MX2011009318A

MX2011009318A - Metodos y composiciones para controlar plagas de plantas.

Info

Publication number: MX2011009318A
Application number: MX2011009318A
Authority: MX
Inventors: Kimberly S Sampson; Daniel J Tomso
Original assignee: Athenix Corp
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2010-03-05
Publication date: 2011-10-03
Also published as: AU2010221183B2; CN102395679A; BRPI1013362A2; AU2010221183A1; US8076533B2; EP2403948A1; US8440882B2; US7919272B2; AR075799A1; US20100226951A1; US20120066793A1; US20130210712A1; EP2666866A2; WO2010102172A1; US20110197314A1; CA2753918A1; AU2016202083A1; EP2666866A3

Abstract

Se proveen composiciones y métodos para conferir actividad pesticida a bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas. Se proveen composiciones que comprenden una secuencia de codificación de un polipéptido delta-endotoxina. Las secuencias de codificación pueden ser usadas en construcciones de ADN o cassettes de expresión para la transformación y expresión en plantas y bacterias. Las composiciones además comprenden bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas transformadas. En particular, se proveen moléculas de ácido nucleico de deltatoxinas aisladas. Además, quedan comprendidas las secuencias de aminoácidos que corresponden a los polinucleótidos, y los anticuerpos que se unen específicamente a tales secuencias de aminoácidos. En particular, la presente invención provee moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácido indicada en la ID. de SEC. Nro.: 13-24, o la secuencia de nucleótidos establecida en la ID. de SEC. Nro.: 1-12 y 25-44, así como variantes y fragmentos de las mismas.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA CONTROLAR PLAGAS DE PLANTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proveen nuevos genes que codifican proteínas pesticidas. Estas proteínas y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican resultan de utilidad en la preparación de formulaciones pesticidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo formadora de esporas gram-positiva que se caracteriza por su capacidad para producir inclusiones cristalinas específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero que son inocuas para plantas y otros organismos blanco. Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas pueden ser utilizadas como insecticidas ambientalmente aceptables con el fin de controlar plagas de insectos o vectores de insectos agrícolas en una variedad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas cristal (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis ejercen una potente actividad insecticida fundamentalmente contra larvas de Lepidópteros, Dípteros, y Coleópteros. Estas proteínas además han evidenciado actividad contra plagas de Himenópteros, Homópteros, Ftirápteros, Malófagos, y Ácaros, así como contra otros órdenes invertebrados como Nematelmintos, Platelmintos, y Sarcomastigorforos (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) Estas proteínas fueron originalmente clasificadas como Cryl a CryV fundamentalmente en base a su actividad insecticida. Las clases principales eran Lep dópferos-específícas (I), Lepidópteros- y D pferos-específicas (II), Co/eópteros-específicas (III), D/píeros-específicas (IV), y nemátodos-específicas (V) y (VI). Las proteínas además fueron clasificadas en subfamilias; las proteínas con la mayor relación dentro de cada familia recibieron letras divisionales como Cryl A, CryW, CryIC, etc. Las proteínas aún más relacionadas dentro de cada división recibieron denominaciones específicas como Cry1C1, Cry1C2, etc.

Recientemente se ha descripto una nueva nomenclatura para los genes Cry en base a la homología de las secuencias de aminoácidos en lugar de la especificidad por ciertos insectos (Crickmore et al. (1998) Microbio). Mol. Biol. Rev. 62:807-813). En la nueva clasificación, cada toxina recibe una denominación única que incorpora un grado primario (un número arábigo), un grado secundario (una letra mayúscula), un grado terciario (una letra minúscula), y un grado cuaternario (otro número arábigo). En la nueva clasificación, los números romanos han sido reemplazados por números arábigos en el grado primario. Las proteínas con menos de 45% de identidad de secuencia tienen grados primarios diferentes, en tanto los criterios para los grados secundario y terciario son 78% y 95%, respectivamente.

La proteína cristal no exhibe actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por las proteasas en el tracto digestivo del insecto en una molécula tóxica activa. (Hófte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une a los receptores de las vellosidades apicales en el intestino medio de las larvas blanco y se inserta en la membrana apical creando canales o poros iónicos, con lo cual se produce la muerte larval.

Las delta-endotoxinas en general tienen cinco dominios de secuencia conservados, y tres dominios estructurales conservados (consultar, por ejemplo, de Maagd et al. (2001 ) Trends Genetics 17: 193-199). El primer dominio estructural conservado comprende siete alfa hélices y participa en la inserción en membrana y formación de poros. El dominio II comprende tres beta-láminas dispuestas' en una configuración de clave Griega, en tanto el dominio III comprende dos beta-láminas antiparalelas en topología "jelly roll" (de Maagd et al., 2001 , supra). Los dominios II y III participan en el reconocimiento y unión a receptores, y por lo tanto se consideran determinantes en la especificidad de la toxina.

Además de las delta-endotoxinas, existen varias otras clases conocidas de toxinas de proteínas pesticidas. Las toxinas VIP1/VIP2 (consultar, por ejemplo, Patente Estadounidense 5,770,696) son toxinas pesticidas binarias que exhiben una fuerte actividad sobre insectos a través de un mecanismo que se cree comprende una endocitosis mediada por receptores seguida de una toxificación celular, lo cual resulta similar al modo de acción de otras toxinas binarias ("A/B"). Las toxinas A/B como VIP, C2, CDT, CST, o el edema de B. ant racis y las toxinas letales inicialmente interactúan con las células blanco a través de una unión especifica, mediada por receptores de los componentes "B" como monómeros. Estos monómeros luego forman homoheptámeros. El complejo heptámero-receptor "B" luego actúa como una plataforma de anclaje que subsecuentemente une y permite la translocación del o los componentes enzimáticos "A" en el citosol mediante una endocitosis mediada por receptores. Una vez dentro del citosol de la célula, los componentes "A" inhiben la función celular normal mediante, por ejemplo, ribosilación por ADP de G-actina, o incrementan los niveles intracelulares de AMP cíclico (cAMP). Consultar Barth et al. (2004) Microbio! Mol Biol Rev 68:373-402.

El uso intensivo de insecticidas a base de B. thuringiensis ya ha dado origen a resistencia en poblaciones en campo de la polilla dorso de diamante, Plutella xylostella (Ferré and Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). El mecanismo más común de resistencia es la inducción de la unión de la toxina a su o sus receptores del intestino medio específicos. Esto además puede conferir ¡nter-resistencia a otras toxinas que compartan el mismo receptor (Ferré and Van Rie (2002)).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos para conferir resistencia pesticida a bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácidos nucleicos que codifican secuencias para polipéptidos de delta-endotoxina, vectores que comprenden tales moléculas de ácidos nucleicos, y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones además incluyen secuencias de polipéptidos de la endotoxina, y anticuerpos para tales polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden usarse en construcciones o cassettes de expresión de ADN para transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas diseñadas para expresión en un organismo que incluye, entre otros, un microorganismo o una planta. Las composiciones además comprenden bacterias, plantas, células de plantas, tejidos, y semillas transformadas.

En particular, se proveen moléculas de ácidos nucleicos aisladas que corresponden a secuencias de ácidos nucleicos de delta endotoxina. Adicionalmente, se contemplan secuencias de aminoácidos que corresponden a los polinucleotidos. En particular, la presente invención provee una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en cualquiera de las Id. de Sea Nro.: 13-24, o una secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 1 -12, así como variantes y fragmentos de las mismas. También se contemplan las secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención, o que se hibridan a una secuencia de la invención.

Las composiciones y métodos de la invención resultan de utilidad en la producción de organismos con resistencia pesticida, en especial bacterias y plantas. Estos organismos y composiciones derivadas de ellos son convenientes para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también resultan de utilidad en la generación de proteínas delta endotoxinas alteradas o mejoradas con actividad pesticida, o con el fin de detectar la presencia de proteínas delta endotoxinas o ácidos nucleicos en productos u organismos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para regular la resistencia a las plagas en organismos, particularmente plantas o células de plantas. Los métodos comprenden transformar organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína delta endotoxina de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención resultan de utilidad en la preparación de plantas y microorganismos que poseen actividad pesticida. Así, se proveen bacterias, plantas, células de plantas, tejidos vegetales y semillas transformadas. Las composiciones son ácidos nucleicos de delta endotoxina y proteínas de Bacillus thuríngiensis. Las secuencias se usan en la construcción de vectores de expresión para la subsecuente transformación en organismos de interés, como sondas para el auslado de otros genes de delta endotoxina, y para la generación de proteínas pesticidas alteradas mediante métodos conocidos en el arte, como intercambio de dominios o barajado de ADN. Las proteínas son de aplicación en el control o eliminación de poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, y nemátodos, y en la producción de composiciones con actividad pesticida.

La expresión "delta-endotoxina" hace referencia a una toxina de Bacillus thuríngiensis que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluyendo, entre otras, miembros de los órdenes Lepidópteros, Dípteros, y Coleópteros, o del phylum Nemátodos, o una proteína que tiene homología respecto de tal proteína. En algunos casos, las proteínas delta endotoxinas han sido aisladas de organismos que incluyen, por ejemplo, Clostrídium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas delta endotoxinas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de secuencias de nucleótidos de longitud total aquí reveladas, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud total, ya sea por el uso de un sitio de inicio caudal abajo alternativo, o por el procesamiento que genera una proteína más corta con actividad pesticida. El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el que se expresa la proteína, o en la plaga luego de la ingestión de la proteína.

En varias realizaciones, las secuencias reveladas poseen homología respecto de las proteínas delta endotoxina. Las delta-endotoxinas incluyen las proteínas identificadas como cryl a cry53, cytl y c r2, y la toxina tipo Cyt. Existen en la actualidad más de 250 especies conocidas de delta endotoxinas con una amplia gama de especificidades y toxicidades. Por una lista completa refiérase a Crickmore eí al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, y por actualizaciones regulares consultar Crickmore ef al. (2003) "Bacillus thuríngiensis toxin nomenclature," en www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

En otras realizaciones, las secuencias contempladas en la presente son secuencias tipo MTX. El término "MTX" es utilizado en el arte para delinar un conjunto de proteínas pesticidas producidas por Bacillus sphaericus. La primera de estas, a menudo denominada MTX1 , es sintetizada como un cristal paraesporal que es tóxico para los mosquitos. Los componentes principales del cristal son dos proteínas de 51 y 42 kDa, Dado que es necesaria la presencia de ambas proteínas para tener toxicidad, se considera que MTX1 es una toxina "binaria" (Baumann et al. (1991 ) Microbiol. Rev. 55:425-436).

