JP3322871B2 - 殺虫性タンパク質 - Google Patents

殺虫性タンパク質

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は害虫の抑制用としてのレクチン類の用途に関
する。
レクチン類は、糖複合体の炭水化物部分を認識し、結
合するそれらの能力に基づき分類される（糖）タンパク
質の異種クラスである。昆虫の主要構造炭水化物キチン
はＮ−アセチルグルコサミン〔GluNAc〕のポリマーであ
り、GluNAcに関して糖結合特異性を有する様々なレクチ
ン類が、ある農業害虫に対する殺虫活性とともに開示さ
れている。
欧州特許出願EP−Ａ第0351924号明細書（Shell Inter
nationale Research Maatschappij B.V.）は、天然でみ
られるような植物に対し外来の植物内でレクチンを発現
するレクチン遺伝子を含むトランスジェニック植物に関
する。特に、それはエンドウのレクチンがタバコ中に挿
入され、そのトランスジェニック植物がある程度の昆虫
耐性を有することを開示している。
欧州特許出願EP−Ａ第0427529号明細書（Pioneer Hi
−Bred International,Inc）は選択された植物のレクチ
ン類が多くの一般害虫又は農作物に対して殺幼虫性であ
ることを開示している。
多くのレクチン類は哺乳動物及び鳥類に対して毒性で
あることが知られている。例えば、ファセオルス・ブル
ガリス（Phaseolus vulgaris）のレクチン類はラットに
よりほとんど消化されず、このため腸細胞と反応して十
二指腸及び空腸内細胞の刷子縁を破壊することがある。
その結果、潜在的に有害な物質の異常吸収が起きて、重
度の毒性作用を引き起こす（Pusztaiら,1979）。
したがって、昆虫に対して毒性であるが、同時に哺乳
動物又は鳥類に対して毒性を示さないレクチン類を特定
する必要がある。これらは、外来レクチンがその中に存
在している物を食品使用上の制限なしに農作物の保護適
用できる点で有用であろう。
発明の要旨 我々は、特にヒガンバナ科（Amaryllidaceae）及びア
リウム科（Alliaceae）植物に由来し、特異的マンノー
ス結合能により特徴付けられるレクチン群が、害虫の抑
制に有効であるが、但し哺乳動物及び鳥類に対して無毒
性であることを意外にも発見した。
その最も広義な面において、本発明は害虫の抑制用と
して特異的マンノース結合能を有し及び／又はヒガンバ
ナ科及びアリウム科植物に由来したレクチン類の用途に
関する。具体的には、このようなレクチン類は致死、幼
虫の体重減少及び／又は発育遅延を生じるような量で昆
虫に供される。植物の害虫へのこのようなレクチン類の
供与の結果として、植物は葉、茎、塊茎、果実及び他の
有用な部分に対する損傷から保護される。他方、このよ
うなレクチン類は哺乳動物に対して無毒性であり、化学
殺虫剤の使用に代わる、より安全な代替品である。
本発明に従い用いられるレクチン類は、高度に特異的
なマンノース結合性質を示す。他の一部の植物、例えば
マメ科植物、からのレクチン類はマンノースと結合する
が、それらはグルコース及びＮ−アセチルグルコサミン
とも結合する。したがって、特異的マンノース結合能と
はグルコース及びＮ−アセチルグルコサミンと結合でき
ない能力を伴うマンノースと結合する能力をいう。この
ような結合特異性はShibuyaら,1988で詳述されたような
沈降定量、ハプテン阻止及びアフィニティクロマトグラ
フィーの技術により確認される。
ヒガンバナ科及びアリウム科植物由来のレクチン類を
比較した最近の研究では、アリウム科植物由来のレクチ
ン類がそれらの分子構造、炭水化物結合特異性、アミノ
酸組成及び血清学的性質に関してヒガンバナ科植物由来
のそれと強く似ていることが示されている。すべてＤ−
マンノースとのみ結合する。すべて多量の酸性及び水酸
性のアミノ酸、すなわちグリシン及びロイシンを含有し
ている。すべてジスルフィド結合で連結されないMr11,5
00〜14,000のサブユニットを含み、ダイマー（例えば、
ニンニク）又はテトラマー（例えば、スノードロップ）
として生じる。通常、レクチン濃度はアリウム科植物の
球根よりもヒガンバナ科植物の球根で高い。
本発明によるヒガンバナ科及びアリウム科由来のレク
