UA121303C2 - Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує токсин axmi440, та її застосування - Google Patents

Abstract

Винахід стосується молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, що має пестицидну активність. Винахід також стосується вектора, що містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, клітини-хазяїна, що містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, трансгенної рослини, трансгенного насіння, рекомбінантного поліпептиду з пестицидною активністю, композиції, способу боротьби з популяцією лускокрилого шкідника, способу знищення лускокрилого шкідника, способу одержання поліпептиду з пестицидною активністю, рослини або рослинної клітини із стабільно вбудованою в її геном ДНК-конструкцією, способу захисту рослини від лускокрилого шкідника та способу підвищення врожайності рослини.

Description

з популяцією лускокрилого шкідника, способу знищення лускокрилого шкідника, способу одержання поліпептиду з пестицидною активністю, рослини або рослинної клітини із стабільно вбудованою в її геном ДНК-конструкцією, способу захисту рослини від лускокрилого шкідника та способу підвищення врожайності рослини.

ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ

Даний винахід відноситься до галузі молекулярної біології. У даному документі забезпечуються нові гени, які кодують пестицидні білки. Дані білки та нуклеотидні послідовності, що їх кодують, є придатними при приготуванні пестицидних складів та при отриманні трансгенних рослин, стійких до сільськогосподарських шкідників.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Васійив5 ІпПигіпдіепзі5 являє собою грампозитивну спороутворювальну грунтову бактерію, яка здатна продукувати кристалічні включення, що специфічно токсичні для деяких рядів та видів комах, але є нешкідливими для рослин та інших нецільових організмів. У зв'язку з цим композиції, що містять штами Васійи5 ІПигіпдіепбіз або їх інсектицидні білки, можуть застосовуватися як екологічно прийнятні інсектициди для контролю сільськогосподарських комах-шкідників або комах-переносників різних захворювань людей та тварин.

Кристалічні (Сгу) білки (дельта-ендотоксини) Васійй5 ІПигіпдіепбіз мають потужну інсектицидну активність проти переважно личинок лускокрилих, напівтвердокрилих, двокрилих та твердокрилих. Дані білки також продемонстрували активність проти шкідників рядів

Нутепоріега, Ноторіега, Ріфігаріега, МаПорнада та Асагі, а також інших рядів безхребетних, таких як МетаїВпеїтіпіпез, РіагупеІтіп(пе5 та Загсотавіїдогрпога (РейеІзоп (1993) Тпе Васійив5

Тпигіпдіепві5 Татійу ігее. Іп Адмапсей Епдіпеегей Резіїсіде5, Магсе! ОекКкКег, Іпс., Мем/ МО, М.М).

Дані білки первісно класифікували як СгуІ-Сгтум, переважно на основі їх інсектицидної активності. Основними класами були Іерідоріега-специфічні (І), І ерідоріега-специфічні та

Оіріега-специфічні (ІІ), СоіІеоріега-специфічні (І), Оіріега-специфічні (ІМ) та нематода- специфічні (М) та (МІ). Додатково білки класифікували в підродини; більш спорідненим білкам у складі кожної родини надали кодові позначення СгуїА, Стгу!В, Стуї!С тощо. Ще більш спорідненим білкам в рамках кожної групи надали такі позначення як Сгту1С1, Сту1С2 тощо.

Було описано номенклатуру для генів Сгу, яка більше базується на основі гомології амінокислотних послідовностей, ніж специфічності до комахи-мішені (СтісКктоге еї аї. (1998)

Місгобіої. Мої. Віо!І. Кем. 62:807-813). У даній класифікації кожному токсину надається унікальна назва, що включає первинний ієрархічний рівень (арабська цифра), вторинний ієрархічний рівень (велика літера), третинний ієрархічний рівень (мала літера) та четвертинний ієрархічний

Зо рівень (друга арабська цифра). Римські цифри було замінено арабськими цифрами на первинному ієрархічному рівні. Білки з ідентичністю послідовностей менше 4595 мають різні первинні ієрархічні рівні, а критеріями для вторинних та третинних ієрархічних рівнів є ідентичність 7895 та 9595 відповідно.

Кристалічний білок не проявляє інсектицидної активності до моменту його поглинання та розчинення у середній кишці комахи. Поглинений протоксин зазнає гідролізу протеазами у травному тракті комахи з утворенням активних токсичних молекул. (НОПе апа УмпіеїІеу (1989)

Місгобріої. Кем. 53:242-255). Даний токсин зв'язується з апікальними рецепторами щіткової облямівки у середній кишці личинок-мішеней та вбудовується в апікальну мембрану, утворюючи іонні канали або пори, що має результатом загибель личинки.

Дельта-ендотоксини загалом мають п'ять консервативних доменів послідовностей та три консервативні структурні домени (див., наприклад, ЗФе Маада еї аїЇ. (2001) Тгепа5 Сепеїйіс5 17:193-199). Перший консервативний структурний домен складається із семи альфа-спіралей та бере участь у проникненні через мембрану та пороутворенні. Домен ІІ складається з трьох складчастих бета-шарів, які впорядковані в структурі грецького ключа, а домен ЇЇЇ складається з двох анти-паралельних складчастих бета-шарів у структурі типу "еПу-тої!" (де Маада еї а!., 2001, зирга). Домени І та Ш беруть участь у розпізнаванні та зв'язуванні рецепторів та тому вважаються детермінантами специфічності токсину.

Через спустошення, яке можуть спричинити комахи, та для покращення урожайності шляхом контролю комах-шкідників, існує постійна потреба у відкритті нових форм пестицидних токсинів.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Забезпечуються композиції та способи для надання пестицидної активності бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам та насінню рослин. Композиції містять молекули нуклеїнових кислот, послідовності яких кодують пестицидні та інсектицидні поліпептиди, вектори, які містять дані молекули нуклеїнових кислот, та клітини-хазяїни, які містять такі вектори. Композиції також містять послідовності пестицидних поліпептидів та антитіла до даних поліпептидів. Нуклеотидні послідовності можуть застосовуватися в ДНК-конструкціях або експресійних касетах для трансформації та експресії в організмах, зокрема мікроорганізмах та рослинах. Нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть являти собою синтетичні 60 послідовності, які було сконструйовано для експресії в організмі, включаючи, але без обмежень,

мікроорганізм або рослину. Композиції також містять бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини та насіння, що містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом.

Зокрема, забезпечуються виділені або рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, які кодують пестицидний білок. Крім того, охоплені амінокислотні послідовності, що відповідають пестицидному білку. Зокрема, даний винахід забезпечує виділену або рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, показану в 5ЕО ІЮ МО:3-6 або нуклеотидну послідовність, викладену в ЗЕО ІЮ

МО:1 або 2, а також їх біологічно-активні варіанти та фрагменти. Також охоплюються нуклеотидні послідовності, що є комплементарними нуклеотидній послідовності за даним винаходом або які гібридизуються з послідовністю за даним винаходом чи комплементарним їй ланцюгом,. Додатково забезпечуються вектори, клітини-хазяїни, рослини та насіння, які містять нуклеотидні послідовності за даним винаходом або нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності за даним винаходом, а також їх біологічно-активні варіанти та фрагменти.

Забезпечуються способи одержання поліпептидів за даним винаходом та застосування даних поліпептидів для контролю або знищення комах, які відносяться до рядів лускокрилі, напівтвердокрилі, твердокрилі, нематоди або двокрилі. Також включено способи та набори для виявлення у зразку нуклеїнових кислот та поліпептидів за даним винаходом.

Композиції та способи за даним винаходом є корисними для одержання організмів з підвищеною стійкістю або резистентністю до шкідників. Дані організми та композиції, що містять ці організми, є придатними для сільськогосподарських цілей. Композиції за даним винаходом також є придатними для створення змінених або покращених білків, які мають пестицидну активність або для виявлення присутності пестицидних білків чи нуклеїнових кислот у продуктах або організмах.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС

Даний винахід відноситься до композицій та способів регулювання резистентності або стійкості до шкідників у організмах, зокрема, рослинах або рослинних клітинах. Під "резистентністю" мають на увазі, що шкідник (наприклад, комаха) гине при поглинанні або іншому контакті з поліпептидами за даним винаходом. Під "толерантністю" мають на увазі

Зо порушення або зменшення руху тіла, живлення, розмноження або інших функцій організму шкідника. Способи включають трансформування організмів із застосуванням нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок за даним винаходом. Зокрема, нуклеотидні послідовності за даним винаходом є корисними для одержання рослин та мікроорганізмів, які мають пестицидну активність. Отже, забезпечуються трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини та насіння рослин. Композиції являють собою пестицидні нуклеїнові кислоти та білки від Васійй5 або інших видів. Послідовності знаходять застосування в конструюванні векторів експресії для наступної трансформації в організмах, що представляють інтерес, як зонди для виділення інших гомологічних (або частково гомологічних) генів та для створення змінених пестицидних білків із застосуванням способів, відомих в рівні техніки, таких як переміщення доменних блоків або перестановка в ДНК, наприклад, з використанням представників родин ендотоксинів Сту!, Сту2 та Сгу9. Білки знаходять застосування у здійсненні контролю або винищенню популяцій шкідників з лускокрилих, напівтвердокрилих, твердокрилих, двокрилих або нематод та для одержання композицій з пестицидною активністю.

Під виразом "пестицидний токсин" або "пестицидний білок" мають на увазі токсин, який має токсичну активність проти одного або декількох шкідників, включаючи, але без обмежень, представників рядів І ерідорієга, Рірієга, Нетірієга та СоІеорієга чи типу Метаїйода, або білок, який характеризується гомологією до такого білка. Пестицидні білки було виділено з організмів, які включають, наприклад, Васійй5 в5р., СіІовігідішт рітегтепіап5 та Раеєпірасійи5 роріїає.

Пестицидні білки містять амінокислотні послідовності, виведені від нуклеотидних послідовностей повної довжини, що розкриваються в даному документі, та амінокислотні послідовності, які коротше послідовностей повної довжини за рахунок використання альтернативної нижче розташованої ділянки початку трансляції або за рахунок процесингу, який призводить до утворення більш короткого білка, що характеризується пестицидною активністю.

Процесинг може мати місце у тому організмі, в якому експресується білок, або в організмі шкідника після поглинання білка.

Отже, у даному документі забезпечуються нові виділені або рекомбінантні нуклеотидні послідовності, які забезпечують пестицидну активність. Дані нуклеотидні послідовності кодують поліпептиди з гомологією до відомих дельта-ендотоксинів або бінарних токсинів. Також забезпечуються амінокислотні послідовності пестицидних білків. Білок, синтезований у бо результаті трансляції даного гена, дозволяє клітинам контролювати або знищувати шкідників,

які його поглинають.

Виділені молекули нуклеїнових кислот та їх варіанти і фрагменти

Один аспект за даним винаходом відноситься до виділених або рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, які містять нуклеотидні послідовності, що кодують пестицидні білки та поліпептиди або їх біологічно активні частини, а також молекул нуклеїнових кислот, що підходять для застосування як гібридизаційні зонди для ідентифікації молекул нуклеїнових кислот, які кодують білки з ділянками гомології послідовностей. Також у даному документі охоплено нуклеотидні послідовності, що здатні до гібридизації з нуклеотидними послідовностями за даним винаходом у жорстких умовах, як визначено у іншому розділі даного документа. Як використовується у даному документі, вираз "молекула нуклеїнової кислоти" включає молекули ДНК (наприклад, рекомбінантну ДНК, кДНК або геномну ДНК), молекули РНК (наприклад, ІРНК) та аналоги ДНК або РНК, які створено із застосуванням аналогів нуклеотидів.

Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважно є дволанцюговою ДНК.

Вираз "виділена" або "рекомбінантна" нуклеотидна послідовність (або ДНК) використовується в даному документі для позначення нуклеотидної послідовності (або ДНК), яка більше не перебуває в природному для неї середовищі, наприклад, перебуває у системі іп міго або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні У деяких варіантах здійснення виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота не містить послідовностей (переважно послідовностей, що кодують білок), які у природних умовах фланкують нуклеїнову кислоту (тобто, послідовності, які розташовані на 5' та 3' кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній

ДНК організму, з якого отримана нуклеїнова кислота. У контексті за даним винаходом вираз "виділені" при використанні до молекул нуклеїнових кислот, виключає виділені хромосоми.

Наприклад, у різних варіантах здійснення виділений дельта-ендотоксин, що кодує молекулу нуклеїнової кислоти, може містити нуклеотидні послідовності довжиною менше приблизно 5 т.п.о., 4 т.п.о., З т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о., 0,5 т.п.о. або 0,1 т.п.о., які у природних умовах фланкують молекулу нуклеїнової кислоти у геномній ДНК клітини, з якої було отримано нуклеїнову кислоту. У різних варіантах здійснення білок дельта-ендотоксин, який практично не містить клітинного матеріалу, включає склади білка, що містять менше приблизно 3095, 2095,

Зо 1095 або 595 (на суху вагу) білка дельта-ендотоксину (також називається у даному документі "білок, що забруднює"). У деяких варіантах здійснення рекомбінантна нуклеїнова кислота за даним винаходом містить одну або декілька нуклеотидних замін у порівнянні з ЗЕО ІЮ МО:1 або її варіантом, чи фрагментом.

Нуклеотидні послідовності, що кодують білки за даним винаходом, містять у своєму складі послідовність, викладену в 5ЕО ІЮ МО:1 або 2, та її варіанти, фрагменти і комплементарні ланцюги. Під "кюмплементарною" мають на увазі нуклеотидну послідовність, яка є достатньо комплементарною даній нуклеотидній послідовності, щоб вона могла гібридизуватися із заданою нуклеотидною послідовністю з утворенням стабільного дуплекса. Відповідні амінокислотні послідовності пестицидних білків, які кодуються даними нуклеотидними послідовностями, викладені в ЗЕО ІЮ МО:3-6.

Молекули нуклеїнових кислот, що являють собою фрагменти даних нуклеотидних послідовностей, які кодують пестицидні білки, також включено у даний винахід. Під "фрагментом" мають на увазі частину нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок.

Фрагмент нуклеотидної послідовності може кодувати біологічно активну частину пестицидного білка, або це може бути фрагмент, який може використовуватися як гібридизаційний зонд або

ПЛР-праймер із застосуванням способів, які розкрито нижче. Молекули нуклеїнових кислот, які являють собою фрагменти нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, містять щонайменше приблизно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 суміжних нуклеотидів або число нуклеотидів, що досягає числа нуклеотидів, присутніх у нуклеотидній послідовності повної довжини, що кодує пестицидний білок, розкрито у даному документі, залежно від передбачуваного застосування. Під "суміжними" нуклеотидами мають на увазі нуклеотидні залишки, які безпосередньо прилягають один до одного. Фрагменти нуклеотидних послідовностей за даним винаходом будуть кодувати фрагменти білків, які зберігають біологічну активність пестицидного білка і, отже, зберігають пестицидну активність.

Отже, біологічно-активні фрагменти поліпептидів, розкритих у даному документі, також включено у даний винахід. Під виразом "зберігає активність" мають на увазі, що фрагмент матиме щонайменше приблизно 3095, щонайменше приблизно 5095, щонайменше приблизно т095, 8095, 9095, 9595 або більш високу пестицидну активність щодо пестицидного білка. У одному варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо твердокрилих. бо В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо лускокрилих.

В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо нематод. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо двокрилих. В іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність щодо напівтвердокрилих. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі в рівні техніки. Див., наприклад, С7аріа апа Гапуд (1990) У. Есоп. Епіотої. 83:2480-2485; Апагему5 єї аї. (1988)

Віоспет. 9. 252:199-206; Ма!їтопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293; та патент

США Мо 5743477, кожен з яких включено у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання.

Фрагмент нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, який кодує біологічно активну частину білка за даним винаходом, буде кодувати щонайменше приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 суміжних амінокислот або число амінокислот, величиною до загального числа амінокислот, що присутні у пестицидному білку повної довжини за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення фрагмент являє собою фрагмент, що утворюється у результаті протеолітичного розщеплення. Наприклад, фрагмент, що утворюється у результаті протеолітичного розщеплення, може мати М-кінцеве або С-кінцеве відсікання довжиною щонайменше приблизно 100 амінокислот, приблизно 120, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150 або приблизно 160 амінокислот відносно ЗЕО ІЮ МО:3-6. У деяких варіантах здійснення фрагменти, які включено у даний документ, утворені у результаті видалення С-кінцевого домену кристалізації, наприклад, за допомогою протеолізу або за допомогою вставки стоп-кодону у кодуючу послідовність.

Переважні пестицидні білки за даним винаходом кодуються нуклеотидною послідовністю, яка є достатньо ідентичною нуклеотидній послідовності з«ЕО ІЮ МО: 1 або 2, або пестицидні білки є достатньо ідентичними амінокислотній послідовності, викладеній у ЗЕО ІЮ МО:3-6. Під виразом "досить ідентична" мають на увазі амінокислотну або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше приблизно 6095 або 6595 ідентичність послідовності, приблизно 7095 або 75905 ідентичність послідовності, приблизно 8095 або 8595 ідентичність послідовності, приблизно 9095, 9195, 9295, 9390, 9495, 9595, 9695, 97905, 9895, 9995 або більш високу ідентичність послідовності у порівнянні з еталонною послідовністю, як показано із застосуванням однієї з програм вирівнювання, описаних у даному документі, із застосуванням стандартних параметрів.

Зо Фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що ці значення можуть бути відповідним чином скоректовані для визначення відповідної ідентичності білків, які кодуються двома нуклеотидними послідовностями, з урахуванням виродженості кодонів, подібності амінокислот, позиціонування рамки зчитування тощо.

Для визначення відсотка ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїнових кислот, послідовності вирівнюють з метою оптимального порівняння. Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією від числа ідентичних положень, спільних для послідовностей (тобто, відсоток ідентичності - число ідентичних положень/загальне число положень (наприклад, положення, що перекриваються) х 100). В одному варіанті здійснення дві послідовності мають однакову довжину. У іншому варіанті здійснення відсоток ідентичності розраховується по усій довжині еталонної послідовності (тобто, розкритої у даному документі послідовності у якості будь-якої з послідовностей ЗЕО ІЮ МО:1-6). Відсоток ідентичності між двома послідовностями може бути визначено із застосуванням методик, подібних до тих, які описано нижче, з дозволом або без дозволу гепів. При розрахунках відсотка ідентичності, зазвичай, підраховується число точних збігів. Геп, тобто положення при вирівнюванні, у якому залишок присутній в одній послідовності, але не в іншій, розглядається як положення з неідентичними залишками.

Визначення відсотка ідентичності між двома послідовностями можна здійснити з використанням математичного алгоритму. Необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваним для порівняння двох послідовностей, є алгоритм за Кагіїп апа

Аїзепи! (1990) Ргос. Май. Асайд. 5сі. ОА 87:2264, модифікований як у Капіп апа Ак5спи! (1993)

Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 90:5873-5877. Такий алгоритм включено до програми ВІА5ТМ та

ВІАБТХ за АйЙйбспи! еї а). (1990) 9У. Мої. ВіоІї. 215:403. Пошуки нуклеотидів ВГА5БТ можна здійснювати за допомогою програми ВГА5ТМ, оцінка - 100, довжина слова - 12, для одержання нуклеотидних послідовностей, гомологічних пестицидо-подібним молекулам нуклеїнових кислот за даним винаходом. ВІ А5Т-пошуки білків можна здійснювати за допомогою програми ВІ АЗТХ, оцінка - 50, довжина слова - 3, для одержання амінокислотних послідовностей, гомологічних молекулам пестицидних білків за даним винаходом. Для одержання вирівнювань з гепами з метою порівняння можна застосовувати програму Сарреа ВГА5Т (в ВГА5Т 2.0), як описано у

Аїївспи! еї а. (1997) Мисівїс Асіа5 Невз. 25:3389. Як альтернативу можна застосовувати програму бо РБІ-Віавзі для ітераційного проведення повторного пошуку, який виявляє віддалені зв'язки між молекулами. Див. Ай5спиі еї а!. (1997) зирга. При роботі з програмами ВІ А5Т, Сарреа ВГ А5Т та

РБІ-Віазї можуть застосовуватися параметри за замовчуванням, встановлені для відповідних програм (наприклад, ВГАЗБТХ та ВІ АБЗТМ). Вирівнювання можна також проводити вручну шляхом звіряння.

Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, використовуваним для порівняння послідовності, є алгоритм СіивіаіМмм (Ніддіп5 еї аї. (1994) Мисівїс Асід5 Кез. 22:4673- 4680). СіІивіаМмуУ порівнює послідовності та вирівнює цілісну амінокислотну або ДНК- послідовність та в такий спосіб може надати дані про консервативність для усієї амінокислотної послідовності. Алгоритм СіІивіагМму застосовується у декількох наявних на ринку пакетах програмного забезпечення для аналізу ДНК/амінокислот, у таких як модуль АГІСМХ, що входить у пакет програм Месіог МТІ (Іпмігодеп Согрогайоп, Карлобад, Каліфорнія). Після вирівнювання амінокислотних послідовностей за допомогою програми СіивіаіМу, може бути оцінений відсоток ідентичності амінокислот. Необмежувальний приклад комп'ютерних програм, які застосовуються для аналізу вирівнювань СіизіаМму, включає ЗЕМЕРОС М, ЗЕМЕБОС "м (Каїі Міспоїа5) дозволяє провести оцінку подібності та ідентичності амінокислот (або ДНК) серед численних білків. ІНШИМ необмежувальним прикладом математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовності, є алгоритм Муегх5 апа МіПег (1988) САВІО5 4:11-17. Такий алгоритм, інтегрований у програму АГІСМ (мегвіоп 2.0), яка є частиною пакета програм СО УМізсоп5віп Сепеїййс5, Мегвіоп 10 (що пропонується Ассеїгув, Іпс., 9685 Зсгапіоп Ка., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). При роботі з програмою АГІСМ для порівняння амінокислотних послідовностей можна використовувати таблицю замін залишків РАМ120, штраф за продовження гепа, що дорівнює 12, та штраф за відкриття гепа, що дорівнює 4.