Mediante el análisis de diferentes cepas de Bacillus sphaericus con distintas toxicidades, se han identificado dos nuevas clases de toxinas MTX. MTX2 y MTX3 representan clases separadas y relacionadas de toxinas pesticidas que exhiben actividad pesticida. Consular, por ejemplo, Baumann eí al. (1991 ) Microbio!. Rev. 55:425—436, que se incorpora por completo a la presente como referencia. MTX2 es una toxina de 100-kDa. Más recientemente, se ha identificado MTX3 como una toxina separada, a pesar que la secuencia de aminoácidos de MTX3 de B. sphaericus es un 38% idéntica a la toxina MTX2 de B. sphaericus SSII-1 (Liu, ef al. (1996) Appl. Environ. Microbio!. 62: 2174-2176). Las toxinas Mtx pueden resultar de utilidad tanto para incrementar la actividad insecticida de cepas de B. sphaericus como para manejar la evolución de la resistencia a las toxinas Bin en poblaciones de mosquitos (Wirth et al. (2007) Appl Environ Microbio! 73(19):6066-6071 ).

La presente provee nuevas secuencias de nucleótidos aisladas que confieren actividad pesticida. Asimismo se proveen las secuencias de aminoácidos de las proteínas delta-endotoxinas. La proteína que resulta de la traducción de este gen permite que las células controlen o maten las plagas que las ingieren.

Moléculas de ácidos nucleicos aisladas, y variantes v fragmentos de las mismas Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas delta-endotoxinas y polipéptidos o porciones biológicamente activas de las mismas, así como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para ser usadas como sondas de hibridación para identificar los ácidos nucleicos que codifican proteínas delta-endotoxinas. De acuerdo a la presente, la expresión "molécula de ácido nucleico" comprende moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc, o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos de ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena simple o doble, preferentemente es ADN de cadena doble.

La expresión secuencia de ácidos nucleicos "aislada" (o ADN) en la presente hace referencia a una secuencia de ácidos nucleicos (o ADN) que ya no está en su ambiente natural, por ejemplo, in vitro o en una célula hupesped bacteriana recombinante o de planta. En algunas realizaciones, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferentemente secuencias de codificación de proteínas) que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias dispuestas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual el ácido nucleico deriva. A los fines de la invención, el término "aislado" cuando se lo usa con referencia a moléculas de ácidos nucleicos excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en varias' realizaciones, la delta-endotoxina que codifica la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que naturalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual el ácido nucleico deriva. Una proteína delta endotoxina sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que poseen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de proteína no delta endotoxina (también denominada "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia establecida en la ID. de SEC. Nro.: 1-12, y variantes, fragmentos, y complementos de la misma. La expresión "complemento" se refiere a una secuencia de nucleótidos suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada de modo que pueda hibridarse a la secuencia de nucleótidos dada para en consecuencia formar un dúplex estable. La correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína delta endotoxina codificada por esta secuencia de nucleótidos está establecida en la ID. de SEC. Nro.: 13-24.

Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican delta endotoxinas también son contempladas por la presente invención. El término "fragmento" hace referencia a una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína delta endotoxina. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína delta endotoxina, o puede ser un fragmento que puede ser usado como una sonda de hibridación o primer de PCR usando los métodos que se describen a continuación. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de una delta endotoxina comprenden por lo menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1 150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presente en una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina de longitud total revelada en la presente de acuerdo al uso pretendido. La expresión nucleótidos "contiguos" se refiere a residuos de nucleótidos inmediatamente adyacentes entre si. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención codificarán fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de la proteína delta endotoxina y, en consecuencia, retienen la actividad pesticida. La expresión "retiene actividad" hace referencia a que el fragmento tendrá por lo menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad pesticida de la proteína delta endotoxina. Los métodos para medir la actividad pesticida son muy conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews ef al. (1988) Biochem. J. 252: 199-206; Marrone ef al. (1985) J. oí Economic Entomology 78:290-293; y Patente Estadounidense Número 5,743,477, todos los cuales se incorporan por completo a la presente como referencia.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína delta endotoxina que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína delta endotoxina de longitud completa de la invención.

En algunas realizaciones, el fragmento es un fragmento de clivaje proteolítico. Por ejemplo, el fragmento de clivaje proteolítico puede tener una truncación N-terminal de por lo menos aproximadamente 100 aminoácidos, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, o aproximadamente 160 aminoácidos con relación a la Id. de Sec. Nro.: 13-24. En algunas realizaciones, los fragmentos contemplados por la presente son el resultado de la eliminación del dominio de cristalización C-terminal, por ejemplo, por proteólisis o por inserción de un codón de interrupción en la secuencia de codificación.

Las proteínas delta endotoxinas preferidas de la presente invención son codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de la ID. de SEC. Nro. 1-12. La expresión "suficientemente idéntica" hace referencia a una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que posee al menos aproximadamente 60% o 65% de identidad de secuencia, aproximadamente 70% o 75% de identidad de secuencia, aproximadamente 80% o 85% de identidad de secuencia, aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de referencia que usa uno de los programas de alineación descriptos en la presente con parámetros estándar. El experto en el arte reconocerá que estos valores pueden ser adecuadamente ajustados para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos tomando en consideración la degenerancia de codones, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias son alineadas para una comparación óptima. La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad porcentual = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otra realización, la comparación es a través de toda la secuencia de referencia (por ejemplo, a través de una de las Id. de Sec. 1-12 o una de las Id. de Sec. 13-24). La identidad porcentual entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a aquellas descriptas seguidamente, permitiendo o no espacios. En el cálculo de la identidad porcentual, típicamente se cuentan las concordancias exactas.

La determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin and Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873- Este algoritmo está incorporado a los programas BLASTN y BLASTX de AltschuI ef al. ( 1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden ejecutarse con el programa BLASTN, puntaje = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a moléculas de ácidos nucleicos tipo delta endotoxina de la invención. Las búsquedas de proteínas en BLAST pueden ejecutarse con el programa BLASTX, puntaje = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las proteínas delta-endotoxinas de la invención. Para obtener alineaciones con espacios con fines comparativos, es posible utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) según se describe en AltschuI et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, es posible utilizar PSI-Blast para ejecutar una búsqueda iterada que detecte las relaciones distantes entre las moléculas. Consultar AltschuI eí al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, es posible emplear los parámetros por omisión de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). La alineación también puede ejecutarse manualmente por inspección.

Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara las secuencias y alinea toda la secuencia de aminoácidos o ADN, y de tal forma puede proveer datos sobre la conservación de secuencia de toda la secuencia de aminoácidos. El algoritmo ClustalW se utiliza en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos comercializados en el mercado, como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Ihvitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Luego de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, es posible determinar la identidad porcentual de los aminoácidos. Un ejemplo no limitativo de un software de utilidad para el análisis de alineaciones ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite la determinación de la similitud de los aminoácidos (o ADN) y la identidad entre múltiples proteína. Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de yers and Miller ( 1988) CABIOS 4:1 1 -17. Este algoritmo está incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versión 10 (comercializado por Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, es posible emplear una tabla de residuos en peso PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12, y una penalidad de espacio de 4.

Salvo indicación en contrario, GAP Versión 10, que utiliza el algoritmo de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, será utilizado para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando Peso GAP de 50 y longitud peso de 3, así como la matriz de clasificación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando peso GAP de 8 y longitud peso de 2, y el programa de clasificación BLOSU 62. También es posible utilizar programas equivalentes. La expresión "programa equivalente" hace referencia a cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera una alineación que posee concordancias idénticas entre los residuos de nucleótidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia respecto de la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10. La invención además comprende moléculas de ácidos nucleicos variantes.

Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican delta endotoxinas incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas delta endotoxinas reveladas en la presente pero que difieren conservativamente en razón de la degenerancia del código genético así como aquellas que son lo suficientemente idénticas según lo expuesto. Las variantes alélicas naturales pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular muy conocidas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación según se explica seguidamente. Las secuencias de nucleótidos variantes además incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente generadas que han sido obtenidas, por ejemplo, usando mutagénesis sitio-dirigida pero que aún codifican las proteínas delta endotoxinas reveladas en la presente invención según se expone a continuación. Las proteínas variantes de acuerdo a la presente invención son biológicamente activas, es decir continúan teniendo la actividad biológica deseada de la proteina nativa, es decir, retienen actividad pesticida. La expresión "retienen actividad" hace referencia a que la variante tendrá por lo menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 80% de la actividad pesticida de la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad pesticida son muy conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entorno!. 83: 2480-2485; Andrews ef al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone ef al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente Estadounidense Número 5,743,477, todos los cuales se incorporan por completo a la presente como referencia.

El experto en el arte además advertirá que los cambios pueden ser introducidos por mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención conduciendo en consecuencia a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas delta endotoxinas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Así, las variantes de moléculas de ácidos nucleicos aisladas pueden ser creadas introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la correspondiente secuencia de nucleótidos revelada, de manera que una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos se introduzcan en la proteína codificada. Es posible introducir mutaciones mediante técnicas estándar, como mutagénesis sitio dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Estas variantes de secuencias de nucleótidos también quedan contempladas por la presente invención.

Por ejemplo, es posible realizar sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales preestablecidos. Un residuo de aminoácido "non esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia natural de una proteína toxina sin alterar la actividad biológica, en tanto un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que posee una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina).

Las delta-endotoxinas en general tienen cinco dominios de secuencia conservados, y tres dominios estructurales conservados (consultar, por ejemplo, de Maagd et al. (2001 ) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado comprende siete alfa hélices y está involucrado en la inserción en membrana y la formación de poros. El dominio II comprende tres beta-láminas dispuestas bajo una configuración en clave Griega, en tanto el dominio III comprende dos beta-láminas antiparalelas en topología "jelly-roll" (de Maagd et al., 2001 , supra). Los dominios II y III están involucrados en el reconocimiento y unión a los receptores, y en consecuencia se consideran determinantes de la especificidad de las toxinas.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en regiones no conservadas que retienen la función. En general, estas sustituciones no se realizarían para residuos de aminoácidos conservados, o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, donde tales residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Los ejemplos de residuos conservados y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de las secuencias de nucleótidos de la presente invención y secuencias de toxinas conocidas. Los ejemplos de residuos que son conservados pero que pueden permitir sustituciones de aminoácidos conservadoras y que aún retienen la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que poseen únicamente sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en una alineación de las secuencias de nucleótidos de la presente invención y secuencias de toxinas conocidas. Sin embargo, el experto en el arte entenderá que las variantes funcionales pueden tener alteraciones conservadas o no conservadas menores en los residuos conservados.