チン類の好ましい用途としては、これらのタンパク質を
コードする遺伝子を植物中に挿入することが挙げられ
る。先の出願では、Bt毒素〔例えば、欧州特許出願第01
42924号明細書Lubrizol Genetics Inc.〕及び例えばサ
サゲ由来のトリプシン阻害剤〔欧州特許出願第0272144
号明細書Agricultural Genetics Company〕のような殺
虫活性を有するタンパク質の遺伝子を挿入することに成
功したことを記載している。
トランスジェニック植物における外来遺伝子の導入及
び発現に関する種々の方法が、当業者にとり利用可能で
ある。これらにはアグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）を介した遺伝子導入、細胞又は原形質体中へのDNAの
マイクロインジェクション、成長花粉管によるDNA導
入、接合子胚の吸収によるDNA取込み、炭化ケイ素繊維
を介したデリバリー、マイクロプロジェクト衝撃〔バイ
オリスティック（biolistic）導入〕及びポリエチレン
グリコール、リポソーム又はエレクトロポレーションを
用いたDNA直接取込みがある。トランスジェニック植物
系が確立されると、その特徴は慣用的な植物改良で他の
品質に導入される。
昆虫抑制に有用なレクチン類及びその対応遺伝子は、
必ずしも限定されないが、アリウム・サチブム（Allium
sativum）（ニンニク）、アリウム・ビネアレ（Allium
vineale）、アリウム・アーシナム（Allium ursinu
m）、アリウム・モリ（Allium moly）、アリウム・セパ
（Allium sepa）、アリウム・ポラム（Allium porru
m）、ナーシサス・シュードナーシサス（Narcissus pse
udonarcissus）、クリビア・ミニアタ（Clivia miniat
a）、ガランタス・ニバリス（Galanthus nivalis）（ス
ノードロップ）及びヒッペアストラム・ヒブル（Hippea
strum hybr）から得ることができる。
一方、これらのタンパク質はバチルス・チューリンゲ
ンシス（Bacillus thuringiensis）、Bt毒素、トリプシ
ン阻害剤または他の殺虫物質も含有してよい農薬処方剤
を用いて又は殺虫処方剤の一部として植物に直接投与又
は同時投与してもよい。
抑制される昆虫としては鞘翅目、鱗翅目及び直翅目に
属する植物咀嚼段階の昆虫があり、特に限定されるもの
ではなく以下の種を含む：アカントスセリデス・オブテ
クタス（Acanthoscelides obtectus）、ブルクス種（Br
uchus sps.）、カロソブルクス種（Callosobruchus sp
s.）〔ブルキド・ビートル（bruchid beetle）〕、アグ
リオテス種（Agriotes sps.）〔ワイヤワーム（wirewor
m）〕、アムフィマロン種（Amphimallon sps.）〔チャ
ファー・ビートル（chafer beetle）〕、アントノマス
・グランジス（Anthonomus grandis）〔コットン・ボー
ル・ウィービル（cotton boll weevil）〕、セウトリン
クス・アシミリス（Ceutorhynchus assimilis）〔カベ
ッジ・シード・ウィービル（cabbage seed weevi
l）〕、シラス種（Cylas sps.）〔スィート・ポテト・
ウィービル（sweet potato weevil）〕、ジアブロチカ
種（Diabrotica sps.）〔コーン・ルートワーム（corn
rootworm）〕、エピカウタ種（Epicauta sps.）〔ブラ
ック・ブリスター・ビートル（black blister beetl
e）〕、エピラクナ種（Epilachna sps.）〔メロン・ビ
ートル（melon beetle）等〕、レプチノターサ・デセム
リネアタ（Leptinotarsa decemlineata）〔コロラド・
ポテト・ビートル（Colorado potato beetle）〕、メリ
ギスセス種（Meligisthes sps.）〔ブロッソム・ビート
ル（blossom beetle）〕、メロロンタ種（Melolontha s
ps.）〔コックチャファー（cockchafer）〕、フィレオ
