CN102363631B

CN102363631B - 一种杀虫Bt蛋白Cry8Qa1、其编码基因及应用

Info

Publication number: CN102363631B
Application number: CN 201110352074
Authority: CN
Inventors: 郑爱萍; 李平; 唐裕杰; 朱军; 王世全; 邓其明; 李双成; 王玲霞; 刘怀年
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2011-11-09
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2031-11-09
Also published as: CN102363631A

Abstract

本发明提供了一种新的Bt蛋白Cry8Qa1及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。本发明提供的Bt蛋白Cry8Qa1可以用于制备Bt杀虫剂，编码该蛋白的基因可以转化粮食、棉花、油料、蔬菜，以及其他经济作物、花卉、草坪等多种植物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

一种杀虫Bt蛋白Cry8Qa1、其编码基因及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的杀虫Bt蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。农业类害虫主要集中在鳞翅目与同翅目之中，鞘翅目金龟甲总科内部分昆虫，如蛴螬，也是重要的世界性分布地下害虫，危害双子叶和单子叶粮食作物、多种蔬菜、油料、芋、棉、牧草以及花卉和果、林等播下的种子及幼苗，并且为害期长，从播种到收获均能为害，造成缺苗断垄，甚至绝收，还会影响品质。大量调查表明，蛴螬在地下害虫中为害居首位，占总地下害虫量的70-80％上。主要有暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela Motschulsky)、华北大黑鳃金龟(Holotrichiaoblita faldermann)、铜绿丽金龟(Anomala carpulenta Motsch)等，在我国华北地区如河北、山东等地危害较为严重。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididalcrystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，该蛋白对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了470多种ICPs的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N.，et al.Microbiol Mol BiolRev，1998，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。迄今发现的对蛴螬具有杀虫活性的Bt基因主要有cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等类基因(Shu C.，et al.2009.CurrentMicrobiology，58(4)：389-392.)，其中研究最多的是cry8类基因，cry8类基因由1160-1210个氨基酸组成，分子量为128-137kDa，对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有特异的杀虫活性(Crickmore N.，et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev，62：807-813)。1992年，Ohba等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(Bt.subsp.japonensis BuiBui)(Ohba M etal.，1992.Letters in Applied Microbiology，14：54-57)，1994年从中克隆了一种新的杀虫基因cry8Ca(Sato R.，et al.1994.Curr.Microbiol.28：15-19)。美国Mycogen公司从Bt菌株PS50C分离的Cry8Aa1和Cry8Ba1对花金龟Cotinis sp有明显的杀虫活性(US Patent5554534)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基因，发现对马铃薯甲虫，西方玉米根叶甲，南方玉米根叶甲具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad，et al.2002.WO 02/34774 A2)。在我国，河北省农科院植保所和河北农业大学近年先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(A.exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta)的幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株，室内生测死亡率均达100％(冯书亮等.2000.一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株.中国生物防治，16(2)：74-78)。2004年中国农业科学院植物保护所Bt185分离了一株对暗黑鳃金龟幼虫高效(LC50，0.94cfu/ml)的菌株Bt185，并从中克隆了四个种新的cry8类基因：cry8Ea1，cry8Ea2，cry8Fa1，cry8Ha1。目前绝大部分此类杀虫基因均被国外科研究机构或种子公司进行了专利保护；因此，对这些Bt资源进行挖掘和开发是一项紧迫而又有价值的工作，拥有自主知识产权，对于基因克隆、工程菌构建和抗虫转基因植物均具有重要的理论意义和应用价值。

自本世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是频繁地使单一Bt杀虫蛋白的必然结果是因害虫的适应而产生对Cry类蛋白的抗性；目前，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(Mc Gaughey W.H.，1985.Science.229：193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik B.E.，et al.1994.Natl.Acad.Sci.USA.91：4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究.昆虫学报，39(3)：238-244；Hofte H.，et al.1988.Appl.Environ.Microbiol.54：2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf E.，et al.1998.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3)：775-806)。

为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力Bt菌株及基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治也有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种新的Bt毒力蛋白资源，以克服上述不足。

本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。

本发明的第三个目的在于提供上述蛋白及基因的应用。

本发明从四川省成都平原地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌新菌株ST8。该菌株已于2010年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCCNo.3923。

通过对ST8的毒力测试表明，ST8对鳞翅目棉铃虫、甜菜夜蛾等无杀虫活性；对鞘翅目昆虫具有较高的杀虫活性。根据cry8类基因保守序列设计1对通用引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株存在cry8类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到cry8Qa1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，全长为3555bp，分析表明，GC含量为37.13％，编码1184个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry8Qa1。Cry8Qa1蛋白的氨基酸组成如表1。该蛋白的活性中心位于(2)区段。

表1 Cry8Qa1蛋白的氨基酸组成

氨基酸	百分比％	氨基酸	百分比％
				Ala(A)：	5.66	Met(M)：	1.44
Cys(C)：	0.25	Asn(N)：	6.84
				Asp(D)：	5.57	Pro(P)：	5.24
Glu(E)：	6.67	Gln(Q)：	4.98
				Phe(F)：	4.05	Arg(R)：	4.73
Gly(G)：	6.93	Ser(S)：	7.35
				His(H)：	0.93	Thr(T)：	8.36
Ile(I)：	6.76	Val(V)：	6.42
				Lys(K)：	3.55	Trp(W)：	1.27
Leu(L)：	7.85	Tyr(Y)：	5.15

