CN1323159C - 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株和基因 - Google Patents
对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株和基因 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1323159C CN1323159C CNB2004100098082A CN200410009808A CN1323159C CN 1323159 C CN1323159 C CN 1323159C CN B2004100098082 A CNB2004100098082 A CN B2004100098082A CN 200410009808 A CN200410009808 A CN 200410009808A CN 1323159 C CN1323159 C CN 1323159C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- strain
- bacterial strain
- bacillus thuringiensis
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 11
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 title abstract description 9
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title description 6
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims abstract description 18
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 claims description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 12
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 abstract description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000255925 Diptera Species 0.000 abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 abstract description 2
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 abstract 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 241000346653 Holotrichia parallela Species 0.000 description 12
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 6
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 5
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 5
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 5
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 5
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 5
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 5
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 5
- 241000254062 Scarabaeidae Species 0.000 description 5
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000162439 Brontispa longissima Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 240000002114 Satureja hortensis Species 0.000 description 4
- 241000130993 Scarabaeus <genus> Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000254099 Melolontha melolontha Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 3
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000241395 Anomala corpulenta Species 0.000 description 2
- 241000519879 Anomala cuprea Species 0.000 description 2
- 241000609114 Bacillus thuringiensis serovar japonensis Species 0.000 description 2
- 101100061321 Bacillus thuringiensis subsp. japonensis cry8Ca gene Proteins 0.000 description 2
- 101100061320 Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis cry8Ba gene Proteins 0.000 description 2
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 2
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 2
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 2
- 241001495069 Ischnocera Species 0.000 description 2
- 241000254043 Melolonthinae Species 0.000 description 2
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 2
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 101150086784 cry gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000002420 orchard Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical class OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000181429 Anomala exoleta Species 0.000 description 1
- 101100061319 Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis cry8Aa gene Proteins 0.000 description 1
- 241001124134 Chrysomelidae Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241001277133 Scarabaeoidea Species 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000000974 larvacidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明为“对鞘翅目害虫有效的苏云金芽孢杆菌菌株和基因”，属生物防治技术领域。进一步，本发明涉及对鞘翅目害虫高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株，cry8E和cry8F基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质的氨基酸序列，涉及使用和协同组合使用苏云金芽孢杆菌菌株、cry8E和cry8F基因表达产物。通过使用上述基因或其组合，可使它们对鞘翅目害虫的毒力高于出发菌株和单基因表达产物，扩大它们对鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫的杀虫谱，并通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
Description
本发明的技术领域
本发明属于生物防治技术领域。本发明涉及一种对鞘翅目害虫具有活性的苏云金芽孢杆菌菌株，涉及对鞘翅目害虫高毒力的cry8E和cry8F基因的核苷酸序列和分别由其编码的蛋白质的氨基酸序列，涉及协同组合使用cry8E与cry8F基因表达产物。
本发明的背景技术
金龟子属于鞘翅目金龟总科(Scarabaeidae)，其幼虫(俗称蛴螬，本发明以下也简称为“蛴螬”)是一类重要的世界性分布地下害虫，可危害粮食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料作物、烟草、牧草、花卉、草坪草、果树等多种植物。大量调查表明，蛴螬在地下害虫中的危害居首位，其中主要以鳃金龟科和丽金龟科幼虫为主，占总地下害虫量的70-80％以上。据统计每年全国蛴螬发生面积约1亿亩，严重年份曾达3亿2千万亩，产量损失高达20％以上，有些地块甚至绝产。近年发生面积最大、发生量最多的为黄淮海地区，主要危害粮食、油料等作物；其它地区的危害情况也很严重，如危害甘蔗的蛴螬，在广东、广西、云南、四川、福建等地普遍发生；在西藏、青海、甘肃、新疆等西部地区，蛴螬的发生也很严重(魏鸿钧等，《中国地下害虫》，上海：上海科学技术出版社，1989，1-41；王永祥等，“冀中平原区蛴螬种类及综合防治技术”，《河北师范大学学报》(自然科学版)，1998，22(2)：268-270)。以在我国油料作物中种植面积仅次于油菜居第二位的花生为例。我国的花生产量占世界花生总产量的35％左右，居世界首位，年出口收入达207亿美元，2001年全国花生面积(500万公顷)和总产(1450万吨)均达到历史最高水平。但蛴螬对花生的危害十分严重。为控制蛴螬的危害，一般采用农业、化学、物理等综合防治策略，这虽有一定成效，却难以达到持续控制的效果。因此，寻找新的有效防治方法，已成为当务之急。
在获得对蛴螬高毒力Bt基因的基础上，培育杀蛴螬的转基因植物是一条值得探索的新的防治途径。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽孢的同时，能产生蛋白性质的伴孢晶体(parasporal crystal)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf，E.N.et al，Microbiol.And Molecular BiologyReview，1998，62：3 775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又称δ-内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。