トレタ種（Phyleotreta sps.）、シリオデス種（Psylli
odes sps.）〔フレア・ビートル（flea beetle）〕、ポ
ピリア・ジャポニカ（Popillia japonica）〔ジャパニ
ーズ・ビートル（Japanese beetle）〕、スコリタス種
（Scolytus sps.）〔バーク・ビートル（bark beetl
e）〕、シトフィルス種（Sitophilus sps.）〔グレイン
・ウィービル（grain weevil）〕、テネブリオ・モリタ
ー（Tenebrio molitor）〔イエロー・ミールワーム（ye
llow mealworm）〕、トリボリウム種（Tribolium sp
s.）〔フラワー・ビートル（flour beetle）〕、トロゴ
ダーマ・グラナリウム（Trogoderma granarium）〔カプ
ラ・ビートル（Khapra beetle）〕、アクレリス種（Acl
eris sps.）〔フルーツ・ツリー・トートリクス（fruit
tree tortrixs）〕、アクラエア・アセラタ（Acraea a
cerata）〔スィート・ポテト・バタフライ（sweet pota
to butterfly）〕、アグロティス種（Agrotis sps.）
〔カットワーム（cutworm）〕、オートグラファ・ガン
マ（Autographa gamma）〔シルバーＹモス（silver−Y
moth）〕、カイロ種（Chilo sps.）〔スターク・ボーラ
ー（stalk borer）〕、シジア・ポモネラ（Cydia pomon
ella）〔コドリング・モス（codling moth）〕、ジパロ
プシス種（Diparopsis sps.）〔レッド・ボールワーム
（red bollworm）〕、エフェスチア種（Ephestia sp
s.）〔ウェアハウス・モス（warehouse moth）〕、ヘリ
オシス種（Heliothis sps.）、ヘリコバーパ種（Helico
verpa sps.）〔バドワーム（budworm）、ボールワー
ム〕、マメストラ・ブラッシカエ（Mamestra brassica
e）〔カベージ・モス（cabbage moth）〕、マンジュカ
種（Manduca sps.）〔ホーンワーム（hornworm）〕、マ
ルカ・テスチュラリス（Maruca testulalis）〔マング
・モス（mung moth）〕、ミチムナ種（Mythimna sps.）
〔シリアル・アーミーワーム（cereal armyworm）〕、
オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）〔ヨ
ーロピアン・コーン・ボーラー（European corn bore
r）〕、ペクチノフォラ・ゴシピエラ（Pectinophora go
ssypiella）〔ピンク・ボールワーム（pink bollwor
m）〕、フトリマエア・オペルクレラ（Phthorimaea ope
rculella）〔ポテト・チュバー・モス（potato tuber m
oth）〕、ピエリス・ブラッシカエ（Pieris brassica
e）〔ラージ・ホワイト・バタフライ（large white but
terfly）〕、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）〔スモ
ール・ホワイト・バタフライ（small white butterfl
y）〕、プロジア・インターパンクテラ（Plodia interp
unctella）〔インディアン・グレイン・モス（Indian g
rain moth）〕、プルテラ・キシロステラ（Plutella xy
lostella）〔ダイモンド−バック・モス（diamond−bac
k moth）〕、シタトロガ・セレアレラ（Sitatroga cere
alella）〔アンゴウモイス・グレイン・モス（Angoumoi
s grain moth）〕、スポドプテラ種（Spodoptera sp
s.）〔アーミーワーム〕、トリコプルシアニ（Trichopl
usiani）〔カベッジ・セミルーパー（cabbage semiloop
er）〕、アチェタ種（Acheta sps.）〔フィールド・ク
リケット（field cricket）〕、グリロタルフ種（Gryll