Якщо не зазначено інше, програма САР версії 10, в якій використовується алгоритм згідно

Меєдієтап апа УУипвсй (1970) 9. Мої. Віої. 48(3):443-453, буде використовуватися для того, щоб визначити ідентичність або подібність послідовностей із застосуванням наступних параметрів:

Фо ідентичності та 95 подібності для нуклеотидної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа, що дорівнює 50, штрафу за продовження, що дорівнює 3, та матриці замін пм/уздарапа.стр; 95 ідентичності або 95 подібності для амінокислотної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа, рівного 8, і штрафу за продовження, рівного 2, та

Зо програми підрахунку балів ВГОЗИМБб2. Також можуть використовуватися еквівалентні програми.

Під "еквівалентною програмою" мають на увазі будь-яку програму для порівняння послідовностей, яка для будь-яких двох порівнюваних послідовностей створює вирівнювання, що має ідентичні збіги нуклеотидних залишків та ідентичну відсотокову тотожність послідовностей у порівнянні з відповідним вирівнюванням, отриманим з використанням САР версії 10.

Даний винахід також охоплює варіантні молекули нуклеїнових кислот. "Варіанти" нуклеотидних послідовностей, що кодують пестицидні білки, включають ті послідовності, які кодують пестицидні білки, що розкриваються у даному документі, але які відрізняються консервативно у зв'язку з виродженістю генетичного коду, а також ті послідовності, які є достатньо ідентичними, як обговорювалося вище. Алельні варіанти, що виникають у природних умовах, можуть бути ідентифіковані із застосуванням добре відомих молекулярно-біологічних методик, таких як методики полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та гібридизації, які описано нижче. Варіантні нуклеотидні послідовності також включають одержані синтетичним шляхом нуклеотидні послідовності, які було створено, наприклад, із застосуванням сайт-специфічного мутагенезу, але які ще кодують пестицидні білки, що розкриваються у даному документі, як обговорюється нижче. Варіантні білки, які включено у даний винахід, є біологічно активними, що означає, що вони продовжують проявляти необхідну біологічну активність нативного білка, тобто, пестицидну активність. Під виразом "зберігає активність" мають на увазі, що варіант буде мати щонайменше приблизно 3095, щонайменше приблизно 5095, щонайменше приблизно 7095 або щонайменше приблизно 8095 пестицидної активності нативного білка. Способи визначення пестицидної активності добре відомі в рівні техніки. Див., наприклад, Сларіа апа Гапод (1990) .).

Есоп. Епютої. 83:2480-2485; Апагемух евї а!. (1988) Віоспет. у. 252:199-206; Матопе еї а!. (1985)

У. ої Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включені у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання.

Досвідченому фахівцю також буде зрозуміло, що зміни можуть бути введені шляхом мутацій нуклеотидних послідовностей за даним винаходом, що тим самим призведе до змін в амінокислотній послідовності, що кодує пестицидні білки, не змінюючи біологічну активність білків. Отже, варіантні молекули виділених нуклеїнових кислот можуть бути створені шляхом введення однієї або декількох нуклеотидних замін, вставок або делецій у відповідну 60 нуклеотидну послідовність, що розкривається у даному документі, таким чином, щоб одна або декілька замін, вставок або делецій амінокислот були введені у кодований білок. Мутації можуть бути введені із застосуванням стандартних методик, таких як сайт-специфічний мутагенез та

ПЛР-опосередкований мутагенез. Ці варіантні нуклеотидні послідовності також включено у даний винахід.

Наприклад, консервативні амінокислотні заміни можна здійснити в одному або декількох передбачених замінних амінокислотних залишках. "Замінний" амінокислотний залишок являє собою залишок, який може бути змінений у послідовності дикого типу пестицидного білка без змінення біологічної активності, у той час як "незамінний" амінокислотний залишок необхідний для здійснення біологічної активності. "Консервативна амінокислотна заміна" є такою, при якій амінокислотний залишок заміняється амінокислотним залишком, що має подібний бічний ланцюг. Родини амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, було визначено в рівні техніки. Дані родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланин, метіонін, триптофан), бета- розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланин, триптофан, гістидин).

Дельта-ендотоксини, як правило, мають п'ять консервативних доменів послідовностей та три консервативні структурні домени (див., наприклад, Зе Маада еї аї. (2001) Тгепаз Сепеїйіс5 17:193-199). Перший консервативний структурний домен містить сім альфа-спіралей та приймає участь у інсерції мембрани та пороутворенні. Домен ЇЇ складається із трьох складчастих бета- шарів, які упорядковано в структурі грецького ключа, а домен І складається з двох анти- паралельних складчастих бета-шарів у структурі типу "їеПу-тої!" (де Маада еї аї., 2001, вирга).

Домени ЇЇ ії Ш беруть участь у розпізнаванні та зв'язуванні рецепторів і, отже, вважаються детермінантами специфічності токсину.

Амінокислотні заміни можуть бути здійснені в неконсервативних ділянках, які зберігають функцію. Загалом, такі заміни не здійснюють для консервативних амінокислотних залишків, або для амінокислотних залишків, що перебувають усередині консервативного мотиву, де такі залишки є необхідними для активності білка. Приклади залишків, які є консервативними та які можуть бути незамінними для активності білка, включають, наприклад, залишки, які є ідентичними для усіх білків, включених у вирівнювання схожих або споріднених токсинів до послідовностей за даним винаходом (наприклад, залишки, які ідентичні при вирівнюванні гомологічних білків). Приклади залишків, які є консервативними, але які можуть дозволяти консервативні амінокислотні заміни і при цьому зберігати активність, включають, наприклад, залишки які мають тільки консервативні заміни для усіх білків, включених у вирівнювання послідовностей подібних або споріднених токсинів до послідовності за даним винаходом (наприклад, залишки, які мають тільки консервативні заміни для усіх включених у вирівнювання гомологічних білків). Однак фахівцеві у даній галузі буде зрозуміло, що функціональні варіанти можуть мати незначні консервативні або неконсервативні альтерації у консервативних залишках.

Як альтернатива, різні нуклеотидні послідовності можуть бути отримані шляхом введення випадкових мутацій протягом усієї або частини кодуючої послідовності, як, наприклад, із застосуванням насичувального мутагенезу, а одержані у результаті мутанти можуть бути піддані скринінгу щодо їх здатності забезпечувати пестицидну активність для виявлення мутантів, що зберігають активність. Після мутагенезу білок, що кодується, може експресуватись рекомбінантно, а активність цього білка можна визначити з використання стандартних методик аналізу.

Із застосуванням таких способів як ПЛР, гібридизація та інших, можна ідентифікувати відповідні пестицидні послідовності, такі послідовності, які мають значну ідентичність до послідовності за даним винаходом. Див., наприклад, ЗатбгооК апа Киззеї! (2001) МоїІесша"!

Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї!. (Соїіа Зргіпд Нагброг І арогаїгу Рге55, Соїй Зргіпд Нагрог, МУ) та

Іппі5, еї а). (1990) РСК Ргоїосої!5: А Сціде то Метйоаз апа Арріісайоп5 (Асадетіс Ргев5, МУ).

При використанні способу гібридизації вся пестицидна нуклеотидна послідовність або її частина може використовуватися для скринінгу КДНК або геномних бібліотек. Способи конструювання такої КкДНК та геномних бібліотек загалом відомі в рівні галузі та розкриті у

ЗатьгоокК апа ВиззеїЇ, 2001, вирга. У ролі так званих гібридизаційних зондів можуть виступати фрагменти геномної ДНК, фрагменти кКДНК, фрагменти РНК або інші олігонуклеотиди, та вони можуть бути мічені групою, що детектується, такою як ЗР, або будь-яким іншим маркером, що бо детектується, таким як інші радіоактивні ізотопи, флуоресцентна сполука, фермент або кофактор ферменту. Зонди для гібридизації можуть бути одержані шляхом введення мітки у синтетичні олігонуклеотиди на основі відомої нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок, що розкривається у даному документі. Додатково можуть використовуватися вироджені праймери, сконструйовані на основі консервативних нуклеотидів, амінокислотних залишків у нуклеотидній послідовності або кодованій амінокислотній послідовності. Зонд, зазвичай, містить ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується за жорстких умов із щонайменше приблизно 12, щонайменше приблизно 25, щонайменше приблизно 50, 75, 100, 125, 150, 175 або 200 послідовними нуклеотидами нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок даного винаходу, його фрагмент або варіант.

Способи одержання зондів для гібридизації загалом відомі в рівні галузі і розкриті у Затргоок апа Ризвзеїї, 2001, зирга, що включено у даний документ за допомогою посилання.

Наприклад, ціла послідовність, що визначає пестицидну активність, яка розкривається у даному документі, або одна або декілька її частин можуть використовуватися у якості зонда, здатного до специфічної гібридизації з відповідними пестицидними білок-подібними послідовностями та молекулами інформаційних РНК. Для досягнення специфічної гібридизації за різних умов, такі зонди містять послідовності, які є унікальними та переважно мають у довжину щонайменше приблизно 10 нуклеотидів або щонайменше приблизно 20 нуклеотидів.

Такі зонди можуть використовуватися для ампліфікації відповідних пестицидних послідовностей з вибраного організму за допомогою ПЛР. Дану методику можна застосовувати для виділення додаткових кодуючих послідовностей з необхідного організму або як діагностичний аналіз для визначення присутності кодуючої послідовності у організмі. Методи гібридизації включають гібридизаційний скринінг висіяних на чашки бібліотек ДНК (у вигляді бляшок або колоній; див., наприклад, затрбгоокК еї а. (1989) МоїІесшаг СіІопіпд: А І арогаїогу Мапиаї (24 ед., Соїа З5ргіпд

Нагбог І арогаїогу Ргез55, Соїй 5ргіпд Нагрог, Мем/ УогкК).

Отже, даний винахід охоплює зонди для гібридизації, а також нуклеотидні послідовності, що здатні до гібридизації усієї або частини нуклеотидної послідовності за даним винаходом (наприклад, довжиною щонайменше приблизно 300 нуклеотидів, щонайменше приблизно 400, щонайменше приблизно 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 або нуклеотидної послідовності повної довжини, що розкривається у даному документі). Гібридизація таких

Зо послідовностей може здійснюватися у жорстких умовах. Під виразом "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" мають на увазі такі умови, при яких зонд буде гібридизуватися до своєї цільової послідовності із явно вищим ступенем, , ніж до інших послідовностей (наприклад, щонайменше у 2 рази вище фонового рівня). Жорсткі умови залежать від послідовності та будуть різнитися за різних обставин. Шляхом контролю жорсткості умов гібридизації та/або відмивання можуть бути ідентифіковані цільові послідовності, які на 10095 комплементарні зонду (гомологічне зондування). Альтернативно, умови жорсткості можна скоригувати для надання можливості виникнення невідповідності у послідовності для того, щоб можна було детектувати нижчі ступені подібності (гетерологічне зондування). Загалом, зонд має довжину менше приблизно 1000 нуклеотидів, переважно менше 500 нуклеотидів.

Як правило, жорсткими умовами будуть такі, при яких концентрація солей становить менше приблизно 1,5 М іонів Ма, зазвичай, від приблизно 0,01 до 1,0 М іонів Ма (або інших солей) при рН від 7,0 до 8,3, а температура становить щонайменше приблизно 30"С для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) та щонайменше приблизно б0"С для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорстких умов можна також досягти додаванням дестабілізуючих засобів, таких як формамід. Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію із буферним розчином, що містить від ЗО до 3595 формаміду, 1 М масі, 195 505 (додецилсульфат натрію) при 37"С, та відмивання в 55(С від 1Х до 2Х (20Х 5502-30 М

МмМасі/0,3 М тринатрійцитрат) при 50 до 55"С. Ілюстративні умови середньої жорсткості включають гібридизацію з розчином, що містить від 40 до 4595 формаміду, 1,0 М масі, 195 505 при 37"С, та відмивання в 55С від 0,5Х до 1Х 55С при 55 до 60"С. Типові умови високої жорсткості включають гібридизацію з розчином, що містить 5095 формаміду, 1 М Масі, 1956 505 при температурі 37"С, та відмивання в 0,1Х 55С при 60 до 65"С. Необов'язково, буфери для відмивання можуть містити від приблизно 0,195 до приблизно 195 505. Тривалість гібридизації становить загалом менше приблизно 24 годин, зазвичай, від приблизно 4 до приблизно 12 годин.

Специфічність, як правило, залежить від постгібридизаційних відмивань, при яких найбільш важливими факторами є іонна сила та температура кінцевого розчину для відмивання. Для

ДНКЕ-ДНК гібридів, значення Тт може бути апроксимовано з рівняння МеїпКоїй апа Умапйі (1984)

Апа!. Віоспет. 138:267-284: Ти - 81,57С - 16,6 (0д М) ж 0,41 (дос) - 0,61 (96 форм.) - 500/Л; де бо М - молярність моновалентних катіонів, У003С - процентний вміст гуанозинових та цитозинових нуклеотидів ДНК, 95 форм. - це відсотковий вміст формаміду у розчині для гібридизації, а Ї. - довжина гібрида у парі основ. Тт - температура (при заданій іонній силі та рН), при якій 5095 комплементарної цільової послідовності гібридизується з ідеально відповідним зондом. Тт знижується приблизно на 1"С при невідповідності на кожен 195; отже, Тт, умови гібридизації та/або відмивання можуть бути скоректовані для гібридизації з послідовностями необхідної ідентичності. Наприклад, при проведенні пошуку послідовностей з 290905 ідентичністю, Тя може бути знижена на 10"С. Загалом, жорсткі умови вибирають так, щоб температура була приблизно на 5"С нижче температури плавлення (Тт) для специфічної послідовності та комплементарному їй ланцюгові при заданих значеннях іонної сили та рН. Однак дуже жорсткі умови можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при температурі на 1, 2, З або 4"С нижче температури плавлення (Тт); умови середньої жорсткості можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 107"С нижче температури плавлення (Тт); умови низької жорсткості можуть використовувати гібридизацію та/або відмивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 207С нижче температури плавлення (Тт). ІЗ застосуванням рівняння, композицій для гібридизації та відмивання, а також необхідної Тт середньому фахівцеві у даній галузі буде зрозуміло, що варіації у жорсткості розчинів для гібридизації та/або відмивання, за своєю суттю, описані. Якщо необхідний ступінь невідповідності призводить до Тт менше 45"С (водний розчин) або 32"С (розчин формаміду), то переважним є підвищення концентрації 552 для того, щоб можна було використовувати більш високу температуру. Детальний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведено у Тії55еп (1993) І арогагогу Тесппіднез іп Віоспетівігу апа МоїІесшіаг Віоіоду-Нубгіділаноп м/йп Мисіеїс Асій

Ргобез, Раїі І, Спарієг 2 (ЕІбземіег, Мем/ ок); та А!,5ибеї еї аї., едв. (1995) Сигтепі Ргоосо!5 іп

МоїІесшіаг Віоіоду, Спаріег 2 (Стеепе Рибріїзпіпд апа Уміеу-Іпіегосіепсе, Мем/ МогК). Див. Затогоок еї аї. (1989) Моїіесшіаг Сіопіпу: А Гарогаїогу Мапиаї (24 єа., Соїй 5ргіпуд Нагброг І арогафогу Ргезв5,

Соа 5ргіпд Нагрог, Мем/ МогК).

Виділені білки та їх фрагменти

Пестицидні білки також охоплено у даному винаході. Під "пестицидним білком" мають на увазі білок, що має амінокислотну послідовність, викладену в ЗЕО ІЮ МО:3-6. Їх фрагменти, біологічно активні частини та варіанти також представлені і можуть використовуватися для

Ко) здійснення на практиці способів за даним винаходом. "Виділений білок" або "рекомбінантний білок" застосовують до білка, який більше не перебуває у природних умовах, а перебуває, наприклад, у системі іп міго або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. У деяких варінтах здійснення рекомбінантний білок являє собою варіант ЗЕО ІЮ МО:2-5, де варіант містить щонайменше одну амінокислотну заміну, делецію або вставку порівняно з 5ЕО

ІО МО:2-5. "Фрагменти" або "біологічно активні частини" містять фрагменти поліпептиду, який містить амінокислотні послідовності, що достатньо ідентичні амінокислотній послідовності, викладеній в

ЗБО ІЮ МО: 3-6, і які проявляють пестицидну активність. Біологічно активною частиною пестицидного білка може бути поліпептид довжиною, наприклад, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 00, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 або більше амінокислот. Такі біологічно активні частини можуть бути одержані з використанням рекомбінантних методик та оцінені щодо пестицидної активності. Способи визначення пестицидної активності добре відомі в рівні галузі. Див., наприклад, С7аріа апа Гапд (1990) У. Есоп. Епютої. 83:2480-2485; Апагему5 6вї аї. (1988) Віоспет. 9. 252:199-206; Маїтопе єї а! (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, кожен з яких включено у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання. Як використовується у даному документі, фрагмент містить щонайменше 8 суміжних амінокислот з БЕО ІЮ МО:3-6.

Разом з тим, даний винахід охоплює інші фрагменти, такі як будь-який фрагмент у білку довжиною більше приблизно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 або більше амінокислот.

Під "варіантами" мають на увазі білки або поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 6095, 6595, приблизно на 7095, 7595, приблизно на 8095, 8595, приблизно на 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентична амінокислотній послідовності будь-якій з БО 10 МО:3-6. Варіанти також включають поліпептиди, які кодуються молекулою нуклеїнової кислоти, що гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО:1 чи 2 або комплементарним їй ланцюгом у жорстких умовах.

Варіанти включають поліпептиди, які відрізняються амінокислотними послідовностями у результаті мутагенезу. Варіантні білки, які охоплено за даним винаходом, є біологічно 60 активними, тобто вони продовжують мати необхідну біологічну активність нативного білка,

тобто зберігають пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення варіанти мають покращену активність до нативного білка. Способи визначення пестицидної активності добре відомі в рівні галузі. Див., наприклад, С7аріа апа Гапд (1990) У. Есоп. Епіотої. 83:2480-2485;

Апагем/5 єї а!ї. (1988) Віоспет. 9. 252:199-206; Маттопе еї аї. (1985) 7. ої Есопотіс ЕпіотоЇоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, кожен з яких включено у даний документ у повному обсязі за допомогою посилання.

Бактеріальні гени, такі як гени ахті за даним винаходом, доволі часто мають декілька метіонінових ініціаторних кодонів, розташованих поблизу початку відкритої рамки зчитування.

Часто ініціація трансляції в одному або декількох даних стартових кодонів буде призводити до утворення функціонального білка. Дані стартові кодони можуть мати у своєму складі АТО- кодони. Однак бактерії, такі як Васійи5 5р., також розпізнають кодон СТО у якості стартового кодону, а білки, які ініцюють трансляцію в («зТО-кодонах, містять метіонін як першу амінокислоту. У рідких випадках трансляція у бактеріальних системах може починатися у ТТО- кодоні, хоча у цьому випадку ТО кодує метіонін. Крім того, часто з самого початку не визначено які з даних кодонів використовуються у природних умовах у бактерії. Отже, зрозуміло, що застосування одного з альтернативних метіонінових кодонів може також призводити до утворення пестицидних білків. Дані пестицидні білки охоплені у даному винаході та можуть застосовуватися у способах за даним винаходом. Буде зрозуміло, що за експресії у рослинах необхідно буде змінити альтернативний стартовий кодон на АТО для проходження трансляції відповідним чином.

У різних варіантах здійснення за даним винаходом пестицидні білки містять послідовності, виведені від нуклеотидних послідовностей повної довжини, що розкриваються у даному документі, та амінокислотні послідовності, які коротші послідовностей повної довжини за рахунок використання розташованої нижче альтернативної ділянки початку трансляції. Отже, нуклеотидна послідовність за даним винаходом та/або вектори, клітини-хазяїни і рослини, що містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом (і способи одержання та застосування нуклеотидної послідовності згідно з даним винаходом), можуть містити нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:3, 4 або 5.

Також охоплено антитіла до поліпептидів даного винаходу або до їх варіантів чи фрагментів.

Зо Способи одержання антитіл добре відомі в рівні галузі (див., наприклад, Нагісуг апа І апе (1988)

Апіїродіев: А І арогаїогу Мапиаї, Соїй 5ргіпд Нагрог І арогаюгу, Соїй 5ргіпд Нагрог, МУ; патент

США Мо 4196265).

Отже, один аспект за даним винаходом стосується антитіл, одноланцюгових молекул, що зв'язують антиген, або інших білків, які специфічно зв'язуються з одним або декількома білками або пептидними молекулами за даним винаходом та їх гомологами, гібридами чи фрагментами.

В особливо переважному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, викладену в ЗЕО ІЮ МО:3-6, або її фрагмент. В іншому варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з гібридним білком, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотної послідовності, викладеної в ЗЕО ІЮ МО:3-6, або її фрагмент. В різних варіантах здійснення антитіло, яке специфічно зв'язується з білком за даним винаходом, або білок злиття, що містить білок за даним винаходом, являє собою антитіло, яке не зустрічається у природі.