Alternativamente, las variantes de secuencias de nucleótidos pueden realizarse introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de todo o parte de la secuencia de codificación, como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden ser clasificados por su capacidad para conferir actividad de de delta endotoxina para identificar mutantes que retienen la actividad. Luego de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada de manera recombinante, y la actividad de la proteína puede determinarse usando técnicas de ensayo estándar.

Mediante el uso de métodos como PCR, hibridación, y similares es posible identificar las correspondientes secuencias pesticidas, tales secuencias tienen una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Consultar, por ejemplo, Sambrook and Russell (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Metods and Applications (Academic Press, NY).

En un método de hibridación, toda o parte de la secuencia de nucleótidos de la delta endotoxina puede utilizarse para clasificar ADNc o bibliotecas genómicas. Los métodos de construcción de tales ADNc y bibliotecas genómicas en general son conocidos en el arte y están revelados en Sambrook and Russell, 2001 , supra. Las llamadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genónico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden ser marcadas con un grupo detectable como 32P, o cualquier otro marcador detectable, como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de enzima. Las sondas para hibridación pueden realizarse marcando oligonucleótidos sintéticos en base a la secuencia de nucleótidos que codifica la delta endotoxina conocida que se revela en la presente. Además es posible usar primers degenerados diseñados sobre la base de nucleótidos o residuos de aminoácidos conservados en la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos codificada. La sonda típicamente comprende una región of secuencia de nucleótidos que sé híbrida bajo condiciones astringentes a por lo menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, o 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos que codifica la delta endotoxina de la invención o un fragmento o variante de la misma. Los métodos de preparación de sondas para hibridación son en general conocidos en el arte y están revelados en Sambrook and Russell, 2001 , supra que se incorpora a la presente como referencia. Por ejemplo, una secuencia de delta-endotoxina completa revelada en la presente, o una o más porciones de la misma, puede usarse como una sonda capaz de hibridarse específicamente a las correspondientes secuencias tipo delta endotoxinas y ARNs mensajeros. Para lograr la hibridación específica bajo una variedad de condiciones, estas sondas incluyen secuencias que son únicas y que preferentemente tienen menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Estas sondas pueden ser usadas para amplificar las correspondientes secuencias de toxinas de un organismo elegido por PCR. Esta técnica puede ser empleada para aislar secuencias de codificación adicionales de un organismo deseado o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen hibridación por clasificación de bibliotecas de ADN en placas (ya sea placas o colonias; consultar, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

La hibridación de tales secuencias puede ser llevada a cabo bajo condiciones astringentes. La expresión "condiciones astringentes" o "condiciones de hibridación astringentes" hace referencia a las condiciones a las cuales una sonda se hibridará a su secuencia blanco en un grado detectable mayor que a otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el background). Las condiciones astringentes dependen de las secuencias y serán distintas en distintas circunstancias. Controlando la astringencia de la hibridación y/o las condiciones de lavado, es posible identificar secuencias blanco que sean 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de astringencia pueden ser ajustadas para permitir algún grado de desajustes en las secuencias de modo que se detecten menores grados de similitud (sondeo heterólogo). En general, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferentemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, condiciones astringentes serán aquellas en las cuales la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1.5 ión de Na, típicamente aproximadamente entre 0.01 y 1.0 M concentración de ión de Na (u otras sales) a un pH 7.0 a 8.3 en tanto la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, superiores a 50 nucleótidos). Las condiciones astringentes también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja astringencia incluyen hibridación con una solución buffer de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCI, 1% SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCI/0.3 M citrato trisódico) a 50 a 55°C. Los ejemplos de condiciones de astringencia moderada incluyen hibridación en 40 a 45% formamida, 1.0 M NaCI, 1% SDS a 37°C, y un lavado en 0.5X a 1X SSC a 55 a 60"C. Los ejemplos de condiciones de astringencia alta incluyen hibridación en 50% formamida, 1 M NaCI, 1% SDS a 37°C, y un lavado en 0.1X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, los buffers de lavado pueden comprender aproximadamente entre 0.1% y aproximadamente 1% SDS. La duración de la hibridación es en general inferior a aproximadamente 24 horas, usualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de los lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, el valor Tm puede ser aproximado a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log ) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (bajo una resistencia iónica y pH definidos) a la cual un 50% de una secuencia blanco complementaria se híbrida en una sonda perfectamente concordada. Tm se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1% de desajuste; así, la Tm, hibridación, y/o las condiciones de lavado pueden ajustarse para hibridarse a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm puede disminuir en 10°C. En general, las condiciones astringentes son seleccionadas de modo que sean aproximadamente 5°C inferiores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica y su complemento a una resistencia iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente astringentes puede utilizar una hibridación y/o lavado a 1 , 2, 3, o 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente astringentes pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja astringencia pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11 , 12, 13, 14, 15, o 20°C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Los expertos en el arte advertirán que en el uso de la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, pueden variarse. Si el grado deseado de desajuste da como resultado una Tm inferior a 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC de manera que pueda emplearse una temperatura mayor. La hibridación de ácidos nucleicos está extensamente descripta en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); y Ausubel ef al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York). Consultar Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas Las proteínas delta-endotoxina también caen dentro del alcance de la presente invención. La expresión "proteína delta endotoxina" hace referencia a una proteína que posee la secuencia de aminoácidos establecida en la ID. de SEC. Nro.: 13-24. Además se proveen fragmentos, porciones biológicamente activas, y variantes de las mismas, que pueden utilizarse para llevar a la práctica los métodos de la presente invención. La expresión "proteína aislada" hace referencia a una proteína que ya no se encuentra en su ambiente natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped bacteriana recombinante o de planta. La expresión "proteína aislada" hace referencia a una proteína que ya no se encuentra en su ambiente natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped bacteriana recombinante o de planta.

Los "fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos establecida en la ID de SEC. Nro.: 13-24 y que exhiben actividad pesticida. Una porción biológicamente activa de una proteína delta endotoxina puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas pueden ser preparadas mediante técnicas recombinantes y evaluadas para establecer la actividad pesticida. Los métodos de medición de la actividad pesticida son muy conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews ef al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone ef al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la Patente Estadounidense Número 5,743,477, todos los cuales se incorporan por completo a la presente como referencia. De acuerdo a la presente, un fragmento comprende por lo menos 8 aminoácidos contiguos de la ID. de SEC. Nro.: 13-24. La invención comprende otros fragmentos, sin embargo, como cualquier fragmento de más de aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1 100, 1 150, 1200, 1250, o 300 aminoácidos.

La expresión "variantes" hace referencia a proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 60%, 65%, aproximadamente 70%, 75%, aproximadamente 80%, 85%, aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la ID. de SEC. Nro.: 13-24. Las variantes además incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que se híbrida a la molécula de ácido nucleico de la ID. de SEC. Nro.: 1-12, o un complemento de la misma, bajo condiciones astringentes. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en secuencia de aminoácidos por mutagénesis. Las variantes de proteínas de la presente invención son biológicamente activas, es decir conservan la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, retienen la actividad pesticida. En algunas realizaciones, las variantes tienen una actividad mejorada con relación a la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad pesticida son muy conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews er al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. ofEconomic Entomology 78:290-293; y la Patente Estadounidense Número 5,743,477, todos los cuales se incorporan por completo a la presente como referencia.

Los genes bacterianos como los genes axmi de la presente invención con bastante frecuencia poseen múltiples codones de iniciación de metionina cerca del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, las bacterias como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción de los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Además, con frecuencia no se determina a priori cuáles de estos codones son utilizados naturalmente en la bacteria. Así, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos también puede conducir a la generación de proteínas delta endotoxinas que codifiquen actividad pesticida. Estas proteínas delta endotoxinas caen dentro del alcance de la presente invención y pueden ser usadas en los métodos de la presente invención.

También se contemplan los anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención, o para variantes o fragmentos de los mismos. Los métodos para la producción de anticuerpos son muy conocidos en el arte (consultar, por ejemplo, Harlow and Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY; Patente Estadounidense Número 4,196,265).

Variantes alteradas o mejoradas Se reconoce que las secuencias de ADN de una delta endotoxina pueden ser alteradas a través de varios métodos, y que esta alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes de las codificadas por una delta endotoxina de la presente invención. Esta proteína puede ser alterada en varias formas incluyendo sustituciones, deleciones, truncaciones e inserciones de uno o más aminoácidos de la ID. de SEC. Nro.: 13-24, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 130 o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos.

Los métodos para tales manipulaciones son en general conocidos en el arte. Por ejemplo, es posible preparar variantes de secuencias de aminoácidos de una proteína delta endotoxina por mutaciones en el ADN. Esto también puede lograrse por una de varias formas de mutagénesis y/o en evolución directa. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectará en forma sustancial la función de la proteína. Estas variantes tendrán la actividad pesticida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una delta endotoxina para conferir actividad pesticida puede mejorarse a través del uso de tales técnicas sobre las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, es posible expresar una delta endotoxina en células huéspedes que exhiban mayores tasas de falta de incorporación de bases durante la replicación del ADN, como XL-1 Red (Stratagene). Luego de la propagación de tales cepas, es posible aislar el ADN de la delta-endotoxina (por ejemplo preparando plásmido de ADN, o amplificando por PCR y clonando el fragmento de PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de la delta endotoxina en una cepa no mutagénica, e identificar los genes de mutados con actividad pesticida, por ejemplo ejecutando un ensayo para evaluar la actividad pesticida. En general, la proteína se mezcla y usa en ensayos de alimentación. Consultar, por ejemplo Marrone ef al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tales ensayos pueden incluir poner en contacto plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o provocar la muerte de las plagas. Los ejemplos de mutaciones que dan como resultado una mayor toxicidad pueden encontrarse en Schnepf et al. (1998) Microbio!. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Alternativamente, es posible introducir alteraciones a la secuencia de muchas proteínas en el término amino o carboxi sin afectar en forma sustancial la actividad. Estas pueden incluir inserciones, deleciones, o alteraciones introducidas por métodos moleculares modernos, como PCR, incluyendo amplificaciones por PCR que alteran o extienden la secuencia de codificación de la proteína en virtud de la inclusión de secuencias de codificación de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas agregadas pueden incluir secuencias de codificación de proteínas completas, como aquellas comúnmente utilizadas en el arte para generar fusiones de proteínas. Tales proteínas de fusión son a menudo utilizadas para (1 ) incrementar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática, o epitopo para facilitar la purificación de la proteína, detección de la proteína, u otros usos experimentales conocidos en el arte (3) secreción blanco o traducción de una proteína en un organelo subcelular, como el espacio periplásmico de las bacterias Gram-negativas, o el retículo endoplasmático de células eucarióticas, resultando éste último en la glicosilación de la proteína.