otalph sps.）〔モル・クリケット（mole cricke
t）〕、ロクスタ・ミグラトリア（Locusta migratori
a）〔ワタリイナゴ〕及びシュイストセルカ・グレガリ
ア（Schistocerca gregaria）〔デザート（desert）イ
ナゴ〕。
本発明に従い用いられるレクチン類は鞘翅目の害虫に
対して特に有効である。
本発明の方法に従い好ましくは形質転換により保護で
きる植物としては、特に限定されるものではなく、米、
小麦、トウモロコシ、ワタ、ジャガイモ、サトウキビ、
ブドウの木、カッサバ、サツマイモ、タバコ、大豆、テ
ンサイ、豆類、リンゴ、トマト、菜種及びヒマワリがあ
る。
植物物質からのレクチン類の抽出 ヒガンバナ科及びアリウム科植物種からレクチン類を
抽出するため、以下の操作が行われる。
球根又は葉を新鮮な組織グラム当たり1M硫酸アンモニ
ウム50mlを用いてブレンダーでホモゲナイズする。次い
でその抽出液をガーゼで濾過し、遠心する（4000gで10
分間）。得られた上澄を−20℃で一晩凍結させる。解凍
後に沈澱物は２回目の遠心により除去される。清澄化さ
れた上澄は1M硫酸アンモニウムで平衡化されたマンノー
ス−セファロースのカラム（層容量50ml）に適用され
る。未結合タンパク質を洗い落とし、レクチンを非緩衝
化20mM 1,3−ジアミノプロパンを用いて取りはずす。
すべてのフェノール系化合物を除去するため、アフィ
ニティ精製レクチンは固体塩を加えることで1M硫酸アン
モニウムに調整され、1M硫酸アンモニウムで平衡化され
たフェニルセファロース（商標名）のカラム（15×3c
m）に適用される。カラム洗浄後にレクチンは蒸留水又
は1,3−ジアミノプロパン（20mM、非緩衝化溶液）を用
いて溶出される。
植物への挿入用レクチン遺伝子のクローニング ヒガンバナ科及びアリウム科レクチン類に関する遺伝
子のクローニングは特別な問題を提起する。球根組織か
らのRNAの抽出は特に困難である。レクチン類が豊富で
あるとわかった子房組織はmRNAの抽出に適することが判
明した。
以下、スノードロップ（ガランタス・ニバリス）から
レクチン遺伝子を得る方法について記載する。当業者で
あれば、この方法がヒガンバナ科又はアリウム科の他の
種類の植物にも容易に適用できることがわかるであろ
う。
スノードロップの開花植物が集められ、子房が花から
切出され、液体窒素で凍結され、−80℃で貯蔵される。
全細胞RNAは本質的にFinkelstein及びCrouch（1986）で
記載されたように子房組織から調製される。ポリＡリッ
チRNAは、Siflowら（1979）で記載されたようにオリゴ
デオキシチミジンセルロース〔Sigma Chemical Compan
y、セントルイス〕クロマトグラフィーにより精製され
るが、但しポリＡリッチRNAは室温で溶出される。
cDNAライブラリーは、単離されたポリＡリッチRNAを
用い、例えばスウェーデン，ウプサラのPharmacia社のc
DNA合成キットを用い、多機能性ファージミドpT7T3I8U
（ファルマシア社、スウェーデン）のEcoR I部位中に挿
入することによって得られる。そのライブラリーは大腸
菌（E.coli）XL1ブルー〔Stratagene、カリフォルニア
州，ラジョラ〕で増殖される。
レクチン遺伝子に関する組換え型のクローンを選択す
るため、コロニーは、残基41−45に関するレクチンのア
ミノ酸配列に由来する32P末端標識された部分的縮重オ
リゴヌクレオチドプローブ、即ち： を用いてスクリーニングされる。ハイブリッド形成はpH
7.5の90mMトリスHCl、6mM EDTA、10×デンハーツ（Denh
ardts）、0.1％SDS、180mg/ml加水分解された酵母RNA及
び２×106cpm/ml32P標識プローブを含有した0.9M塩化ナ
トリウム中38℃で12時間実施される。ハイブリッド形成
後にフィルターは６×SSC（１×SSC＝0.9M塩化ナトリウ
ム及び0.09Mクエン酸ナトリウム,pH7.0）中室温で15分
間にわたり４回洗浄され、しかる後６×SSC中ハイブリ
ッド形成温度で５分間洗浄される。フィルターは乾燥ブ
ロットされ、サランラップ（Saran Wrap）で被覆され、
−80℃でKodak−Ｘ−Omatフィルムに露出された。陽性
シグナル発生コロニーは同様の条件下で同様のプローブ
