CN101300268A

CN101300268A - 新的具有杀虫活性的细菌蛋白质

Info

Publication number: CN101300268A
Application number: CNA2006800328645A
Authority: CN
Inventors: M·索贝隆恰维斯; A·布拉沃-德-拉-帕拉
Original assignee: Universidad Nacional Autonoma de Mexico
Current assignee: Universidad Nacional Autonoma de Mexico
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2006-07-04
Publication date: 2008-11-05
Also published as: EP1904521A2; US8173871B2; BRPI0613111A2; WO2007007147A3; US20090144854A1; WO2007007147A2; US20140304855A1; US20120255065A1; US8822157B2; ES2435079T3; EP1904521B1; CA2625061A1

Abstract

本发明提供了类似S层蛋白质的杀虫特别是杀昆虫蛋白质，还有其变体或突变体及编码它们的DNA。还提供了使用所述DNA或蛋白质用于控制害虫特别是植物昆虫害虫的方法和手段。

Description

新的具有杀虫活性的细菌蛋白质

发明领域

本发明涉及害虫控制、特别是昆虫控制领域，提供了编码命名为ISLP蛋白质的杀虫蛋白质其毒性片段或变体的重组DNA序列，其有效用于保护生物体不受害虫损伤，如保护植物不被昆虫损伤。还提供了含有编码本发明的ISLP蛋白质的核酸分子的植物，及使用这些核酸序列来减少害虫如昆虫对于植物的危害的方法和手段。

技术背景

使用细菌生物杀虫剂如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是农业及其他领域(即疾病载体)用于昆虫控制的可行选择，这将会以经济上可持续和环境上友好的方式增加作物产量。Bt的Cry蛋白质是高度特异性的，对于人类、脊椎动物和植物无害，并且是可完全生物降解的，所以不会在环境中累积残留的毒性产物(Schnepf等，1998)。迄今为止超过200种cry基因序列已经被确定并分类成44个家族和不同的亚类(Crickmore等，1998，2005)。此外，Bt生产许多可能对毒力有贡献的胞外化合物，如磷脂酶、蛋白酶、几丁质酶及其他毒素如β-外毒素或VIP蛋白质(Schnepf等，1998)。

尽管过去十年来进行了广泛研究，但只有少数的细菌杀昆虫毒素大规模地用于最具破坏性虫害的生物害虫防治应用，例如那些使用Bt植物的应用。

S层是蛋白质原性晶格排列的有序结构，覆盖在许多古细菌和真细菌的表面(Beveridge等，1997；Sara和Sleytr，2000)，并构成高达总细胞蛋白质的15％。S层蛋白质的功能还没有被精确地说明，但是认为这些蛋白质参与细胞完整性和形状的维持。因为它们是最外层的细胞被膜组分，还有人假设其可能参与与环境间的大分子交换(Beveridge等，1997)。在某些革兰氏阴性致病细菌中，它们已经与毒力和补体介导的杀伤抗性相牵连(Sara和SLeytr，2000；Pei和Blaser，1990)。据描述在蜡状芽孢杆菌(B.cereus)中，S层能促进和人类白细胞及与宿主间的相互作用，促成了致病性(Kotiranta等，1998)。认为在炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)中，S层和荚膜可能协同地和宿主相互作用(Mignot等，2002)。

已描述了炭疽芽孢杆菌中两种不同的S层蛋白质(SAP和EA1)(Mignot等，2002)。这些蛋白质的存在并非杆菌正常荚膜化所必需的(Mesnage等，1998)。这些蛋白质以生长阶段依赖性的方式陆续出现，SAP的合成在EA1合成之前(Mignot等，2002)。描述了苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(B.thuringiensis subs.galleria)的S层蛋白质SlpA，它与炭疽芽孢杆菌的SAP蛋白质类似。在苏云金芽孢杆菌幕虫亚种(B.thuringiensis subsp.finitimus)中描述了S层CTC蛋白质(GenBank登录号AAR23791)，此蛋白质和炭疽芽孢杆菌的EA1类似(Sun等，2001)。CTC分子大小为100kDa，并在生长的芽孢形成期能形成类芽孢体。

Xu等(2004)描述了在SDS-PAGE分析正处于芽孢形成期中的苏云金芽孢杆菌菌株的晶体/芽孢混合物时，存在120kDa的蛋白质。发现溶解、离心并透析之后获得的此晶体/芽孢混合物的上清液能延长用传染性伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)血样注射的小鼠的存活。该120kDa蛋白质的N端序列(15个氨基酸)显示出和苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种S层蛋白质N端100％的同源性(Mesnage等，1998报道)。未提供此蛋白质编码基因的核苷酸序列，但据说编码821个氨基酸残基，推断具有87.5kDa的分子量。在此文献中未测定分离或纯化的蛋白质或生产此蛋白质的重组宿主针对疟原虫感染的功效。并且，此文章中没有保藏或具体描述从中分离这种晶体/芽孢混合物的菌株。