Las variantes de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la presente invención además comprenden secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos o recombinogénicos como barajado de ADN. Con este procedimiento, una o más regiones de codificación distintas de la proteína delta endotoxina pueden utilizarse para crear una nueva proteína delta endotoxina que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que poseen una identidad de secuencia sustancial y que pueden ser homólogamente recombinadas en vitro o en vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, es posible barajar los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés entre un gen de delta endotoxina de la invención y otros genes de delta endotoxina conocidos para obtener una nueva codificación genética para una proteína con una propiedad de interés mejorada, como una mayor actividad insecticida. Las estrategias para barajado de ADN son conocidas en el arte. Consultar, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri ef al. (1998) Nature 391.288-291 ; y Patentes Estadounidenses Números 5,605,793 y 5,837,458.

El intercambio o barajado de dominios es otro mecanismo para generar delta-endotoxinas alteradas. Los dominios II y III pueden ser intercambiados entre las proteínas delta endotoxinas, lo cual da como resultado toxinas híbridas o quiméricas con Una mejor actividad pesticida o espectro blanco. Los métodos de generación de proteínas recombinantes y ensayo de las mismas tendientes a evaluar la actividad pesticida son muy conocidos en el arte (consultar, por ejemplo, Naimov eí al. (2001 ) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de aagd ef al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge eí al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf eí al. (1990; J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang eí al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vectores Una secuencia de delta endotoxina de la invención puede ser provista en un cassette de expresión para la expresión en una planta de interés. La expresión "cassette de expresión en planta" hace referencia a una construcción de ADN que es capaz de da como resultado la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal.

Típicamente estos contienen un promotor y una secuencia de codificación. Con frecuencia, tales construcciones además contendrán una región 3' sin traducir. Tales construcciones pueden contener una "secuencia de señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte co-translacional o post-translacional del péptido a ciertas estructuras intracelulares como el cloroplasto (u otro plástido), el retículo endoplasmático, o el aparato de Golgi.

La expresión "secuencia de señal" hace referencia a una secuencia de la cual se sabe o sospecha que da como resultado el transporte de péptidos cotranslacional o post-translacional a través de la membrana celular. En 'los eucariotes, esto típicamente comprende la secreción en el aparato de Golgi, con algo de glicosilación resultante. La expresión "secuencia líder" hace referencia a cualquier secuencia que al ser traducida, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para disparar el transporte co-translacional de la cadena de péptidos a un organelo sub-celular. Así, esto incluye secuencias líderes orientadas al transporte y/o glicosilación por pasaje al retículo endoplasmático, pasaje a las vacuolas, plástidos que incluyen cloroplastos, mitocondrias y similares.

La expresión "vector de transformación vegetal" hace referencia a una molécula de ADN que es necesaria para una transformación eficiente de una célula vegetal. Esta molécula puede comprender uno o más cassettes de expresión vegetales, y puede organizarse en más de una molécula de ADN "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación vegetales que utilizan dos vectores de ADN no-contiguos para codificar todas las funciones cis- y trans- necesarias para la transformación de las células vegetales (Hellens and ullineaux (2000) Tren s in Plant Science 5:446-451 ). La palabra "vector" hace referencia a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferencia entre distintas células huéspedes. La expresión "vector de expresión" hace referencia a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias de ADN heterólogas o fragmentos en una célula extraña. El cassette incluirá secuencias regulatorias 5' y 3' operativamente unidas a una secuencia de la invención. La expresión "operativamente unidas" hace referencia a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en tanto la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. En general, operativamente unidas significa que las secuencias de ácidos nucleicos unidas son contiguas y, que cuando es necesario unen dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en el mismo cuadro de lectura. El cassette puede adicionalmente contener al menos un gen adicional a ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, el o los genes adicionales pueden ser provistos en múltiples cassettes de expresión.

La expresión "promotor" hace referencia a una secuencia de ácidos nucleicos que funciona, para dirigir la transcripción de una secuencia de codificación caudal abajo. El promotor junto con otras secuencias de ácidos nucleicos regulatorias transcripcionales y translacionales (también denominadas "secuencias de control") son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Se provee un cassette de expresión de este tipo con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de delta endotoxina bajo la regulación transcripcional de las regiones regulatorias.

El cassette de expresión incluirá en la dirección 5 -3' de transcripción, una región de iniciación transcripcional y translacional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación translacional o transcripcional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, al huésped vegetal y/o a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" o "homólogo" al huésped vegetal, se pretende que el promotor se encuentre en la planta nativa donde se introduce. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o natural para la secuencia de ADN operativamente unida de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN operativamente unida de interés, puede ser nativa con el huésped vegetal, o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de interés, el huésped vegetal, o cualquier combinación de los mismos). Las regiones de terminación convenientes se obtienen del plásmido-Ti de A. tumefaciens, como las . regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Consultar además, Guerineau ef al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141 -144; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991 ) Genes Dev. 5:141-149; Mogen ef al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe ef al. (1990) Gene 91 : 151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando resulte adecuado, el o los genes pueden ser optimizados para una mayor expresión en la célula huésped transformada. Es decir, los genes pueden ser sintetizados usando los codones preferidos de la célula huésped para una expresión mejorada, o pueden ser sintetizados usando codones a una frecuencia de uso de codones preferidos en el huésped. En general, el contenido GC del gen será incrementado. Consultar, por ejemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 donde se describe el uso de codones preferidos en el huésped. Se dispone en el arte de métodos para sinterizar genes preferidos por las plantas. Consultar, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Números 5,380,831 , y 5,436,391 , y Murray eí al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, que se incorpora a la presente como referencia.

En una realización, la delta endotoxina es dirigida al cloroplasto para la expresión. De este modo, cuando la delta endotoxina no es directamente insertada en el cloroplasto, el cassette de expresión contendrá además un ácido nucleico que codifique un péptido de tránsito para dirigir la proteína a los cloroplastos. Estos péptidos de tránsito son conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Von Heijne ef al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark ef al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer ef al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 ; y Shah ef al. (1986) Science 233:478-481.

El gen de delta endotoxina a ser dirigido al cloroplasto puede ser optimizado para la expresión en el cloroplasto con el fin de contemplar las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este organelo. De este modo, los ácidos nucleicos de interés pueden ser sintetizados usando codones preferidos por el cloroplasto. Consultar, por ejemplo, Patente Estadounidense Número 5,380,831 , que se incorpora a la presente como referencia.

Transformación de la planta Los métodos de la invención comprenden introducir una construcción de nucleótidos en una planta. La expresión "introducir" hace referencia a presentar a la planta la construcción de nucleótidos de manera que la construcción tenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren la utilización de un método específico de introducción de una construcción de nucleótidos a una planta, solamente que la construcción de nucleótidos tenga acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos de introducción de construcciones de nucleótidos en plantas son conocidos en el arte e incluyen, entre otros, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria, y métodos mediados por virus.

La expresión "planta" se refiere a plantas enteras, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de la misma. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callos, células de cultivos en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen).

Las expresiones "plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "establemente transformados" hace referencia a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácidos nucleicos o fragmentos de ADN exógenos en la célula vegetal. Estas secuencias de ácidos nucleicos incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal sin transformar. La expresión "heterólogas" en general hace referencia a las secuencias de ácidos nucleicos que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo donde están presentes, y que han sido incorporadas a la célula por infección, transfección, microinyección, electrof oración, microproyección, o similares.

Las plantas transgénicas de la invención expresan una o más de las secuencias pesticidas reveladas. En varias realizaciones, la planta transgénica además comprende uno o más genes adicionales que afecten la resistencia de los insectos, por ejemplo, uno o más genes adicionales tendientes a controlar plagas de coleópteros, lepidópteros, heterópteros, o nematodos. El experto en el arte entenderá que la planta transgénica puede comprender cualquier gen que imparta un rasgo agronómico de interés.

La transformación de las células vegetales puede lograrse mediante una de varias técnicas conocidas en el arte. El gen endotoxina de la presente puede ser modificado para obtener o mejorar la expresión en células vegetales. Típicamente, una construcción que exprese dicha protema contendría un promotor para impulsar la transcripción del gen, así como una región 3' sin traducir para permitir la terminación de la transcripción y poliadenilación. La organización de tales construcciones es muy conocida en el arte. En algunos casos, puede resultar de utilidad diseñar el gen de modo que el péptido resultante sea secretado, o de lo contrario dirigido dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede ser diseñado para contener un péptido de señal con el fin de facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplasmático. Asimismo puede ser conveniente diseñar el cassette de expresión vegetal de modo que contenga un intrón, de modo que se requiera el procesamiento de ARNm del intrón para la expresión.

Típicamente este "cassette de expresión vegetal" será insertado en un "vector de transformación vegetal". Este vector de transformación vegetal puede estar constituido por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación vegetal. Por ejemplo, constituye una práctica común en el arte utilizar vectores de transformación vegetales que están compuestos por más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores a menudo se, denominan en el arte "vectores binarios". Los vectores binarios así como los vectores con plásmidos colaboradores son utilizados en la mayor parte de los casos para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente es bastante importante, siendo conveniente la separación de funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios típicamente contienen un vector de plásmido que contiene secuencias de actuación cis- necesarias para la transferencia de ADN-T (como borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionado diseñado para ser capaz de expresión en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen diseñado para ser capaz de expresión en una célula vegetal de la cual se desea la generación de plantas transgénicas). Asimismo en este vector de plásmido se encuentran presentes secuencias necesarias para la replicación bacteriana. Las secuencias con actuación cis- están dispuestas para permitir una eficaz transferencia a las células vegetales y su expresión en ellas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen pesticida se disponen entre los bordes izquierdo y derecho. Con frecuencia un segundo vector de plásmido contiene los factores de trans-actuación que median la transferencia de ADN-T de Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por clivaje en secuencias borde y la transferencia de ADN mediada por vir, tal como se entiende en el arte (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451 ). Es posible utilizar varias cepas de Agrobacterium (por ejemplo LBA4404, GV3101 , EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de la planta. El segundo vector de plásmido no es necesario para la transformación de las plantas por otros métodos como microproyección, microinyección, electroforación, polietilen glicol, etc.