を用いて再スクリーニングされる。プラスミドはBirnbo
im及びDoly（1979）で記載されたようなアルカリ溶解法
を用いて精製コロニーから単離され、ジデオキシ法（Sa
ngerら,1977）を用いてレクチン遺伝子を特定するため
に配列が決定される。
いくつかのイソ型のスノードロップレクチンに相当す
るcDNAの完全なヌクレオチド配列は、添付した配列表に
示されるとおりである。レクチンcDNA LECGNA2は、18
位に開始コドンが存在するらしい570ヌクレオチドの読
取り枠を含んでいる。このコドンで始まる翻訳は、スノ
ードロップレクチンに関するインビトロ翻訳産物に相当
する計算分子量16,917ドルトンの157アミノ酸ポリペプ
チドを形成する。３′非翻訳領域は、６つの枠内終止コ
ドンと532位の１つの可能なポリアデニル化シグナルを
含む。レクチンに関するアミノ末端配列とレクチンクロ
ーンに関する演繹されたアミノ酸配列との比較では、23
アミノ酸のリーダー（シグナル）配列（2315ドルトン）
を有するレクチンが合成されることが示されている。22
アミノ酸（2278ドルトン）がタンパク質のＣ末端から翻
訳後に除去されることもありうる。
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定阻害剤によるDNA配列決定）.Proc.Natl.Acad.Sci.,7
4,5463−5467. 害虫におけるレクチン類の効果 ヒガンバナ科又はアリウム科植物由来のレクチン類の
殺虫性に関して試験するため、それらは様々な人工食餌
中に配合され、葉の表面に適用され又はその遺伝子を用
いて植物を形質転換してそのタンパク質を産生させても
よい。
例１ スノードロップ又はニンニクから精製されたレクチン
を人工種子食（クリング−フィルムスキン（cling−fil
mskin）中にヒヨコマメミールを含む）中に配合し、ブ
ルキド・ビートルのカロソブルクス・マクラタスで試験
した。
様々な濃度のレクチン配合（対コントロール）下にお
ける昆虫幼虫の生存への効果は図１に示されるとおりで
ある。低レベルにおいてニンニクレクチンはブルキド・
ビートルの生存率を増加させたが、この効果は食餌中１
％以上のレベルで完全に逆転され、スノードロップレク
チンに関しては観察されなかった。結果は、ニンニク及
びスノードロップレクチンに関し0.9％程度のLC50を示
す。チューリップ（密接に関連した科−ユリ科）由来の
うち１つのレクチンは殺虫活性を示さなかった。
例２ このようなレクチンの活性をバイオアッセイする上で
困難なことの１つは、一部の人工食餌においてレクチン
が食物中でマンノースに結合し、それを消費する昆虫に
とり利用不能になるということである。この問題を克服
し、スノードロップから得られたレクチンのスポドプテ
ラ・リトラリス（Spodoptera littoralis）（アーミー
ワーム）に対する効果を分析するため、コミュニオン
（communion）ウエハースからなる特別人工食餌を案出
し、５％（w/w）スノードロップレクチンを水溶液中で
コミュニオンウエハースに適用した。スポドプテラをウ
エハース上におき、２日毎に取り替えた。
図２及び表１は生存昆虫の生存率及び体重増加に関す
る効果を示したものである。結果は５％スノードロップ
レクチンがスポドプテラ幼虫の生存率を減少させ、生存
昆虫の体重増加を実質上減少させることを示している。
例３ スノードロップレクチンクローンの構築及び形質転換 LECGNA2クローンは、ファージミドpT7T3 18Uに組み
込んでクローニングされた570塩基EcoR I連結化スノー
ドロップレクチン（GNA）遺伝子のcDNAを含んでいた。
プロセッシング時に開裂されて成熟タンパク質を形成す
るＮ末端及びＣ末端ペプチドを配列データ上にマークし
た。
レクチン遺伝子のコード領域は標準的なポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）技術を用いてpUC19に組込みサブクロー
ニングした〔Innis,M.A.et al.eds.,PCR Protocols:A G
uide to Methods and Application,Academic Press,San
Diego,1990〕。その結果得られた増幅断片がBamH I/Kp