目前人们已经克隆了300多种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因，它们分属141种模式基因。近年国际上cry8类基因的研究动向引人瞩目。研究表明，这类基因对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀虫作用。1992年，Ohba等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(Ohba，M.et al.，A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activityspecific for scarabaeid beetles，Letters in Applied Microbiology，1992.14：54-57)，1994年Sato等从中克隆出一种新的杀虫基因cry8C(Sato，R.et al，Cloning，heterologous expression，andlocalization of a novel crystal protein gene from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strainbuibui toxic to scarabaeid insects，Curr. Microbiol.1994.28：15-19.4)。目前已发现9种基因，编码的蛋白由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。详细的信息见表1(Asano，S，Yamanaka，S.and Takeuchi，K.，Protein having insecticidal activity，DNA encoding the protein，and controlling agent and controlling method of noxious organisms，2002，JP 2002045186-A andJP 2002045186-A/2))。其中美国Mycogen公司分离的Cry8Aa1和Cry8Ba1对金龟科的多种害虫具有明显的杀虫活性(Tracy E.Michaels，et al.，Bacillus thuringiensis toxins active againstscarab pests，1994，USP5554534)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基因，发现对西方玉米根叶甲(Western corn rootworm)具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad，Andre，R.，Duck Nicholas，B.，Feng，Xiang，Flannagan Ronald，D.，Kahn，Theodore，W，Sims，Lynne，E.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity againstcoleopterans，2002，WO 02/34774 A2)。在我国，河北省农业科学院植物保护研究所和河北农业大学近年来先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(Anomala exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta)幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株，室内生测死亡率均达100％(冯书亮等，“一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株”，《中国生物防治》，2000，16(2)：74-78)。
表1 苏云金芽孢杆菌Cry8类杀虫晶体蛋白
| 名称 | 编号 | 分子量 | 氨基酸数 | Bt菌株 | 活性 | 文献出处 |
| Cry8Aa1 | U04364 | 131.00 | 1157 | kumamotoensis | scarabs | Tracy，et al，1994 |
| Cry8Ba1 | U04365 | 133.54 | 1169 | kumamotoensis | scarab | Tracy，et al，1994 |
| Cry8Bb1 | AX543924 | 136.53 | 1206 | Bt | Leptinotarsadecemlineata，Diabrotica virgiferavirgifera，Deiabroticaundecimpunctatahowardi | Abad，et al，2002 |
| Cry8Bc1 | AX543926 | 137.20 | 1210 | Bt | Abad，et al，2002 | |
| Cry8Ca1 | U04366 | 130.42 | 1160 | japonensisBuibui | Anomala cuprea | Sato，et al.1994 |
| Cry8Da1 | AB089299 | 128.05 | 1144 | Bt galleriae | Anomala cuprea | unpublished |
| Cry8Da2 | BD133574 | 130.51 | 1167 | Bt | scarabs | Asano，et al，2002 |
| Cry8Da3 | BD133575 | 130.51 | 1167 | Bt | scarabs | Asano，et al，2002 |
本发明的内容
本发明的目的：
本发明的目的是提供对暗黑鳃金龟、椰心叶甲等鞘翅目重要害虫具有高毒力的一种苏云金芽孢杆菌菌株和两种新的cry8E和cry8F模式基因序列，以及一种对暗黑鳃金龟具有明显增效作用的cry8E和cry8F基因组合，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。
本发明的技术方案：
1.对鳃金龟地下害虫有效的Bt菌株185的筛选与鉴定
本发明自行分离了Bt菌株185。土壤采自河北省保定市顺平县苹果园。取0.1-0.2g土样放入装有10ml灭菌水和玻璃珠的试管中，在旋涡振荡器上振荡3分钟，将土粒打碎，然后放于200rpm摇床上振荡10分钟，75℃水浴锅中水浴17分钟，充分将非芽孢菌杀死，待稍静置后，选取10-2、10-3、10-4三个稀释度，分别吸取100ul菌悬液于BP平板上，涂布均匀，于37℃培养三天，挑取似Bt菌落涂片镜检。发现一株含有球形晶体的Bt菌株(见附图1)。
该菌株的培养条件为30℃，普通LB培养基，pH7.0。该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、苏云金芽孢杆菌种，并已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2004年11月5日，保藏编号为CGMCC NO.1242。经鉴定，关于该菌株的信息包括：能形成芽孢，同时能形成球形伴孢晶体，SDS-PAGE电泳表明其杀虫晶体蛋白约为130kDa(见附图2)；其晶体蛋白在14小时开始表达，而生长曲线表明其14小时已进入停滞期(见附图3)，表明该晶体蛋白启动子可能为依赖芽孢形成的；生物学测定表明，该菌株对金龟科地下害虫暗黑鳃金龟具有明显杀虫作用，7天校正死亡率达90％，对椰心叶甲也具有一定的杀虫活性(见表2)。
表2 Bt菌株185的杀虫活性
| 7天校正死亡率％ | 14天校正死亡率％ | |
| 暗黑鳃金龟 | 90 | 100 |
| 椰心叶甲 | 22 | 35 |
2.菌株185中cry基因鉴定
根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物：
S5un8：5-’CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3’
S3un 8：5-’CTGACTGATTTCCACCATCACG-3。
表3是这些基因与引物的同源序列，表4是用这对引物预测的cry8基因扩增产物，以及酶切片段大小，通过这种PCR-RFLP方法可以分别鉴定出将这些基因。
表3 引物与cry8各基因的保守区配对情况及配对区在基因上的位置
| 基因型 | 引物S5un8/S3un8与基因的保守区配对情况 | |||
| 引物S5un8：5`-cggcaaacttagtagaatgc-3` | 位置 | 引物S3un8：5`-gcactaccacctttagtcagtc-3 | 位置 | |
| cry84Aacry8Bacry8Bbcry8Bccry8Cacry8Da | cggcaaacttagtGgaatgccggcCaacttagtGgaagccggcaaacttagtGgaatgccggcaaacttagtGgaatgccggcaaacttaAtagaatgcTAAAaaacttagtagaatgc | 2101～21202089～21082104～21232116～21352092～21112044～2063 | cgtgatggtggaaatcaAtcagcgtgatggtggaaatcaAtcagcgtgatggtggaaacaAAcagcgtgatggtggaaatcaAAcagcgtgatggtgcaaatcagAcagcgtgatggtgCGaatcagTcag | 3273～32943261～32823276～32973288～33093282～33033234～3255 |
注：“N”为不配对碱基。
表4 cry8的PCR扩增产物和限制性酶切长度多态性
| 基因型 | PCR(S5un8/S3un8) | |
| 产物大小Size(bp) | EcoO109I和DraI酶切结果Digested with EcoO109I and DraI(bp) | |
| cry8Aacry8Bacry8Bbcry8Bccry8Cacry8Da | 119411941194119412121212 | 197，442，555639，555，639，555639，555197，92，310，613197，92，310，613 |
用下列PCR反应体系(50μL)鉴定了Bt菌株185：
| 10×PCR buffer | 5μL |
| MgCl2(20mM) | 6μL |
| dNTP(10mM) | 1μL |
| 引物对(10mM) | 1μL/个 |
| 模板 | 1μL |
| Taq聚合酶(5U/μL) | 0.5μL |
超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。
扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。
结果(见附图4)显示与已知cry8类基因的图谱不同，表明菌株185中可能含有新的cry8杀虫基因。
3.菌株185中cry8E基因的克隆
用PstI和KpnI酶切Bt菌株总DNA，用载体pBluescript SK(+)分别建立了两个DNA片段库，然后用引物S5un8/S3un8(见表3)和PCR方法检测两个DNA库，得到两个阳性克隆pSS3612和pSS162，分别插入11kb的pstI片段和2.0kb的KpnI片段(见附图5)。酶切分析pSS3612，7kb的PstI和KpnI双酶切片段含有cry8Ea1的全长基因，用pBluescript SK(+)亚克隆该片段，得到pSS3612-7，同时亚克隆了4kb的KpnI片段中，得到pSS3612-4(见附图6)。将pSS162和pSS3612-7的插入序列测序。得到序列SEQ ID NO 1。
4.cry8Ea1基因的序列分析
序列SEQ ID NO 1为pSS3612中PstI和KpnI双酶切片段，序列全长7276bps，分析表明其含有两个较大的开放阅读框，ORF1的位置是3658-7152，ORF2的位置是2799-3377。
ORF1的位置是3658-7152，GC含量为38.03％，编码1164个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性，表5为其同源性数据。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有58.2％(Cry8Bb1)，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ea1。
表5 Cry8蛋白同源比较数据
| Cry8a1 | Cry8Ba1 | Cry8Bb1 | Cry8Bc1 | Cry8Da1 | Cry8Ca1 | Cry8Ea1 | Cry8Fa1 | |
| Cry8Aa1 | 100％ | |||||||
| Cry8Ba1 | 46.10％ | 100％ | ||||||
| Cry8Bb1 | 47.20％ | 82.10％ | 100％ | |||||