En general, los métodos de transformación de plantas comprenden transferir el ADN heterólogo a las células vegetales blanco (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos no diferenciados, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (de acuerdo al gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa de células sin transformar. Los éxplantos típicamente son transferidos a un suministro nuevo del mismo medio y cultivados de manera convencional. A continuación, las células transformadas son diferenciadas en brotes luego de colocarlas sobre medio de regeneración suplementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Los brotes luego son transferidos a un medio de radiculación selectivo para recuperar brotes o plántulas con raíz. La plántula transgénica luego crece hasta transformarse en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo Hiei eí al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantos son típicamente transferidos a un suministro nuevo del mismo medio y cultivados de manera convencional. Una descripción general de las técnicas y métodos de generación de plantas transgénicas se encuentra en Ayres and Park (1994) Critica! Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células, tanto células transformadas como sin transformar están presentes en cualquier porción del callo blanco o tejido o grupo de células. La capacidad para matar las células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da como resultado cultivos vegetales transformados. Con frecuencia, la capacidad de eliminar las células no transformadas es una limitación a una recuperación rápida de las células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar de acuerdo al tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, blanco de transformación. La generación de plantas transgénicas puede realizarse mediante uno de varios métodos, incluyendo, entre otros, microinyección, electroforación, transferencia de gen directa, introducción de ADN heterólogo por Agrobactenum en células vegetales (transformación mediada por Agrobactenum), bombardeo de células vegetales con ADN extraño heterólogo adherido a partículas, aceleración de partículas balística, transformación con haz en aerosol (Solicitud de Patente Estadounidense Publicada No. 20010026941; Patente Estadounidense Número 4,945,050; Publicación Internacional Número WO 91/00915; Solicitud de Patente Estadounidense Publicada No. 2002015066), transformación Lec1 , y varios otros métodos no mediados directamente con partículas para transferir ADN.

Los métodos de transformación de cloroplastos son conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Svab ef al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601 -606. El método se basa en la liberación mediante una pistola de partículas de ADN conteniendo un marcador seleccionable y la dirección del ADN al genoma del plástido por recombinación homologa. Adicionalmente, la transformación del plástido puede lograrse por transactivación de un transgen de plástido silencioso por expresión con preferencia de tejido de una polimerasa de ARN con codificación nuclear y dirigida al plástido. Este sistema ha sido reportado en McBride ef al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :7301 -7305.

Luego de la integración del ADN extraño heterólogo en las células vegetales, se aplica un nivel de umbral máximo de selección adecuada en el medio para matar las células sin transformar y separar y proliferar las células putativamente transformadas que sobreviven a partir de este tratamiento de selección por transferencia regular a un medio nuevo. Mediante el paso continuo y desafío con la selección adecuada, es posible identificar y proliferar las células que se han transformados con el vector de plásmido. Luego es posible aplicar métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que han sido transformadas pueden transformarse en plantas mediante métodos convencionales. Consultar, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden entonces crecer, y polinizar con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante tener la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga y herede en forma estable y luego cosecharse las semillas con el fin de asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada ha sido alcanzada. De este modo, la presente invención provee una semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") que posee una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un cassette de expresión de la invención, establemente incorporado a su genoma.

Evaluación de la Transformación de la Planta Luego de la introducción del ADN extraño heterólogo a las células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se conforma mediante varios métodos como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis PCR es un método rápido para clasificar las células transformadas, tejidos o brotes respecto de la presencia del gen incorporado en el estado temprano antes de trasplantar al suelo (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El análisis PCR se ejecutar usando primers de oligonucleótidos específicos para el gen de interés o background del vector de Agrobacterium, etc.

La transformación de la planta puede ser confirmada por análisis Southern blot del ADN genómico (Sambrook and Russell, 2001 , supra). En general, todo el ADN es extraído del transformante, digerido con enzimas de restricción adecuadas, fraccionado en un gel de agarosa y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon. La membrana o "blot" luego es sondeada con, por ejemplo, un fragmento de ADN blanco 32P radiomarcado para confirmar la integración del gen introducido al genoma de la planta de acuerdo a técnicas convencionales (Sambrook and Russell, 2001, supra).

En el análisis Northern blot, el ARN es aislado de tejidos específicos del transformante, fraccionado en un gel de agarosa con formaldehido, y transferido sobre un filtro de nylon de acuerdo a procedimientos convencionales que son rutinariamente aplicados en el arte (Sambrook and Russell, 2001, supra). Luego se prueba expresión de ARN codificado por la toxina por hibridación del filtro en una sonda radioactiva derivada de una toxina, a través de métodos conocidos en el arte (Sambrook and Russell, 2001 , supra).

Es posible realizar el análisis Western blot, ensayos bioquímicos y similares sobre las plantas transgénicas para confirmar la presencia de proteína codificada por el gen de delta endotoxina mediante procedimientos convencionales (Sambrook and Russell, 2001 , supra) usando anticuerpos que se unen a uno o más epitopos presentes en la proteína delta endotoxina.

Actividad pesticida en plantas En otro aspecto de la invención, es posible generar plantas transgénicas expresando una toxina que posea actividad pesticida. Los métodos antes descriptos a modo de ejemplo pueden ser utilizados para generar plantas transgénicas, pero la forma en la cual ello se realice no resulta crítica a los fines de la invención. Los métodos conocidos o descriptos en el arte como transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolistica, y métodos mediados no por partículas pueden ser usados a discreción del experimentador. Las plantas que expresan una delta-endotoxina pueden ser aisladas por métodos comunes descriptos en el arte, por ejemplo por transformación de callos, selección de callos transformados, y regeneración de plantas fértiles a partir de tales callos transgénícos. En este proceso, es posible usar cualquier gen como marcador seleccionable en la medida en que su expresión en las células vegetales confiera la capacidad de identificar o seleccionar las células transformadas.

Se ha desarrollado cierto número de marcadores para uso con células vegetales, como resistencia a cloranfenicol, el aminoglicósido G418, higromicina, o similares. Otros genes que codifican un producto que interviene en el metabolismo de cloroplastos también pueden ser utilizados como marcadores seleccionares. Por ejemplo, los genes que proveen resistencia a los herbicidas vegetales como glifosato, bromoxinilo, o imidazolinona pueden encontrar particular uso. Tales genes han sido reportados (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa con resistencia a bromoxinilo); y Sathasivan eí al. (1990) Nucí. Acids Res. 18:2188 (gen de resistencia a imidazolinona AHAS). Además, los genes revelados en la presente resultan de utilidad como marcadores para determinar la transformación de las células bacterianas o vegetales.

Los métodos para detectar la presencia de un transgen en una planta, órgano de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie de la misma son muy conocidos en el arte. En una realización, la presencia del transgen es detectada evaluando la actividad pesticida.

Las plantas fértiles que expresan una delta endotoxina pueden ser sometidas a ensayos de actividad pesticida, y las plantas que exhiban una actividad óptima seleccionada para su posterior cría. En el arte se dispone de métodos tendientes a evaluar la actividad insecticida. En general, la proteína es mezclada y usada en ensayos de alimentación. Consultar, por ejemplo Marrone ef al. ( 985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención puede ser utilizada para la transformación de especies vegetales, incluyendo, entre otras, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, entre otros, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, azafrán, maníes, batata, mandioca, café, coco, ananá, cítricos, cacao, té, banana, palta, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, castaña, macadamia, almendra, avenas, verduras, ornamentales, y coniferas.

Las verduras incluyen, entre otras, tomates, lechuga, porotos verdes, chauchas, arvejas, y miembros del género Curcumis como el pepino, melón, y cantalupo. Las ornamentales incluyen, entre otras, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, poinsettia, y crisantemo.

Preferentemente, las plantas de la presente invención son cultivos (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Uso en el control de pestes Los métodos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, en el control pesticida o en el desarrollo de otros organismos como agentes pesticidas son conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo la Patente Estadounidense Número 5,039,523 y EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, o los microorganismos que han sido genéticamente alterados para contener un gen pesticida y la proteína pueden usarse en la protección de cultivos agrícolas y productos contra las plagas. En un aspecto de la invención, células enteras, es decir, sin lisar de un organismo producto de toxina (pesticida) son tratadas con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula es aplicada al ambiente de la o las plagas blanco.

Alternativamente, el pesticida es producido introduciendo el gen de delta endotoxina en un huésped celular. La expresión del gen de delta endotoxina da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y mantenimiento del pesticida. En un aspecto de la presente invención, estas células luego son tratadas bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula es aplicada al ambiente de la o las plagas blanco. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estos pesticidas naturalmente encapsulados pueden entonces ser formulados de acuerdo a técnicas convencionales para su aplicación al ambiente que aloja una plaga blanco, por ejemplo, el suelo, agua, y el follaje de plantas. Consultar, por ejemplo EPA 0192319, y las referencias allí citadas. Alternativamente, es posible formular las células que expresan un gen de la presente invención para permitir la aplicación del material resultante como un pesticida.

Composiciones pesticidas Los ingredientes activos de la presente invención normalmente son aplicados en forma de composiciones y pueden ser aplicados al área de cultivo o la planta a tratar, simultáneamente o luego de otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, eliminadores de malezas, crioprotectores, surfactantes, detergentes, jabones insecticidas, aceites insecticidas, polímeros, y/o formulaciones portadoras de liberación prolongada o biodegradables que permiten una dosificación a largo plazo sobre un área dada luego de una sola aplicación de la formulación. Asimismo pueden ser herbicidas, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amoebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscocidas selectivos o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con portadores agrícolamente aceptables adicionales, surfactantes o adyuvantes estimuladores de la aplicación convencionalmente empleados en el arte de la formulación. Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias ordinariamente empleadas en la tecnología de la formulación, por ejemplo sustancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes incrementadores de la pegajosidad, aglutinantes o fertilizantes. De igual modo, las formulaciones pueden ser preparadas en "cebos" comestibles o diseñadas como "trampas" para plagas para permitir la alimentación o ingestión por parte de la plaga blanco de la formulación pesticida.

Los métodos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene por lo menos una de las proteínas pesticidas producida por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen aplicación al follaje, recubrimiento de semillas y aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infección por parte de plaga correspondiente.

La composición puede ser formulada como un polvo, harina, pellet, granulo, spray, emulsión, coloide, solución, o similar, y es posible prepararla por aplicación de métodos convencionales como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprenden el polipéptido. En todas estas composiciones que contienen por lo menos un polipéptido insecticida, el polipéptido puede estar presente en una concentración que oscila aproximadamente entre 1% y aproximadamente 99% en peso.