n I二重切断を用いてサブクローニングできるように、
オリゴヌクレオチドプライマーは制限部位が挿入された
Ｎ末端及びＣ末端領域をカバーするように作製された。
これらのプライマーは下記配列を有していた： 断面はPCR及び鋳型としてLECGNA2 DNAを用いて増幅さ
せた。増幅された断片をBamH I＋Kpn Iで直鎖化されたp
UC19に組込んでクローニングした。組換えプラスミド
は、BamH I/Kpn Iを用い正確な挿入サイズに関してスク
リーニングされた。得られた構成物は、望ましくない変
異がPCR反応の人工産物といして作製されなかったこと
を確認するために配列決定された。
GNAコード断片はBamH I/Kpn IでpUC19−1GNA2構成物
を切断することによって単離され、Bam I/Kpn I切断pRO
K2に連結され、大腸菌株MC1022を形質転換するために用
いられた。これらの組換え体は図３で示されるアグロバ
クテリウム二元系ベクター構成物を提供したが、これは
トランスジェニック植物中におけるGNAの構造発現にと
り有用である。コロニーはBamH I/Kpn I、Sph I及びHin
d IIIを用いて制限切断によりスクリーニングし、正確
なpRok9GNA1構成物を、確立された方法に従いpRK2013/H
B101で三親接合によりアグロバクテリウム・ツメファシ
エンス（Agrobacterium tumefaciens）株LBA4404中に移
した〔Bevan,M.（1984）Binary Agrobacterium vectors
for plant transformation（植物形質転換用の二元系
アグロバクテリウムベクター）,Nucleic Acids Resaerc
h,12,103−110〕。pROK−GNAプラスミドを含む単一コロ
ニーをBamH I/Kpn Iでの切断により再スクリーニングし
て、正確な挿入サイズに関してチェックした。
次いで形質転換実験を標準葉ディスク法を用いてニコ
チアナ・タバクム（Nicotiana tabaccum）var.サムスン
（Samsun）で実施した〔Horsch,R.B.et al.（1985）A s
imple and general method for transforming genesint
o plants（遺伝子を植物に組込むために単純かつ一般的
な方法）,Science,227,1229−1231〕。葉ディスクをカ
ナマイシン100mg/L含有選択培地上で培養して、形質転
換された苗条について選択した。苗条をカナマイシン上
で根付かせ、未形質転換回避を排除した。形質転換され
た苗木を、標準ELISA法〔Engvall,E.（1980）Meths.Enz
ymol.,70,419〕により、スノードロップレクチン発現に
関して試験した。系15GNA33、15GNA35及び15GNA79から
のトランスジェニック植物は、各々40.2、26.6及び47.3
μg/g新鮮重量に相当する高レベルのGNA抗原を発現す
る。これらの植物におけるレクチンの生物活性は、自由
乾燥葉組織のリン酸緩衝液抽出物におけるトリプシン処
理ウサギ赤血球を用いた標準ヘマグルチニンアッセイ操
作により証明できるであろう〔Liss,H.＆ Sharon,N.（1
973）The biochemistry of plant lectins（phaetohaem
agglutinins）（植物レクチン（フィトヘマグルチニ
ン）の生化学）,Ann.Rev.Biochem.,42,541−574〕。
例４ ヘリオジス・ビレッセンスに対する脱離葉バイオアッセ
イ （例３で記載されたように産生された）系15GNA33、1
5GNA35及び15GNA79からのクローン複製トランスジェニ
ック植物を、５インチ（約13cm）ポット中のロームベー
ス堆肥（Levingtons M3）；（Fisons plc）に移し、12
時間完全、４時間半分光日養生法で、生育室中26℃、65
％RHで維持した。
葉サンプル（約600mm2）を、トランスジェニック植物
及びコントロールタバコ植物から除去し、２枚の湿潤フ
ィルターペーパーディスクの上にある3oz（約85g）プラ
スチック製ケイタリング（catering）ポットにいれた。
サンプルにそれぞれ５匹の割合で新生（＜24時間齢）H.