| Cry8Bc1 | 46.10％ | 83.50％ | 90.50％ | 100％ | ||||
| Cry8Da1 | 51.30％ | 26.20％ | 25.60％ | 25.50％ | 100％ | |||
| Cry8Ca1 | 36.70％ | 21.20％ | 21.30％ | 21.00％ | 63.10％ | 100％ | ||
| Cry8Ea1 | 26.60％ | 55.60％ | 57.00％ | 58.20％ | 26.10％ | 21.00％ | 100％ | |
| Cry8Fa1 | 24.40％ | 42.50％ | 42.40％ | 42.10％ | 24.60％ | 20.60％ | 64.80％ | 100％ |
本发明进一步分析了Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成(见表6，附图7)，得知其分子量为131.56kDa，等电点为pH4.735(见附图8)。
表6 Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成
| 氨基酸 | 数目 | 百分比％ | 氨基酸 | 数目 | 百分比％ |
| Ala(A)： | 63 | 5.41 | Asn(N)： | 80 | 6.87 |
| Asx(B)： | 0 | 0 | Pro(P)： | 52 | 4.46 |
| Cys(C)： | 4 | .34 | Gln(Q)： | 61 | 5.24 |
| Asp(D)： | 63 | 5.41 | Arg(R)： | 62 | 5.32 |
| Glu(E)： | 80 | 6.87 | Ser(S)： | 93 | 7.98 |
| Phe(F)： | 43 | 3.69 | Thr(T)： | 87 | 7.47 |
| Gly(G)： | 80 | 6.87 | Val(V)： | 81 | 6.95 |
| His(H)： | 9 | .77 | Trp(W)： | 17 | 1.46 |
| Ile(I)： | 62 | 5.32 | Unk(X)： | 0 | 0 |
| Lys(K)： | 46 | 3.95 | Tyr(Y)： | 69 | 5.92 |
| Leu(L)： | 93 | 7.98 | Glx(Z)： | 0 | 0 |
| Met(M)： | 19 | 1.63 | Total | ： | 1164 |
5.cry8Fa1基因的克隆
对pSS162质粒中插入序列进行了分析，片段长2.3kb，具有完整的3’端序列，与cry8Ea1序列完全同源，但5’端差异较大，并且缺少完整的读码框，根据该序列的特异区段设计了1对引物(5-185-KpnI：TTGGTATGGCGTTTCGTTG；和3-185-Kpnl：TATTGCAGGTCCAGGATTCAC)，用于克隆该全长基因，将菌株185的质粒DNA用XbaI酶切，与载体pBluescript SK(+)连接，筛选得到插入约9Kb外源片段的阳性克隆pSS266(见附图9)，进一步酶切分析表明ClaI酶切产生的3.0kb片段含有5’端读码框(见附图10)，用pBluescript SK(+)亚克隆得到该片段，阳性克隆命名为pSS266-3，对该片段进行了测序，把得到的序列与pSS162中的插入序列进行拼接得到3.9kb片段。
6.cry8F基因的序列分析
对上述3.9kb的核酸片段进行测序，得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。对该序列进行分析表明：该序列含有1个较大的开放阅读框357-3878；GC含量为36.88％；编码1174个氨基酸组成的蛋白(其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)。进一步的同源分析表明，该蛋白质与Cry8类蛋白有较高的同源性(同源性数据见以上表5)。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有64.8％(Cry8Ea1)，该蛋白被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Fa1。
本发明用生物分析软件Bioedit进一步分析了Cry8Fa1蛋白的氨基酸组成，结果见表7和附图11。结果表明，该蛋白的分子量为133.08kDa，等电点为pH4.565(见附图12)。
表7 Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成
| 氨基酸 | 数目 | 百分比％ | 氨基酸 | 数目 | 百分比％ |
| Ala(A)： | 68 | 5.79 | Asn(N)： | 91 | 7.75 |
| Asx(B)： | 0 | 0 | Pro(P)： | 54 | 4.59 |
| Cys(C)： | 3 | .25 | Gin(Q)： | 60 | 5.11 |
| Asp(D)： | 62 | 5.28 | Arg(R)： | 60 | 5.11 |
| Glu(E)： | 87 | 7.41 | Ser(S)： | 82 | 6.98 |
| Phe(F)： | 47 | 4 | Thr(T)： | 91 | 7.75 |
| Gly(G)： | 68 | 5.79 | Val(V)： | 79 | 6.72 |
| His(H)： | 12 | 1.02 | Trp(W)： | 15 | 1.27 |
| Ile(I)： | 72 | 6.13 | Unk(X)： | 0 | 0 |
| Lys(K)： | 40 | 3.4 | Tyr(Y)： | 63 | 5.36 |
| Leu(L)： | 102 | 8.68 | Glx(Z)： | 0 | 0 |
| Met(M)： | 18 | 1.53 | Total | 1174 | 100 |
7.cry8E和cry8F基因的表达
本发明根据克隆的cry8Ea1和cry8Fa1基因的全长序列，设计了用于表达两种基因的引物，序列如下：
8E1：CGC
GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG
8E2：ACGC
GTCGAC(Sal I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC
8F1：CGC
GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG
8F2：CATTAACTCTGCCCACGGATC
T(C)TCTGGTGCAAAGAAGTCCAG
8F3：CTTGACTTCTTTGCACCAGA
A(G)GATCCGTGGGCAGTTAATG
8F4：CCG
CTCGAG(Xho I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC
引物8E1和8E2分别引入BamHI和SalI位点，以含全长cry8Ea1的pSS3612质粒DNA为模板，扩增得到全长基因，插入Bt表达载体pSXY422b中，转化大肠杆菌SCS110，提取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中(该突变株来源于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，可以向公众提供)，得到工程菌BioT8E。
由于cry8Fa1全长基因内存在1个BamHI切点，用重叠引物PCR的方法对这一位点进行了突变，重叠引物8F2和8F3中引入了点突变(划线部分)、引物8F1和8F4分别引入BamHI和XhoI。以含全长cry8Fa1基因的pSS266质粒DNA为模板，分别用8F1和8F2、8F3和8F4扩增得到0.3kb和3.1kb产物，再分别以它们为模板，分别利用引物8F1和8F4扩增得到3.4kb的全长基因，插入Bt表达载体pSXY422b中，转化大肠杆菌SCS110，提取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中，得到工程菌BioT8F。
分别将上述两株工程菌30℃于牛肉膏培养基(蛋白胨5克，牛肉膏3克，葡萄糖10克，水1000mL，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌)中培养30小时，取500μL菌液至Eppendorf管中，超声波破碎30秒钟(B.Braun U Labsonic，230V，T间隔＝0.5秒)；取100μL加入25μL新配0.5N NaOH，25℃作用5分钟；加入65μL3×样品缓冲液(925μL上样缓冲液+75μLβ-巯基乙醇)，100℃煮沸5分钟。离心除去沉淀。上样10uL进行SDS-PAGE电泳分析结果(方法参见Sambrook，J.et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.1989)。结果(见附图13)表明，工程菌Biot8E和Biot8F中的cry8Ea1和cry8Fa1基因均获得了表达，表达物的分子量为130kDa左右。
8.Cry8E和Cry8F蛋白的活性测定
将Bt工程菌株接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养3天。将受体菌株HD-73-接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养4天。将培养物洗下，2倍梯度浓度稀释，将40ml菌悬液加入到200g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中，混匀，使土壤含水量保持在18％-20％。接入暗黑鳃金龟15天龄幼虫20头，以加入清水的处理为空白对照，28℃感染饲养，14天检查死虫数，计算LC50。结果见表8，表明工程菌株对暗黑鳃金龟具有极高的毒杀活性。其表达的Cry8E和Cry8F蛋白均具有杀暗黑鳃金龟幼虫的活性。
表8 Bt工程菌和185菌株对暗黑鳃金龟幼虫的毒力测定
| 菌株 | LC50(108cfu/ml) | 回归方程 | R值 |
| Biot8E | 0.5250 | Y＝5.3841+1.3724X | 0.9671 |
| Biot8F | 0.9464 | Y＝5.0276+1.1515X | 0.9918 |
菌种保藏信息：
菌种名称：芽孢杆菌属、苏云金芽孢杆菌，Bacillus thuringiensis
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏日期：2004年11月5日
保藏编号：CGMCC NO.1242
附图说明：
图1：185菌株芽孢和晶体形态。
图2：185菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析。
图3：185菌株生长曲线。
图4：菌株185的PCR-RFLP图谱。其中：
M.DNA分子量标准
1.PCR产物
2.PCR产物酶切
图5：重组质粒pSS162和pSS3162的PCR扩增产物和酶切分析。其中：
M.λDNA/Eco130I
1.pSS162 PCR产物
2.pSS3162 PCR产物
3.pBlueScript SK(+)/KpnI
4.pSS162/KpnI
5.pSS3162/PstI
图6：pSS3612插入片段的亚克隆酶切分析。其中：
M.λDNA/Eco 130I
1.pBlueScript SK(+)/KpnI
2.pSS3162/PstI+KpnI
3.pSS3612/KpnI
4.pSS3162/PstI+KpnI
图7：Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成图。
图8：Cry8Ea1蛋白的滴定曲线。
图9：重组质粒pSS266的PCR扩增产物和酶切分析。其中：
M.λDNA/Eco 130I
1.pSS266 PCR产物
2.pSS162/XbaI
3.pBlueScript SK(+)/XbaI
图10：重组质粒pSS266的酶切分析。其中：
1.XbaI
2.NotI
3.PstI
4.NdeI
5.ClaI
6.SacI
7.KpnI
M.λDNA/Eco 130I
图11：Cry8Fa1蛋白的氨基酸组成图。
图12：Cry8Fa1蛋白的滴定曲线。
图13：cry8Ea1和cry8Fa1基因在Bt无晶体突变株中的表达。其中：
M.蛋白质分子量标准
1.Biot8E
2.Biot8F
3.Bt185
4.HD-73-
具体实施方案
以下叙述根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。