Los lepidópteros, coleópteros, o nematodos pueden ser eliminados o reducidos en número en un área dada por los métodos de la invención, o es posible la aplicación profiláctica a un área para impedir la infección por una plaga susceptible. Preferentemente, la plaga ingiere, o se pone en contacto con una cantidad efectiva desde el punto de vista pesticida del polipéptido. La expresión "cantidad efectiva desde el punto de vista pesticida" se refiere a una cantidad del pesticida capaz de ocasionar prácticamente la muerte de por lo menos una plaga, o reducir en forma notable el crecimiento de la plaga, su alimentación, o desarrollo fisiológico normal. Esta cantidad dependerá de factores tales como, por ejemplo, las plagas específicas a controlar, el ambiente, localización, planta, cultivo, o sitio agrícola a tratar, las condiciones ambientales, y el método, tasa, concentración, estabilidad, y cantidad de aplicación de la composición de polipéptido efectiva desde el punto de vista pesticida. Las formulaciones también pueden variar con relación a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales, y/o frecuencia de aplicación y/o severidad de la infección con la plaga.

Las composiciones pesticidas descriptas pueden ser preparadas formulando la célula bacteriana, cristal y/o suspensión de esporas, o componente de proteína aislada con el portador agrícolamente aceptable deseado. Las composiciones pueden ser formuladas antes de la administración en un medio adecuado como liofilizado, secado por congelamiento, desecado, o en un portador, medio o diluyente acuoso adecuado, como una solución salina u otro buffer. Las composiciones formuladas pueden adoptar la forma de un polvo o material granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o de emulsiones en agua o aceite/agua, o de polvo humectable, o combinadas con cualquier otro material portador adecuado para aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son muy conocidos en el arte. La expresión "portador aceptable desde el punto de vista agrícola" cubre a todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, surfactantes, agentes incrementadores de la pegajosidad, aglutinantes, etc. comúnmente usados en la tecnología de formulación de pesticidas; estos son muy conocidos por los expertos en el arte de la formulación de pesticidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y preparadas de diferentes formas, por ejemplo, mezclando homogéneamente, combinando y/o moliendo la composición insecticida con adyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y métodos de aplicación adecuados están descriptos en la Patente Estadounidense Número 6,468,523, que se incorpora a la presente como referencia.

Las plantas también pueden ser tratadas con una o más composiciones químicas, que incluyen uno o más herbicidas, insecticidas, o fungicidas. Los ejemplos de composiciones químicas incluyen: Herbicidas para Frutas/Verduras: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzin, Simazina, Trifluralin, Fluazifop, Glufosinato, Halosulfuron Gowan, Paraquat, Propyzamida, Setoxidim, Butafenacil, Halosulfuron, Indaziflam; Insecticidas para Frutas/Verduras: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbarilo, Carbofuran, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrin/beta-ciflutrin, Esfenvalerato, Lambda-cihalotrin, Acequinocilo, Bifenazato, etoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefuran, Fluacripirim, Tolfenpirad, Clotianidin, Spirodiclofen, Gamma-cihalotrin, Espiromesifen, Espinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Spinoteram, Triflumuron.Spirotetramat, Imidacloprid, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofen, Cianopirafen, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Espinotoram, Tiodicarb, Flonicamid, etiocarb, Emamectina-benzoato, Indoxacarb, Foztiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifen, Fenbutatin-oxid, Hextiazox, Metomilo, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino] furan-2(5H)-ona; Fungicidas para Frutas/Verduras: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Azufre, Tiofanate-metil, Azoxistrobin, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetilo, Iprodiona, Kresoxim-metilol, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobin, Etaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobin, Fenhexamid, Oxpoconazol fumarato, Ciazofamid, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobin, Piraclostrobin, Ciflufenamid, Boscalid; Herbicidas para Cereales: Isoproturon, Bromoxinilo, loxinilo, Fenoxis, Clorsulfuron, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluroxipir, Metsulfuron, Triasulfuron, Flucarbazona, lodosulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafen, esosulfuron, Beflubutamid, Pinoxaden, Amidosulfuron, Thifensulfuron, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfosulfuron, Pyrasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxasulfon; Fungicidas para Cereales: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobin, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazole, Kresoxim-metilo, Quinoxifen, Tebuconazol, Trifloxistrobin, Simeconazol, Picoxistrobin, Piraclostrobin, Dimoxistrobin, Protioconazol, Fluoxastrobin; Insecticidas para Cereales: Dimetoato, Lambda-cihaltrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, ß-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid. Acetamiprid, Dinetofuran, Clorfrifos, Metamidofos, Oxidemeton-metilo, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas para el Maíz: Atrazina, Alaclor, Bromoxinilo, Acetoclor, Dicamba, Clopiralid, (S-)Dimetenamid, Glufosinato, Gliposáto, Isoxaflutol, (S-)Metolaclor, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfon; Insecticidas para el Maíz: Carbofuran, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprid, Lambda-Cihalotrina, Teflutrina, Terbufos, Thiametoxam, Clotianidina, Spiromesifen, Flubendiamida, Triflumuron, Riynaxipir, Deltametrina, Tiodicarb, ß-Cflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina.Tebupirimfos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Avermectina, etiocarb, Spirodiclofen, Spirotetramat; Fungicidas para el Maíz: Fenitropan, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobin; Herbicidas para el Arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cihalofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazosulfuron, efenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofan, Flufenacet, Fentrazamida, Halosulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalid, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargilo, Etoxisulfuron, Pretilaclor, Mesotrione, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfan; Insecticidas para el Arroz: Diazinon, Fenitrotion, Fenobucarb, Monocrotofos, Benfuracarb, Buprofezin, Dinotefuran, Fipronil, Imidacloprid, Isoprocarb, Tiacloprid, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefuran, Clotianidina, Etiprole, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprid, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Emamectina-Benzoato, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan- 2(5H)-ona, Carbofuran, Benfuracarb; Fungicidas para el Arroz: Tiofanato-metilo, Azoxistrobin, * Carpropamid, Edifenfos, Ferimzona, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Pyroquilon, Triciclazole, Trifloxistrobin, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas para el Algodón: Diuron, Fluometuron, MS A, Oxifluorfen, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butilo, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac-sódico, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron; Insecticidas para el Algodón: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofos, Abamectina, Acetamiprid, Emamectina Benzoato, Imidacloprid, Indoxacarb, Lambda-Cihalotrina, Espinosad, Tiodicarb, Gamma-Cihalotrina, Espiromesifen, Piridalilo, Flonicamid, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, gamma Cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalylo, Espiromesifen, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endosulfan; Fungicidas para el Algodón: Etridiazol, Metalaxilo, Quintozeno; Herbicidas para la Soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron-Etilo, Cloransulam-Metilo, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzin, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Insecticidas para la Soja: Lambda-cihalotrina, Metomilo, Paration, Tiocarb, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Emamectina-Benzoato, Fipronil, Etiprole, Deltametrina, ß-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramat, Espinodiclofen, Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrina; Fungicidas para la Soja: Azoxistrobin, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobin, Tebuconazol, Trifloxistrobin, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas para la Remolacha: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralid, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfuron, Tepraloxidim, Quizalofop; Insecticidas para la Remolacha: Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Deltametrina, fl-Ciflutrina, gamma/lambda Cihalotrina, 4-[[(6-Clorp¡ridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofuran; Herbicidas para Cañóla: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralin Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas para Cañóla: Azoxistrobin, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolin; Insecticidas para Cañóla: Carbofuran, Organofosfatos, Piretroides, Tiacloprid, Deltametrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofuran, ß-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Espinosad, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.

La expresión "plaga" incluye, entre otros, insectos, hongos, bacterias, nemátodos, ácaros, garrapatas, y similares. Los insectos incluyen aquellos seleccionados de los órdenes Coleópteros, Dípteros, Himenópteros, Lepidópteros, Malófagos, Homeópteros, Hemípteros, Ortópteros, Tisanópteros, Dermápteros, Isópteros, Anopluros, Sifonápteros, Tricópteros, etc., particularmente Coleópteros, Lepidópteros, y Dípteros.

El orden Coleópteros incluye los subórdenes Adéfagos y Polífagos. El suborden Adéfagos incluye las superfamilias Caraboideos y Girinoideos, mientras que el suborden Polífagos incluye las superfamilias Hidrofiloideos, Estafilinoideos, Cantaroideos, Cleroideos, Elateroideos, Dasciloideos, Driopoideos, Birroideos, Cucujoideos, Meloideos, Mordeloideos, Tenebrionoideos, Bostricoideos, Scarabaoideos, Cerambicoideos, Crisomeloideos, y Curculionoideos. La superfamilia Caraboideos incluye las familias Cicindelidos, Carábidos, y Ditiscidos. La superfamilia Girinoideos incluye la familia Girinidos. La superfamilia Hidrofiloideos incluye la familia Hidrofílidos. La superfamilia Estafilinoideos incluye las familias Sílfidos y Estafilínidos. La superfamilia Cantaroideos incluye las familias Cantáridos y Lampíridos. La superfamilia Cleroideos incluye las familias Cléridos y Derméstidos. La superfamilia Elateroideos incluye las familias Elateridos y Buprestidos. La superfamilia Cucujoideos incluye la familia Cocinelidos. La superfamilia Meloideos incluye la familia Meloidos. La superfamilia Tenebrionoideos incluye la familia Tenebriónidos. La superfamilia Scarabaeoideos incluye las familias Pasálidos y Scarabaeidos. La superfamilia Cerambicoideos incluye la familia Cerambícidos. La superfamilia Crosomeloideos incluye la familia Crisomélidos. La superfamilia Curculionoideos incluye las familias Curculiónidos y Scolitidos.

El orden Dípteros incluye los Subórdenes Nematóceros, Braquíceros, y Ciclórrafos.. El suborden Nematóceros incluye las familias Tipúlidos, Psicólidos, Culícidos, Ceratopogónidos, Quironómidos, Simúlidos, Bibiónidos, y Cecidómidos. El suborden Braquíceros incluye las familias Estratiómidos, Tabánidos, Terévidos, Asilidos, Mldidos, Bombílidos, y Dolicópodidos. El suborden Ciclórrafos incluye las Divisiones Aschiza y Aschiza. La División Aschiza incluye las familias Fóridos, Sírfidos, y Conópidos. La División Aschiza incluye las Secciones Acaliptratados y Caliptrataos. La Sección Acaliptratados incluye las familias Otíttdos, Tefritidos, Agromízidos, y Drosofílidos. La Sección Caliptrátados incluye las familias Hípobóscidos, Oéstridos, Taquínidos, Antomíidos, Múscidos, Califóridos, y Sarcofágidos.

El orden Lepidópteros incluye las familias Papiliónidos, Piéridos, Licaénidos, Ninfálidos, Danaidos, Satírídos, Hesperíidos, Esfingidos, Saturníidos, Geométridos, Arctiidos, Noctúidos, Limantriidos, Sesíidos, y Tinéidos.