Антитіла за даним винаходом можуть застосовуватися для кількісного чи якісного визначення вмісту білка чи пептидної молекули за даним винаходом або детекції посттрансляційних модифікацій білків. Як використовується у даному документі, про антитіло або пептид кажуть, що вони "специфічно зв'язуються" з молекулою білка або пептиду за даним винаходом, якщо таке зв'язування не повністю інгібується присутністю неспоріднених молекул.

Антитіла за даним винаходом можуть входити до складу набору, що застосовується для детектування білка або пептидної молекули за даним винаходом. Даний винахід також пропонує спосіб детектування білка або пептидної молекули (зокрема білка, що кодується амінокислотною послідовністю, викладеною в 5ЕО ІЮ МО:3-6, включно з варіантами або фрагментами, що здатні до специфічного зв'язування з антитілом за даним винаходом), що включає приведення зразка у контакт з антитілом за даним винаходом та визначення, чи містить зразок білок або пептидну молекулу за даним винаходом. Способи використання антитіл для детектування білка або пептиду, що представляють інтерес, відомі з рівня техніки.

Змінені або покращені варіанти

Відомо, що послідовності ДНК пестицидного білка можуть бути змінені із використанням різних способів, а також, що ці альтерації можуть призвести до утворення послідовності ДНК, яка кодує білки з амінокислотними послідовностями, що відрізняються від тих, які кодують 60 пестицидні білки згідно з даним винаходом. Даний білок може бути змінений різними способами,

числі включно із амінокислотними замінами, делеціями, відсіканням та вставкою однієї або декількох амінокислотних послідовностей з ЗЕО ІЮ МО:3-6, включаючи до приблизно 2, приблизно 3, приблизно 4, приблизно 5, приблизно 6, приблизно 7, приблизно 8, приблизно 9, приблизно 10, приблизно 15, приблизно 20, приблизно 25, приблизно 30, приблизно 35, приблизно 40, приблизно 45, приблизно 50, приблизно 55, приблизно 60, приблизно 6565, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 85, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 105, приблизно 110, приблизно 115, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 135, приблизно 140, приблизно 145, приблизно 150, приблизно 155 або більш амінокислотних замін, делецій або вставок. Способи проведення таких маніпуляцій загалом відомі в рівні галузі. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності пестицидного білка можуть бути отримані із застосуванням мутацій у ДНК. Це також може бути досягнуто шляхом одного з декількох різновидів мутагенезу талабо шляхом спрямованого розвитку. У деяких аспектах зміни, що кодуються амінокислотними послідовностями, не будуть суттєво впливати на функцію білка. Такі варіанти будують мати необхідну пестицидну активність. Однак зрозуміло, що здатність пестицидного білка забезпечувати пестицидну активність може бути покращено шляхом застосування таких методик щодо композицій з даного винаходу.

Наприклад, можна експресувати пестицидний білок у клітинах-хазяїнах, які проявляють високі рівні помилок вбудовування основ при реплікації ДНК, такі як ХІ-1 Кеа (5ігаїадепе, Ла-Холла,

Каліфорнія). Після розмноження в таких штамах можна виділити ДНК (наприклад, шляхом одержання плазмідної ДНК або шляхом ампліфікування за допомогою ПЛР та клонування отриманого у результаті ПЛР- фрагмента у векторі), провести культивування пестицидного білка з мутаціями у немутагенному штамі та ідентифікувати гени з пестицидною активністю, що зазнали мутації, наприклад, шляхом проведення аналізу для дослідження пестицидної активності. Загалом, білок змішується і застосовується в аналізах із згодовуванням. Див., наприклад, Магтопе єї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293. Такі аналізи можуть включати приведення рослини в контакт з одним або декількома шкідниками,визначення здатності рослини до виживання та/або здатності викликати загибель шкідників. Приклади мутацій, які призводять до підвищення токсичності, вказані в 5сппері еї аї. (1998) Місгобіо!ї. Мо.

Віої. Кем. 62:775-806.

Зо Як альтернатива можуть бути введені альтерації у послідовність багатьох білків у аміно- або карбокси-кінцях без спричинення істотного впливу на активність. Такі зміни можуть включати вставки, делеції або зміни, індуковані застосуванням сучасних молекулярних способів, таких як

ПЛР, числі включно із ПЛР-ампліфікацією, які змінюють або подовжують кодуючу білок послідовність за рахунок вставок кодуючих амінокислоти послідовностей в олігонуклеотидах, що залучені в ПЛР-ампліфікацію. Як альтернатива, додані послідовності білків можуть містити цілі послідовності, які кодують білок, такі як ті, що зазвичай, застосовуються в рівні техніки для одержання гібридних білків. Такі гібридні білки часто використовують для (1) підвищення експресії білка, що представляє інтерес, (2) введення домену зв'язування, ферментативної активності або епітопа для того, щоб полегшити очищення білка, для детектування білка або інших експериментальних застосувань, відомих в рівні техніки, (3) спрямовування секреції або трансляції білка в субклітинну органелу, таку як периплазматичний простір грамнегативних бактерій, ендоплазматичний ретикулум еукаріотичних клітин, при цьому останнє часто призводить до глікозілювання білка.

Варіанти нуклеотидних та амінокислотних послідовностей за даним винаходом також охоплюють послідовності, одержані із процедур, що призводять до рекомбінації і мутацій, таких як перестановка в ДНК. При виконанні такої методики можуть використовуватися одна або декілька різних ділянок, що кодують пестицидні білки, для створення нового пестицидного білка, який має необхідні властивості. Таким чином, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів створюють з популяції споріднених послідовностей полінуклеотидів, які містять ділянки послідовності, що мають суттєві ідентичності та можуть бути гомологічно рекомбіновані іп міїго або іп мімо. Наприклад, при застосуванні даного підходу мотиви послідовностей, що кодують домен, який представляє інтерес, можуть бути піддані перестановці між геном за даним винаходом, що визначає пестицидну активність, та іншими відомими генами, що визначають пестицидну активність, для одержання нового гена, який кодує послідовність білка, що представляє інтерес, з покращеною властивістю, як, наприклад, з підвищеною інсектицидною активністю. Стратегії такої перестановки в ДНК відомі в рівні техніки. Див., наприклад, зіеттег (1994) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 91:10747-10751; 5іеттег (1994) Маште 370:389-391; Статегі еї аІ. (1997) Маїшге Віоїесп. 15:436-438; Мооге еї аї. (1997) У. Мої. ВіоїЇ. 272:336-347; 7Напд еї аї. (1997) Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА 94:4504-4509; Статегі еї а. (1998) Машге 391:288-291; та 60 патенти США МоМо 5605793 та 5837458.

Переміщення або перестановка доменів є ще одним механізмом створення змінених пестицидних білків. Домени можна переміщати між пестицидними білками, що призводить до утворення гібридних або химерних токсинів з покращеною пестицидною активністю або різними цільовими характеристиками. Способи створення рекомбінантних білків та їх дослідження щодо пестицидної активності добре відомі в рівні техніки (див., наприклад, Маїтом єї аї. (2001) Аррі.

Епмігоп. Місгобіо!. 67:5328-5330; де Маада е! а!. (1996) Аррі. Епмігоп. Місгобіо!. 62:1537-1543; Се еї а). (1991) 9. ВіоІ. Спет. 266:17954-17958; 5сппері еї а!. (1990) 9. ВіоЇ. Спет. 265:20923-20930;

Вапо еї а. (1999) Аррі. Епмігоп. Місгобіо!. 65:2918-2925).

Вектори

Послідовність за даним винаходом, яка визначає пестицидну активність, може бути представлена в експресійній касеті для експресії у клітині-хазяїні, що представляє інтерес, наприклад, в рослинній клітині або мікроорганізмі. Під "рослинною експресійною касетою" мають на увазі ДНК-конструкцію, яка здатна призводити до експресії білка з відкритої рамки зчитування у клітині рослини. Зазвичай вони містять промотор та кодуючу послідовність. Часто такі конструкції будують також містити 3'-нетрансльовану ділянку. Такі конструкції можуть містити "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність" для полегшення котрансляційного чи посттрансляційного транспорту пептиду до певних внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласт (або інша пластида), ендоплазматичний ретикулум або комплекс Гольджі.

Під "сигнальною послідовністю" мають на увазі послідовність, для якої відомо або передбачається, що вона призводить до котрансляційного або посттрансляційного транспорту пептидів через клітинну мембрану. У еукаріот це зазвичай пов'язано з секрецією у апараті

Гольджі з деяким підсумковим глікозілюванням. Інсектицидні токсини бактерій часто синтезуються у вигляді протоксинів, які протеолітично активуються у кишечнику цільової комахи (Спапд (1987) Меїйпод5 Еплгутої. 153:507-516). У деяких варіантах здійснення за даним винаходом сигнальна послідовність локалізована у нативній послідовності, або може бути отримана з послідовності за даним винаходом. Під "лідерною послідовністю" мають на увазі будь-яку послідовність, яка при трансляції призводить до утворення амінокислотної послідовності, достатньої для ініціації котрансляційного транспорту пептидного ланцюга до субклітинної органели. Отже, це включає лідерні послідовності, що виявляють спрямований

Зо вплив на транспорт та/або глікозілювання за рахунок проходження в ендоплазматичний ретикулум, проходження у вакуолі, пластиди, у тому числі хлоропласти, мітохондрії та їм подібні. Отже, додатково запропонований даному документі поліпептид містить амінокислотну послідовність за даним винаходом, яка функціонально зв'язана з гетерологічною лідерною або сигнальною послідовністю.

Під "рослинним трансформаційним вектором" мають на увазі молекулу ДНК, яка необхідна для ефективної трансформації клітини рослини. Така молекула може містити одну або декілька рослинних експресійних касет та може бути організованою у більше ніж одну "векторну" молекулу ДНК. Наприклад, бінарні вектори являють собою рослинні трансформаційні вектори, які використовують два несуміжні ДНК-вектори для кодування усіх необхідних функцій з активністю в цис- та транс-положеннях для трансформації рослинних клітин (НеПепз апа

Миїйпеацйх (2000) Тгепаз іп Ріапі 5сіеєпсе 5:446-451). Вираз "вектор" відноситься до конструції нуклеїнової кислоти, призначеної для переносу між різними хазяїнами. "Експресійним вектором" називається вектор, який має здатність вводити, інтегрувати у чужорідну клітину та експресувати в ній послідовності гетерологічної ДНК або її фрагменти. Касета буде мати у своєму складі 5' та/або 3' регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з послідовністю за даним винаходом. Під "функціонально зв'язаним" мають на увазі функціональний зв'язок між послідовністю промотору та іншою послідовністю, де послідовність промотору ініціює і опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, відповідної до другої послідовності. Загалом, вираз "функціонально зв'язаний" означає, що зв'язані нуклеотидні послідовності є суміжними і, у тих випадках, коли необхідно об'єднати дві ділянки, що кодують білок, вони є суміжними та перебувають в одній і тій же рамці зчитування. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий гендля котрансформації всередині організму. Як альтернатива, додатковий) ген(и) забезпечують за допомогою численних експресійних касет.

У різних варіантах здійснення нуклеотидна послідовність за даним винаходом є функціонально зв'язаною з гетерологічним промотором, який здатен керувати експресією нуклеотидної послідовності у клітині, наприклад, у рослинній клітині або мікроорганізмі. "Промотором" називається нуклеотидна послідовність, функція якої полягає у керуванні транскрипцією нижче розташованої кодуючої послідовності. Промотор разом з іншими транскрипційними та трансляційними регуляторними нуклеотидними послідовностями (які також 60 називаються "контрольними послідовностями") є необхідними для експресії послідовності ДНК,

що представляє інтерес.

Така експресійна касета забезпечується численними ділянками рестрикції для вставки послідовності, яка забезпечує пестицидну активність, що підлягає транскрипційній регуляції регуляторними ділянками.

Експресійна касета матиме у своєму складі в 5-3" напрямку транскрипції ділянку ініціації транскрипції і трансляції (тобто, промотор), ДНК-послідовність за даним винаходом та ділянку термінації трансляції і транскрипції (тобто, ділянку терминації), що функціонує у рослині.

Промотор може бути нативним чи аналогічним або може бути чужорідним чи гетерологічним до рослини-хазяїна та/або до послідовності ДНК за даним винаходом. Додатково, промотор може являти собою природну послідовність або, як альтернатива, синтетичну послідовність. Там, де промотор є "нативним" або "гомологічним" до рослини-хазяїна, мають на увазі, що промотор знайдений у нативній рослині, в яку цей промотор вводять. Там, де промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" до послідовності ДНК за даним винаходом, мають на увазі, що промотор не є нативним або таким, що виникає у природних умовах, для функціонально зв'язаної послідовності ДНК за даним винаходом.

Ділянка термінації може бути нативною ділянці ініціації транскрипції, може бути нативною функціонально зв'язаній послідовності ДНК, що представляє інтерес, може бути нативною рослині-хазяїну, або може бути отримана з іншого джерела (тобто, чужорідного або гетерологічного до промотору, послідовності ДНК, що представляє інтерес, рослини-хазяїна або будь-якої їх комбінації). Придатні ділянки термінації, такі як октопінсинтази та нопалінсинтази, доступні з Ті-плазміди А. Шптегїтасіеєп5,, Див. також Сицегіпеацй єї аІ. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагоої (1991) Сеї! 64:671-674; Запіасоп єї аі. (1991) Сепе5 Юем. 5:141-149;

Модеп еї аї. (1990) Ріапі Сеї! 2:1261-1272; Мипгое еї аї. (1990) Сепе 91:151-158; Ваїйаз еї аї. (1989) Мисівєїс Асіа5 Кев. 17:7891-7903; та дозпі єї а. (1987) Мисієїс Асіа Кев5. 15:9627-9639.

У необхідних випадках ген(и) можуть бути оптимізовані для підвищення експресії у трансформованій клітині-хазяїні. А саме, гени можуть бути синтезовані з використанням переважних для клітини-хазяїна кодонів для покращення експресії або можуть бути синтезовані з використанням кодонів за частоти використання кодонів, переважних для хазяїна. У цілому, вміст ОС у гені підвищиться. Див., наприклад, Сатррбеї!Ї апа Сбом/угі (1990) Ріапі Рпузіої. 92:1-11,

Зо де обговорюється застосування переважних для хазяїна кодонів. У даній галузі техніки існують способи синтезу переважних для рослини генів. Див., наприклад, патенти США МоМо 5380831 та 5436391, публікацію патенту США Мо 20090137409 та Митггау єї аї. (1989) Мисіеїс Асід5 Кезв. 17:477-498, які включено у даний документ за допомогою посилання.

У одному варіанті здійснення пестицидний білок спрямовують у хлоропласт для експресії.

Таким чином, у тих випадках, де пестицидний білок не вводиться безпосередньо в хлоропласт, експресійна касета буде додатково містити нуклеїнову кислоту, що кодує транзитний пептид, який спрямовує пестицидний білок у хлоропласти. Такі транзитні пептиди відомі в рівні техніки.

Див., наприклад, Моп Неї|пе еї а!. (1991) Ріапі Мої. Віо!. Кер. 9:104-126; СіаїКк єї а. (1989) 9. Віо!.

Спет. 264:17544-17550; ОейПа-Сіорра еї а! (1987) Ріапі Рпузіо!. 84:965-968; Вотег вї аї. (1993)

Віоспет. Віорпуз. Ке5. Соттип. 196:1414-1421; та 5папй єї а!. (1986) 5сієпсе 233:478-481.

Ген, що визначає пестицидну активність, який повинен бути спрямований у хлоропласт, може бути оптимізований для експресії у хлоропласті для обліку відмінностей між ядром рослини і даної органели при використанні кодону. Таким чином, нуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, можуть бути синтезовані з використанням кодонів, переважних для хлоропластів. Див., наприклад, патент США Мо 5380831, який включено у даний документ за допомогою посилання.

Трансформація рослин

Способи за даним винаходом включають введення нуклеотидної конструкції у рослину. Під "введенням" мають на увазі забезпечення рослини нуклеотидною конструкцією таким чином, щоб конструкція одержала доступ до внутрішнього простору клітини рослини. Способи за даним винаходом не вимагають застосування конкретного способу введення нуклеотидної конструкції у рослину, а лише того, щоб ця нуклеотидна конструкція одержала доступ до внутрішнього простору щонайменше однієї клітини рослини. У рівні техніки відомі способи введення нуклеотидних конструкцій у рослини, включаючи, але без обмежень, способи стабільної трансформації, способи тимчасової трансформації та способи, опосередковані вірусами.

Під "рослиною" мають на увазі цілі рослини, органі рослини (наприклад, листя, стебла, коріння тощо), насіння, рослинні клітини, паростки, зародки та потомство даних рослин.

Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, суспензія культури клітин, протопласти, клітини листя, клітини кореня, клітини флоеми, бо пилок).

"Трансгенні рослини", або "трансформовані рослини", або "стабільно трансформовані" рослини, або клітини, або тканини відносяться до рослин, які мають введені або інтегровані в рослинну клітину екзогенні нуклеотидні послідовності чи фрагменти ДНК. Дані нуклеотидні послідовності мають у своєму складі такі, які є екзогенними, або не представлені у нетрансформованій рослинній клітині, а також такі, які можуть бути ендогенними, або присутні у нетрансформованій рослинній клітині. "Гетерологічний" загалом відноситься до нуклеотидних послідовностей, які не є ендогенними до клітини або не є частиною нативного генома, в якому вони присутні, та які були внесені в клітину шляхом зараження, трансфекції, мікроін'єкції, електропорації, бомбардування мікрочастинками тощо.

Трансгенні рослини за даним винаходом експресують одну або декілька нових послідовностей токсинів, що розкриваються у даному документі. У різних варіантах здійснення трансгенна рослина додатково містить один або декілька додаткових генів стійкості до комах (наприклад, Стгу!т, такі як представники родин СтутА, Сту1В, Сту1сС, Сту10, СтутЕ та СтутЕ; Стуг, такі як представники родин СтгугА; Сгу9г, такі як представники родин СтгузА, Сту9В, Сту9С, Сту9О,

Сту9Е та Сту9Е тощо). Фахівцеві у даній галузі буде зрозуміло, що трансгенні рослини можуть містити будь-який ген, який наділяє сільськогосподарською ознакою, що представляє інтерес.

Трансформацію рослинних клітин може бути здійснено із застосуванням одного або декількох методів, відомих у рівні техніки. Ген, що визначає пестицидну активність, за даним винаходом може бути модифікований для одержання або підвищення експресії у клітинах рослин. Як правило, конструкція, яка експресує такий білок, містить промотор, що регулює транскрипцію гена, а також 3' нетрансльовану ділянку, яка забезпечує термінацію транскрипції та поліаденілювання. Структура таких конструкцій добре відома у даній галузі. У деяких випадках доцільним може бути конструювання гена таким чином, що це буде призводити до секреції синтезованого у результаті пептиду або іншої спрямованої дії у клітині рослини.

Наприклад, ген може бути сконструйовано таким чином, щоб містити сигнальний пептид для полегшення переносу пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Також переважним може бути конструювання експресійної касети, що містить інтрон, таким чином, що ІРНК-процесинг даного інтрона необхідний для експресії.

Як правило, дана "рослинна експресійна касета" буде введена у "рослинний

Зо трансформувальний вектор". Даний рослинний трансформувальний вектор може містити один або декілька ДНК-векторів, необхідних для досягнення трансформації рослини. Наприклад, звичайною практикою у даній галузі є використання рослинних трансформувальних векторів, які містять більше одного суміжного сегмента ДНК. У даному рівні техніки ці вектори часто називають "бінарними векторами." Бінарні вектори, як і вектори з хелперними плазмідами, найчастіше використовуються для трансформації, опосередкованої Адгобасіегіит, де розмір та сумарна довжина сегментів ДНК, необхідних для досягнення ефективної трансформації, є досить великими, та є доцільним розділити функції за окремими молекулам ДНК. Бінарні вектори, як правило, містять плазмідний вектор, який містить цис-активні послідовності, необхідні для переносу Т-ЮМА (як ті, що розташовані на лівій межі та на правій межі фрагмента), селективний маркер, який сконструйований таким чином, щоб бути здатним до експресії у клітині рослини, та "ген, що представляє інтерес," (ген, сконструйований таким чином, щоб бути здатним до експресії у рослинній клітині, для якої потрібне створення трансгенних рослин). Також у даному плазмідному векторі присутні послідовності, необхідні для реплікації бактерій. Цис-активні послідовності організовані таким чином, щоб забезпечувати ефективне перенесення у рослинні клітини та експресію в них. Наприклад, ген селективного маркера та ген, що визначає пестицидну активність, локалізовані між лівою та правою межами.

Часто другий плазмідний вектор містить транс-активні фактори, які опосередковують перенесення Т-ОМА від Адгорасієегішт до рослинних клітин. Плазміда часто містить гени вірулентності (гени Міг), які забезпечують інфікування рослинних клітин з використанням

Адгорасієегішт і перенесення ДНК шляхом розщеплення межових послідовностей та міг- опосредованому переносі ДНК, як відомо у рівні техники (НеїЇеп5 апа МиїІїпеаих (2000) Тгепаз іп

Ріапі Зсіепсе 5:446-451). Кілька типів штамів Адгобасіегічт (наприклад, ГВА4404, ЗМ3101,

ЕНАТОЇТ, ЕНАТО5 тощо) може бути використано для трансформації рослин. Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослини із застосуванням інших способів, таких як бомбардування мікрочастинками, мікроін'єкція, електропорація, трансфекція за допомогою поліетиленгліколю тощо.