实施例1、对鳃金龟地下害虫有效的Bt菌株185的筛选与鉴定
土壤采自河北省保定市顺平县苹果园。取0.1-0.2g土样放入装有10ml灭菌水和玻璃珠的试管中，在旋涡振荡器上振荡3分钟，将土粒打碎，然后放于200rpm摇床上振荡10分钟，75℃水浴锅中水浴17分钟，充分将非芽孢菌杀死，待稍静置后，选取10-2、10-3、10-4三个稀释度，分别吸取100ul菌悬液于BP平板上，涂布均匀，于37℃培养三天，挑取似Bt菌落涂片镜检。发现一株含有球形晶体的Bt菌株(见附图1)。
该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、苏云金芽孢杆菌种。将该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏日期为2004年11月5日，保藏编号为CGMCCNO.1242。经鉴定，关于该菌株的信息包括：能形成芽孢，同时能形成球形伴孢晶体，SDS-PAGE电泳表明其杀虫晶体蛋白约为130kDa(见附图2)，其晶体蛋白在14小时开始表达，而生长曲线表明其14小时已进入停滞期(见附图3)，表明该晶体蛋白启动子可能为依赖芽孢形成的；生物学测定表明，该菌株对金龟科地下害虫暗黑鳃金龟具有明显杀虫作用，7天校正死亡率达90％，对椰心叶甲也具有一定的杀虫活性。
实施例2、菌株185中cry基因鉴定
根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物
S5un8：5-’CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3’
S3un8：5-’CTGACTGATTTCCACCATCACG-3。
用下列PCR反应体系(50μL)鉴定了Bt菌株185：
| 10×PCR buffer | 5μL |
| MgCl2(20mM) | 6μL |
| dNTP(10mM) | 1μL |
| 引物对(10mM) | 1μL/个 |
| 模板 | 1μL |
| Taq聚合酶(5U/μL) | 0.5μL |
超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。
扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。
结果(见附图4)显示与已知cry8类基因的图谱不同，表明菌株185中可能含有新的cry8杀虫基因。
实施例3、菌株185中cry8E基因的克隆
用PstI和KpnI酶切Bt菌株总DNA，用载体pBluescript SK(+)分别建立了两个DNA片段库，然后用引物S5un8/S3un8和PCR方法检测两个DNA库，得到两个阳性克隆pSS3612和pSS162，分别插入11kb的pstI片段和2.0kb的KpnI片段(见附图5)。酶切分析pSS3612，7kb的PstI和KpnI双酶切片段含有cry8Ea1的全长基因，用pBluescript SK(+)亚克隆该片段，得到pSS3612-7，同时亚克隆了4kb的KpnI片段中，得到pSS3612-4(如附图6)。将pSS162和pSS3612-7的插入序列测序，得到序列SEQ ID NO 1。该序列为pSS3612中PstI和KpnI双酶切片段，序列全长7276bps，分析表明其含有两个较大的开放阅读框，ORF1的位置是3658-7152，ORF2的位置是2799-3377。
ORF1的位置是3658-7152，GC含量为38.03％，编码1164个氨基酸组成的蛋白，经测定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性(见表5)。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有58.2％(Cry8Bb1)，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ea1。
本发明进一步分析了Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成(见表6和附图7)，得知其分子量为131.56kDa，等电点为pH4.735(见附图8)。
实施例4、cry8Fa1基因的克隆
对pSS162质粒中插入序列进行了分析，片段长2.3kb，具有完整的3’端序列，与cry8Ea1序列完全同源，但5’端差异较大，并且缺少完整的读码框，根据该序列的特异区段设计了1对引物(5-185-KpnI：TTGGTATGGCGTTTCGTTG；和3-185-Kpnl：TATTGCAGGTCCAGGATTCAC)，用于克隆该全长基因，将185质粒DNA用XbaI酶切，与载体pBluescript SK(+)连接，筛选得到插入约9Kb外源片段的阳性克隆pSS266(见附图9)，进一步酶切分析表明ClaI酶切产生的3.0kb片段含有5’端读码框(见附图10)，用pBluescript SK(+)亚克隆得到该片段，阳性克隆命名为pSS266-3，对该片段进行了测序，把得到的序列与pSS162中的插入序列进行拼接得到3.9kb片段。对核酸片段进行测序，得到如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。对该序列进行分析表明：该序列含有1个较大的开放阅读框357-3878；GC含量为36.88％；编码1174个氨基酸组成的蛋白(该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)。进一步的同源分析表明，该蛋白质与Cry8类蛋白有较高的同源性(见表5)。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有64.8％(Cry8Eal)，该蛋白被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Fa1。
本发明用生物分析软件Bioedit进一步分析了Cry8Fa1蛋白的氨基酸组成(见表7和附图11)。结果表明，该蛋白质的分子量为133.08kDa，等电点为pH4.565(见附图12)。
实施例5、cry8E和cry8F基因的表达
根据克隆的cry8Ea1和cry8Fa1基因的全长序列，设计了用于表达两种基因的引物，序列如下：
8E1：CGC
GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG
8E2：ACGC
GTCGAC(Sal I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC
8F1：CGC
GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG
8F2：CATTAACTCTGCCCACGGATC
T(C)TCTGGTGCAAAGAAGTCCAG
8F3：CTTGACTTCTTTGCACCAGA
A(G)GATCCGTGGGCAGTTAATG
8F4：CCG
CTCGAG(Xho I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC
引物8E1和8E2分别引入BamHI和SalI位点，以含全长cry8Ea1的pSS3612质粒DNA为模板，扩增得到全长基因，插入Bt表达载体pSXY422b中，转化大肠杆菌SCS110，提取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中，得到工程菌BioT8E。
由于cry8Fa1全长基因内存在1个BamHI切点，用重叠引物PCR的方法对这一位点进行了突变，重叠引物8F2和8F3中引入了点突变(划线部分)、引物8F1和8F4分别引入BamHI和XhoI。以含全长cry8Fa1基因的pSS266质粒DNA为模板，分别用8F1和8F2、8F3和8F4扩增得到0.3kb和3.1kb产物，再分别以它们为模板，分别利用引物8F1和8F4扩增得到3.4kb的全长基因，插入Bt表达载体pSXY422b中，转化大肠杆菌SCS110，提取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中，得到工程菌BioT8F。
分别将上述两株工程菌30℃于牛肉膏培养基中培养30小时，取500μL菌液至Eppendorf管中，超声波破碎30秒钟(B.Braun U Labsonic，230V，T间隔＝0.5秒)；取100μL加入25μL新配0.5NNaOH，25℃作用5分钟；加入65μL3×样品缓冲液(925μL上样缓冲液+75μLβ-巯基乙醇)，100℃煮沸5分钟。离心除去沉淀。上样10uL进行SDS-PAGE电泳分析结果。结果(见附图13)表明，工程菌Biot8E和Biot8F中的cry8Ea1和cry8Fa1基因均获得了表达，表达物的分子量为130kDa左右。
实施例6、Cry8E和Cry8F蛋白的活性测定
将Bt工程菌株接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养3天。将受体菌株HD-73-接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养4天。将培养物洗下，2倍梯度浓度稀释，将40ml菌悬液加入到200g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中，混匀，使土壤含水量保持在18％-20％。接入暗黑鳃金龟15天龄幼虫20头，以加入清水的处理为空白对照，28℃感染饲养，14天检查死虫数，计算LC50。结果(见表8)表明工程菌株对暗黑鳃金龟具有极高的毒杀活性。其表达的Cry8E和Cry8F蛋白均具有杀暗黑鳃金龟幼虫的活性。
附：本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列
SEQ ID NO 1(cry8Ea1基因的核苷酸序列)：
ctgcagaata gacacggata cgatcgcctt cacataaatg ctgaaatctt cttctagaca 60
PstI
ttcttgtgtc acctcatttt ttgtttttaa actacagtat gttatatgca aaagaagggg 120
tagaggattg ggccttttac tacaaaaata caaaaacata cttatgattg catatggaga 180
tgtcaaagtg catgcattaa aaatggatta gaaatgattt caaataggca aaagcctatt 240
ccaatgaaga aagattgaca taggctattg tatatagaag aaggtaacga ggaacatact 300
gttagggtac acctaacata gaagtatgct tgtttgaagc atgtacatct tgaaatacca 360
gtagaaatat gggggaacat gttattttaa taattggtaa aatcttttgt tagaaggtga 420
aggcgtatga gacaacaaag agtatgtgag tgtaacaatt gtaggaaaaa gggtgagaag 480
aatcatcttt gtcaatatat aaaacgtggg gattgtatat gggtcagttc ctttggaagc 540
aagttacaaa agagtggtat tttcctgtta ataaaagatt cttttttatt atggtttgat 600
gaaaaacatc aattaaatca aaccagtcta caggggatcc atattgaaaa aagacaataa 660
atgaagaagg agtctcattg ttaacgaagt gtgtacatct atcatgtaca catcgtaagt 720
cgtatgttct acctgtatct ggtaggaaag aattgtcgca tgtgcaaggc gtatatacac 780
aaacatgttt tgttatattt ttgaataatt tgaaaataaa tatgttataa ttaatatact 840
ttcgtgtgtt ttttttgcga aatccctaga aagtatcgta aaaagtccct aacaattttg 900
tgaactgaac ccaaaaaatt agacaaatat attaagcagc tactaaggat tgaactctgt 960