Los nemátodos incluyen nemátodos parasíticos como nematodos formadores de nudos en la raíz, quiste, y de la lesión, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; particularmente elementos de los nemátodos quiste, que incluyen, entre otros, Heterodera glycines (nemátodos del quiste de la soja); Heterodera schachtii (nemátodos del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nemátodos del quiste de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nemátodos del quiste de la papa). Los nemátodos de la lesión incluyen Pratylenchus spp.

Las plagas de insectos de la invención para los cultivos principales incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis. Taladro del maíz europeo; Agrotis ípsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano cogollero del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano soldado de otoño; Diatraea grandiosella, taladro del maíz del sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Diatraea saccharalis, taladro de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos de alambre; Cyclocephala borealis, escarabajo enmascarado del norte (larva blanca); Cyclocephala immaculata, escarabajo enmascarado del sur (larva blanca); Popillia japónica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, escarabajo del maíz; Rhopalosiphum maidis, áfido de la hoja del maíz; Anuraphis maidiradicis, áfido de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Agromyza parvicornis, minador de la hoja del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de la hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, acaro araña de dos manchas; Sorgo: Chilo partellus, taladro del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano soldado de otoño; Helicoverpa zea, gusano cogollero del maíz; Phyllofagos crinita, larva blanca; Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer; Feltia subterránea, granúlate cutworm; Phyllophaga crinita, larva blanca; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., gusanos del alambre; Oulema melanopus, escarabajos de la hoja del cereal; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz Sphenophorus maidis, escarabajo del maíz; Rhopalosiphum maidis, áfido de la hoja del maíz; Sipha flava, áfido amarillo de la caña de azúcar del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, escarabajo chinche; Contarinia sorghicola, mosca del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, acaro araña carmín; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas: Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano soldado; Spodoptera frugiperda, gusano soldado de otoño; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador del oeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja del cereal; Hypera punctata, gorgojo del trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; áfido del trigo Ruso; Sc izaphis graminum, escarabajo verde; Macrosiphum avenae, áfido del grano Inglés; Melanoplus femurrubrum, langosta de patas rojas; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Mayetiola destructor, Mosca de Hess; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, gusano del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca del tallo del trigo; /Acería tulipae, ácaro del enrulado del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla del capullo del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtlana, mosquito de la semilla de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano cogollero del algodón; Helicóverpa zea, gusano de la cápsula del algodón; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano cogollero rosado; Anthonomus grandis, gorgojo cogollero; Aphis gossypii, áfido del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulga del algodón; Trialeurodes abutilones, mosca blanca de alas rayadas; Lygus lineolaris, escarabajo de planta manchado; Melanoplus femurrubrum, langosta de patas rojas; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cihnabarinus, ácaro araña carmín; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas; Arroz: Diatraea saccharalis, taladro de la caña de azúcar, Spodoptera frugiperda, gusano soldado del otoño; Helicóverpa zea, gusano cogollero del maíz; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo de agua del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, langosta del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, escarabajo chinche; Acrosternum hilare, chinche verde; Soja: Pseudoplusia includens, oruga de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga de las leguminosas; Plathypena scabra, gusano verde de la soja; Ostrinia nubilalis, taladro del maíz Europeo; Agrotis ípsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Heliothis virescens, gusano cogollero; Helicóverpa zea, gusano cogollero del maíz; Epilachna varivestis, escarabajo del frijol Mexicano; Myzus persicae, áfido del durazno verde; Empoasca fabae, langosta de la papa; Acrosternum hilare, escarabajo verde; Melanoplus femurrubrum, langosta de patas rojas; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, ácaro araña de la frutilla; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas; Cebada: Ostrinia nubilalis, taladro del maíz Europeo; Agrotis ípsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, escarabajo verde; Blissus leucopterus leucopterus, escarabajo chinche; Acrosternum hilare, chinche verde; Euschistus servus, chinche marrón; Delia platura, gusano de la semilla del maíz; Mayetiola destructor, mosca de Hess; Petrobia latens, ácaro del trigo marrón; Colza: Brevicoryne brassicae, áfido de la col; Phyllotreta cruciferae, Escarabajo pulga; Mamestra configurata, gusano soldado Bertha; Plutella xylostella, polilla dorso de diamante; Delia ssp., gusanos de la raíz.

Métodos para incrementar el rendimiento vegetal Se proveen métodos para incrementar el rendimiento vegetal. Los métodos comprenden proveer a una planta o célula vegetal que expresa un polinucleótido que codifica la secuencia de polipéptidos pesticida de la presente y dejar crecer la planta o una semilla de la misma en un campo infectado con una plaga contra la cual dicho polipéptido ejerce actividad pesticida. En algunas realizaciones, el polipéptido ejerce actividad pesticida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros, o nemátodos, y dicho campo está infectado con una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros, o nemátodos.

De acuerdo a la presente, el término "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. El término "biomasa" se refiere a cualquier producto de la planta medido. Un incremento en la producción de biomasa constituye una mejora en el rendimiento del producto medido de la planta. El incremento del rendimiento de la planta tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de hojas de la planta puede aumentar la producción de vegetales de hoja para consumo humano o animal. Adicionalmente, el incremento de la biomasa de hojas puede utilizarse para incrementar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento del rendimiento puede comprender cualquier incremento estadísticamente significativo que incluye, entre otros, por lo menos 1% de aumento, por lo menos un 3% de aumento, por lo menos un 5% de aumento, por lo menos un 10% de aumento, por lo menos un 20% de aumento, por lo menos un 30%, por lo menos un 50%, por lo menos un 70%, por lo menos un 100% o un aumento mayor en el rendimiento respecto de una planta que no exprese la secuencia pesticida.

En ciertos métodos, el rendimiento de la planta se incrementa como resultado de una mejorada resistencia a -las plagas de una planta que expresa una proteina pesticida revelada en la presente. La expresión de la proteína pesticida da como resultado una menor capacidad de la plaga para infectar o alimentarse de la planta, mejorando así el rendimiento.

Los siguientes ejemplos tienen carácter ilustrativo y no limitan el modo alguno el invento. Experimental Ejemplo 1. Descubrimiento de nuevos genes toxinas de la cepa de Bacillus thuringiensis ATX15903 Se identifican nuevos genes pesticidas a partir de las cepas bacterianas descriptas en la presente usando métodos como: Método 1 • Preparación de ADN extra cromosómico de la cepa, que incluye plásmidos que típicamente albergan genes de delta endotoxina.

• Corte mecánico o enzimático del ADN extra cromosómico para generar fragmentos distribuidos por tamaño.

• Clonación de fragmentos de ~2 Kb a -10 Kb de ADN extra cromosómico.

• Producción de -1500 clones del ADN extra cromosómico.

• Secuenciado parcial de los 1500 clones usando primers específicos al vector de clonación (lecturas de extremos) • Identificación de genes de toxina putativos por análisis de homología mediante el enfoque MiDAS (conforme se describe en la Publicación de Patente Estadounidense Nro. 20040014091, que se incorpora por completo a la presente como referencia) • Terminación de la secuencia ("walking") de clones que contienen fragmentos de los genes toxina putativos de interés.

Método 2 • Preparación de ADN extra cromosómico de la cepa (que contiene una mezcla de algunos o todos los siguientes: plásmidos de varios tamaños; cromosomas fagos; fragmentos de ADN genómico no separados por el protocolo de purificación; otras moléculas extra cromosómicas sin caracterizar.

Corte mecánico o enzimático del ADN extra cromosómico para generar fragmentos distribuidos por tamaño.

Secuenciado del ADN fragmentado por métodos de piro-secuenciado de alto rendimiento.

Identificación de genes de toxina putativos por homología y/u otros análisis computacionales.

Tabla 1. Nuevos genes pesticidas de la Cepa ATX15903 Ejemplo 2. Expresión en Bacillus El gen insecticida revelado en la presente es amplificado por PCR a partir de pAX980, y el producto de PCR es clonado en el vector de expresión de BacHIus pAX9l6, u otro vector adecuado, a través de métodos conocidos en el arte. La cepa de BacHIus resultante, que contiene el vector con el gen axmi es cultivada en un medio de crecimiento convencional, como medio CYS (10 g/l Bacto-casitona; 3 g/l extracto de levadura; 6 g/l KH2P04; 14 g/l K2HP04; 0.5 mM gS04; 0.05 mM MnCI2; 0.05 mM FeS04), hasta que la esporulación resulte evidente al examen microscópico. Se preparan las muestras que son testeadas en cuanto a su actividad en bioensayos.

Ejemplo 3. Construcción de secuencias sintéticas En un aspecto de la invención, se generaron secuencias de axmi sintéticas. Estas secuencias sintéticas poseen una secuencia de ADN alterada con relación a la secuencia toxina axmi, y codifican una proteína que es colineal con la toxina axmi a la cual corresponde, pero carece del "dominio cristal" C-terminal presente en muchas proteínas delta-endotoxinas. Los genes sintéticos se listan en la Tabla 2.

Tabla 2 Nombre del gen natural Nombre del gen sintético Id. de Sec. Nro.: axm¡077bv01 25 axmi077 axmi077bv02 26 axmi078bv01 27 axm¡078 axmi078bv02 28 axmi083_1 bv01 29 axmi083_1 bv02 30 axmi083 axmi083_2bv01 31 axmi083_2bv02 32 axm¡085bv01 33 axm¡085 axmi085bv02 34 axm¡089bv01 35 axmi089 axmi089bv02 36 axmi094bv01 37 axm¡094 axmi094bv02 38 axmi095bv01 39 axm¡095 axmi095bv02 40 axm¡105bv01 41 axmi105 axm¡ 05bv02 42 axmi106bv01 43 axmi106 axmi106bv02 44 En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de genes sintéticos de manera que el péptido resultante esté dirigido a un organelo de la planta, como el retículo endoplasmático o el apoplasto. Las secuencias de péptidos que dirigen las proteínas de fusión a organelos de la planta son conocidas en el arte. Por ejemplo, la región N-terminal del gen de fosfatasa ácida de Lupín Blanco Lupinus albus (Genebank ID Gl:14276838; Miller ef al. (2001 ) Plant Physiology 127: 594-606) es conocida en el arte por dirigir al retículo endoplasmático proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante además contiene una secuencia de retención endoplasmática que comprende el péptido N-término-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL" (ID. de SEC. Nro.: 45) en el C-término, la proteína de fusión será dirigida al retículo endoplasmático. Si la proteína de fusión carece de una secuencia que la dirija al retículo endoplasmático en el C-término, la proteína será dirigida al retículo endoplasmático pero en última instancia quedará secuestrada en el apoplasto.