Загалом, способи трансформації рослин включають перенесення гетерологічної ДНК у цільові рослинні клітини (наприклад, у незрілі або зрілі зародки, суспензійні культури, недиференційований калюс, протопласти тощо) з наступним застосуванням відповідного бо відбору з максимальним граничним рівнем відповідного відбору (залежно від селективного маркерного гена) для того, щоб виділити трансформовані рослинні клітини з групи нетрансформованої клітинної маси. Експлантати, зазвичай, переносять у свіжу порцію такого ж культурального середовища та культивують стандартно. Пізніше, трансформовані клітини диференціюються у пагони після їх поміщення на регенераційне середовище, в яке додано засіб для селекції у концентрації максимального граничного рівня. Пагони потім переносять на селективне середовище для укорінення пагона або саджанця. Трансгенний саджанець потім виростає у зрілу рослину та продукує фертильне насіння (наприклад, Нієї єї аї. (1994) Те Ріапі доитаї 6:271-282; Ізпіда еї аї. (1996) Маїшиге Віотесппоіоду 14:745-750). Експлантати, як правило, переносять у свіжу порцію такого ж культурального середовища і стандартно культивують.

Загальний опис методик та способів одержання трансгенних рослин наведено в Ауге5 апа Рак (1994) Стйіса!І Кемієму5 іп Ріапі Зсіепсе 13:219-239 та Воттіпепі апа Чдашпаг (1997) Мауаїса 42:107-120. Через те, що трансформований матеріал містить численні клітини, як трансформовані, так і нетрансформовані клітини присутні у будь-якій частині обробленого цільового калюса, тканини або групи клітин. Здатність викликати загибель нетрансформованих клітин та дозволяти проліферацію трансформованих клітин одержати має результатом культури трансформованих рослин. Часто, здатність до видалення нетрансформованих клітин є обмеженням для швидкого виділення трансформованих рослинних клітин та успішного створення трансгенних рослин.

Протоколи трансформації, а також протоколи для введення нуклеотидних послідовностей у рослини можуть варіювати залежно від типу рослини або рослинної клітини, тобто, однодольна чи дводольна, призначених для трансформації. Створення трансгенних рослин можна здійснювати із застосуванням одного з декількох способів, включаючи, але без обмежень, мікроін'єкцію, електропорацію, спрямоване перенесення генів, введення гетерологічної ДНК за допомогою Адгобасіегішт у рослинній клітини (трансформація, опосередкована Адгобасієегішт), бомбардування рослинних клітин гетерологичною чужорідною ДНК, кон'югованою з частинками, способом прискорених частинок, трансформація із застосуванням аерозольного пучкового інжектора (опублікована заявка на патент США Мо 20010026941; патент США Мо 4945050; міжнародна публікація Мо М/О 91/00915; опублікована заявка на патент США Мо 2002015066),

Ї ес 1-трансформація та різні інші способи переносу ДНК, не опосередковані прямим введенням

Зо часток.

Способи для трансформації хлоропластів відомі у рівні техніки. Див., наприклад, Змаб еї аї. (1990) Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА 87:8526-8530; Змаб апа Маїїда (1993) Ргос. Маї!. Асайд. Зсі. ОБА 90:913-917; 5маб апа Маїїда (1993) ЕМВО 4). 12:601-606. Даний спосіб базується на використанні генної гармати для доставки ДНК, що містить селективний маркер, та спрямованого введення

ДНК у геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації. Додатково, трансформації пластид досягнуто можна досягнути шляхом транс-активації неактивного пластидного трансгена за рахунок тканино-переважної експресії пластидної, ядерної РНК-полімерази. Таку систему описано у МевВгіде еї а). (1994) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 91:7301-7305.

Після інтеграції гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини використовують відповідний відбір з максимальним граничним рівнем відповідного відбору у середовищі, щоб викликати загибель нетрансформованих клітин , відокремити та викликати проліферацію передбачувано трансформованих клітин, які виживають у результаті даної селекційної обробки, шляхом регулярного перенесення клітин у свіже середовище. За допомогою безперервного пасажу та введення відповідного засобу для відбору ідентифікують та стимулюють проліферацію клітин, які були трансформовані за допомогою плазмідного вектора. Молекулярні та біохімічні способи потім може бути використано для підтвердження присутності інтегрованого гетерологічного гена, що представляє інтерес, у геномі трансгенної рослини.

Клітини, які було трансформовано, можна виростити у рослини відповідно до загальноприйнятих способів. Див., наприклад, МеСоптіск еї аї. (1986) Ріапі Сеї! ВБерогів 5:81-84.

Дані рослини потім можна вирощувати та або запилювати такою ж трансформованою лінією, або іншою лінією, а отриманий у результаті гібрид, що має конститутивну експресію необхідної фенотипічної характеристики, може бути ідентифікований. Два або більше покоління можуть бути вирощені для того, щоб впевнитися, що експресія необхідної фенотипічної ознаки стабільно зберігається та успадковується, а потім насіння збирають для того, щоб впевнитися, що експресія бажаної фенотипічної ознаки була досягнута. Таким чином, даний винахід забезпечує трансформоване насіння (також називають "трансгенне насіння"), що містить нуклеотидну конструкцію за даним винаходом, наприклад, експресійну касету за даним винаходом, стабільно вбудовану у їх геном.

Оцінка трансформації рослин бо Після введення гетерологічної чужорідної ДНК у рослинні клітини, підтверджують трансформацію або інтеграцію гетерологічного гена у геном рослин різними способами, такими як аналіз нуклеїнових кислот, білків та метаболітів, асоційованих з інтегрованим геном.

ПЛР-аналіз являє собою експрес-методику скринінгу трансформованих клітин, тканини або пагонів на присутність введеного гена на більш ранній стадії до пересаджування в грунт (бБатргтоокК апа Вивзеї! (2001) МоїІесшіаг Сіопіпд:. А Гарогаїогу Мапиа). Со бргіпуд Нагрог

І арогаїогу Ргез55, Со Зргіпд Нагог, МУ). ПЛР здійснюють з використанням олігонуклеотидних праймерів, специфічних до гена, що представляє інтерес, фону вектора Адгобасіегійт тощо.

Трансформацію рослин можна підтвердити за допомогою Саузерн-блот аналізу геномної

ДНК (Затюогоок апа Киззеїї, 2001, зирга). Загалом, сукупну ДНК екстрагують із трансформанта, розщеплюють за допомогою відповідних рестрикційних ферментів, фракціонують в агарозному гелі та переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану. Мембрану або "блот" далі досліджують за допомогою, наприклад, міченого радіоактивним ЗР. фрагментом цільової ДНК для підтвердження інтеграції введеного гена у геном рослин згідно зі стандартними методиками (ЗатбгоокК апа Риззеї, 2001, зирга).

У нозерн-блот аналізі виділяють РНК із спеціальних тканин трансформанта, фракціонують в агарозному гелі, що містить формальдегід, та переносять на нейлоновий фільтр згідно із стандартними процедурами, які регулярно використовують у даній галузі техніки (затбьгоок апа

КиззеїЇ, 2001, взирга). Потім досліджують експресію РНК, яка кодується геном, що визначає пестицидну активність, шляхом гібридизації на фільтрі з радіоактивним зондом, отриманим з гена, що визначає пестицидну активність, за допомогою способів, відомих у рівні техніки (ЗатбгоокК апа Риззеї, 2001, зирга).

Підтвердження присутності білка, який кодується геном, що визначає пестицидну активність, можна здійснювати на трансгенних рослинах з використанням стандартних процедур вестерн- блота, біохімічних аналізів та їм подібних на трансгенних рослинах (ЗатьгоокК апа Киззеїї, 2001, зирга) з використанням антитіл, які зв'язуються з одним або декількома епітопами, присутніми на пестицидному білку.

Пестицидна активність у рослин

В іншому аспекті за даним винаходом можна створити трансгенні рослини, у яких експресується пестицидний білок, що має пестицидну активність. Для створення трансгенних

Зо рослин можна використовувати способи, описані вище як приклад, але спосіб, згідно з яким отримують трансгенні рослинні клітини, не є критично важливим для даного винаходу. На розсуд експериментатора можна застосовувати способи, відомі або описані в даній галузі, такі як трансформація, опосередкована Адгобасієегішт, біолістична трансформація та способи, не опосередковані частинками. Рослини, що експресують пестицидний білок, можна виділити за допомогою загальновідомих способів, описаних у рівні техніки, наприклад, за допомогою трансформації калюсу, відбору трансформованого калюсу та регенерації плодоносної рослини з такого трансгенного калюсу. У такому способі можна використовувати будь-який ген як селективний маркер за умови, що його експресія у рослинних клітинах надасть можливість для ідентифікації або відбору трансформованих клітин.

Для застосування у рослинних клітинах було розроблено цілий ряд маркерів, таких як стійкість до хлорамфениколу, аміногликозиду 5418, гігроміцину або їм подібним. Також як селективні маркери можна використовувати інші гени, які кодують продукт, залучений до метаболізму хлоропластів. Наприклад, окреме використання можуть знайти гени, які забезпечують стійкість рослин до гербіцидів, таких як гліфосат, бромоксиніл або імідазолінон.

Такі гени було описано (ЗіаїЇКег еї аїЇ. (1985) у). Віої. Спет. 263:6310-6314 (ген нітрилази, яка надає стійкість до бромоксинілу); та Заїйавімап еї аї. (1990) Мисі. Асід5 Ке5. 18:2188 (ген АНА5Б, який надає стійкість до імідазолінонів). Додатково, гени, розкриті у даному документі, є придатними як маркери для оцінки трансформації бактеріальних або рослинних клітин. Способи виявлення присутності трансгена у рослині, органі рослини (наприклад, листі, стеблах, корінні тощо), насінні, рослинній клітині, паростку, зародку або їх потомстві добре відомі у галуз рівні техніки. В одному варіанті здійснення присутність трансгена виявляють шляхом дослідження пестицидної активності.

Плодоносні рослини, у яких експресується пестицидний білок, можна досліджувати щодо пестицидної активності, а для подальшого схрещування можна проводити відбір рослин, у яких проявляється оптимальна активність. У галузі рівні техніки доступні способи аналізу щодо пестицидної активності. Зазвичай, білок перемішують та використовують у аналізах із згодовуванням. Дивись, наприклад Маїтопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіопто!оду 78:290-293.

Даний винахід можна застосовувати для трансформації будь-якого виду рослин, включаючи, але без обмежень, однодольні та дводольні рослини. Приклади рослин, які представляють бо інтерес, включають, але без обмежень, кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, помідор,

хрестоцвіті, перцеві, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь та олійний рапс, Вгазвзіса 5р., люцерну, жито, просо, сафлор, земляні горіхи, солодку картоплю, маніок, кавове дерево, кокос, ананас, цитрусові дерева, дерево какао, чайний кущ, банан, авокадо, фігове дерево, гуаву, мангове дерево, маслину, папайю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні рослини та хвойні.

Овочі включають, але без обмежень, помідори, латук, зелену квасолю, квасолю ліма, види гороху та представників роду Сигситі5, таких як огірок, канталупа та мускусна диня.

Декоративні рослини включають, але без обмежень, азалію, гортензію, гібіскус, троянди, тюльпани, жовті нарциси, петунію, гвоздику, пуансетію та хризантему. Переважно рослини за даним винаходом являють собою культурні рослини (наприклад, маїс, сорго, пшениця, соняшник, помідор, хрестоцвіті, перцеві, картопля, бавовник, рис, соя, цукровий буряк, цукрова тростина, тютюн, ячмінь, олійний рапс тощо).

Застосування у боротьбі зі шкідниками

У даній галузі техніки відомі загальні способи використання штамів, які містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом чи її варіант, як пестицидних засобів у боротьбі зі шкідниками або при створенні інших організмів. Дивись, наприклад, патент США Мо 5039523 та

ЕР 0480762А2.

Штами Васійи5, що містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом чи її варіант, або мікроорганізми, які генетично змінювали так, щоб вони містили ген, який визначає пестицидну активність за даним винаходом, та білок можна застосовувати для захисту сільськогосподарських культур та продуктів від шкідників. У одному аспекті за даним винаходом, цільні, тобто нелізовані клітини організму, що продукує токсин (пестицид), обробляють реактивами, які пролонгують активність токсину, що продукується у клітині, якщо клітину поміщають у середовище цільового шкідника (шкідників).

Як альтернатива, пестицид отримують за рахунок введення гена, що визначає пестицидну активність, у клітину-хазяїна. Експресія гена, що визначає пестицидну активність, прямо або опосередковано призводить до внутрішньоклітинної продукції та підтримання рівня пестициду.

У одному аспекті за даним винаходом дані клітини потім обробляють в умовах, які пролонгують активність токсину, що продукується у клітині, якщо клітину поміщають у середовище цільового

Зо шкідника (шкідників). Отриманий у результаті продукт зберігає токсичність, характерну для токсину. Ці природно капсульовані пестициди згодом можуть бути розроблені згідно традиційним методикам для внесення в середовище проживання цільового шкідника, наприклад, грунт, воду та на листя рослин. Дивись, наприклад, ЕРА 0192319 та посилання, які цитуються у ньому. Як альтернатива, можна розробити препарат з клітин, що екпресують ген за даним винаходом, таким чином, щоб забезпечити застосування отриманого у результаті матеріалу у якості пестициду.

Активні інгредієнти за даним винаходом зазвичай застосовуються у формі композицій, та їх можна наносити одночасно або послідовно з іншими сполуками на посівну площу або рослину, що підлягають обробці. Цими сполуками можуть бути добрива, гербіциди, кріопротектори, поверхнево-активні речовини, детергенти, пестицидні мила, масла, використовувані у період спокою рослини, полімери та/або склади з носіями, що повільно вивільнюються або здатні до біологічного розкладання, які дають можливість довгострокового дозованого вивільнення у цільовій області після разового внесення складу. Вони також можуть являти собою селективні гербіциди, хімічні інсектициди, віруциди, мікробіциди, амебіциди, пестициди, фунгіциди, бактерициди, нематоциди, молюскоциди або суміші декількох даних препаратів, якщо потрібно, разом з додатковими прийнятними у сільському господарстві носіями, поверхнево-активними речовинами або допоміжними речовинами, що сприяють нанесенню, які зазвичай використовують у рівні техніки складу. Придатні носії та допоміжні речовини можуть бути твердими або рідкими та відповідають речовинам, які зазвичай використовують у технології складання, наприклад, натуральні або відновлені мінеральні речовини, розчинники, диспергувальні речовини, засоби, що змочують, речовини, що надають липкість, речовини, що зв'язують, або добрива. Подібним чином склади можна приготувати у формі їстівних "наживок", або їм можна надати форму "пасток" для шкідників, щоб забезпечити можливість згодовування або поглинання пестицидного складу цільовим шкідником.

Способи нанесення активного інгредієнта за даним винаходом або агрохімічної композиції за даним винаходом, яка містить щонайменше один з пестицидних білків, що продукуються бактеріальними штамами за даним винаходом, включають нанесення на листя, покриття насіння та внесення в грунт. Кількість нанесень та норма нанесення залежить від інтенсивності зараження відповідним шкідником. бо Композицію можна складати у вигляді порошку, дусту, пелети, гранули, аерозолю емульсії,

колоїду, розчину або їм подібних та можна одержати за допомогою таких традиційних способів, як сушіння, ліофілізація, гомогенізація, екстракція, фільтрація, центрифугування, осадження або концентрування культури клітин, що містять поліпептид. В усіх таких композиціях, які містять щонайменше один такий пестицидний поліпептид, даний поліпептид може бути присутнім у концентрації від приблизно 195 до приблизно 9995 за вагою.

За допомогою способів за даним винаходом на даній площі можна знищувати або зменшувати кількість лускокрилих, напівтвердокрилих, двокрилих чи твердокрилих шкідників, або їх можна використовувати профілактично у навколишньому середовищі для запобігання зараженню чутливим шкідником. Переважно шкідник поглинає або контактує з пестицидно- ефективною кількістю поліпептиду. Під "пестицидно-ефективною кількістю" мають на увазі кількість пестициду, що здатна викликати загибель щонайменше одного шкідника або помітно обмежувати ріст шкідника, харчування або нормальний фізіологічний розвиток. Дана кількість буде варіювати залежно від таких факторів, як, наприклад, конкретні цільові шкідники, що підлягають контролю, конкретне навколишнє середовище, місцезнаходження, рослина, культура або сільськогосподарська ділянка, що підлягає обробці, умови навколишнього середовища та спосіб, норма, концентрація, стабільність та кількість нанесення пестицидно- ефективної композиції поліпептиду. Склади можна також варіювати з урахуванням кліматичних умов, впливу на навколишнє середовище та/або частоти нанесення та/або тяжкості зараження шкідниками.

Описані пестицидні композиції можна приготувати шляхом складання препарату або з бактеріальної клітини, кристала та/або суспензії спор, або з виділеного білкового компонента з необхідним сільськогосподарсько-прийнятним носієм. Композиції можна складати перед застосуванням за допомогою відповідних способів, таких як ліофілізація, висушування сублімацією, сушіння, або у водному носії, середовищі або придатному розріджувачі, такому як сольовий розчин або інший буфер. Складені композиції можуть бути у формі дусту чи гранульованого матеріалу, або суспензії у олії (рослинній олії або мінеральному маслі), або водних, або масляних/водних емульсій, або як порошок, що змочується, або у комбінації з будь- якою іншою речовиною-носієм, що придатна для застосування у галузі сільського господарства.

Придатні для сільського господарства носії можуть бути твердими або рідкими, та добре відомі

Зо у рівні техніки. Вираз "придатний у сільському господарстві носій" охоплює усі допоміжні речовини, інертні компоненти, диспергувальні речовини, поверхнево-активні речовини, речовини, що надають липкість, речовини, що зв'язують, тощо, які зазвичай застосовують у технології розробки складу пестицидних препаратів; вони добре відомі фахівцям у даній галузі розробки складу пестицидних препаратів. Дані склади можна змішувати з одним або декількома твердими або рідкими допоміжними речовинами та одержувати різними способами, наприклад, шляхом рівномірного змішування, перемішування та/або подрібнення пестицидної композиції з придатними допоміжними речовинами із застосуванням традиційних методик розробки складу.

Придатні склади та способи нанесення описано у патенті США Мо 6468523, який включено у даний документ за допомогою посилання. "Шкідник" включає, але без обмежень, комах, грибів, бактерій, нематод, кліщів, іксодових кліщів та їм подібних. Комахи-шкідники включають комах, вибраних із рядів СоіІеорієга, Оірієга,

Нутепорієега, Іерідорієга, МаїПорпада, Ноторіега, Нептіріега, Огпійпгорієга, Тпузапоріеєга,

Оептаріега, Ізорієга, Апоріига, Зірпопаріега, Тгіспорієга тощо, зокрема, СоїІеоріега, І ерідоріега та Оіріеєга.

Ряд СоІеоріега включає підряди Адерпада та РоїІурпада. Підряд Адерпада включає надродини Сагароїдеа та Сугіпоїдеа, у тої час як підряд РоіІурпада включає надродини

Нуагорпіоідеа, еарпуїйпоїдеа, Сапіпагоїдеа, СіІегоїдеа, ЕІагегоїдеа, РОазсіПйоідеа, Огуороідеа,

Вугппоїдеа, Сисціоїдеа, Меїоіїдеа, МогаеїІоідеа, Тепергіопоіїдеа, Вовігіспоіїдеа, Зсагараеоідеа,

Сегатрусоїдеа, Спгузотеїоіїдеа та Сигсшіопоїдеа. Надродина Сагароїдеа включає родини

Сісіпаеїйдає, Сагарідаеє та бБуїіїзсідаєе. Надродина Сугіпоїдеа включає родини сСугіпідає.

Надродина Нуагорпйоіїдеа включає родину Нуагорпійїдає. Надродина 5арпуїїпоїдеа включає родини Зіїрпідає та еїарпуїіпідае. Надродина Сапіпагоїдеа включає родини Сапійагідає та

ІГатругідае. Надродина Сіегоїдеа включає родини Сіегідає та Оегптевзіійає. Надродина

ЕІаіегоїдеа включає родини ЕПІагегідае та Виргезідаеє. Надродина Сисціоідеа включає родину

Соссіпеїйдає. Надродина МеїЇоїдеа включає родину МеїЇоїдає. Надродина ТепеБбгіопоїдеа включає родину Тепебгіопічдае. Надродина Зсагараєоїдеа включає родини Рабззаїїдає та зЗсагаравідае. Надродина Сегатрусоїдеа включає родину Сегатбрусідае. Надродина

Спгузотеїоідеа включає родину СПгузотеїїдає. Надродина Сигсцшіопоіїдеа включає родини

Сигсцшіопідає та зсоїуїаае. 60 Ряд бОіріега включає підряди Метаїйосега, Вгаспусега та Сусіоппарпа. Підряд Метаїйосега включає родини Тіриїдає, Рзусподідає, Сшисідає, Сегаюродопідає, Спігопотідає, зітиїйааєеє,

Віріопідає та Сесідотуйдає. Підряд Вгаспусегта включає родини 5ігайотуідає, Табапідає,

Тпегемідає, Азійдає, Муадаідає, Вотрбуїйдає та Роїїспородідає. Підряд Сусіогпарнпа включає секції

Азспіга та Азспіга. Секція Аб5спіга включає родини РПогідає, Зугрпідає та Сопорідає. Секція

Азспіга включає підсекції Асаіурігаїае та Саїурігаїае. Секція Асаїурігаїає включає родини

Оїщшідає, Терпгйідає, Адготулідаеє та Огозорпййдає. Секція Саїурігаїае включає родини

Нірробозсідає, Оеєзігідає, Таспіпідає, Апіпотуїдає, Мизсідає, СаїпПрпогідає та Загсорпадідає.