attgcacggg ggacaatcct tttagttttg ttttaattct tttgtgattg tagtaatgaa 1020
tataagtttc tagttcttgc ttaaattgtt ccatactttc aaactcttta agataaagta 1080
attcagactt taataagcca aagaaatttt ccatgactgc attatctaag caatttccct 1140
tacgggacat actttggata acgttatgtt ttttaagcga ctgatgatat tgtcgcattt 1200
gataatgcca accttgatcc gagtgtaaaa taggagtttc cttatcattc aaacattgaa 1260
acgccttatt taacatttta gaaacaaggg aataggcagg tctatgttct atattgtaag 1320
ctataatttc tccgttatat aagtcttaaa tgggtgatag atatagtttt ttaccatgta 1380
agtggaactc cgtcacatct gttacccatt tctcgtttgg ttttgatgcg tgaaaattac 1440
gttttaaaat attaggagcg aatttcccga cagtcccttt atatgaacga tattttttta 1500
atcgaacaag acattttaat cccaggatat tcattaaacg tcgaacggtt ttatgattta 1560
atgcatggcc tcgattacgt aattccaatg taatacgacg ataaccatac ctcccaaaat 1620
tctcactaaa aatctcttta attaattctt taactttctt atatttatct ggacgtttcg 1680
cttgtttcat ccagtaataa tacgtactac gagcgatatt agcgactttc acaaggtcaa 1740
cgaccttata tttatgcctt aattcataaa tcaattgcgc tttgtcttgg tctgtgatgt 1800
tttcttcttt tgaactaagg cattcaactt ttttaaatag tcattttcca tacgcagacg 1860
ttcattctct gcttgtagcg cttctataga accttcaaga aatacttcgt tttgttttaa 1920
atgttgtagc ttagcttttt ctttggccat ggttagacgc ccctttttct ttgattttag 1980
ggcatctaat ccttctgttt cataagctac tttccatttt cggagtgttt cgcaagaagg 2040
aatattaaaa aaagcagctg tttctctcag agatgtccca ttttcattca tataatgaat 2100
tacatctagt ttatactcga gagggtaagt tgtatagcgt ttttcaaacg ccttttcccc 2160
tgaaaattca aaccgtttaa tccattgata aagttctcta ggatgaaccc ctatagaatt 2220
agcaatggtt tttccgcctt ccgtaccttc tagatatcgt tttactgctt gtattttatc 2280
ttttgaagaa aatttagcca taaaaaatgc acctccaatt gttaattatg tgtctaacaa 2340
ttggggtgca cttcattgtt ggggactttt gtatgttcct ttttagacat tcttttaagt 2400
tctttatata gaaagactga agaaagcaga ataagaagtc catcccctga ttcatgagaa 2460
ccgaaaaatt catgatgcac tggatgccaa atatttagat acatttccta ttgatattct 2520
acgagattga attgatgtaa tgttgttccc ttttggtcaa actgaccaat ggcgatagct 2580
ctccttgcat gagtacttct caaacttcca ttacacattg tattccccat cttttttatg 2640
tatatctttt ggggaaaatc gtaatttctg cttatgatga caagatttta ctaaaataag 2700
aagagtggaa tattttactc tatgtcaaac aaaaaagcaa tatatgttta aacgcgaaaa 2760
taatcatcat atcaacaatg cccggtacat aaagatag
gggggattt ttcgaaatga 2820
ORF2→
ttcgaaaagg ctccattgat tcgataggag gtgcacagaa aaaaatggaa gaacaatatg 2880
catcgcaaga tcagtcagat gtagaaggtt tcaagcggaa gaaaaaacat accattccct 2940
ttcaatgtat ggtttctatt ccaacagggt ttcaaattca aaaaccgaat acaccaaaac 3000
ttgtttatga tgtaagccat ttatctatgg taaaagagat gtgtaaacga gtgattgacg 3060
tagaggattg tgggcaagtc gaaatcgatt tacatgtctt aaaaatcaaa ggtgtcttac 3120
cctttattgt gaacgtttcc attgagccgc ttagtatgga acatgtgtat accacaagtg 3180
gtagagacac atccctattt ttaagttgtc aagaaaccgt atatgtggat catattttaa 3240
aatatagtgt cgatcatgtc ccgtattatg tgattgatgg tcatcatatt ctagtacgtg 3300
atgtcgtgat aaagttgttg gaagaaaacc cgcaaacggc tcaaatatca ggtgtttttt 3360
attttgatta tgca
ttt caatagaaac aaaaacgttc tcttatacgg cattcccaaa 3420
End codon
agcatcgcca ccttttttat catacaatag ttcgttctaa gaagagccgt aatatttttc 3480
tatctaacag gaattttatc atctacagaa gaatattctt atcatggtaa tgaggagagg 3540
gattgaaagt caaaagatta cctgatttgt catgtaagaa aaaggaatcg atcgtacagg 3600
aaagtcaaaa gaaagtgtaa aaattttata tcttgtgtat gtata
aaaatag
3660
RBS ORF1→
agtccaaata atcaaaatga atatgaaatt atagatatgg caccttctac atctgtatcc 3720
aatgattcta acagataccc ttttgcgagt gatccaacaa atgcattaca aaatatgaat 3780
tataaagagt atttaagaat gtctgaggga tatgatagtg aatattctgg ctcacctgaa 3840
gtgcttatta gtgagcgaga tgcggttaag acagcaatca gtttggtagg tactatatta 3900
ggaaaattag gagttccatt ggtaggaccg attgtgagcc tatatagtac acttattgat 3960
gttttgtggc caggtggaaa gagtcaatgg gaaattttta tggaacaagt agaagcactt 4020
attaatcaaa aaatagcaga atacgcaagg gctaaggcac ttgcagaatt agaagggtta 4080
ggaaataact atcaattata tttaacagca cttgaagaat ggcaggaaaa tccaagcagt 4140
acaagagtct tacgtgatgt tcggaatcga tttgaaatcc ttgatagctt atttacacaa 4200
tatatgcctt cttttcgggt aacaggttat gaagtaccat tactttcagt atatgcgcaa 4260
gcagctaacc ttcatttatt gttattaaag gacgcttcta tttttggaga agaatggggg 4320
ttctctacaa ccgctattaa taactattat aatcgtcaaa tgagtcttat cgcgcaatat 4380
tctgatcatt gtgtacaatg gtatagaact gggttagatc gattaaaagg atcgaatgct 4440
aaacaatggg ttgaatataa ccgcttccga agagaaatga cattatcggt gttagatatt 4500
atgacattat ttccaatgta tgacatgcgc acgtacccaa tggaaacaaa agcacaacta 4560
acaagggaag tatatacaga tccaattggt gccataggag cgcaaggttc ttggtatgac 4620
tcagcacctt ctttcaatac tctggaaagt acttttataa gaggaaagca tctatttgat 4680
tttataacta gactctctat atatacaggg cgaagctcat tcagtgctag taattactta 4740
aaaaaatgga tagggcatca aatatcctct caacctatag gcggcagtat acaaactcaa 4800
acctatggca ctacgagtgg cagttctgtt attgctacgc agcaaattgg ctttacaggt 4860
tttgacgttt ataagacttt atcaacagcg ggggttctgt ttgcttatac ttcgaaatat 4920
tatggcgtat ctaaagttgt ttttgatgcg atatatcctg acaacaagta taaaacaaca 4980
tttacctata atcctggatc tgaaggtatt ggagcgcaag aaaaggattc agaagttgaa 5040
ttgccaccag aaacattaga tcaacccaat tatgaggcgt atagccatag attgaattat 5100
gttacattta ttagaaatcc agatgtacca gtattttctt ggacacatcg gagtgcggat 5160
cgtacgaata cagtttattc agataaaatc actcaaatac cagttgtaaa ggccagtgac 5220
ggccctaaac cttccgctaa cgaagttgga cactatcttg gtggagatcc aatatcattt 5280
aactcttctg gtagcactgg agtgataagg ttaaatataa attcaccatt atcccaaaaa 5340
taccgtgtga gaattcgcta ttgctcttca gttgattttg acttagatgt agttcgtgga 5400
ggcactactg taaataatgg tagatttaac aaaagcgcgc ctaacgtcgg atggcaaagt 5460
ttgaagtatg aaaattttaa atttgcaagc ttttctacac cttttacatt taatcaagct 5520
caagatacat taaaaataag tgtaaggaat tttagttcaa tcgtaggagg cagcgtagtt 5580
