CN101531980A - 苏云金芽孢杆菌hs18-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株HS18－1，保藏号为CGMCC No.2718。通过对HS18－1的毒力活性测试表明，HS18－1对鳞翅目、双翅目害虫等，均具有极高的毒力。可以将本发明苏云金芽孢杆菌HS18－1制成杀虫剂，用于重要农作物害虫的防治。从而使苏云金芽孢杆菌杀虫剂的产品多样化和系列化，扩大了苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围，降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

苏云金芽孢杆菌HS18-1及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物新菌株及其应用，具体地说是一种苏云金芽孢杆菌及其在农业虫害防治中的应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。另外，蚊媒病在预防医学中占有重要位置，其中登革热和黄热病等蚊媒病传播力强、流行面广、发病率高、危害性大。据WHO统计，全世界每年感染登革热人数多达8000万，我国的海南省在1980和1986年曾经暴发过两次登革热，发病分别达到437469例和113589例。登革热和黄热病主要由埃及伊蚊传播。

为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来(Adang M.J et al，Characterized full-length and truncated plasmidclones of the crystal protein of Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki HD-73 andtheir toxicity to Manduca sexta，Gene，1985，36(3)：289～300.)，人们已经分离克隆了390多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N，Zeigler D R，Feitelson J，et al.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensispesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。一般而言，Cry1，Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治(Kozie，M.G.，Beland，G.L.，Bowman，C.，et al.Field performance of elite transgenic maize plants expressing aninsecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis.Bio/Technology，1993，11：194-200；Perlak，F.J.，Deaton，R.W.，Armstrong，T.A.，et al.Insect resistantcotton plants.bio/technology，1990；8：939-943；Van Frankenhuyzen，K.，Gringorten，L.，and Gauhier，D.1997.Cry9Cal toxin，a Bacillus thuringiensisinsecticidal crystal protein with high activity against the spruce bud worm(Choristoneura fnniferana).Appl.Environ，Microbviol.63：4132-4134；王飞，2001，苏云金芽孢杆菌特异菌株生物学特性及cry9新基因的研究，硕士论文，南开大学)。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治(Goldberg L J，and Margalit J，1977.A bacterial spore demonstrating rapidlarvicidal activity against Anopheles sergentii，Uranotaenia unguiculata，Culexunivitattus，Aedes aegypti，and Culex pipiens.Mosqito News，37：355-358；)。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性(Wu，D.，Johnson，J.J.，and Federici，B.A.1994.Synergism ofmosquitocidal toxicity between CytA and CryIVD Proteins using inclusionsproduced from cloned genes of Bacillus thuringiensis.Mol.Microbiol.13：965-972；Wirth，M.C.，Georghiou，G.P.，and Federeci，B.A.1997.CytA enables CryIV endotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome highlevels of CryIV resistance in the mosquito，Culex quinquefasciatus.Proc.Natl.Acad.Sci.94：10536—10540)

自本世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是，由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(M cGaughey，W.H.1985.Insect resistance to the biological insecticideBacillus thuringiensis.Science.229：193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik，B.E.，Finson，N.，Groeters，F.R.，et al.1994.Reversal ofresistance to Bacillus thuringiensisin Plutella xylostella.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究。昆虫学报，39(3)：238-244；Hofte，H.，Van Rie，J.，Jansens，S.，Van Houtven，A.，Vanderbruggen，H.，and Vaeck，M.，1988.Monoclonalantibody analysis and insecticidal spectrum of three types oflepidopteran-specific insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis.Appl.Environ.Microbiol.54：2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf，E.，Crickmore，N.，Van Pie，J.，et al.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidalCrystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3)：775-806)。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题(Regis L，et al.，2000.The use ofbacterial larvicides in mosquito and black fly control programsin Brazil.Mem.Instituto Oswaldo Cruz，95：207-210.)，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou GP，and Wirth MC，1997.Influence of exposure to single versus multiple toxins of Bacillusthuringiensis subsp.israelensis on development of resistance in the mosquitoCulex quinquefasciatus(Diptera：Culicidae).Applied and EnvironmentalMicrobiology，63：1095-1101.)。

为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力菌株及基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治也有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种对农业生产和卫生安全领域的一些主要害虫，特别是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鞘翅目、鳞翅目害虫和传播登革热和黄热病等蚊媒病的双翅目害虫具有较高毒力的苏云金芽孢杆菌新菌株HS18-1。

本发明菌株是四川省成都平原土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株，该菌株已于2008年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCC No.2718。

HS18-1具体通过如下方法筛选获得：采用醋酸钠-抗生素分离法，称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养(200r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片。发现一株含有球状晶体形态的Bt菌株，将其命名为HS18-1。