Ряд Іерідоріега включає родини Раріїопідає, Рієегідає, Гусаєпідає, Мутрпаїйдаеє, бапаїдає, заїугідає, Незрегіїдає, Зрпіпдідає, Зашгпіїдає, сСеоптеїгідає, Агсійдає, Мосіцідає, Гутапігідає, зевіїдає та Тіпеїдає.

Комахи-шкідники за даним винаходом для основних культур включають: маїс: Об5ігіпіа пибріїаій5, європейського кукурудзяного метелика; Адгоїї5 ірзіоп, совку-іпсилон; Неїїсомегра 7еа, кукурудзяну совку; Зродоріега їїидірегда, совку трав'яну; Оіайаєа дгапаїіозеїа, вогнівку кукурудзяну південно-західну; ЕІазтораїриє5 ІдпозеПйи5, зернового точильника; Оіаїгаєа засопагаїї5, вогнівку цукрового очерету; Ріабгоїйса мігдітега, західного кукурудзяного кореневого жука; Оіаргоїїса Іопдісогтіз бБагбрегі, північного кукурудзяного кореневого жука; бБіабгоїїса ипаесітрипсіаїа пожагаі, південного кукурудзяного кореневого жука; МеїЇапоїйи5 5рр., жуків- коваликів; Сусіосерпаїа Богеаїї5, хрущика північного (личинку хруща); Сусіосерпаїа іттасшага, хрущика південного (личинку хруща); РорійШа |аропіса, хрущика японського; Спаеіоспета риїїсагіа, земляну кукурудзяну блішку; Зрпепорпоги5 таїйдіє, кукурудзяного довгоносика;

КПпора!озірпит таїдіх, кукурудзяну листову попелицю; Апигарпі5 таїйдігадісіх, кукурудзяну кореневу попелицю; Віїз5и5 Іеисоріеги5 Іеисоріеги5, клопа-ч-ерепашку пшеничного північноамериканського; МеїІапоріих5 Тетиггибгит, червононогу кобилку; МеїІапоріи5 запдпіпірев, кобилку, що мігрує; Нуїетуа ріаїшга, личинку паросткової мухи; Адготуа рагмісогпі5, міль- пістрянку кукурудзяну; Апарпоїйпгір5 орзсгиги5, трипса злакового; ЗоІепорзіз тіїезіа, мураху- крадія; Теїгапуспив5 игпісає, звичайного павутинного кліща; сорго: Спйо рагпеїйш5, соргового точильника; Бродоріега идірегда, совку трав'яну; Неїїсомегра 7еа, кукурудзяну совку;

ЕІазтораїрих5 ІщдпозеїПййи5, маленького точильника кукурядзяного стебла; ЕРеша 5и,ибБіетапеа, гусеницю озимої совки; РпуїПорпада сгіпіа, личинку хруща; ЕІеоде5, Соподеги5 та Аеоїиз 5рр.,

Зо дротяників; ОшШіета теїапори5, п'явицу червоногруду; СПпаеєїоспета риїсагіа, кукурудзяну блішку; 5рпепорпоги5 таїйдіє, кукурудзяного довгоносика; КпораїЇозірпит таїйдіє; кукурудзяну листову попелицю; Зірпа Пама, жовту попелицю цукрового очерету; Віїзби5 Іеисоріеги5

Іеисоріеги5, клопа-черепашку пшеничного північноамериканського; Сопіагіпіа 5огопісоїа, галівницю соргову; Теїгапуспи5 сіппабагіпи5, червоного павутинного кліща; Теїгапуспиз игісає, звичайного павутинного кліща; пшениця: Рзецйдаїейа ипірипсіаїа, совку лугову; Зродорієега їгидірегда, совку трав'яну; ЕІазтораїри5 ІдпозеПйи5, маленького точильника кукурудзяного стебла; Адгоїї5 огіподопіа, прямокутну совку; ЕіІіаєтораїрих Іїщдпозеїйш5, маленького точильника кукурудзяного стебла; Оціета пеіапори5, п'явицу червоногруду; Нурега рипсіаїа, довгоносика листяного конюшинового; ОЮіаргоїїса иипаесітрипсіаїа Поугагаі, південного кукурудзяного кореневого жука; російську пшеничну попелицю; Зспігарнпіз дгатіпит, звичайну злакову попелицю; Масгозірпит амепає, велику злакову попелицю; Меїапоріи5 Тетитиргит, червононогу кобилку; МеїІапоріих5 аїйегепіаїй5, кобилку виду; МеІапоріи5 запдпиіпіре5 кобилку, що мігрує; Мауеїйоїа дезігисіог, гесенську муху; Зйоаіріозі5 тозеїІапа, оранжеву злакову галівницю;

Меготуа атегісапа, личинку американської меромізи; Нуїетуа соагсіаїа, озиму муху;

ЕгапкіїпіеПа Тиса, тютюнового трипса; Серпи5 сіпсій5, хлібного пильщика; Асегіа шіірає, кліщ цибульний чотириногий; соняшник: Зцйціеіта Пеїїапіпапа, соняшникову брунькову листовійку;

Нотоеозота еїесіешт, соняшникову вогнівку; 72удодгатта ехсіатайопіх, соняшникову окличну совку; Воїпуги5 діррозив5, моркв'яного жука; Меоіазіоріега тигпеапа, галицю соняшникового насіння; бавовник: Неїйоїпіх мігезсеп5, бавовникову листовійку; Неїїсомегра 7єа, бавовникову совку; Зродорієга ехідца, совку малу; Ресііпорпога доззурієїЇа, рожевого бавовникового хробака;

Апіпопоти5 дгапаїх, бавовникового довгоносика; Арпі5 доз5зурії, бавовникову попелицю;

Рзецдаютозвзсеїї5 з5егіа5, бавовникового гедзя; Тгіаієигоде5 аршіопеа, бавовникову білокрилку;

Гудив Ііпеоїагіх, трав'яного клопа; МеїЇапоріи5 Тептиггибгит, червононогу кобилку; МеїІапоріи5 аїйнегепійіа|йє, кобилку виду; ТПгір5 їарасі, цибулевого трипса; ЕгапкКіїпівіа їибса, тютюнового трипса; Теїгапуспи5 сіппабрагіпиз5, червоного павутинного кліща; Теїгапуспиз ипісає, звичайного павутинного кліща; рис: Оіайаєа засспагаїйє, точильника цукрового очерету; Зродорієега

Тїгидірегаа, совку трав'яну; Неїїсомегра 7єеа, кукурудзяну совку; листоїда виду Соїіазрі5 ргиппеа;

ІГів5о г порігиє огулорпйи5, рисового водяного довгоносика; ЗПпПОорпйи5 огулає, рисового довгоносика; Мерпоїейціх підгорісіи5, рисову цикадку; Вії55и5 Іеисоріеги5 Іеисоріеги5, клопа- бо черепашку пшеничного північноамериканського; Асгов5іегпит Піїйаге, зеленого клопа-щитника;

соя: Рзхецдоріивіа іпсіцдеп5, соєвого п'ядака; Апіісагзіа деттагаїї5, гусеницю совки оксамитових бобів; Ріаїйтурепа з5сабга, зеленого шкідника конюшини; Об5ігіпіа пибіїайє, європейського кукурудзяного метелика; Адгоїї5 ірзйоп, совку-іпсилон; Ззродорієега ехідча, совку малу; Неїоїпів мігезсеп5, бавовникову листовійку; Неїїсомегра 7єеа, кукурудзяну совку; Еріасппа магімевії5, мексиканську бобову зерновку; Мули5 регзісае, зелену персикову попелицю; Етроазса Табає, цикадку картопляну; Асгов5іегпит Пійаге, зеленого клопа-щитника; Меїапоріи5 Тетиггибгит, червононогу кобилку; МеїЇапоріиз айгегепійайє, кобилку виду, НуїЇетуа ріаїшга, личинку паросткової мухи; 5Зегісоїйгір5 магіаріїє, трипса соєвого; ТПгір5 їабасі, трипса цибульного;

Теїмгапуспиб5 ШштКевіапі, туркестанського павутинного кліща; Теїйгапуспив5 игіісає, звичайного павутинного кліща; ячмінь: Об5ігіпіа пибіїай5, європейського кукурудзяного метелика; Адгоїїі5 ірзіоп, совку-іпсилон; Зспігарнпіх дгатіпит, звичайну злакову попелицю; Віїз5и5 Іеисоріеги5

Іеисоріеги5, клопа-ч-ерепашку пшеничного північноамериканського; Асгозіегпит Піїаге, зеленого клопа-щитника; Еиб5спізійи5 5егми5, коричневого клопа-щитника; ОЮОеїйЇйа ріайшга, личинку паросткової мухи; Мауеїйоїа аевзігисіог, гесенську муху; Реїгобіа Іаїеп5, петробію багатоїдну; олійний рапс: Вгемісогупе Бгаззісае, попільницю; РпПуїоїгейа сгисітегає, блішку хрестоцвітну;

Матевзіга сопіїдигага, совку латукову; Рішейа хуїозіеНйа, капустяну совку; Оеїїа 55р., личинок весняної капустяної мухи.

Нематоди включають паразитичні нематоди, такі як бульбочкові, цистоутворювальні, та нематоди, що ранять, які включають Неїегодега 5рр., МеІоідодупе 5рр. та СіІородега 5рр.; зокрема, представників цистоутворювальних нематод, включаючи, але без обмежень,

Неїегодега діусіпе5 (соєву цистоутворювальну нематоду); Неїегодега 5спаснійї (бурякову цистоутворювальну нематоду); Неїегодега амепає (зернову цистоутворювальну нематоду); та

Сіородега гоб5іоспіепзіз та СіІородега раййа (картопляні цистоутворювальні нематоди).

Нематоди, що ранять, включають Ргагуепсвпиз 5рр.

Способи підвищення урожайності рослин

Забезпечуються способи підвищення урожайності рослин. Способи включають забезпечення рослини або рослинної клітини, які експресують полінуклеотид, що кодує послідовність пестицидного поліпептиду, розкритого у даному документі, та вирощування рослини або отриманого з неї насіння у полі, ураженому (або сприйнятливого до ураження) шкідником, проти якого зазначений поліпептид має пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення поліпептид володіє пестицидною активністю проти лускокрилого, твердокрилого, двокрилого, напівтвердокрилого шкідника або нематоди-шкідника, а зазначене поле уражено лускокрилим, напівтвердокрилим, твердокрилим, двокрилим шкідником або нематодом- шкідником. Як визначено у даному документі, "Урожайність" рослини відноситься до якості та/або кількості біомаси, що продукується рослиною. Під "біомасою" мають на увазі будь-який визначуваний продукт рослинного походження. Підвищення продукції біомаси являє собою будь-яке покращення визначуваного виходу продукту рослинного походження. Підвищення урожайності рослин має кілька комерційних застосувань. Наприклад, підвищення біомаси листя рослин може підвищувати урожайність листяних овочів для споживання людиною або твариною. Додатково підвищення біомаси листя можна застосовувати для підвищення виробництва фармацевтичних або промислових продуктів рослинного походження. Підвищення урожайності може включати будь-яке статистично значуще підвищення, включаючи, але без обмежень, підвищення щонайменше на 195, підвищення щонайменше на 395, підвищення щонайменше на 595, підвищення щонайменше на 1095, підвищення щонайменше на 2095, щонайменше на 3095, щонайменше на 5095, щонайменше на 7095, щонайменше на 10095 або більше підвищення урожайності у порівнянні з рослиною, у якій не експресується послідовність, що визначає пестицидну активність. При використанні конкретних способів урожайність рослин підвищується у результаті підвищення стійкості до шкідників рослини, яка експресує пестицидний білок, розкритий у даному документі. Експресія пестицидного білка призводить до зниження здатності шкідника до зараження або поїдання.

Рослини можна також обробляти одним або декількома хімічними композиціями, що містять один або кілька гербіцидів, інсектицидів або фунгіцидів. ілюстративні хімічні композиції включають: гербіциди для фруктів/овочів: атразин, бромацил, діурон, гліфосат, лінурон, метрибузин, симазин, трифлуралін, флуазифоп, глюфосинат, галосульфурон компанії сомап, паракват, пропізамід, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, індазифлам; інсектициди для фруктів/овочів: алдікарб, Васійиє (пигіепдіепоіх, карбарил, карбофуран, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, цифлутрин/бета-цифлутрин, есфенвалерат, лямбда- цигалотрин, ацеквіноцил, біфеназат, метоксифенозид, новалурон, хромафенозид, тіаклоприд, динотефуран, флуакрипірим, спіродиклофен, гамма-цигалотрин, спіромезифен, спіносад, бо ринаксипір, ціазипір, трифлумурон, спіротетрамат, імідаклоприд, флубендіамід, тіодікарб,

метафлумізон, сульфоксафлор, цифлуметофен, ціанопірафен, клотіанідин, тіаметоксам, спінеторам, тіодікарб, флонікамід, метіокарб, емамектин бензоат, індоксакарб, фенаміфос, піріпроксифен, фенбутатин-оксид; фунгіциди для Фруктів/овочів: аметоктрадин, азоксистробін, бентіавалікарб, боскалід, каптан, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ціазофамід, цифлуфенамід, цимоксаніл, ципроконазол, ципродиніл, дифеноконазол, диметоморф, дитіанон, фенамідон, фенгексамід, флуазинам, флудіоксоніл, флуопіколід, Ффлуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, фолпет, фосетил, іпродіон, іпровалікарб, ізопіразам, крезоксим-метил, манкоцеб, мандіпропамід, металаксил/умефеноксам, метирам, метрафенон, міклобутаніл, пенконазол, пентіопірад, пікоксистробін, пропамокарб, пропіконазол, пропінеб, проквіназид, протіоконазол, піраклостробін, піриметаніл, квіноксифен, спіроксамін, сірка, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для зернових: 2,4-О0, амідосульфурон, бромоксиніл, карфентразон-Е, хлоротолурон, хлорсульфурон, клодинафоп-Р, клопіралід, дикамба, диклофоп-М, дифлуфенікан, феноксапроп, флорасулам, флукарбазон-МА, флуфенацет, флупіросульфурон-М, флуроксипір, флуртамон, гліфосат, іодосульфурон, іоксиніл, ізопротурон, МСОСРА, мезосульфурон, метсульфурон, пендиметалін, піноксаден, пропоксикарбазон, просульфокарб, піроксулам, сульфосульфурон, тифенсульфурон, тралкоксидим, тріасульфурон, трибенурон, трифлуралін, тритосульфурон; фунгіциди для зернових: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, цифлуфенамід, ципроконазол, ципродиніл, димоксистробін, епоксиконазол, фенпропідин, фенпропіморф, флуопірам, флуоксастробін, флуквінконазол, флуксапіроксад, ізопіразам, крезоксим-метил, метконазол, метрафенон, пентіопірад, пікоксистробін, прохлораз, пропіконазол, проквіназид, протіоконазол, піраклостробін, квіноксифен, спіроксамін, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; инсектициди для зернових: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, ДВ-цифлутрин, біфентрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, хлорпірифос, піримікарб, метіокарб, сульфоксафлор; гербіциди для маїсу: атразин, алахлор, бромоксиніл, ацетохлор, дикамба, клопіралід, (5-)диметенамід, глюфосинат, гліфосат, ізоксафлютол, (5-)метолахлор, мезотріон, нікосульфурон, примісульфурон, римсульфурон, сулкотріон, форамсульфурон, топрамезон, темботріон, сафлуфенацил, тієнкарбазон, флуфенацет, піроксасульфон; інсектициди для маїсу:

Зо карбофуран, хлорпірифос, біфентрин, фіпроніл, імідаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тіаметоксам, клотіанідин, спіромезифен, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, дельтаметрин, тіодікарб, ВД-цифлутрин, циперметрин, біфентрин, луфенурон, тебупіримфос, етіпрол, ціазипір, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, авермектин; фунгіциди для маїсу: азоксистробін, біксафен, боскалід, ципроконазол, димоксистробін, епоксиконазол, фенітропан, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, ізопіразам, метконазол, пентіопірад, пікоксистробін, пропіконазол, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, трифлоксистробін; гербіциди для рису: бутахлор, пропаніл, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даімурон, фентразамід, імазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, піразосульфурон, пірибутикарб, квінклорак, тіобенкарб, інданофан, флуфенацет, фентразамід, галосульфурон, оксазикломефон, бензобіциклон, пірифталід, пеноксулам, биспірибак, оксадіаргіл, етоксисульфурон, претилахлор, мезотріон, тефурилтріон, оксадіазон, феноксапроп, піримісульфан; інсектициди для рису: діазинон, фенобукарб, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фіпроніл, імідаклоприд, ізопрокарб, тіаклоприд, хромафенозид, клотіанідин, етипрол, флубендіамід, ринаксипір, дельтаметрин, ацетаміприд, тіаметоксам, ціазипір, спіносад, спінеторам, емамектин-бензоат, циперметрин, хлорпірифос, етофенпрокс, карбофуран, бенфуракарб, сульфоксафлор; фунгіциди для рису: азоксистробін, карбендазим, карпропамід, диклоцимет, дифеноконазол, едифенфос, феримзон, гентаміцин, гексаконазол, гімексазол, іпробенфос (ІВР), ізопротіолан, ізотіаніл, касугаміцин, манкоцеб, метоміностробін, оризастробін, пенцикурон, пробеназол, пропіконазол, пропінеб, піроквілон, тебуконазол, тіофанат-метил, тіадиніл, трициклазол, трифлоксистробін, валідаміцин; гербіциди для бавовнику: діурон, флуометурон, ММА, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралін, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, гліфосат, норфлуразон, пендиметалін, піритіобак- натрій, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глюфосинат, флуміоксазин, тидіазурон; інсектициди для бавовнику: ацефат, алдікарб, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, ацетаміприд, емамектин бензоат, імідаклоприд, індоксакарб, лямбда-цигалотрин, спіносад, тіодікарб, гамма-цигалотрин, спіромезифен, піридаліл, флонікамід, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, бета-цифлутрин, спіротетрамат, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, динетофуран, флубендіамід, ціазипір, спіносад, спінеторам, гамма-цигалотрин, 4-

І(б-хлорпіридин-3-іл)метил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, тіодікарб, авермектин, бо флонікамід, піридаліл, спіромезифен, сульфоксафлор; фунгіциди для бавовнику: азоксистробін,

біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, фенамідон, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, іпродіон, ізопіразам, ізотіаніл, манкоцеб, манеб, метоміностробін, пентіопірад, пікоксистробін, пропінеб, протіоконазол, піраклостробін, квінтозен, тебуконазол, тетраконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для сої: алахлор, бентазон, трифлуралін, хлорімурон-етил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомезафен, флуазифоп, гліфосат, імазамокс, імазаквін, імазетапір, (5-)метолахлор, метрибузин, пендиметалін, тепралоксидим, глюфосинат; інсектициди для сої: лямбда-цигалотрин, метоміл, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, спіносад, спінеторам, емамектин-бензоат, фіпроніл, етіпрол, дельтаметрин, р-цифлутрин, гама- та лямбда-цигалотрин, 4-((б-хлорпіридин-3-іл/уметил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, спіротетрамат, спінодиклофен, трифлумурон, флонікамід, тіодікарб, бета-цифлутрин; фунгіциди для сої: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флутріафол, флуксапіроксад, ізопіразам, іпродіон, ізотіаніл, манкоцеб, манеб, метконазол, метоміностробін, міклобутаніл, пентіопірад, пікоксистробін, пропіконазол, пропінеб, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, тетраконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для цукрового буряка: хлоридазон, десмедифам, етофумезат, фенмедифам, тріаллат, клопіралід, флуазифоп, ленацил, метамитрон, квінмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, хізалофоп; інсектициди для цукрового буряка: імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, дельтаметрин, Д-цифлутрин, гама/лямбда-цигалотрин, 4-((б-хлорпіридин-3-ілуметил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, тефлутрин, ринаксипір, ціаксипір, фіпроніл, карбофуран; гербіциди для каноли: клопіралід, диклофоп, флуазифоп, глюфосинат, гліфосат, метазахлор, трифлуралін етаметсульфурон, квінмерак, хізалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгіциди для каноли: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флусилазол, флуксапіроксад, іпродіон, ізопіразам, мепікват-хлорид, метконазол, метоміностробін, паклобутразол, пентіопірад., пікоксистробін, прохлораз, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, тіофанат-метил,

Зо трифлоксистробін, вінклозолін; інсектициди для каноли: карбофуран, тіаклоприд, дельтаметрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, ацетаміприд, динетофуран, р-цифлутрин, гама- та лямбда-цигалотрин, тау-флувалеріат, етіпрол, спіносад, спінеторам, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, 4-((б-хлорпіридин-3-іл)уметил|(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он.