tatatagacc gaatcgagct catcccagta aatgcaacat atgaggcaga acaagattta 5640
gattcggcaa agaaagcagt gaataccttg tttacgaata caaaagatgg tttacgacca 5700
ggggtaacgg attatgaagt gaatcaagcg gcaaacttag tggaatgcct atcggatgat 5760
ttgtatccaa atgaaaaacg cttgttattt gatgcagtga aagaggcaaa acgactcagc 5820
gaggcacgta acttactaca agatccagat ttccaagaga taaatggaga aaatggatgg 5880
accgcaagta caggaattga ggttgtagaa ggagatgctc tatttaaagg gcgttatcta 5940
cgcctaccag gtgcgagaga aatggataca gaaacgtatc caacgtatct gtatcaaaaa 6000
gtagaggaag gtgtattaaa accatacaca agatatagat tgagagggtt tgtcggaagc 6060
agtcaaggct tggaaatttc cacaattcgt catcagacga accgaattgt aaaaaatgtt 6120
ccagatgatt tattaccaga tgtacctcct gtaaactctg atggtagaat caatcgatgc 6180
agcgaacaaa agtatgtgaa tagccgttta gaaggagaaa gaggattacc aaatgggaat 6240
cgttctgctg aagcgcatga attctctctc cctattgata taggagagct ggattacaat 6300
gaaaatgcag gaatatgggt tggatttaag attacggacc cagagggata tgcaacactc 6360
ggtaaccttg aattggtaga agagggacca ttgtcaggag acgcactaga acgcctgcaa 6420
agagaagaac aacagtggaa gcttcaaatg acaaaaagac gtgaagagac ggatagaaaa 6480
tatacggcag caaaacaagc ggtagatcgt ttatatgcag attaccaaga tcaacaattg 6540
aatccaaacg tagaaattac ggatattact gcggcccaaa acctgataca gtccattcct 6600
tatgtatata atgaaatgtt cccagaaata caagggatga actatacgaa gtacacagag 6660
ttaacaaatc gactccaaca agcgtggggt ttgtatgatc aacgaaacgc cataccaaat 6720
ggtgatttcc gaaatgaatt aagtaattgg aatacaacat ctggtgtaaa tgtacaacaa 6780
atcaacaata cgtctgtctt agtcatgcca aactgggatg ggcaagtttc gcaacagttt 6840
acagttcaac cgaatcaaag atatgtatta cgagttactg caagaaaaga aggggtaggg 6900
aatgggtatg tgagtatccg tgatggtgga aatcaaacag aaacgcttac gtttagtgca 6960
agcgattata acacagatag tgtgtataat acgcaagtgt cgaatacaaa tggtttgtac 7020
aatgagcaaa caggatatac cacaaaaaca gtgacattca tcccatatac agatcaagtg 7080
tggattgaga tgagcgagac cgaaggtatg ttctatatag aaagtgtcga attgattgtt 7140
gacgtagag
tggtagta cccctccaga tacaggtttc atctggaggg gtttttttct 7200
End codon
gaaaaagggc ctttttgtag agaagaatcc gattatttta ttacgattat atattttgtg 7260
gatagatcat
ggtacc 7276
KpnI
SEQ ID NO 2(Cry8Ea1蛋白的氨基酸序列)：
MSPNNQNEYE IIDMAPSTSV SNDSNRYPFA SDPTNALQNM NYKEYLRMSE GYDSEYSGSP 60
EVLISERDAV KTAISLVGTI LGKLGVPLVG PIVSLYSTLI DVLWPGGKSQ WEIFMEQVEA 120
LINQKIAEYA RAKALAELEG LGNNYQLYLT ALEEWQENPS STRVLRDVRN RFEILDSLFT 180
QYMPSFRVTG YEVPLLSVYA QAANLHLLLL KDASIFGEEW GFSTTAINNY YNRQMSLIAQ 240
YSDHCVQWYR TGLDRLKGSN AKQWVEYNRF RREMTLSVLD IMTLFPMYDM RTYPMETKAQ 300
LTREVYTDPI GAIGAQGSWY DSAPSFNTLE STFIRGKHLF DFITRLSIYT GRSSFSASNY 360
LKKWIGHQIS SQPIGGSIQT QTYGTTSGSS VIATQQIGFT GFDVYKTLST AGVLFAYTSK 420
YYGVSKVVFD AIYPDNKYKT TFTYNPGSEG IGAQEKDSEV ELPPETLDQP NYEAYSHRLN 480
YVTFIRNPDV PVFSWTHRSA DRTNTVYSDK ITQIPVVKAS DGPKPSANEV GHYLGGDPIS 540
FNSSGSTGVI RLNINSPLSQ KYRVRIRYCS SVDFDLDVVR GGTTVNNGRF NKSAPNVGWQ 600
SLKYENFKFA SFSTPFTFNQ AQDTLKISVR NFSSIVGGSV VYIDRIELIP VNATYEAEQD 660
LDSAKKAVNT LFTNTKDGLR PGVTDYEVNQ AANLVECLSD DLYPNEKRLL FDAVKEAKRL 720
SEARNLLQDP DFQEINGENG WTASTGIEVV EGDALFKGRY LRLPGAREMD TETYPTYLYQ 780
KVEEGVLKPY TRYRLRGFVG SSQGLEISTI RHQTNRIVKN VPDDLLPDVP PVNSDGRINR 840
CSEQKYVNSR LEGERGLPNG NRSAEAHEFS LPIDIGELDY NENAGIWVGF KITDPEGYAT 900
LGNLELVEEG PLSGDALERL QREEQQWKLQ MTKRREETDR KYTAAKQAVD RLYADYQDQQ 960
LNPNVEITDI TAAQNLIQSI PYVYNEMFPE IQGMNYTKYT ELTNRLQQAW GLYDQRNAIP 1020
NGDFRNELSN WNTTSGVNVQ QINNTSVLVM PNWDGQVSQQ FTVQPNQRYV LRVTARKEGV 1080
GNGYVSIRDG GNQTETLTFS ASDYNTDSVY NTQVSNTNGL YNEQTGYTTK TVTFIPYTDQ 1140
VWIEMSETEG MFYIESVELI VDVE 1164
SEQ ID NO 3(cry8Fa1基因的核苷酸序列)：
atcgataaag ggaatggaag acaactcgca aatggctcaa atatcgggtg ttttttattt 60
tgattatgca taattacaat gaaaacaaaa agaattcatt tgtatagtat tcccagaaat 120
atcgtgacat cgtttatcat acaataattc gttctaagaa gagccggatt atttttcaat 180
ctaacaggaa ttttattgtc tacagaagaa tattcttatc acggtaatga ggagagggag 240
tgaaaatcaa aagagtacct gatttgtcat gtaagaacaa aagaaatcga tcgtacagga 300
aagtcaaaag aaagtgtaaa aaattttata tcttttgtat gtata
aaaatag
360
RBS ORF→
agtccaaata atcaaaatga atatgaaatt atagatatgg caccttctac atctgtaacc 420
aatgattcta acagataccc ttttgcgaat gagcccacaa atgcattaca aaatatgaat 480
tataaggatt atttaagaat gtctgaggga tattctcctg aatatttaac aagcctaagt 540
ccttacagcc agtttggcac agttgataag atcatcagta ttattagtct attgaatagt 600
gctgcaggta ttcctggtct tgattttttt actggattgc tgcaatttat tcttgacttc 660
tttgcaccag aggatccgtg ggcagagtta atggaactag tggaacaact catagatcaa 720
aaaataacag ttgctacaag agaaaaggcg ctcgcagaat taagaggact gataaatgga 780
taccttgtat atcagcaatc attagaaagt tggctggaaa atccaaatgc tacaagagct 840
agtatagttc gagaacaata tgtcgcttta gaacttgatt ttgttacttc gatttcatct 900
tttgcgatag ctggacagga agtaccgtta ttagccgtgt acgcacaagc tgctaattta 960
catttgttat tattgagaga tgtgtcaata tttggagaag aatggggatt aacagtaaat 1020
gaggttaata ccttctatat tcgtcaaatg acttatacaa ctgagtatag tgattattgt 1080
gtaagaattt ataatactgg cttaaataaa ttaaaaggat ctagtgcatc tagttgggtt 1140
gattataatc gctttcgtag agaaatgaac ttactagtac tagatattat tgcgttattt 1200
ccaaactatg atgttcgtag gtatccaatg gaaacaacaa cggaattaac aagagtagtt 1260
tacactgatc caattgtgtt tgacgaaagg aagggggtgg cgtcgactca tagttggacg 1320
gcgattgcac catctttctc aagtatagaa tctctaactc gacgaccagg attatttaca 1380
tggttagatc aactaactat tttttcgaaa cgcatatcgc aacctagtgt atttataaat 1440
agttgggcgg ggcataagat tagcaccttt agaacacaaa aaacagatat actcataaat 1500
accacccatg gagatactaa taatcctata aaagaatttg tagtagatac caaaaaagta 1560
gaagatattt atcaaacgat agcataccca catgcagtag caaatgaagt attctattta 1620
ttcggtgtcc caaaagttga ttttaatatg gtacctgcag gtggctctgc aaactctgca 1680
cacaccctca ttttttctga tagtacggga gggagactgg aaagtattac gaagaactca 1740
