不同于权利要求1-8任一项所述构建体编码的杀虫蛋白质的第三种杀虫核苷酸一起表达。

14.根据权利要求13所述用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，所述第三种杀虫核苷酸可以编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。

15.根据权利要求13所述用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，所述第三种杀虫核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。

16.一种产生抗虫植物的方法，其特征在于，包括：将权利要求1-8任一项所述构建体或权利要求9所述重组载体导入植物。

17.一种用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，其特征在于，包括：将权利要求1-8任一项所述构建体或权利要求9所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受昆虫害虫侵害量的杀虫蛋白质。

18.一种控制昆虫害虫的方法，其特征在于，包括：使昆虫害虫与抑制量的权利要求1-8任一项所述构建体编码的昆虫抑制性蛋白质接触。

19.根据权利要求18所述的控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白存在于产生其的植物细胞中，所述昆虫害虫通过摄食所述植物细胞与所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白接触。

20.根据权利要求19所述的控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白存在于产生其的转基因植物中，所述昆虫害虫通过摄食所述转基因植物的组织与所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白接触，接触后所述昆虫害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对昆虫害虫为害植物的控制。

21.根据权利要求20所述的控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物可以处于任意生育期。

22.根据权利要求20所述的控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物的组织可以为叶片、茎秆、雄穗、雌穗、花药或花丝。

23.根据权利要求20所述的控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述对昆虫害虫为害植物的控制不因种植地点的改变而改变。

24.根据权利要求20所述的控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述对昆虫害虫为害植物的控制不因种植时间的改变而改变。

25.根据权利要求19-24任一项所述的控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述植物可以来自玉米、水稻、高粱、麦、粟、棉花、芦苇、甘蔗、茭白、蚕豆或油菜。

26.根据权利要求19-25任一项所述的控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述Cry1Ca蛋白和所述Cry1Ab/Ac蛋白的多核苷酸的植物。

27.根据权利要求18-26任一项所述控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述昆虫害虫为鳞翅目昆虫害虫。

28.根据权利要求27所述控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述鳞翅目昆虫害虫为大螟和/或二化螟。

29.一种权利要求1-8任一项所述构建体编码的昆虫抑制性蛋白质控制昆虫害虫的用途。

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