Наступні приклади запропоновано з метою ілюстрації, а не з метою обмеження.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Виявлення нових генів, що визначають пестицидну активність, у Васійш5

Шигіпаіепвів

Ідентифікували нові гени, що визначають пестицидну активність, у бактеріального штаму

АТХ27487 із застосуванням наступних етапів: не Одержання сукупної ДНК зі штаму. Сукупна ДНК містить як геномну ДНК, так і позахромосомну ДНК. Позахромосомна ДНК містить суміш деякого або усього з наступного: плазміди різного розміру; фагові хромосоми; інші неохарактеризовані позахромосомні молекули. не Секвенування ДНК. Сукупну ДНК секвенують за допомогою способів секвенування наступного покоління. е Ідентифікація ймовірних генів токсинів за допомогою аналізів гомології та/або інших комп'ютерних аналізів. ее Обробка послідовності гена, що представляє інтерес, за допомогою однієї з декількох стратегій ПЛР або клонування (наприклад, ТАЇЇ -РСК), якщо необхідно.

Штам АТХб66600 виділили зі зразка грунту, відібраного на острові Санта Круз Галапагоського архіпелагу.

Таблиця 1

Новий ген, ідентифікований зі штаму АТХ666О00 маса (кДа) ЗЕО Ю МО ЗЕО Ю МО

Ахті440 134,6 З7Фо Ахті129, ЗЗоо 1 З

Ахті440.2" Сту7Са! 2 4

Ахті440 5 (укорочений) 4296 иР 04148895, 4190

Ахті440.2 б (укорочений) Сту7Са! "Ахіті440.2 представляє собою білок, що кодується 3 сайту ініціації транскрипції, розташованого нижче відносно Ахіті440. Ахіті440.2 (укорочений) являє собою білок що кодується з сайту ініціації транскрипції, розташованого нижче відносно домену токсину Ахіті440, викладеного тут як Ахті440(укорочений).

Приклад 2. Аналізи пестицидної активності

Нуклеотидні послідовності за даним винаходом можна досліджувати щодо їх здатності виробляти пестицидні білки. Здатність пестицидного білка діяти на шкідника як пестициду часто аналізують за допомогою ряду методик. Одна методика, добре відома у рівні техніки, полягає у здійсненні аналізу із згодовуванням. У ході такого аналізу із згодовуванням шкідника піддавали впливу зразка, що містить або сполуку, яку необхідно досліджувати, або контрольні зразки.

Часто його здійснювали при поміщенні матеріалу, який необхідно досліджувати, або придатного розчину такого матеріалу на матеріал, який шкідник буде поглинати, як, наприклад, штучне живильне середовище. Матеріал, який необхідно досліджувати, може складатися з рідини, твердої речовини або суспензії. Матеріал, який необхідно досліджувати, можна помістити на поверхню і потім надати йому можливість висохнути. Як альтернатива, матеріал, який необхідно досліджувати, можна змішати з розплавленим штучним живильним середовищем і потім розподілити у камері для аналізу. Камерою для аналізу може бути, наприклад, чашка, тарілка або лунка мікротитрувального планшета.

Аналізи із сисними шкідниками (наприклад, попелицями) можуть включати відділення від комахи матеріалу, що тестують, перегородкою, в ідеальному випадку - секцією, яку сисна комаха може проколоти частинами сисного ротового апарату, щоб забезпечити поглинання досліджуваного матеріалу. Часто досліджуваний матеріал змішували зі стимулятором поїдання, таким як сахароза, щоб сприяти поглинанню досліджуваної сполуки.

Інші типи аналізів можуть включати мікроін'єкцію досліджуваного матеріалу у ротову порожнину або кишечник шкідника, а також - розробку трансгенних рослин з наступним дослідженням здатності шкідника харчуватися на трансгенній рослині. Дослідження рослин може включати ізоляцію частин рослин, які зазвичай споживають, наприклад, у невеликі камери,

Зо прикріплені до аркуша, або ізоляцію цілих рослин у камерах, в яких утримуються комахи.

З рівня техніки відомі інші способи та підходи до аналізу шкідників, і їх можна знайти, наприклад, в Кобегізоп апа Ргеїзіег, ед5. (1992) Резіісіде ріоаззау5 м/йп агіпгород5, СКС, Воса

Каюп, Р... Як альтернатива, аналізи, зазвичай, описано в журналах Агіпгород Мападетепі Теві5 та доигпа! ої Есопотіс Епіотоіоду, або їх обговорюють з членами Ентомологічного суспільства

Америки (Е5ЗА).

У деяких варіантах здійснення ділянки ДНК, що кодують ділянку токсину в пестицидних білках, розкритих у даному документі, клонували у вектор експресії РМАЇ -С4х Е. соїї за геном та!ІЕ, що кодує мальтоза-зв'язувальний білок (МВР). Ці гібриди усередині рамки призводять у результаті до експресії гібридних білків МВР-Ахпі в Е. соїї.

Для експресії в Е. соїї ВГ21"0ОЕЗ трансформували окремими плазмідами. Окремі колонії інокулювали у середовище Лурія-Бертані, доповнене карбеніциліном і глюкозою, та вирощували протягом ночі при 37"С. Наступної доби свіже середовище інокулювали 195 добової культури і вирощували при 377"С до логарифмічної фази росту. Потім культури індукували 0,3 мМ ІРТО протягом ночі при 20"С. Кожний осад клітин суспендували в 20 мМ буфері Ттгі5-СІ, рН 7,4 - 200

ММ Масі ж 1 мМ ОТ ж інгібітори протеаз і руйнували ультразвуком. Для підтвердження експресії гібридних білків можна застосовувати аналіз за допомогою ЗО5-РАСЕ.

Усі безклітинні екстракти потім пропускали через стовпчик з амілозою, що приєднаний до хроматографа для рідинної експрес-хроматографії білків (ЕРГС) для афінного очищення гібридних білків МВР-ахіті. Зв'язані гібридні білюи елюювали зі смоли за допомогою 10 мМ розчину мальтози. Очищені гібридні білки потім розщеплювали або фактором Ха, або трипсином для видалення амінокінцевої МВР-мітки з білка Ахті. Розщеплення та розчинність білків можна визначити за допомогою 505-РАСЕ.

Приклад 3. Експресія та очищення

Укорочений варіант Ахті440 (викладений у даному документі як ЗЕО ІЮО МО:5) експресували та аналізували його біологічну активність. Даний ген ампліфікували за допомогою ПЛР із штаму

АТХб66600 з використанням ДНК полімерази НЕКСИЇ АЗЕФІЇ Ривіоп і праймерів, які вбудовують на 3 кінці лінкер, що містить сайт АвбсіІ. Ампліфікований за допомогою ПЛР продукт розщеплювали з використанням Авсі та лігували у вектор рмМаІС4Х для утворення плазміди рАХ8548. Клон аналізували за допомогою секвенування та рАхХ8548 трансформували у компетентні клітини ВІ2І. Окрему колонію інокулювали у середовище І В, вирощували при 37С до досягнення логарифмічної фази росту та індукували за допомогою 0,5 мМ ІРТО при 20С протягом 16 годин. Очищений Ахіті440 розщеплювали за допомогою фактора Ха у співвідношенні 1:50 при кімнатній температурі протягом ночі. Очищений Ахті440 надавали для біологічного аналізу з вибраними комахами відповідно до стандартного протоколу. Результати показано у таблиці 2.

Таблиця 2

Бали затримки росту та відсоток смертності

Приклад 4. Перенос генів за допомогою вектора для експресії у рослинах

Кодуючі ділянки за даним винаходом з'єднують з відповідними послідовностями промоторів і термінаторів для експресії в рослинах. Такі послідовності добре відомі з рівня техніки, і можуть містити актиновий промотор рису, промотор убіквітину маїсу для експресії в однодольних рослинах, промотор ВОЗ Агабідорзіз або промотор Самм 355 для експресії у дводольних рослинах, і термінатори по5 або Ріпії. Методики одержання і підтвердження конструкцій промотор - ген - термінатор також добре відомі з рівня техніки.

В одному аспекті за даним винаходом конструюють і створюють синтетичні послідовності

ДНК. Ці синтетичні послідовності мають змінену нуклеотидну послідовність у порівнянні з вихідної послідовністю, але кодують білки, які, по суті, ідентичні вихідній послідовності.

Зо В іншому аспекті за даним винаходом конструюють модифіковані варіанти синтетичних генів таким чином, щоб отриманий у результаті пептид був націлений на органелу рослини, таку як ендоплазматичний ретикулум або апопласт. З рівня техніки відомі послідовності пептидів, які, як відомо, призводять до націлювання гібридних білків на органелу рослини. Наприклад, з рівня техніки відомо, що М-кінцева ділянка білка, який кодується геном кислої фосфатази білого люпину Гиріпи5 аіїби5 (ЗЕМВАМКФ ІО С1:14276838, Мійег еї аїІ. (2001) Ріапі Рпузіоіюду 127:594- 606), призводить до націлювання гетерологічних білків на ендоплазматичний ретикулум. Якщо отриманий у результаті гібридний білок також містить на С-кінці послідовність для утримання в ендоплазматичному ретикулумі, яка містить з М-кінця пептиду лізин-аспарагінову кислоту- глутамінову кислоту-лейцин (тобто мотив "КОЕЇ", ЗЕО ІО МО:7), то гібридний білок буде націлений на ендоплазматичний ретикулум. Якщо в гібридному білку на С-кінці відсутня послідовність що націлює на ендоплазматичний ретикулум, білок буде націлений на ендоплазматичний ретикулум, але в остаточному підсумку буде зв'язаний в апопласті.

Отже, даний ген кодує гібридний білок, який містить на М-кінці тридцять одну амінокислоту з гена кислої фосфатази білого люпину І иріпи5 аІри5 (ЗЕМВАМКФ ІЮО 01:14276838, Мійег еї аї., 2001, 5ирга), злиту з М-кінцем амінокислотної послідовності за даним винаходом, а також послідовність КОЕГ. (5ЕО ІО МО:7) на С-кінці. Отже, передбачається, що отриманий у результаті білок націлений на ендоплазматичний ретикулум рослини при експресії у рослинній клітині.

Рослинні експресійні касети, описані вище, поєднують з придатним для рослини селективним маркером, щоб полегшити відбір трансформованих клітин і тканин, і лігують у вектори для трансформації рослин. Вони можуть містити бінарні вектори для трансформації, опосередкованої АдгоБрасіегішт, або прості плазмідні вектори для трансформації з використанням аерозолю чи біолістичної трансформації.

Приклад 5. Трансформація клітин маїсу генами пестицидного білка, описаними в даному документі

Качани маїсу найкраще збирати через 8-12 діб після запилення. Зародки виділяли з качанів і при трансформації переважно використовували зародки розміром 0,8-1,5 мм. Зародки висаджували щитком угору придатне середовище для інкубації, таке як середовище ОМб62А55 (3,98 г/л солей Мб; 1 мл/л (1000х маточного розчину), вітаміни Мб; 800 мг/л І -аспарагіну; 100 мг/л міоіїнозиту; 1,4 г/л І-проліну; 100 мг/л казамінових кислот; 50 г/л сахарози; 1 мл/л (маточного розчину з концентрацією 1 мг/мол) 2,4-0). Проте, придатні середовища і солі, що відмінні від ОМб2А55, є відомими з рівня техніки. Зародки інкубували протягом ночі при 25"7С у темряві. Хоча інкубація зародків протягом ночі як така не є необхідною.

Одержані у результаті експлантати переносили у комірки сітки (30-40 на чашку), переносили на осмотичне середовище приблизно на 30-45 хвилин, потім переносили на пластину для інжекції (див., наприклад, РСТ публікацію Мо М/О/0138514 і патент США Мо 5240842).

ДНК-конструкції, сконструйовані для експресії генів за даним винаходом у рослинних клітинах потрапляють у рослинну тканину за рахунок прискорення із застосуванням прискорювача пучків аерозолю, із застосуванням умов, які, по суті, описані в РСТ публікації Мо

УММО/0138514. Після інжекції зародки інкубували протягом приблизно 30 хвилин на осмотичному середовищі і поміщали в середовище для інкубації на ніч при 25"С у темряві. Щоб уникнути зайвого ушкодження експлантів, підданих інжекції, їх інкубували протягом щонайменше 24 годин до переносу в середовище для відновлення. Зародки потім розподіляли у середовищі на період відновлення тривалістю приблизно 5 діб при 25"С у темряві, потім переносили на селективне середовище. Експлантати інкубували у селективному середовищі протягом періоду тривалістю до восьми тижнів, залежно від природи і характеристик конкретного використовуваного методу відбору. Після періоду відбору отриманий у результаті калюс переносили на середовище для дозрівання зародків і культивували доти, доки не спостерігалось утворення зрілих соматичних зародків. Отримані у результаті зрілі соматичні зародки потім поміщали в умови 3 низьким рівнем освітленості та ініціювали процес регенерації за допомогою способів, відомих в рівні техніки. Отриманим у результаті пагонам давали можливість укорінитись на середовищі для

Зо укорінення, а одержані у результаті рослини переносили у горщики для розсади і розмножували як трансгенні рослини.

Матеріали

Середовище ОМб2Аб55 продукту С 149) розчину) У У 1 мл/л (маточний розчин з ! рН розчину доводили до рН 5,8 за допомогою 1М КОН/ЛМ КСІ, додавали Сеїгйе (Зідта) у концентрації до З г/л і автоклавували середовище. Після охолодження до 50"С додавали 2 мл/л маточного розчину нітрату срібла з концентрацією 5 мг/мл (Рпуіотесппоїоду І ав).

Приклад б. Трансформація генами за даним винаходом рослинних клітин шляхом трансформації, опосередкованої Аагобасієегічт

Качани найкраще збирати через 8-12 діб після запилення. Зародки виділяли з качанів і при трансформації переважно застосовували зародки розміром 0,8-1,5 мм. Зародки висаджували щитком угору у середовище для інкубації та інкубували протягом ночі при 25"7С у темряві. Хоча інкубація зародків протягом ночі як така не є необхідною. Зародки зв'язували зі штамом

Адгорасіегішт, що містить придатні для опосередкованого Ті-плазмідою переносу вектори, протягом приблизно 5-10 хвилин і потім поміщали у середовище для спільного культивування приблизно на З доби (25"7С у темряві). Після спільного культивування експланти переносили у середовище на період відновлення тривалістю приблизно п'ять діб (при 25"С у темряві).

Експланти інкубували у селективному середовищі протягом періоду тривалістю вісім тижнів залежно від природи і характеристик конкретного використовуваного методу відбору. Після періоду відбору отриманий у результаті калюс переносили у середовище для дозрівання зародка та культивували доти, доки не спостерігалось утворення зрілих соматичних зародків.

Отримані у результаті зрілі соматичні зародки потім поміщали в умови з низьким рівнем освітленості та ініціювали процес регенерації, як відомо в рівні техніки.

Усі публікації і заявки на патент, згадані у даному описі, свідчать про кваліфікацію фахівців у галузі техніки, до якої належить даний винахід. Усі публікації і заявки на патент включені у даний документ за допомогою посилання тією самою мірою, якби малося б на увазі, що кожна окрема публікація або заявка на патент конкретно і окремо включена за допомогою посилання.

Хоча вищевикладений винахід був досить детально описаний шляхом ілюстрації, а також як приклад для чіткості розуміння, очевидно, що при практичному здійсненні можна вносити певні зміни та модифікації у межах обсягу прикладеної формули винаходу.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІЛЮВНОСТЕЙ

«111 Атевіжшс Корп.

ТАЙЄВ, Ребекка

СсАМПСОЗ, Кімберні, С.

ЛЕХТІНЕН, Дуда

МмАСАЛВО, песнаюде «120» тОожЖсин гЕНУ АХМІЯЯО тА СНОСОВБИ ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ: «130 вРА13-6051 хі50» 61/8563589 чх«івзІі» 2п13-08-03 «Іб0х «1105 Рацсенсїй версій 3.5 «Ай» 1 «2ї1х 4999 ки» ДИКЕ кім Васі!іїцв сСвокіпчієвзнів «м 1 асчавававоа асавсчаває азосваєсвас чсвасзчаса восабзроада Бсросасаву БО заачЕсесєь серавецьас сасвосвасс ссачавоЯає брзвассоує ассасавусче 120 каїссавзаво базсаввову гоєкчачсає ссадосоває зїааачавов аєчЕссвав. КО асочсоосва сзовачаУсУу суугсаццса чазабксась сасавУєвсе завчабсавад 74 заєссаєсєьо себаБасачі спасвеєсцаа чЧраєсзасста сакуєчасво чадаччасе Зо годвсяачЧчасе сасасссава адзавісяса скасчссува азаачвУсУє всекасвове зо щшачьесас аасобазчьов дсастуєуса дасадсатац ассбеаасія сдзазаєава 430 гаччсвсчсоя асебсаадсає асаваєевся даєсчавагбоа астсстісвса БебБоастава 480 акстессуст: ассгссачї сгасіаоває аааагавача бБаасссваву брараачее 5349 азсааєаваає чавзбассаса засво ра аччавсваво беоссзкчрач ашасекетма 500 зааказавач чаасдааїкав асассвоває асадезччеачУ зазвчччасЕ боса су 560 аєсажвазада аказазкЕкає аєвваєваче асвгачзкудаа апаєсатєсаа: засо юа.; ї20 їаЕсовЕдаа аєчсаєанає вузазовавєа здаебоасдавса сававовеце заведе 780 часваєогач свзчавччсчас бсавазосев оїбодрассетїа ссакєвссова сазсасьеса во свасчтваяачуч йввасасаос авасцзааєства асссасчаєа абсававвх срадцав Я севавасастач чеЕсасоузвача бассаосова опсадеразсо сусваеазчасряє аассааєсвоє пе асассаваєдч Казстгосаас вассстдавс ЄЕсеевадва жсосусавоєс гочовсвава 1020 асссеєзЕЧЕ зЕсазаваст аєсбааствЕ рабзсчсств абчаваасає сесзцваєсчо 1050 часгазвавсча Боаовсччсаає адвзачезова апавассавда вазтсааєсча часачесвах 10 ачЕссчосо Скдсочаєье ачасчУсєса здоасодсавоє кааадестта бзуваавоба Т200 сесзачазее чдозасдачЧав сававаєцчає ссауакачев садсествах чЕвасатсоє 1259 всЕаддасач сбааєЄцлавст асстосаває чЧасасачЧеве сквсечессс сааводвкає їЗ2о чачусастас Євсбзуасяєс агасосаваз усадсаваєс тасайєєсдоє єсБЕЕБагзув. 1380 чаєсдсачаас багасаусос ачассоваза агоасстсаас абчадатааа кт аксвках 1440 саацаасаач зазаєссасво авазуваєса содчассаєє ддевсавоєва згассваава 1500 чзчачЕравакос азіссвпасав зесваукоса стаччассзучда свазаєзтав ссцзссасада і580 воссвааєча сваксаабсяє чада чбБдсуєсає асссаваєта ЕдвечеЕвеце 1625 ааашасссаа Борссасаса соасзчачсв авсаасваєсте есасвсача ссовавкоц ї688

ЖЕкОзсоавс чзасчудавс содтаствує ззччссеося сосадтасов аустьяуасує у740 жест еасса ачасачавааа сзвзасоаставь сстусаєстсу асаєсавсва астсасавивє і800 авастадсач басаєссага азазасававї чосаясосає Єсабччорас собача ов 1880 чзачеаксоса свастсачча сасрасасєсь зсззасссаа сасавчазає заасосаєцуа 1920 часчереЕсацч чражксостас сасасстсввка етававаасв сазавБаєкта ббаБасуана 1953

ЕсвасЯсвзаЯ саасзраєта ЄБасасезає засосттаса заседорсаою гЕсаапацьє 240 сабсттжгсаєу чадтававкає ткстааксча айочаавств гсваєтаєча ксавпцЗакаєх з1йо захтттсаває ссСачсаєса звайаЧаєсса аставкцвов газесчкаче сек сеацув 2160 сосасваась зеацадаска єааєваааєає здксавсаде свадссавак сеокдаваос 2220 ссєзєваавс азгесастча Чсбавосюса ааєзавазьс совсосває асьсзатсач 2880 акчасакєсва чсасавоєсу ЕзаазаавсьЕ сттвоасчесв аксваассао дсадаєвиса 2340 чокасагачЕ сБсовспзаава бвасссатес абудсавева саавуютсава сотчасавс 28090 цчсчдасажка ккардазоцт гісваавдаев жЕжтОосЯвтсв атчапчєчає взЧчстучаває гав табсчказсая ассоссааца ббабачісвеа свавесоаво сСексозачі са абасусьвсо 252О астчсааусє чкссасбася чЕЕкастаса бссаццеаває сбдчвосавс суєсаассса 2580 чазаавасас сасвазавчя сзчасчадава вавесзсачьс ссвевсавата ссочЧавсає вай тсачакосся сад вав сестсевояє ассьсачаве боссватькс бавсесвбаве 2705 «Ессе воЧчає вБаєстчстаа сЧайаатова сасасазаба адабссеяваєє ваєкссзвае во асавзачзаєд асетацчасаа здааасаєсо дазазозусвя ввавгацечоє давав 2520 вЕБаткчаєса дсасссачав 5Бкававаса чавусоувсау аббабєбоавахє ачабсазуєї зво тскагчаїля сачассавое десвуладай сБаїахєссаа ведайадаєт аассвеско 2340 татстачкава адсавуєсаз вазаславцї аптасвоцаза воскаавессї позакеспаво 3000 гсвассессба сраастссауа ачасаєтаво учесазсася чЧааасссу Сожкаєзова 3050 чааєстачач асусеячьссе сазаадаавав Басчрасакє свочеоадвос адабаасчає 3129 сзосабсссав соабсасстяаса госаацпавата зчасовассав вавгсазсячв абетасаача ЗНО байссваєтує давдбсссав азавоцавує субодеЕБУуЯЧ агчватаєчє васссуєває зЗрай чЧаспсазазо збодзазвсасЄ Зайва счоачаєекає осссачабєаа са всеєває УЗ авочаавасЗ дрозассача ссуєстяєсса сазачдассає асасвуааса дазуєєвогва 33650 пазззацчаза ЕбЧаставасда звсоксасаквці пвассесечаєв севасчасес сесвкесввов 3850 їсаазаєсччає ашовсебча сксовсопосає брагссестас асясучасас сесчасовать зано чассссааву агаавесвача сассбудавь жбасесовав сабсчабаас зуаєсочаєає Ззо чсайвачасса зсвасаєсоа вп счава часодассає Свасааавас бчасастоуза 3600 тстасваавчиа чавсочаваа єваавсзовав чададачечи вуадсаєсоя верясавачу 3660 апдаавдасає асчасасвцдс заавстакає 2аебцабсааєс барстзуадуч сбексавдаає 3720 асайавуєечє аЕссртЕває сасаєбеєва асаєсатоса акдебедаса асгтаєавах 3789 вачаєькава асазакатач бссскозева зсакєбааттво студачсдва єваєвавеьєа 3840