gaagcagaat tacctccaac agagtcatta tcagatacac ctcaaccaaa ccaagtaact 1800
tattctcaca gattagatta tgctacaata attaaagcaa ataaaagtta tggaagtggg 1860
tatattccat tattaggttg gacccatcgg agtgtagatc gtaataatac aatttatccg 1920
aataaaatca ctcaaatacc agcagtaaaa gctttctcat atactgaatc atttaatgta 1980
aatgttattg caggtccagg attcacagga ggagatttaa taagtttagg tcatttagag 2040
aatatttata tgaaattaaa cgttccaaat cctcaaaaat tccgtgttcg tattcgttat 2100
gctgctagta caacttcgta tttgcaaata actgggctat ctaatttagc tcagtctgat 2160
cgtttcgaac agacgtattc taatgaaaat gaaaacaatt tgatgtttga aaattttcaa 2220
tatgtagaac ttagaaatat tttttcggta gatgctccat tagaaaatca tcaagtaagt 2280
atacaaaatt atcaaggtaa tggttttgtt attatagacc gaatcgaatt catcccagta 2340
aatgcaacat atgaggcaga acaagattta gattcggcaa agaaagcagt gaataccttg 2400
tttacgaata caaaagatgg tttacgacca ggggtaacgg attatgaagt gaatcaagcg 2460
gcaaacttag tggaatgcct atcggatgat ttgtatccaa atgaaaaacg cttgttattt 2520
gatgcagtga aagaggcaaa acgactcagc gaggcacgta acttactaca agatccagat 2580
ttccaagaga taaatggaga aaatggatgg accgcaagta caggaattga ggttgtagaa 2640
ggagatgctc tatttaaagg gcgttatcta cgcctaccag gtgcgagaga aatggataca 2700
gaaacgtatc caacgtatct gtatcaaaaa gtagaggaag gtgtattaaa accatacaca 2760
agatatagat tgagagggtt tgtcggaagc agtcaaggct tggaaatttc cacaattcgt 2820
catcagacga accgaattgt aaaaaatgtt ccagatgatt tattaccaga tgtacctcct 2880
gtaaactctg atggtagaat caatcgatgc agcgaacaaa agtatgtgaa tagccgttta 2940
gaaggagaaa gaggattacc aaatgggaat cgttctgctg aagcgcatga attctctctc 3000
cctattgata taggagagct ggattacaat gaaaatgcag gaatatgggt tggatttaag 3060
attacggacc cagagggata tgcaacactc ggtaaccttg aattggtaga agagggacca 3120
ttgtcaggag acgcactaga acgcctgcaa agagaagaac aacagtggaa gcttcaaatg 3180
acaaaaagac gtgaagagac ggatagaaaa tatacggcag caaaacaagc ggtagatcgt 3240
ttatatgcag attaccaaga tcaacaattg aatccaaacg tagaaattac ggatattact 3300
gcggcccaaa acctgataca gtccattcct tatgtatata atgaaatgtt cccagaaata 3360
caagggatga actatacgaa gtacacagag ttaacaaatc gactccaaca agcgtggggt 3420
ttgtatgatc aacgaaacgc cataccaaat ggtgatttcc gaaatgaatt aagtaattgg 3480
aatacaacat ctggtgtaaa tgtacaacaa atcaacaata cgtctgtctt agtcatgcca 3540
aactgggatg ggcaagtttc gcaacagttt acagttcaac cgaatcaaag atatgtatta 3600
cgagttactg caagaaaaga aggggtaggg aatgggtatg tgagtatccg tgatggtgga 3660
aatcaaacag aaacgcttac gtttagtgca agcgattata acacagatag tgtgtataat 3720
acgcaagtgt cgaatacaaa tggtttgtac aatgagcaaa caggatatac cacaaaaaca 3780
gtgacattca tcccatatac agatcaagtg tggattgaga tgagcgagac cgaaggtatg 3840
ttctatatag aaagtgtcga attgattgtt gacg
agt aatggtagta cccctccaga 3900
End codon
tacaggtttc atctggaggg gtttttttct gaaaaagggc ctttttgtag agaagaatcc 3960
gattatttta ttacgattat atattttgtg gatagatcat ggtacc 4006
SEQ ID NO 4(Cry8Fa1蛋白的氨基酸序列)：
MSPNNQNEYE IIDMAPSTSV TNDSNRYPFA NEPTNALQNM NYKDYLRMSE GYSPEYLTSL 60
SPYSQFGTVD KIISIISLLN SAAGIPGLDF FTGLLQFILD FFAPEDPWAE LMELVEQLID 120
QKITVATREK ALAELRGLIN GYLVYQQSLE SWLENPNATR ASIVREQYVA LELDFVTSIS 180
SFAIAGQEVP LLAVYAQAAN LHLLLLRDVS IFGEEWGLTV NEVNTFYIRQ MTYTTEYSDY 240
CVRIYNTGLN KLKGSSASSW VDYNRFRREM NLLVLDIIAL FPNYDVRRYP METTTELTRV 300
VYTDPIVFDE RKGVASTHSW TAIAPSFSSI ESLTRRPGLF TWLDQLTIFS KRISQPSVFI 360
NSWAGHKIST FRTQKTDILI NTTHGDTNNP IKEFVVDTKK VEDIYQTIAY PHAVANEVFY 420
LFGVPKVDFN MVPAGGSANS AHTLIFSDST GGRLESITKN SEAELPPTES LSDTPQPNQV 480
TYSHRLDYAT IIKANKSYGS GYIPLLGWTH RSVDRNNTIY PNKITQIPAV KAFSYTESFN 540
VNVIAGPGFT GGDLISLGHL ENIYMKLNVP NPQKFRVRIR YAASTTSYLQ ITGLSNLAQS 600
DRFEQTYSNE NENNLMFENF QYVELRNIFS VDAPLENHQV SIQNYQGNGF VIIDRIEFIP 660
VNATYEAEQD LDSAKKAVNT LFTNTKDGLR PGVTDYEVNQ AANLVECLSD DLYPNEKRLL 720
FDAVKEAKRL SEARNLLQDP DFQEINGENG WTASTGIEVV EGDALFKGRY LRLPGAREMD 780
TETYPTYLYQ KVEEGVLKPY TRYRLRGFVG SSQGLEISTI RHQTNRIVKN VPDDLLPDVP 840
PVNSDGRINR CSEQKYVNSR LEGERGLPNG NRSAEAHEFS LPIDIGELDY NENAGIWVGF 900
KITDPEGYAT LGNLELVEEG PLSGDALERL QREEQQWKLQ MTKRREETDR KYTAAKQAVD 960
RLYADYQDQQ LNPNVEITDI TAAQNLIQSI PYVYNEMFPE IQGMNYTKYT ELTNRLQQAW 1020
GLYDQRNAIP NGDFRNELSN WNTTSGVNVQ QINNTSVLVM PNWDGQVSQQ FTVQPNQRYV 1080
LRVTARKEGV GNGYVSIRDG GNQTETLTFS ASDYNTDSVY NTQVSNTNGL YNEQTGYTTK 1140
TVTFIPYTDQ VWIEMSETEG MFYIESVELI VDVE 1174
Claims (5)
1.一种苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.1242。
2.权利要求1的菌株在杀灭鞘翅目害虫中的应用。
3.一种从权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株分离克隆的cry8E基因，其特征是该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
4.一种Cry8Ea1蛋白，其特征是该蛋白是由权利要求3的基因所编码，且氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
5.一种增强对鞘翅目害虫毒性的方法，其特征是该方法协同组合使用cry8F基因和权利要求3的cry8E基因，所述cry8F基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100098082A CN1323159C (zh) | 2004-11-16 | 2004-11-16 | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株和基因 |
| PCT/CN2005/001133 WO2006053473A1 (fr) | 2004-11-16 | 2005-07-27 | Souche de bacillus thuringiensis et genes a haute activite larvicide sur les coleopteres |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100098082A CN1323159C (zh) | 2004-11-16 | 2004-11-16 | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株和基因 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2007100905422A Division CN100532555C (zh) | 2004-11-16 | 2004-11-16 | 对鞘翅目害虫高效的cry8F基因、其表达蛋白及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1609191A CN1609191A (zh) | 2005-04-27 |
| CN1323159C true CN1323159C (zh) | 2007-06-27 |
Family
ID=34763102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100098082A Active CN1323159C (zh) | 2004-11-16 | 2004-11-16 | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株和基因 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1323159C (zh) |