经鉴定，关于该菌株的信息包括：能形成芽胞，同时能形成球形伴胞晶体(见图1)，SDS-PAGE电泳表明，菌株HS18-1主要产生约130，70kDa左右大小的2种蛋白(见图2)；其晶体蛋白在16小时开始表达，而生长曲线表明其16小时已进入停滞期(见图3)，表明该晶体蛋白启动子可能为依赖芽孢形成的；生物学测定表明，该菌株对对鳞翅目棉铃虫杀虫活性最高，LC₅₀为4.71μg/mL；对鞘翅目暗黑鳃金龟杀虫活性的LC₅₀为10.7cfu/mL；对双翅目伊蚊的LC₅₀为8.92μg/mL(见表1)。。

表1 HS18-1的杀虫活性

本发明进一步对菌株HS18-1中的cry基因进行了鉴定。结果表明，HS18-1中存在cry4和cry30类基因。采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株HS18-1的总DNA；分别设计全长基因引物并以菌株HS18-1总DNA为模板，分别扩增cry30和cry4的全长基因，结果表明它们的全长分别约为2kb和3.5kb(图4)。分别将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，分别挑取有目的片段的阳性克隆，进行测序。将测序结果在GenBank上进行检索，结果表明所获的的基因均为新基因。cry30和cry4基因的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和3所示。现将它们分别命名为cry30Gal、cry4Cbl。

通过对HS18-1的毒力测试表明，HS18-1对鳞翅目害虫、鞘翅目和双翅目害虫等等，均具有极高的毒力。因而，可以将本发明苏云金芽孢杆菌HS18-1或其发酵液制成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。从而使苏云金芽孢杆菌杀虫剂的产品多样化和系列化，扩大了苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围。本领域技术人员还可以根据本发明公开的基因，将其转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为HS18-1菌株的球形伴孢晶体、芽孢及营养细胞(5000×)；

图2为HS18-1菌株SDS-PAGE电泳分析，其中：M为蛋白质Marker；

图3为HS18-1菌株的生长曲线；

图4为HS18-1菌株中cry基因型的PCR鉴定，其中：M为DNA Marker100bp，1为cry4类基因扩增产物，2为cry30类基因扩增产物；

图5菌株HS18-1中cry30和cry4全长基因的PCR扩增产物，其中：M为DNA分子量标准，1为cry30的PCR产物，2为cry4的PCR产物。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 苏云金芽孢杆菌的筛选与鉴定

土壤采自四川省成都温江地区。采用醋酸钠-抗生素分离法，称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养(200r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片。发现一株含有球状晶体形态的Bt菌株(见附图1)。经用光学显微镜和电子显微镜观察，该菌株细胞呈杆状，两端钝圆，菌株大小为1.2-1.5μm×3.5-4.4μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。将该Bt菌株命名为HS18-1，并进行了保藏，保藏号为CGMCC No.2718。

实施例2 菌株HS18-1中cry基因的鉴定

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株HS18-1的总DNA。分别根据cry4和cry30类基因保守序列设计特异对。

根据cry4类基因设计一对特异引物：

5’-GTGTCAAGAGAACCAACAGTATG-3’

5’-ACTAAGTCTCCTCCTGTATGACCAG-3’

根据cry30类基因设计一对通用引物：

5’-AAGATTGGCTCAATATGTGTC-3’

5’-GATTATCAGGATCTACACTAG-3’

用下列PCR反应体系鉴定：

10×buffer         2.5μl

MgCl₂(25mM)        1.5μl

Taq酶              0.2μl

dNTPs(2.5mM)       2μl

引物               2μl

模板               5μlμ

最终反应体积       25μl

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果(见附图4)。

实施例3 菌株HS18-1中cry4和cry30基因的克隆

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株HS18-1的总DNA；设计其全长基因引物P1、P2、P3、P4(引物序列如下)；以菌株HS18-1总DNA为模板分别用所述引物进行PCR扩增，反应体系和反应程序同实施例2；以菌株HS18-1总DNA为模板，用P1和P2扩增cry30全长基因，得到长约2kb的片段；用P3和P4扩增cry4全长基因，得到长约3.5kb的片段。分别将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，分别挑取一个有目的片段的阳性克隆，测序，分别得到序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO 3。

P1：5’ATGAATTTATATCAAAATGAAAATGA3’

P2：5’TTAGTTCATTTTACAAGCTTCTACAC3’

P3：5’ATGTCTAATCGTTATCAACGGTACCC3’

P4：5’TCACTCGTTCATACAAATCAACTCGA3’

1.cry30Ga基因的序列分析

序列SEQ ID NO1的全长为1995bp，分析表明，GC含量为32.53％，编码664个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在softberry网站采用bacterial sigma 7.0 promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将该基因命名为cry30Ga1。本发明进一步分析了Cry30Gal蛋白的氨基酸组成(见表2)。

表2 Cry30Gal蛋白的氨基酸组成

 