ЕЕсОзадааб бачсеатсач аксссавває дсткасаве їатакєсаваб ааЗаваєсєка Зо зказазазсу учечастває кадасочєкке зкЕчазсвуда бдасвасасс зуЗзеуєасва зЗ960 чічсаавач асадеочсввс стосасасеї чдапссазаєа ччесоааодваача асавчсодка 1029 сааазацеас саасосассв ачазваєоос Бабобавсас ачкстаасаци вапчсезвачавй 43080 чаїсеЕсацчцач заЗзчатасає бавоадстаче чзакЧаваєцоа чівасатьча гаскавєвата дао

Ерачіссаї Чеаасвдасєс азаєваєчає чссбсткаїтза зїзаєтасу сасаовадач 4500

Бкасадесст сссседаєто ачатсасУусв саєстеввдава ЄсадоаЧчавас адвазчавса. за тессзчавке саачеосста доставка асучавачає аг чо 2 «211» З5Яб6 «МТЗ ДНК «2135 Васьїїцв ЄБпакіпФівдвів «00» 2 зеЕчазвчаєва асуасосава сдаабгоазчаї азсосазсау асуєчассоча ввасоскоеве 60 чеасттачева стссухасзвза сустстадсва сосаавчавла асасзцодаа садеавсавсо 1259 таїчасвасю асвзасткссса адассєесса есассадтве абавадакає сасксавуса ї8о чеказввасзо заваасчкаді садсассаса стааасцчвай стуєаасває сесдпазвевсе 240 тгсаадчачьсс сатакчесвуч састставеє встебсвраєс азавасташе кадекатика 300 тадсссівсу вадасаство сдеасозчаї авазссасчч судсачоеча адосуссавка зво аавссаавааа бсаабчацає адеітававаї сеЕЧЧстсібоа саодаєсвача Безе васа 420 сусавстїяаа ачсстьсассло азасцсвевї зачавссузтча абачвовгаєзи аавкоавкоса аВо закачсасач сіссазкувс адасоЯаскес ачзавсацеєта абчавоваве Бчсдайсвах зЗ4ад ахтччессевк Бідссостаз его сассаз чевевассьс єдоасугтата сусзапацев БОЮ сдстагаабсосває асввасьев сісаачазчахє довзовасває аєчуєасача ссаоочваса 60 ссбчавчаєу всакаватеЕ ассксавосва чазсааовау асБасадчааа возавакЕсу т20 чассасссоса сасссєсдсва бсазавазуд ссСазаєсаде єсвакааачсс садсудсвавсч тво заєссзуаєва азсзеваєоя стаседався базваєцасаа вага зав кев 84

ЧчеФтскавАбсасс свваєсваєча счіксесчсава бассеваєчє сстасасасвасє чдозвзасссасв ча адваєтвцаває абтсадавис сабо Е: чабсавсчав бсозцазесбоав БбБастазвадо З50

ЧЕЕсоцсЧеКЄ зусаєзаацс боддасдевсв ссеЗсвдада садзаватай сассаюкесь 1029 чевсостдата сссовжбаваєт Еаївааавдай стазсауває акхсавааая дасававасо зво адесоаєтса гучесестст ссддасада саттссасваа сісвзцасає бБасатстсаса; 140

ЧдчЕксадсас аауавакава пдсасСодадає дссесаууку боостасесяс ассееваєсє 200 завайсасач аівасстатеу сасцуасатос асочоусадчува сураєтавта бакжднатеаде 125 ссттаїдайо бдессаствес зазачуссає ссЕсакаава сааатасско їагссавайда 13920 чавгаєтсксв актаєчаєвса ечакассває сесааавско ачовісваава зоаастсавУє 15850 аакадачакац сЕЧвадсссь сссводасос асачастасу зЗучассаваа казававасєчь 1449 саїсууєкаа чссагасссс таабасоссст всвгаваєсаче ссастоасеєє пачсеовадие 1599 чав ссескоєавєк соасебразаса сасссазазса свастісокаа ваавсесссте ї559 вакчдссавіє аваїссвасуса аактсесадцсхї чЧеідаваєсссс всааакватай стсдісехву 1620 асазжЕсчЧЕва зсісваввоая зкастсакаас чаатвсасва уаазуюєтье давадевЕЕ 1680 совсЕсааєд аадодасауо ваЧчавастає чсачсадаве деєуазчаєсе садесавсамх 1740 сЕБоУєсЕвс дод сасава сасЕвссвасє укаавоаєтовс бастисууЄе суставаєсс 18500 васеатассо дессаассоє їаахтїбасава зазасавовас задвастсса тпавасазав 1860 їавачеьось бБсвадтвссс узатастса чаростовоува Уусбааосс єссвозбасе 1829

Есвачавкос стачевксва ссссавзквс песвазасває сеооєзасча анасчваває 1980 загачаєвава ссчвасавас сссавісаса вавазасоаєь сачдасвазза васассасвав за4о завчсвчава запдсозчкчаа боса асєсасєвоба сосазчавееє дазавсваза 2100 чедасазаєт асстьасадче ксвучеЕсЕсях асуасавсач ассасчваєс кчвадавова: 2100 басссаваєо зазазосчача ес сбБоБає ссачбанаоуєс абсосуааавя асавачвав МаРЕРЖН асасчазасє севсЕсточа сСссоаваскео фсссосасса асЕсвовача кассвасоч 2280

ЕЧосаєсоуава ЗссссУцсе бакадкачаа ссоєудауавя бозосствав ауааавсває аз чЧіасасссає дбодесовзаа Едасодвласчє табссозасає асскуїасса заавдасачас Або

Чдвассазаве гавасачаваєса басаачавсає саахвосадЯ чкЕссасасча задаваєеве 2460

Чуєтсучеза бавасуєавх со касчуає дсзадасаєц аавсастова сов сазч 25 закЕкаєссс сауакаассь доосрасаво заайкчсачьс зассачаксу сбоасбсасаа БЕ) чаассасаба єсозасадво чзсбвовасаа чааоаачьсЯа ськасуваєдв госаєдєсах 2540 тЕБЧаєссса вгуноирссес зкеєксавса вабоачесаєс сЕбебдавсс асаєсавеве 2700 їсссталасвсЯ тЕЧатасоця автстаєкчає геЕгааачава ажЕгсазастахє стада 280 кЕсаваїтає сдасвасада Бодакаєоса вазчаєсчода авкастуваєє сзбосаасад 2829 ччассаєсксва сасозачее астсочассс асєваазачає бучаааасаа веспдогаваай 559 азадкздача чесвЕкеЧье всевччавах зааасакавс вс:всацдевай ассатававя 29340 заєааєставу ксадачаосбс ксаазаєася аачесчсасо секссевсас абсусавса зо0оо стакссесваасу стісчасаасю сзрваавраач абссасваса звабавачесо бочоскасса 160 рЕзассссса чезсчвнаста гзасставес чавпвасєавуу ссчуєсачаєс сСвавдваваюь 3129 сткасаваатсав абувкасаза даготсоаюєа свазаєчаче чаєекаєкда садЕстсвова 3180 адттачаєдЧа садсасовуу соасасавава счаваасчаєа дезсассостс савастєофад 3285 хЕваавачкЕ зчудвадааса ачкозусасав аааукассад Бабвуссявча часова азоо чеастасчс саасаусєвач заавсовачай сбаоуаззазу Забсаїаїкав даскаведає З36О чаваєзачса азБадкоасас сасвасаєєсє забасабасеа акаассоваа тавваасокс. заго етавагаєа аббваєцеЕвасє асаауачсва чадекесєтсо стдакреісача бБаєчкково зав стісчЧавассч чоцавасзуа аччавсассє садаєваєва чЧкЕаексчасеь ааєсеєаатд 35489 чаазчає 3546 чиїй З «ії» 1182 «їй» БЮ «137 Васіі1їц85 Єлигіпдтівпвів «аа

Ммек пув ї16 Авп ав УЯЬ Ав обів ТКо АБроАБп Уві Аїа бій Уві ТвК і З 19 15

Зо біз Авпорхо ем Аіа Ро бег Ї1е Рго Туг Авпоувії пев бів ДгЯ Був 258 30. сій Ап тах АБа Азоп бій Тен тТпх Тух Ар два тує Ав Ра Сів одер 4 45.

Вре пеп Твг оїез біу Тук сів Авротіє твВк бій Кіа віза два Аза б1в 59

Авв'чаї тіє вв ТП ТОЖ Гай Ав» баг тне АтТа Тв ЇІлЛеЄ пев Ав Ба

БА 70 т5 во жен біу уаї Рго Туг діа Біу Тве Уаї 112 беу Межб Тук бій Буя Бей 85 зо 95

Ре Ава тує бе ТЕр Бго тую сій Авр Тих бБекобій Ттгр о Авробув Меж 100 105 119

Ме діа віз уаї біз діа рей тіє два бій пуз Із дви пі так маї їжа їй 125 їує Бех Пей Аїа їй АТа Азр цей Авробіу це С1у Ася дво Бей пу 130 135 : 146 зех тТук бі Авуи Аза Тей ув Ав тТЕроАвп сію дп Був Ав Ар Ав 185 ТЗ 155 169

Аве Бех Так о Аіа цен уаі Гем Ар о Аху Рйе Ага Тс оуді звй бій пе 163 170 17

Рре таі дви АвромМеї Аїа Бех Рне Аза Рхо туз Су Тук сі ва Пец їно То 199 їей Ге; Азр узі Ту Ава був Аза Аза Авп тей пів ПесробБей РБе ем 1955 290 205

Ака Авр о Аїа бій Бец Тух біт Аза Аз Жср о сіу Меє рго бі дяр обі 210 215 : гай

ІХМе Ав оцей Ре тує бів бій сій іс Авр о тує вка бух бій тує Бех 285 2350 235 250

Авр нів Сув Тіє Бех Тер Тук сів бує бі Пей Аз Сів РПє АвпоБувє 245 25О 28 бек Бет Аза Без Адвр Тхр їїе Був Тук Аза аку Тух Ак Тих бід Ме 280 2655 279

ТвжЖ ІТе Ап оуаї Бем Авр вБНе уаї Аіа йец Тух Рхо Аво Тук Авр Уаї 275 8 285

Ага Був ТуУуХК Рхо Меб Бах Тс нія ТЕ сій ви Тнж ду тп уаї тую жо 295. ЗІНЕ бек Авр о рРго їїє Сіу рпе двр сій Агу Тс сту ТВх біу Тк ер Ту 305 310 315 320

Чаї аку 8Та Ткр ТУжЄ БЦ Аза слу Аг Бех те Лі сім ї18 бі Ава 325 ах 335

Авв Аїа Ії Рго Аіва РкЕб Авротіе Узі ПУБ РБе 116 дво обув рем ТЕ 349 за5 зо чаї тТук Бех Був Агу тТіє АБИ Віа бек кко ре мех Аіїа ТПУ Ак ТКр 355 зо 5

Аіа біу Нів Бак її ТЬх Сіп Звр оТБг Тс орпе Тбу Сіу бех Аїа бів 370 З75 зо оїш її був тухк сіу дао уві Бех піу чаї РКО ТОК тих Ре оПцец вве 85 399 395 00 їув Аво тн дав її тух аку Та т1їе Бех ту Уаї біу Таж ТтТух тТуко 405 410 15; тТух тах Авп о сіу РІО тує цув Бей Рхо Бей Бе Був чаї Нів Ре тук 420 25 230

Сі тіє авп Тбх Бег Авп Ага Гуз біо Твк рбе Авпотух яр обів Авор 435 440. 45

Ії два Ре Пув вве біп нів сій Мув о АБробБеє Бех Анп Ядо Тіе АТа 450 155 450

Уві Укї Шшч Бра стіу ВуостТНЕ Авр оТує біу два отух Авп був Тус бек 365 376 475 480

Ні Аа пПей Беї тТук ї1і6е бекг ляр вій РКО їіє6 Був сій вве тах сту 185 ч90 495 їеп век Бет Ав біц біу Ре уггі Рго Маї ББе бі Тер Меє Нів Бех 500 505 ЗІВб

Беї Тік тТвк Ак Був АБИ Ве Пец бак діа дело бій ї1е тях біп ї18 5158 З2о 525 вхо Ата о ущі Був Бек Вів сії тус Ап Бек бек Меб Аїа ї1е уві Бек 530 зав 540

Бех Авт осіу Тух Сев біт Сіу Ту їІле Меб Був уаї Бех Пув чаї РОв 545 адлО зи зЗ5О рко РпЄ Ап бід Уаї Тах Аза біу Ава оТух Уаї маї Авор Су сії йвр аб 570 5 тує зах віп сів: це Ага Ре Ак Уаї Акч Тук Аза пек Тк Маї бЗекг 5ЗО ЗВ зо

Сув вто пес АхУ Ре Аза ТЕ Впе бек Ііє Беї піу Рко Тк Уві Ав 585 600 БОх

Пей ша був ТБкЕ бе бід Був єіу вро біш тів Був тТух дет ек Рне

Бій ві5 529

Був тує бБекє бій Тух бек Авр Рго уаі Ак РП дДЕп о рго рго біу тцЕ 65625 630 535 5чо

Бек бі вне рко Беж Вп Азпобен їіев Ре Уа3 бі1у їеюв Бек о Ата Авп пі45 я вва зі Ав оуді тую лів Авоз Був ТІіе зіц Сук хіе рРхОосма)ї тних Бу й 66 555 579

Авр о Без АБр Був сій Тк о бви бій Був Аза бій був Аха уаї Ава дів 575 80 ва

Пец Ре чІїе Авробіу Так обі Аяп Пец пув с Тв біз Уві Тих Аве отує 650 535 то сСув їіїє Авр о зі Уаії Бег Мек Ііє Ті АБр о Сун Уаї Бек аїр» Буш пе 785 то 715 25 тух то Авт 5із Був Аху дар бек бец Тїух це) маї Був нів вів Був 725 730 735

Ах зів Бех АБО Тв ВЕЯ Авйи сед ї16 їео АвробБех Аа о РНцє Тих бек

ТАЗ тав 750 ті два Бех бі) Авроуаї Ап об1у Тер о Тук біу Бех Рко біу цей тТ1є 755. 780 тв тУуаї бів Бо біУ Акр Уві Уаї вне був сім с Авп Тух УВІ нів Бей вка 778 5 780 бІ1у Бго АвпоАвр осі Ака Тук рко Те Тух пво Тук Сід Був їіє Авр

Тт85 та 795 900 слів пет був Бей тТВх бі тТук тс важка Ту сій їз Ако б1іу впе іє

ОБ щіб 8І5 сіш біу Бек Ахо біу пен біс уаї Тук уаї ї1їе йга Туд Авр о Аїа Гуз 520 ва 830 нів вір тТвЕ Бей Дяпочаю тей сіу бр Бей Бек цей АБ? вава Бен ве 35 840 з45 тТУх о АввобВій був сРіу 615 ро Авр Ах був Зеб сіл бій рко Тух їїе 850 35 в ої1в бЄзіп дгЯ Ббец сій біп сів бій Угі Аїа Ап осів Аа Аза Суя нів 865 870 875 во впе АвроБех Авйп вер Бек Беж Бек бех 5ек вва Оіу Тут Ркос Бех Авр 585 890 55

Зех нів Нів Гец бек Пец Нік Уаї Авр Тк біу бек Ї18е Авр ре ГувБ 309 90 910

Зі: Аа» пех слу тхтТе тТЕр їі Тез Рде дув їжи Бак ШЖаЕ ТЕ АвросІТу 929 25

ТУК Аіа пу т11е сіу вв ї1їе сїч Беп Ууаї 01) бів бі Бсхо ей таж 339 235 40 , сіу Бех Аза пво бут бек оті Бух Ату Ме бій Аво Ббуя Тр оГув піп 48 950 з55 Зо

Ппув чаї Зіс бек ті Акта Тез бї1п бІу бує ув Та туї Ав тк АТ 965 979 975 ув йеи Тух Ті АБр оАво Беп Ре біз сіу Явуг Тв двпо отв Був раец зва а85 990

Тух Рхто Впе уаї Та Ве бен тих Бецш дет Ав Аза Ака бій Бен Те. 995 і099 19005

АБп Був отте Тук АБ був тує бек орто Тур Бей Бех пейп тів гко 1010 1015 16029

Сіу таї Ав тує два отївч о вйпе бін бій рей Аіа Уаї дка вБе бій 1025 то030 1935

Ав овіа їй Сів бев тк Ав о тик о Ака Аа Бей її біп дво обіух 10950 ії945 1050

Акч впе І1е Аввосіх їво Уаії Веє Тв Мас ТНК отвж ре сіу Уві 1055 1060 Т065 сСіп уві гу бує Двр Бек Аза бех Бех І16 Бецп бій цес два Бек 1070 1075 1080

Ттхо бів біз бій ді уві СТБ був уд во аз був бів бі тує то85 709 1085 бі тТух ві пев ака уві Тв о Аза Бесг Був бій Авро Пе біу сів 1100. 155 11319 су ту їіє Був Уаі Бех Авр о бій Меб сбіу Ав Бек о Авр от І1е 1115 1120 1125 її вйе бек Аза був Ап Анни бек двп АБО Авр о Ууді Бек о Тїів Ав 1130 1х55 11450 йавпоту: Уві ТБх бій бій дев Сі рве Ре бкго Авро беж АБО тТух 1155 1150 ТІ5З5 туаї Ні без Бій їіє біу бів СВК бій бі Тахо Ре бів Біє Маз 1160 1155 ТЕ7О

Бек очаї сій рей лів цей Меб бій дво 1175 1180 «війхм а «11 1091 «РТ 0 вІЛОК «213» Васіії їв свВихіпдієтвів «Оп» 4

Меї ТеУк бів був Беч вЛе Аз) отук Без Тра Во Тук бів Або Те век 1 5 10 15 бій Тер Авр мув Меб Меб Аїа А1т1а Уві бі Дід іс 218 Авпобіп Був 29 Кох 30

Т16 днпосіч твКоуві Був веб Бей Аза Бей АТа Аво о тези Авробіу Бей 49 45 світу гу авп оби Був вех ТУ 5іУ Авподій їх Був АвпотЖткроАвп бі1ц 53 5о

Ав Ку авп Авр АТа двр Бех ТпкЕ Аїа цес хуаі еп Ар Ага Ре АгУ 65 709 7 о

Тр;к Уаї дви бій без ває уві дев дво Меї лій Яех рне діа РКО бує 85 що 95 сіу Ту біц Уаї пе їн пен др уаї Тув Аїа Гу Аза Аза Авв о їей 1990 т105 119 нів Беб без РНе рей Ах Вер оАїа сій рец тук о сіу Азв Авротер о б1у

ТВ 120 а

Меє Рко біз Авробій її Ав о їев Ре тує біп о біц бій бі др тує 130 | 135 . 149

Ата Був бій тує Бех Аво Ні Сув тІіє Бех Тер тук сів Був біу Пец 145 159 155 150

Авпобіп Рпе Ап був бег Бек Аїа цес Авро Тер ї18 пуз Тук о Ава АКо 155 17 175 тут Аку твж біб Ммеє тик ті двп о уаі ей дер Бе аж Аа Бе тУк 180 185 1955

Тго АБпотук о Авр о уаїф Ак пу Тук о рго Меє Бех ТП нів Тпк о бію Бен 155 200 265

ТВж АхЯ Тк уаї туї Бек АБр Ро їі сту Бпе АВБ об1й Агу так ост» 210 215 ше

Тих б1у Тпх Бех Сіу Уаї Ак Аіїа Ткр Тук Сій А1їа б1у Ахо Явк РНе 2425 230 аа 230

Аза бій 116 бій дей Авподіа тіє рко дій руб Ав оті маї Був Ре

Зб

245 ЗО а

Ті Авв був без Тв узі Тух беб Був Ак т1е Ади Аза бек РКО Ре 250 258 270.