| WO (1) | WO2006053473A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101130762B (zh) * | 2007-08-07 | 2010-08-25 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8H基因、蛋白及其应用 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7329736B2 (en) * | 2006-04-14 | 2008-02-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacillus thuringiensis cry gene and protein |
| CN101113424B (zh) * | 2007-07-04 | 2010-12-29 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8G基因、蛋白及其应用 |
| CN101531980B (zh) * | 2009-04-13 | 2010-05-12 | 四川农业大学 | 苏云金芽孢杆菌hs18-1及其应用 |
| MX356526B (es) | 2012-03-09 | 2018-06-01 | Vestaron Corp | Produccion de peptidos toxicos, expresion de peptido en plantas y combinaciones de peptidos ricos en cisteina. |
| US11692016B2 (en) | 2012-03-09 | 2023-07-04 | Vestaron Corporation | High gene expression yeast strain |
| CN102659933B (zh) * | 2012-04-21 | 2013-12-25 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 苏云金芽胞杆菌基因cry8like、与cry8G组合及其应用 |
| US11447531B2 (en) | 2016-10-21 | 2022-09-20 | Vestaron Corporation | Cleavable peptides and insecticidal and nematicidal proteins comprising same |
| CN116649372B (zh) * | 2023-07-26 | 2023-10-27 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种微生物组合物及其在防治鞘翅目害虫中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5554534A (en) * | 1991-12-16 | 1996-09-10 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis toxins active against scarab pests |
| US7605304B2 (en) * | 2000-10-24 | 2009-10-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Genes encoding novel bacillus thuringiensis proteins with pesticidal activity against coleopterans |
-
2004
- 2004-11-16 CN CNB2004100098082A patent/CN1323159C/zh active Active
-
2005
- 2005-07-27 WO PCT/CN2005/001133 patent/WO2006053473A1/zh active Application Filing
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specific for scarabaeid beetles. Ohba,M et al,Letters in Applied Microbiology,Vol.14 1992 * |
| A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specific for scarabaeid beetles. Ohba,M et al,Letters in Applied Microbiology,Vol.14 1992;一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株 冯书亮，等，中国生物防治，第16卷第2期 2000 * |
| 一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株 冯书亮，等，中国生物防治，第16卷第2期 2000 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101130762B (zh) * | 2007-08-07 | 2010-08-25 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8H基因、蛋白及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1609191A (zh) | 2005-04-27 |
| WO2006053473A1 (fr) | 2006-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Beegle et al. | Invitation paper (CP Alexander Fund): history of Bacillus thuringiensis Berliner research and development | |
| CA2199049C (en) | Novel pesticidal proteins and strains | |
| CN101113424B (zh) | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8G基因、蛋白及其应用 | |
| CN101292035B (zh) | 编码苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白的基因cry7Bal | |
| CN101130762B (zh) | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8H基因、蛋白及其应用 | |
| KR20010099680A (ko) | 살충성 단백질 | |
| Zhang et al. | Cloning and characterization of a novel cry8Ab1 gene from Bacillus thuringiensis strain B-JJX with specific toxicity to scarabaeid (Coleoptera: Scarabaeidae) larvae | |
| CN1323159C (zh) | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株和基因 | |
| CN100532555C (zh) | 对鞘翅目害虫高效的cry8F基因、其表达蛋白及其应用 | |
| CN101984045B (zh) | 苏云金芽孢杆菌cry8Na1基因，表达蛋白及其应用 | |
| AU667041B2 (en) | Novel nematode-active toxins and genes which code therefor | |
| CN101497657B (zh) | 一种新的杀虫Bt蛋白Cry54Aa1、其编码基因及应用 | |
| CN102781955B (zh) | Bt蛋白Cry4Cb2、其编码基因及应用 | |
| CN102363631B (zh) | 一种杀虫Bt蛋白Cry8Qa1、其编码基因及应用 | |
| EP0945510A1 (en) | STRAIN BELONGING TO THE GENUS $i(BACILLUS) AND INSECTICIDAL PROTEINS | |
| US20110201549A1 (en) | Enhancement of Bacillus Thuringiensis Cry Toxicities to Lesser Mealworm Alphitobius Diaperinus | |
| CN101413007B (zh) | 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽胞杆菌cry8Ⅰ基因、蛋白及其应用 | |
| CN101591381A (zh) | Bt蛋白Cry4Cb1、其编码基因及应用 | |
| CN104211790A (zh) | 一种高效杀灭同翅目害虫的Bt蛋白Cry21NJ、编码基因及其应用 | |
| Gleave et al. | Cloning and nucleotide sequence of an insecticidal crystal protein gene from Bacillus thuringiensis DSIR732 active against three species of leafroller (Lepidoptera: Tortricidae) | |
| CN101300268A (zh) | 新的具有杀虫活性的细菌蛋白质 | |
| WO2001000840A9 (en) | Insecticidal and nematicidal proteins | |
| CN103103203A (zh) | 一种Bt cry54Ab1基因及其编码蛋白和应用 | |
| WO2010118630A1 (zh) | 杀虫晶体蛋白基因Cry52Ba1及其编码蛋白和应用 | |
| CN102363630A (zh) | 一种杀虫Bt蛋白Cry8Pa1、其编码基因及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Beijing Dabeinong Technology Group Co., Ltd. Assignor: Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences | Institute of Plant Protection, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences Contract record no.: 2012990000249 Denomination of invention: Bacillus thringiensis strain and gene with high effect on coleoptera pests Granted publication date: 20070627 License type: Exclusive License Open date: 20050427 Record date: 20120419 |
|
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract | ||
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Beijing Dabeinong Technology Group Co., Ltd. Assignor: Institute of plant protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences| Institute of plant protection, Hebei Academy of agriculture and Forestry Sciences Contract record no.: 2012990000249 Date of cancellation: 20170313 |