ビレッセンス（Heliothis virescens）幼虫を寄生さ
せ、シールし、25℃で維持した。生きている虫は48時間
毎に葉サンプルを新しくするため移した。７日間後にす
べての生きている虫をカウントして、秤量した。すべて
の葉サンプルを圧縮し、７日間かけて食べられた葉面積
をイメージ分析により測定した。結果は以下にまとめら
れるとおりである。
昆虫生存率 サンプル当たりの昆虫バイオマス 非パラメーターマン−ホイットニー（Mann−Whitne
y）Ｕ検定。データは平均＋S.E.M.として示されるが、
但しデータは正規分布化されなかったことに留意。
サンプル当たりの昆虫数の分布 区分はサンプル当たり昆虫０、１又は＞１にまとめら
れた。Ｇ検定〔Ho:exp＝con〕。図４参照。
サンプル当たりで食べられた葉面積 食べられた平均葉面積＋S.E.M.（mm2）。タイプIANOV
A。
例５ 葯を系15GNA79の開花トランスジェニック植物から取
出し、除雄された非形質転換コントロールN.タバクムva
r.（N.tabacum var）「サムスン（samsun）」植物を授
精させるために用いた。得られたハイブリッド種子を堆
肥にまいた。２枚の葉ディスク（5mm径）を４葉段階で
種苗から採取し、２枚のニトロセルロース間で押しつぶ
した（BA85;Schleicher ＆ Schuell）。標準的技術（Ja
hn,R.,Schiebler,W ＆ Greengard,P.（1984）A quant i
tative dot−immunobinding assay for proteins using
nitrocellulose membrane filters（ニトロセルロース
膜フィルターを用いたタンパク質に関する定量的ドット
免疫結合アッセイ）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,1684
−1687）を用い、ウサギ抗GNA一次抗体及び125Iロバ抗
ウサギIgG〔アマーシャム・インターナショナル社（Ame
rsham International plc）〕二次抗体による得られた
「押しつぶしブロット」のラジオイムノアッセイから、
GNA発現〔GNA+xCON〕及び非発現〔GNA゜xCON〕分裂系を
確認した。
得られたハイブリッド植物は、全植物バイオアッセイ
に関して用いることができる。昆虫のダメージは例４で
記載されたように調べられてもよい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヒルダー，ボーガン イギリス国ダーラム、サウス、ロード、 ユニバーシティ、オブ、ダーラム、デパ ートメント、オブ、バイオロジカル、サ イエンシーズ内 (72)発明者 バン ダム，エルス ベルギー国エーベルレー、ウイレム、 ド、クロイラーン、42、ラボラトリア ム、フォール、プランテンビオケミー、 カトリーケ、ユニベルシテイト、ルーベ ン内 (72)発明者 プーマンズ，ウイリー ベルギー国エーベルレー、ウイレム、 ド、クロイラーン、42、ラボラトリア ム、フォール、プランテンビオケミー、 カトリーケ、ユニベルシテイト、ルーベ ン内 (72)発明者 ニューエル，クリスティーン イギリス国ケンブリッジ、ミルトン、ロ ード、サイエンス、パーク、154、アグ リカルチュラル、ジェネティックス、カ ンパニー、リミテッド内 (72)発明者 ハミルトン，ウイリアム イギリス国ケンブリッジ、ミルトン、ロ ード、サイエンス、パーク、154、アグ リカルチュラル、ジェネティックス、カ ンパニー、リミテッド内 (56)参考文献 特開 平２−107137（ＪＰ，Ａ) ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．215, Ｎｏ．１（1987）ｐ．140−144 Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，Ｖｏ ｌ．73，Ｎｏ．１（1988）ｐ．52−57 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．, Ｖｏｌ．179（1989）ｐ．327−331 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】特異的マンノース結合能を有し、ヒガンバ