氨基酸	百分比％	氨基酸	百分比％
				Ala(A)：	6.78	Met(M)：	2.11
Cys(C)：	1.05	Asn(N)：	9.34
				Asp(D)：	3.16	Pro(P)：	5.72
Glu(E)：	4.82	Gln(Q)：	4.37

 

Phe(F)：	3.31	Arg(R)：	3.92
				Gly(G)：	6.17	Ser(S)：	6.93
His(H)：	0.90	Thr(T)：	7.83
				Ile(I)：	10.09	Val(V)：	3.01
Lys(K)：	4.22	Trp(W)：	1.20
				Leu(L)：	9.19	Tyr(Y)：	5.57

2.cry4Cb1基因的序列分析

序列SEQ ID No.3的全长为3474bp，分析表明，GC含量为35.90％，编码1157个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。在softberry网站采用bacterial sigma 7.0 promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将该基因命名为cry4Cb1。本发明进一步分析了Cry4Cb1蛋白的氨基酸组成(见表3)。

表3 Cry4Cb1蛋白的氨基酸组成

 

氨基酸	百分比％	氨基酸	百分比％
				Ala(A)：	5.96	Met(M)：	2.07
Cys(C)：	1.12	Asn(N)：	7.78
				Asp(D)：	5.53	Pro(P)：	3.98
Glu(E)：	5.01	Gln(Q)：	4.67
				Phe(F)：	3.28	Arg(R)：	3.37
Gly(G)：	5.96	Ser(S)：	6.91
				His(H)：	2.68	Thr(T)：	7.95
Ile(I)：	6.40	Val(V)：	5.70
				Lys(K)：	5.70	Trp(W)：	1.30
Leu(L)：	8.82	Tyr(Y)：	5.79

实施例4 菌株HS18-1的活性检测

对鳞翅目害虫：将菌株HS18-1在液体LB培养基中30℃，200r/min振荡培养30h；离心收集菌体(12,000r/min，15min，4℃)，超净工作台风干，计量菌体重量；然后把菌株悬浮于蒸馏水中，配制成从1μg/ml到100ng/ml6个不同浓度；选老嫩适中的卷心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm²大小，分放在不同浓度菌液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB浸泡叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；选放健康的2-3龄棉铃虫30头；每处理重复3次，置室内，于3d后调查幼虫死亡情况，用SPSS 10.0软件计算LC₅₀；结果如表1，表明菌株对这类害虫具有毒杀活性。

对双翅目害虫：将菌株HS18-1在液体LB培养基中30℃，200r/min振荡培养30h；离心收集菌体(12,000r/min，15min，4℃)，超净工作台风干，计量菌体重量；然后把菌株悬浮于蒸馏水中，配制成从1μg/ml到100ng/ml6个不同浓度；选放健康的4龄蚁蚊30头于1L含不同菌体浓度悬浮液中；每处理重复3次，置28℃培养箱内，于24h后调查幼虫死亡情况，用SPSS10.0软件计算LC₅₀；结果如表1，表明菌株对蚁蚊具毒杀活性。

对鞘翅目害虫：Bt菌株在LB培养基上培养3天后，刮下并悬浮于无菌水中，采用乳糖悬浮丙酮沉淀的方法，制备成粉剂备用。将上述粉剂按照2倍等比级差梯度浓度稀释。将稀释液，加入到均匀粗细土豆丝的灭菌细土中混匀，以20d暗黑鳃金龟作为供试虫主，每个处理接虫30头，重复三次，以加入清水的处理作为空白对照，感染饲养7天、14天检查死虫数，用SPSS 10.0软件计算LC₅₀；结果如表1，表明菌株对暗黑鳃金龟具毒杀活性。

序列表说明：

SEQ ID No.1&2、SEQ ID No.3&4分别是cry30Ga1基因和cry4Cb1的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列；SEQ ID No.5&6、SEQ ID No.7&8是用于扩增cry30类和cry4基因保守序列的特异性引物；SEQ ID No.7&8、SEQ ID No.9&10用于扩增cry30Ga1和cry4Cb1基因的特异性引物。

序列表

<110>四川农业大学

<120>苏云金芽胞杆菌HS18-1及其应用

<130>KHP09112218.4

<160>12

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1995

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis HS18-1

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1995)

<400>1

<210>2

<211>664

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis HS18-1

<400>2

<210>3

<211>3474

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis HS18-1

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3474)

<400>3

<210>4

<211>1157

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis HS18-1

<400>4

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

Claims (4)

1、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)HS18-1，保藏号为CGMCC No.2718。

2、含有权利要求1所述菌株或其发酵产物的杀虫剂。

3、权利要求1所述菌株或权利要求2所述杀虫剂在农作物虫害防治中的应用。

4、如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述虫害为鞘翅目、鳞翅目或双翅目害虫。

Images