Ejemplo 4. Ensayos de actividad pesticida La capacidad de una proteína pesticida de actuar como un pesticida sobre una plaga a menudo es evaluada de distintas formas. Una manera muy conocida en el arte consiste en realizar un ensayo de alimentación. En este ensayo de alimentación, uno expone la plaga a una muestra que contiene los compuestos a probar, o muestras de control. Con frecuencia esto se ejecuta colocando el material a probar, o una dilución adecuada de este material, sobre un material que la plaga ingerirá, como una dieta artificial. El material a probar puede estar compuesto de un líquido, sólido, o pasta. El material a testear puede ser colocado sobre la superficie y luego se deja secar. Alternativamente, el material a testear puede mezclarse con una dieta artificial fundida, luego colocado en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, plato, o una cavidad de una placa de microtitulación.

Los ensayos sobre plagas chupadoras (por ejemplo, áfidos) pueden comprender la separación del material de ensayo del insecto mediante una división, idealmente una porción que pueda ser perforada por la boca chupadora del insecto, para permitir la ingestión de dicho material de ensayo. A menudo el material de ensayo se mezcla con un estimulante de la alimentación, como sucrosa, al efecto de estimular la ingestión del compuesto de ensayo.

Otros tipos de ensayos pueden incluir la microinyección del material de ensayo en la boca, o el intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido por un ensayo de la habilidad de la plaga para alimentarse de ella. El ensayo sobre la planta puede comprender el aislamiento de partes de la planta normalmente consumidas, por ejemplo, pequeñas jaulas fijadas a una hoja, o el aislamiento de las plantas enteras en jaulas que contengan los insectos.

Otros métodos y enfoques para realizar ensayos sobre plagas son conocidos en el arte y pueden encontrarse, por ejemplo, en Robertson, J. L. & H. K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, Boca Ratón, FL Alternativamente, los ensayos son comúnmente descriptos en las revistas "Arthropod Management Tests" y "Journal of Economic Entomology" o es posible obtener información de los miembros de la Entomological Society of America (ESA).

Ejemplo 5. Vectorización de los genes pesticidas de la invención para la expresión en plantas Cada una de las regiones de codificación de los genes de la invención se conectan independientemente con secuencias promotoras y terminadoras adecuadas para la expresión en plantas. Estas secuencias son muy conocidas en el arte y pueden incluir el promotor actina del arroz o el promotor ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor Arabidopsis UBQ3 o el promotor CaMV 35S para la expresión en dicotiledóneas, y los terminadores nos o Pinll. Las técnicas para producir y confirmar las construcciones de promotor -gen - terminador también son muy conocidas en el arte.

Ejemplo 6. Transformación mediada por Agrobacteríum de los genes de la invención en células de plantas Las espigas se recogen luego de 8-12 días de la polinización. Los embriones son aislados de las espigas, y aquellos embriones de 0.8-1.5 mm de tamaño son usados para la transformación. Los embriones son colocados en placas con el escutelo hacia arriba sobre un medio de incubación adecuado, e incubados durante la noche a 25°C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche. Los embriones son puestos en contacto con una cepa de Agrobacteríum que contiene los vectores adecuados para la transferencia mediada por plásmido Ti por espacio de 5-10 min, y luego colocados en placas sobre medio de co-cultivo por espacio de 3 días (25°C en la oscuridad). Luego del co-cultivo, los explantos son transferidos a medio de período de recuperación por espacio de cinco días (a 25°C en la oscuridad). Los explantos son incubados en medio de selección por espacio de hasta ocho semanas, de acuerdo a la naturaleza y características de la selección en particular utilizada. Luego del período de selección, el callo resultante es transferido a medio de maduración de embriones, hasta observar la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes luego son colocados bajo luz baja, y el proceso de regeneración es iniciado según se conoce en el arte. Los brotes resultantes se dejan echar raíz en medio de radiculación, y las plantas resultantes son transferidas a macetas para viveros y propagadas como plantas transgénicas.

Ejemplo 7. Transformación de Células de Maíz con los genes pesticidas de la invención Se recogen espigas de maíz luego de 8-12 días de la polinización. Los embriones son aislados de las espigas, y aquellos embriones de 0.8-1.5 mm de tamaño son usados para la transformación. Los embriones son colocados en placas con el escutelo hacia arriba sobre , un medio de incubación adecuado, como DN62A5S (3.98 g L N6 Sales; 1 mUL (de 1000x Stock) N6 Vitaminas; 800 mg/L L-Asparagina; 100 mg/L Mío-inositol; 1.4 g/L L-Prolína; 100 mg/L Casaminoácidos; 50 g/L sucrosa; 1 mL/L (de 1 mg/mL Madre) 2,4-D), y se incuban durante la noche a 25°C en la oscuridad.

Los explantos resultantes son transferidos a cuadrados de malla (30-40 por placa), transferidos sobre medio osmótico por espacio de 30-45 minutes, luego transferidos a una placa de "radiculación" (consultar, por ejemplo, Publicación por el PCT Nro. WO/0138514 y la Patente Estadounidense Número 5,240,842).

Las construcciones de ADN diseñadas para expresar los genes de la invención en células vegetales son acelerados en el tejido vegetal usando un acelerador con haz en aerosol, usando las condiciones esencialmente descriptas en la Publicación por el PCT Nro. WO/0138514. Luego del tratamiento, los embriones son incubados por espacio de 30 minutos en medio osmótico, luego colocados sobre medio de incubación durante la noche a 25°C en la oscuridad. Para evitar daños indebidos en los explantos, son incubados por espacio de por lo menos 24 horas antes de la transferencia al medio de recuperación. Los embriones luego son diseminados en medio de período de recuperación, por espacio de 5 días, 25°C en la oscuridad, posteriormente transferidos a un medio de selección. Los explantos son incubados en medio de selección durante hasta ocho semanas, de acuerdo a la naturaleza y características de la selección en particular utilizada. Luego del período de selección, el callo resultante es transferido a medio de maduración de embriones, hasta observar la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes luego son colocados bajo luz baja, y el proceso de regeneración es iniciado según se conoce en el arte. Los brotes resultantes se dejan echar raíz en medio de radiculación, y las plantas resultantes son transferidas a macetas para viveros y propagadas como plantas transgénicas.

Material Medio DN62A5S Se ajusta el pH de la solución a 5.8 con 1 N KOH/1 N KCI, se agrega Gelrite (Sigma) a 3g/L, y se coloca en autoclave. Luego de enfriar a 50°C, se agregan 2 ml/L de una solución madre de 5 mg/ml de Nitrato de Plata (Phytotechnology Labs). La receta arroja aproximadamente 20 placas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria son indicativas del nivel de la técnica al cual la presente invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan a la presente como referencia como si cada una de ellas fuese específica e individualmente indicada como incorporada en calidad de referencia.

No obstante la invención precedénte ha sido descripta con cierto nivel de detallé a modo ilustrativo y de ejemplo al efecto de permitir un mejor entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden llevarse a la práctica dentro del alcance de las reivindicaciones que se acompañan.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con actividad pesticida, en tanto dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo integrado por: a) la secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las ID. de Sec. Nro.: 1 -12; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee al menos 95% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24.

2. La molécula de ácido nucleico recombinante de la Reivindicación 1 , en la cual dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta.

3. La molécula de ácido nucleico recombinante de la Reivindicación 2, en la cual dicha secuencia está establecida en cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 25-44.

4. La molécula de ácido nucleico recombinante de la Reivindicación 1 , en la cual dicha secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en una célula de planta.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1.

6. El vector de la Reivindicación 5, que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

7. Una célula huésped que contiene el vector de la Reivindicación 5.

8. La célula huésped de la Reivindicación 7 la cual es una célula huésped bacteriana.

9. La célula huésped de la Reivindicación 7 la cual es una célula de planta.

10. Una planta transgénica que comprende la célula huésped de la Reivindicación 9.

11. La planta transgénica de la Reivindicación 10, la cual es seleccionada del grupo integrado por maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza.

12. Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1.

13. Un polipéptido recombinante con actividad pesticida, seleccionado del grupo integrado por: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee al lo menos 95% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24; y c) un polipéptido codificado por cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 1-12.

14. El polipéptido de la Reivindicación 13 que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.

15. Una composición que comprende el polipéptido recombinante de la Reivindicación 13.

16. La composición de la Reivindicación 15, la cual es seleccionada del grupo integrado por un polvo, harina, pellet, gránulo, spray, emulsión, coloide, y solución.

17. La composición de la Reivindicación 15, la cual es preparada por desecación, liofilización, homogeneizacion, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células de bacterianas.

18. La composición de la Reivindicación 15, que comprende aproximadamente entre 1% y aproximadamente 99% en peso de dicho polipéptido.

19. Un método de control de una población de plagás de lepidópteros, coleópteros, heterópteros, nemátodos, o dípteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad efectiva desde el punto de vista pesticida del polipéptido de la Reivindicación 13.

20. Un método para matar una plaga de lepidópteros, coleópteros, heterópteros, nemátodos, o dípteros que comprende poner en contacto dicha plaga, o alimentar dicha plaga, con una cantidad efectiva desde el punto de vista pesticida del polipéptido de la Reivindicación 13.

21. Un método de producción de un polipéptido con actividad pesticida, que comprende cultivar la célula huésped de la Reivindicación 7 bajo condiciones en las cuales la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido se expresa.

22. Una planta que posee establemente incorporada a su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con actividad pesticida, en la cual dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo integrado por: a) la secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las ID. de Sec. Nro.:1-12; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee al menos 95% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24; en tanto dicha secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión de una secuencia de codificación en una célula de planta.

23. La planta de la Reivindicación 22, la cual es una célula de planta.

24. Un método de protección de una planta contra una plaga, que comprende expresar en una planta o célula de la misma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido pesticida, en el cual dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo integrado por: a) la secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las ID. de Sec. Nro.: 1-12; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee al menos 95% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24.

25. El método de la Reivindicación 24, en el cual dicha planta produce un polipéptido pesticida con actividad pesticida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, heterópteros, nemátodos, o dípteros.

26. Un método para incrementar el rendimiento de una planta que comprende cultivar en un campo una planta o una semilla de la misma que posee incorporada establemente en su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con actividad pesticida, en el cual dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo integrado por: a) la secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las ID. de Sec. Nro.:1-12; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee al menos 95% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. Nro.: 13-24; en tanto dicho campo está infectado con una plaga contra la cual dicho polipéptido ejerce actividad pesticida.