    ナ科又はアリウム科植物に由来する単離されたレクチン
    を、害虫又はそれらの環境に適用することを特徴とす
    る、害虫の抑制方法。
  2. 【請求項２】レクチンが、害虫に対して植物を保護する
    ために植物に適用される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】レクチンが、レクチンを含む組成物で植物
    を処理することにより適用される、請求項２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】レクチンが、以下に示す配列番号LECGNA
    1、LECGNA2、LECGNA3、LECGNA5又はLECGNA8のタンパク
    質と同一の配列を有するものである、請求項１〜３のい
    ずれかに記載の方法：
  5. 【請求項５】双子葉植物又はイネとメイズ（maize）か
    ら選択された単子葉植物を、以下に示す配列番号LECGNA
    1、LECGNA2、LECGNA3、LECGNA5又はLECGNA8のタンパク
    質と同一の配列を有するレクチンをコードするDNAによ
    り形質転換させることを特徴とする、害虫を抑制する性
    質を上記植物に対して付与する方法：
  6. 【請求項６】害虫が、コレオプテラ目に属する、請求項
    １〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】特異的マンノース結合能を有し、ヒガンバ
    ナ科又はアリウム科植物に由来するレクチンであって、
    以下に示す配列番号LECGNA1、LECGNA2、LECGNA3、LECGN
    A5又はLECGNA8のタンパク質と同一の配列を有するレク
    チンをコードする異種遺伝子を含み、かつ発現可能な植
    物細胞：
  8. 【請求項８】特異的マンノース結合能を有し、ヒガンバ
    ナ科植物に由来するレクチンをコードする遺伝子であっ
    て、以下に示す配列番号LECGNA1、LECGNA2、LECGNA3、L
    ECGNA5又はLECGNA8のタンパク質と同一の配列を有する
    レクチンをコードするものを含む、形質転換DNA分子：
  9. 【請求項９】請求項８に記載されたDNA分子が組込まれ
    たことを特徴とする、組換えDNAプラスミド。
  10. 【請求項１０】請求項８に記載されたDNA分子を、双子
    葉植物又はイネとメイズから選択された単子葉植物の核
    ゲノム中に組込み、特異的マンノース結合能を有し、ヒ
    ガンバナ科又はアリウム科植物に由来するレクチンの発
    現を得ることを特徴とする、トランスジェニック植物の
    製造方法。
  11. 【請求項１１】特異的マンノース結合能を有し、ヒガン
    バナ科又はアリウム科植物に由来する、単離又は精製さ
    れたレクチンを含むことを特徴とする、害虫抑制用農薬
    組成物。
  12. 【請求項１２】レクチンが、以下の配列番号LECGNA1、L
    ECGNA2、LECGNA3、LECGNA5又はLECGNA8のタンパク質と
    同一の配列を有するものである、請求項11に記載の農薬
    組成物：
  13. 【請求項１３】以下の配列番号LECGNA1、LECGNA2、LECG
    NA3、LECGNA5又はLECGNA8のタンパク質と同一の配列を
    有するか、又はそのサブユニットであって、特異的マン
    ノース結合能を有することを特徴とする、レクチン：
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