Меб діа тик вга тер зів біт ців бер її тих сів ввр ота Таг ре 275 280 285

Яні су бек віз Сіп бів ї11є Був оТухк сіу двр Маї Зак бі Уві Вухо 290 295 . 300

ТвЕ ТНх Ре Сей Ре йцув Авп отв о Ажрої1е Тух Або тТпх тів вах тах 3015 з10 315 зей чаї БіУ ТвВу тТук тую Тут Твк АБИ Бі вхо тТух Був рей РКО цев Бех 130 аа

Був уаї Ків Впе тух Її т1ле Ап отих бБег Аяп о АкЯ пув бій Жах Рре за0 345 359

Ав ТуУух Ар осів дво; ті деп вне був Ре сій нів Зіп Пув Ав обех 355 360 355

Бех Авопо бій її Аів УВІ Уві Бей ро біу ро ТіК оАвр о тую с1у АБО 370 375 зво

ТУх АБ був тук Бек нів ВЗ Гей бек тТух ті Беї Ав Аіїа рго їїЕ

За зх за 00

Був біб Ре ТВ Сіу Пез бБет бБехї Аяп Сі: б1іу Рве аю Бхо Уаї Ре 405 15 415 сіу Тр оМеє нів бек бек ТВс ТВг Ахо Пув дб Рйе Бец оБег АТа Ав 42О 25 438 іп Іі Так бів їзе Ро діа уаі Був бе Ні бів Тук два бег Бех 449 345 мес діа її уаї Зек бег АБп Сіу Тух Сук біу біу Тут ї1є Меї був 459 45я 350 туаї Бет Ппув Мак ВБе Бго РБе АБо бів Уві Так Аіїа сіу АБИ Тук Уаї 165 470 5 80 чаї вар Сув Сію Аввротух бек біп біп Рпе Ага гне Аг узі Ако Тукг «а «590 495

Аїа Бех Ткг Уаї Бех Су Руб Бем Аг Ріє Аіа ТВх Ре бек Ії Бех зо 505 ЗІ сіу Бхо ТЬх Уаї Авпобеж Оу Був ТВтх реч бів був б1у Авробіч 118

ЗІ5 520 525

Був тує бек йех ВБПе був Тут Бей сій Тук бек Аврорто баї АкЯ Бе 530 35 вай двповхОо Еко сту тТпг Бех біу рйе рго бег вав Ав пеп тіє Бре Уві 5А5 Бо 55 3680 сьу Бей Бех АТа авп сіб Авпобаї Тук о Т1е Авробув тТіє біз Сув ТІе

ЗБ ЗУ 515

Рго Ууаі ТВх Був Авр о Авропво Авробув бі Твк пе; біб Ге АТа біс 5я0 85 ЗО їтуз Аїв о маї вАвй Аіа їв Ре ї16є Авр ОТу ТК осів Ази їз Пув ТАХ 595 що а

Сів уві Таж Аяр тую Сув 115 Авр ої уаі Бех МеєЄ тіе Т16 АвросСув 619 15 ва уві Баг Сіц бій рей Туг Бко Авц Сі Пув Агро Авробем рей Тух рез 625 635 535 40 "Чаї був нів Аїа був дгФ о біп Бек Автп отв Ага Авй цей їТїе Без Авр вай БО 555

Бек Ап РЦце Тс Бех Іїів а45вп Бер біз Авроуві АвБпобіуУ Торо тує д1у

БО вЕ5 570

Бак РКО б1іу рем ті 7аї сів Бек біу АБ уві Уаії Ре Був о вім дев до. Ба 685

ТУк Уа) нів цей АкЧ О1у БКо АБп ово сії АКУ ТУ Бко Так отуг пецй 650 по ай

Тук СІ Був Ії дво бі Бек пуз їй Тв 10 Тесс тах Аа Тек бів 705 719 715 то їецп Акха біу Ре її сій Єїу Беж Ага Ху рей Сів Ууаї тук Уві ї1є 725 730 735

Вгч Тук АБО АТа пув нів сії ТВ пе Ав Уві Пер о Сіу Аве обевд Бех 78о 745 753 їеу Авр о АвВа їв век Тук Аа сід був пі 18 во Ар Аха був бат

ТБ ТБ 755 іп бів Бко Тек тів біх сів АгЯ Пей бій бій б105 біш Уаї Аїа Ави то 775 752 біз Ак Аїз Сув нів Рів АБО век Аа Авр бех Тец Беж Беї бетг Авип 785 90 ТУ 805

Сіу рук бко Бек Авр Бег Нів Ні Пец бек рез Нів Заї Двр Тс п1у вп іо 8І5

Бек БТіє Аве Ве Бу СТО Ав ії-у бі ї1е ТО її Тех Ре їжв5 Пец 820 825 330

Бек ТВх ТЕ АБр обіу Ту Аза був Тіє біу дви ї16е біс беп уві піц 835 840 845 бі сіу Бго Бей Так біу Бек Азчїа ви с1у бек Ті рук Аку Меб сів 850 855 яко

Ава був Ткр Го бів бує Уві бій Бек 118 Ага тер сій СТУ Був о БУ 85 879 875 йо

Аза тує Ар о тТВх Аза пузв пей Тує Ії Аз Аво Без рлпе бі б1у ех в 890 895 сів вві тТапк обуз Бей тує Ро вве баї ТНж вне Бей твх пе бех Ав 0 о Зо

Аїа Ах бів без Т16 дж Був ті тТук Анни обук Тух Бех Рхо Ткр о Беч з5 520 325

Бех Пес Ії Рго бі Уві Авп отТух АвроБец вле сій бій бе Аза Уа) зо з35 540 ха вце іп оАяй діа Бей бїВп без ТУЮ Ар ТВх йкз Ав оБез тів бій за5 350 55 во

Анв о сіу ку Ре ті Авр біу Пец уаї бек Тр о Мес Так тВх орто сту

Зв з70 375 уві сів Уаї Акс пу дД5р о бес Ада бек бек ї12 їей бі; Бер Авп о Бег 285 285 50

ТтТкв біс січ бів уаї баїії бів був бек вто Уаї Сук Сіп біу Тук сїу 595 1000 1005

Туг Уа Пец аго чаі ТроАТа Бех Бук б'іц Авропей біУу біш 515 1010 1015 1020

ТК Ті бух Уві бБекоАвр б Ме бі дви бвк о АвО тТваЄ ї1їе їТе 1925 1030 1035 вЕпе бах Аза Сув деп лай Бет дай Ал АБО уаї бВех ттіЄе деп два ї94а Т085 т1а50

Тух Уаї їв біп сій Бпви біш рБе ВБе Рко АБр бек АБО Тух Уаї 1055 1060 . 1053

Нів пец сій хі б1у сіб тру бій сіу вн о рНе сій тіе'уві Беєг 1079 ТО75 10850 чаї бій беч Ті їси Меб Сів двр кове 1099 «Вій» 5 «РІ» 683 «12 БІЛОК «2135» ВасїіТва єпигіпцієювів капа» В

Ме ув ї1іе Авп дя» таї АБИ біо Тер АБО оАяй Чаї Аза вів Уаї вих ї З 10 15 біч дяки ро ппей діа ко бБет т1е РроотТух Авап Маї Бех обіп АФ Ппув

КН яв 30 бін Аа Тс о Аза Авп обі) Бе) Тег отТУуЄ Авро Ап Ту Авбо вНпе амп Аве ввЕЖ тей ТВК йей обі Тек о біч Авр о ї16 Тк сій Аза Аза Авй Віа сів що З5 65о

Авооуаї тіе Аво ТіК Тлс о рео дво Ууаі так діа Тв Ії Ббеп йвп РБе 85 19 ТВ о їєв зїУ уаї ро тТухк діа біУу тн УВО т16 Бех Мей: Тук біп Був Бех 85 20 95

Ре Авп о Тук бер ТтІр рто Тук Сі: Абр Так бек біо Тер о Авробує Ме тао то5 110

Меж Атїа Аза уаї ство вів Без їТї6 дви бій був їі Два бів ЖВх Уа 115 129 135. ув Бех Пем Аза Бех Аїа Авр Гей Двр о сСіу Пейн біу Ак звпоПем Був 139 135 і40 век тук сіУ Авп оАфа Пес пув Ав Тур Ави біб Ал Був Аво Авр Вів 145 і59 М55 50

Авр Бех ТП Аза Пец Ууаї Пеп Авр о Акч вас Аг Тв таї Авц іч пбец їб5 7 175

Ре таї Ап Ав» Мес Аза бег Рпе Аїа Бо Мдув 0О3іу Тут бій Май Бей

Во і85 ї950 тен с гей Авроуаї Ту дія Був Аза Аза вай пецп нів пев цей рне Бей 1955 38 5 вхч АЗроАїа бій бес Туг біу Аза дар їхр о біу Мер Вго бій Авр о бій 210 275 а

Ті Авп о бей РНє тує сів бій біз біз с Авротух Ага Був бій Тек Бет 225 38 235 «й

Аве Ні Суз її6є Бек Ткв Тук бій руз пі цев двп біл ре Аяв ої ув 245 258 255

Бек вет Аїа їйеч дя ТІКр Ії1е пу Тух Аапойхоа Тух аку ТЕ СТо Ме

Бо 258 АГ, твг тів дви чаї гей Авр о вВпеоуаї Аза дез Тух Рго АвзпотТук ДвБр Маї 278 во 285 ка був Тут Рко Меж Ббву Тве Вів вне біз без Твк дко Тпх уві Тег аа 295 Зо

Беж АвроРто Тї16 Сі БОе пер сів Аг ТВ б1у тк сіу Тв оБес б1у зах 10 з15 20

Ууаії йко Аїз Ткр о тТук сі дїа бі; дху бек вп Лів біп Тів 01 два 325 330 335

А дз о АТа тів РтОо діа Рго Аврої11е уаї пуб РНК ті дяй Був во тТвЕ з40 зах 350 тай тук бех пуб Ак 118 Ав» о А1а бек рис вве мес Аза тТвЕ дкЯ ЕВ 355 зво зе5 діа сіу пів чех ІТе Тлх біл Авр оТВК ТвВх Ве Так бі бек Аїа бій 310 378 зв зт тів був тух біу Ав уаї бек бі уві во ТЕ ТАЖ ває рей РНе 385 30 395 що

Був АБ Таг Азрої1є Тук оАку ТвВг ї3)3є бас лає уаї сіу тТх Тук Тух 405. ЩІ 415

Тух ТвЕ о Авпосіу Ко Туг БУБ їей Рко пев Бех Гув Ууші Нів Рпе Тук 420 25 430

Сіу її АБпоТйх бег Ав Аха Бруз бів тТьх Рпе Ав ТУух двросіш Авр 435 4549 145

І16 Ава ве був Ве біл нів бій Був Авр Бек Бе Ап біз її6 Ав 50 їі858 460

Уаїх чаї цей рко бі ВКко Тих АвротТух бі дБ; отут дЕВ Був Тук бек 65 43795 475 480 нів Ака ем бек Тух ї12е Бек Авр Аза Ро ті тув бів Бйе Тпж с1у 485 480 95

Гей Бек Бек Авп бі с01у вве баї РКО УувьЬ вне сту тер меб нів Бек 5ОВ: 505 БІ1О0

Бек тВвЕ тТиї о дкЯа Бук Ав оре тб бек АзїаоАви Сіп Іі тв біо Тіє зей аа

Бо діа уаї був Бег о Нів бій Тух Авп бек Бег Мей дів т116є Уаї Бех 555 Іо

Беж АвпобіУ Тук Сув 0їуУ сС1у Тух ї1е Меб Шув Узі Бех Пцув Уві Ве 43 559 5З5 з5о хо рНе с Азпобій уаії Тах Аіа бі дви Тук уУаї Уві АвроСув Сів Авр 565 57о Зі

Тук Бек Сіп сій Ра Ако Ре Ася аз Ако Тух АТа беє ТЬк Уві Зв 569 585 59

Сув Ехо рей Ах Рце Аіїз Тіпг о РПе Бетх Її Зех сіу ркго тТпх Уві дав 555 ОО БО

Пеж біз бує ТВ Без біп Бу5 бі Аво 6165 Ті Був Тух беї бек РЕ 510 515 52

Пцув тує Бех бій Ту Бех вро орто Чаї АхЯ вас дво Бго ро біу тую ваз 630 515 «40

Беж Біу ве вхо бпековпє Ап отец Іїе вБпе уві сіу Бесобек А1їА Айва 5і5 650 8555 бій дяпоуаї Тух Ті Ав» був їі біи Сув іє рРхо уді вд ех «їз 5 «11 578 . ка1й» ВІЛОК «213 Васі1іїе єНокапаієпнік ках в

Меє тук біп був рей Гпе Ав Тух Пей ТЕр рхо Тус сіб Ар отв ве 1 5 30 15

Оіч Тко дво бує Меб Мек Аїа Аів Уві бі) діа пей їі Авпобіп пуб о 25 30

Іїе Ав сії Тв уаї пув бек Пец АТ це) Аза Аво їз Ар обіу їй сіУ Аг АБп оЇІви Був беж Тук сіу дви Вів Бей БбубБ АБО Тр Ав сів

Зо За 5)

Авпойпув АвпоАво ВІВ АБО ех ТВ Аїа Мей Уаї Бей Авв Ако Рпе АкЯ 76 75 80 тТвх Уаії Авп обі без Ре уаї Ав дер о Мек Аза Бех Впе Аїа БЖо Цув 85 зо 55 сьу тує сій маї Пец пес рей АБр оуаі тус Ата Був Аза Аза вва Бех 105 І 105 119

Бів пес пейп орРпе пец Яку Аво Аа бій пер о тук о біу Афа Авр Тр сіу 115 125 125

Меє ро бій Авр біб Т1е Авпоїєш Ре Тек бій бій бін сі АБр о Тухє 130 135 150

Ага пу шій тує Бех Авр о нів СУБ тів Бек Ткр тТук ЄтТи Був бі ГПенй 145 155 155 15о

Ави сі1поВбе АБилоТув Бег Бег Аіа цей Авр Ткр 116, Був Тук Авпозгу їв 170 175

Тух Ах ТИХ біп Меб ТБ І116 Авп Уаі цей оАвр рРпе Уа) вів гвч тТух ї18о ї85 195

Бго Ап отут АБр ві дкгч Був Тух РКО Меє Бек тих Нів ТВжЕ ЄГи Ге ї95 о ав

Твх Ак тв о Маї тує бБетг ввровто тів 0Тїу рве АБр ост Ако тТвк о с1у іо в ! 220 тТвкЕ о сіу Тв обвх С1у Уаї Ажоз діа ТЕр Тук біз Алі сту Аху Бек Рре ди 230 735 28

Аа Бі ї1іе бій АвБпоАнп діа їтїе ро діа ро вою їїі6е Уаї БУВ Рпе 45 259 55 т12 АзпоБуа бви Ту Уа тує бег омув Аг Їїе Авп одДіа беж Ро Ре 259 255 276

Ммеє діа Та Ага То Аза От1уУу Нів Бет їіе ЩЖНж бі) Аврорах Тв рНе ат 2985 285 твжх алу Бех діа сій бів тів пуб Ттух стїу двр оуаї пек біу чаї рРгОо зо 795 ЗО тТНЕ ТнЕж вва пезпо рає пув АБ тт одкр ЇХ Тух Аа ТВЕ їІе Бе Тпг

З 15 20

Уа1ї бі» Тв Ту Тук о Тук ТВЕ Аввопіу Бго Тк Цув Бей рго Бей вес 355 330 385 ув тав нів ее тує СбіУ тіє Ави Так Бек Аби Ака бує віп тину вве з41а 345 350

ДвпоТук Авросіп Авр о Ї1е Ап о рРПе Пух Ре біп Нів йіп був Авровех 355 360 365

Бек Авп ост Т1е Діва маї уаї еп вхо б1у рго ТБХ АБо Тудх с1у Авор 370 375 зво тТук Авт пу Тут БЕ Ні Акч рец бек туї Іі Беї Авр о бів Бкго ТІТе з85 3559 за 490 пуз сів ББе ТЕЖ біу Бец бех бек Ак бій б1У Ре уві Вго Узі Ре 95 410 115 біу Тюр Ме Вів Зак о Бег Тнс ТВ АКЯ їув деп Впе ти Бех Ала дви 420 Кк 430 сіп ті Трс бів тів Рг» Аза Уаї бужш бех Нія бів Тех Авпобег Ббех в 440 145

Мек Аза Кі Ущі век вах Авп осіу Тус Сув біу б1іу Тук Їїе Мей пу 450 455 459 заї бек бук уві РІ рго РБе Ав сій Уа) тах Аїа бі двпотук уаї і855 478 аї5 480

Уаї Авр Су сій Авротух Бек біп біп Ре Аку Бе Аг уві Ага Тут ая5 250 «95 діа бек тик уаї бек Сув ро ве; вся рпБ діа ТУ РН Бах її Бех

ЗО 55 5 біу рхо Тпу Чаї Авп оївуи бій Був Те гей Сів був біу Авробів ї1їе вий ВиВ

Був тТук Бет бек рн сову ТУг бек бів тук бек Аво рго уві Аха вне 530 за вай

Ави Рго ВкКо біу Тк бек с01у Ре РгО Бек вне Ап оїем ї1е РБе Уві 545 556 заз 560 біу бе; обех Аіа Ав5побіш дар Уві Тук Ті6е Авз Бу 116 бів Сув 112

Бе що в вто Уа «Дід» 7 «тії» 4 «ії» БІЛОЮ «иа» штучна послідовні сже

Од «3» пептид, шо наційюється на ендозпазматичний ватикулум «апр

Був Аввобів Пе

Claims (23)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, що має пестицидну активність, де зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної в 5ЕО ІО МО: 1 або 2; БЮ) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО: 3-6; с) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність із щонайменше 95 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю будь-якої з ФЕС ІО МО: 3-6.

2. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, де зазначена нуклеотидна послідовність являє собою синтетичну послідовність, яку було сконструйовано для експресії у рослині.

З. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, де зазначена нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з промотором, здатним керувати експресією зазначеної нуклеотидної послідовності у рослинній клітині.

4. Вектор, що містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, де зазначена рекомбінантна нуклеїнова кислота функціонально зв'язана з гетерологічним промотором, який здатен керувати експресією зазначеної нуклеотидної послідовності в клітині-хазяїні.

5. Вектор за п. 4, що додатково містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує гетерологічний поліпептид.

6. Клітина-хазяїн, що містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту за п. 1, де зазначена рекомбінантна нуклеїнова кислота функціонально зв'язана з гетерологічним промотором, який здатен керувати експресією зазначеної нуклеотидної послідовності в клітині-хазяїні.

7. Клітина-хазяїн за п. 6, що являє собою бактеріальну клітину-хазяїна.

8. Клітина-хазяїн за п. 6, що являє собою рослинну клітину. Зо

9. Трансгенна рослина, що містить клітину-хазяїна за п. 8.

10. Трансгенна рослина за п. 9, де зазначена рослина вибрана з групи, що складається з маїсу, сорго, пшениці, капусти, соняшнику, помідора, хрестоцвітів, перцевих, картоплі, бавовнику, рису, сої, цукрового буряка, цукрової тростини, тютюну, ячменю та олійного рапсу.

11. Трансгенне насіння, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1, де зазначена нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з гетерологічним промотором, який здатен керувати експресією нуклеїнової кислоти в насінні.

12. Рекомбінантний поліпептид з пестицидною активністю, вибраний з групи, що складається з: а) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО 10 МО: 3-6, та Б) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність із щонайменше 95 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю будь-якої з ФЕО 10 МО: 3-6.

13. Поліпептид за п. 12, що додатково містить гетерологічні амінокислотні послідовності.

14. Композиція, що містить поліпептид за п. 12.

15. Композиція за п. 14, де зазначена композиція вибрана з групи, яка складається з порошку, дусту, пелети, гранули, аерозолю, емульсії, колоїду та розчину.

16. Композиція за п. 14, де зазначена композиція отримана за допомогою сушіння, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, осадження або концентрування культури бактеріальних клітин.

17. Композиція за п. 14, що містить від 1 95 до 99 95 за масою зазначеного поліпептиду.

18. Спосіб боротьби з популяцією лускокрилого шкідника, що включає згодовування зазначеній популяції пестицидно ефективної кількості поліпептиду за п. 12.

19. Спосіб знищення лускокрилого шкідника, що включає згодовування зазначеному шкідникові пестицидно ефективної кількості поліпептиду за п. 12.

20. Спосіб одержання поліпептиду з пестицидною активністю, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 6 в умовах, за яких експресується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид.

21. Рослина або рослинна клітина із стабільно вбудованою в її геном ДНК-конструкцією, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок, що має пестицидну активність, де зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної в 5ЕО ІО МО: 1 або 2; Юр) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО: 3-6, і с) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність із щонайменше 95 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю будь-якої з ФЕС ІО МО: 3-6.

22. Спосіб захисту рослини від лускокрилого шкідника, який включає експресію в рослині або її клітині нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, що має пестицидну активність проти лускокрилого шкідника, де зазначену нуклеотидну послідовність вибрано з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної в 5ЕО ІО МО: 1 або 2; БЮ) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО: 3-6, і с) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність із щонайменше 95 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю будь-якої з ФЕС ІО МО: 3-6.

23. Спосіб підвищення врожайності рослини, що включає вирощування у полі рослини або її насінини із стабільно вбудованою у її геном ДНК-конструкцією, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок, що має пестицидну активність, де зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної в 5ЕО ІО МО: 1 або 2; БЮ) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО: 3-6, і с) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність із щонайменше 95 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю будь-якої з ФЕС ІО МО: 3-6, де зазначене поле заражене шкідником, проти якого зазначений поліпептид проявляє пестицидну активність.