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Cry8Qa1的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第22位的Asn替换为Ala，或将第30位的Ala替换为Ser，或将第70位的Asp缺失，或将第86位增加一个Gln或增加His，不影响其活性。因此，本发明的Bt蛋白Cry8Qa1还包括SEQID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Bt蛋白Cry8Qa1同等活性的由Cry8Qa1衍生得到的蛋白质。

本发明基因包括编码所述蛋白Cry8Qa1的核苷酸序列。

本发明提供了编码上述Bt蛋白Cry8Qa1的基因，其核苷酸序列为如序列表SEQ ID NO.1所示。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的基因和蛋白质可以从菌株ST8中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。

可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转cry8Qa1基因的转化体，例如农作物或者果树等植物，使其具备抗虫活性。

在本发明的一个实施例中，Bt蛋白Cry8Qa1重组表达载体的获得是通过将cry8Qa1基因插入到表达载体pET-32a(+)上构建得到重组表达载体pET-8Q。

此外，还可以通过发酵本发明菌株ST8，得到含有Cry8Qa1蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。因此本发明提供了Bt蛋白Cry8Qa1或其编码基因cry8Qa1或含有该基因的重组表达载体在制备杀虫剂中的应用。

本发明还提供了Bt蛋白Cry8Qa1或其编码基因cry8Qa1或含有该基因的重组表达载体在提高植物抗虫性中的应用。

本发明提供了Bt蛋白Cry8Qa1或其编码基因cry8Qa1或含有该基因的重组表达载体在制备转基因植物中的应用。

本领域技术人员还可以根据本发明公开的cry8Qa1基因，将其转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。

本发明提供Cry8Qa1蛋白是一种新的Bt蛋白，具有较好的杀虫活性，将其用于制备转基因植物，能够特异性杀灭害虫，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染。目前还没有害虫或昆虫对该蛋白产生抗性的报道，因此，本发明的Bt蛋白Cry8Qa1具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫性中。

附图说明

图1是cry8Qa1基因的PCR扩增结果电泳图，其中M：DNAmarker，1：cry8Qa1基因；

图2是重组质粒PET-8Q的酶切鉴定图，1，Sac I+Not I双酶切pET-8Q；2，重组质粒pET-8Q；3，SacI+NotI双酶切pET-32a；4，插入的DNA；M，DNA marker；

图3是cry8Qa1基因在E.coli BL21(DE3)中的SDS-PAGE检测，其中M.蛋白marker；1.空载体(pET-32a)在E.coii BL21(DE3)中的表达；2.裂解液上清；3.包涵体中的Cry8Qa1蛋白。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 cry8Qa1基因的克隆

本发明从四川省成都平原地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌新菌株ST8，该菌株已于2010年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCCNo.3923。

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株ST8的总DNA。并设计引物序列如下：

P1：5’ATGAGTCCAAATAATCAAAAT 3’

P2：5’TTACTCTACGTCAACAATTAA 3’

25μl PCR反应体系：

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，43℃退火50s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图1所示，通过扩增得到了约为3555bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，与目的序列一致。

实施例2 Cry8Qa1蛋白的获得

根据cry8Qa1基因开放阅读框两端序列，设计并合成一对特异性引物：cry8R：5′-CGGAGCTCATGAGTCCAAATAATCAAAAT-3′；cry8F：5′-ATTTGCGGCCGCTTACTCTACGTCAACAATTAA-3′，

5’端引物下划线部分碱基分别为Sac I和Not I酶切位点。以ST8DNA为模板进行扩增，扩增的产物采用Sac I和Not I进行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pET-32a(+)连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，将重组质粒命名为pET-8Q。重组质粒的酶切电泳验证插入片断大小符合目的片段后(图2)，再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)，含重组质粒的重组子命名为E.coli.BL21(8Q)。然后转接阳性转化子于LB培养基中，在210r/min、37℃培养条件下，当OD₆₀₀值为0.6时，加入0.6mmol/L IPTG进行诱导表达20h。SDS-PAGE分析表明cry8Qa1基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中(图3)，分子量约为132kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。

实施例3 Cry8Qa1蛋白的抗虫作用测定

用cry8Qa1基因表达产物分别对棉铃虫、暗黑鳃金龟及华北大黑鳃金龟进行杀虫活性测定。

对鳞翅目害虫：将实施例2中获得的Cry8Qa1蛋白配制成从1μg/ml到100ng/ml 6个不同浓度，选老嫩适中的卷心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm²大小，分放在不同浓度Cry8Qa1蛋白液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB液体培养基浸泡的叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；每个培养皿选放健康的2-3龄棉铃虫30头；每处理重复3次，置室内，于3d后观察幼虫死亡情况，用SPSS 10.0软件计算LC₅₀。

对鞘翅目害虫：将Cry8Qa1蛋白配制成0.1，4，8，16，32，64μg/mL等6个不同的浓度梯度。然后将稀释液加入到均匀粗细土豆丝的灭菌细土中混匀，以5-7日龄暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟作为供试虫主，每个处理接虫30头，重复3次，以加入清水的处理作为空白对照，感染饲养7d、14d检查死虫数，用SPSS 10.0软件计算LC₅₀。结果表明：表达产物对棉铃虫基本无杀虫活性，而对华北大黑鳃金龟的活性最好，LC₅₀为29.6μg/g。

Claims

1.一种杀虫Bt蛋白Cry8Qa1，其氨基酸序列是：

SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.含有权利要求1所述蛋白的杀虫剂，所述杀虫剂对华北大黑鳃金龟具有杀虫活性。

6.权利要求1所述的蛋白或权利要求4所述表达载体在制备杀虫剂中的应用，所述杀虫剂对华北大黑鳃金龟具有杀虫活性。