发明概述

本发明提供了分离的杀虫ISLP蛋白质，其特征在于：

a)对于一些害虫具有特异性杀虫活性，而对于其他害虫则没有，且

b)与细菌S层蛋白质具有至少50％的序列同一性，以及这样的蛋白质：其与SEQ ID NO：2的蛋白质或其毒性片段具有至少50％的序列同一性，且具有大约50到大约120kDa的分子量。

本文还提供了分离的杀虫ISLP蛋白质，其特征在于：

a)对于一些昆虫具特异性杀昆虫活性，而对于其他昆虫则没有，

b)与细菌S层蛋白质具有至少70％的序列同一性，

c)大约50到大约120kDa的分子量，以及这样的蛋白质：其与SEQ IDNO：2的蛋白质或其毒性片段具有至少75％的序列同一性，且具有大约50到大约120kDa的分子量。

根据本发明还提供了如上文所定义的ISLP杀虫蛋白质，含有SEQ IDNO：2中始于第1位氨基酸和第31位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列，或者含有SEQ ID NO：2中始于第1位氨基酸和第531位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列，例如含有SEQ IDNO：2氨基酸序列的蛋白质。

本文还包括分离的编码任一上述ISLP蛋白质的DNA序列及嵌合基因，所述嵌合基因包含：a)含有这样的DNA的编码序列，及b)允许在植物细胞中表达的启动子。在一实施方案中，这样的嵌合基因含有的编码序列是经优化的合成DNA序列，以便在宿主植物特别是玉米、棉花、大豆、稻、油菜、花椰菜及甘蓝中表达。

本文还提供了含有此类上述嵌合基因的植物转化载体。

在本发明另一实施方案中，提供了含有任一上述嵌合基因的转基因植物、种子或植物细胞，特别是玉米、棉花、大豆、稻、油菜、花椰菜及甘蓝的植物、种子或细胞。

本文还提供了保护植物对抗以所述植物所属的植物物种为食的植物害虫如昆虫害虫导致的损伤的方法，包括在所述植物的细胞中表达任一上述嵌合基因的步骤；还有保护植物对抗以所述植物所属的植物物种为食的植物害虫例如昆虫害虫导致的损伤的方法，包括以任一上述嵌合基因转化植物细胞，将所述细胞再生为植物，和获得含有任一这类嵌合基因的所述植物的后代或繁殖材料例如种子的步骤。

本发明还提供了用于杀死害虫的方法，包括用任一上述ISLP蛋白质接触所述害虫，特别是这样的害虫是昆虫类害虫的时候；以及保护田间植物对抗害虫如昆虫的方法，包括：对田间植物应用任一上述ISLP蛋白质，或者以含有此类蛋白质的杀虫组合物的形式，或者以表达所述蛋白质的重组生物体的形式，特别地，其中所述的生物体是表达此类蛋白质的转基因植物。

本文还提供了编码任一上述ISLP蛋白质或其毒性片段的任一DNA、或任一上述嵌合基因，或任一上述ISLP蛋白质在控制或杀死害虫如昆虫害虫中的用途。

本发明实施方案的详细描述

本发明提供了用于减轻害虫特别是昆虫害虫如鞘翅目(Coleopteran)或鳞翅目(lepidopteran)虫害所导致的植物损伤的方法和手段。本发明还提供了与从前描述的核酸序列和蛋白质截然不同的新的核酸序列和蛋白质。这些核酸和蛋白质能用于控制害虫如昆虫害虫，例如通过在植物或植物细胞中整合并表达至少一种这些新核苷酸序列，或者通过用含有这些核酸分子编码的毒素的组合物来外部处理植物或植物部分。

本发明提供了新的来自于细菌菌株的杀虫毒素，及其在控制害虫例如昆虫中的用途。

根据本发明，“核酸序列”意指DNA或RNA分子，是单链或双链形式，其编码本发明的任一ISLP蛋白质。本文使用的术语“分离的核酸序列”不局限于分离状态的核酸序列，还包括不再处于其分离自的天然环境的核酸序列。因而，根据本发明，“分离的ISLP核酸(序列)”或“分离的ISLP蛋白质(序列)”包括相较于原始细菌生物体的另一细菌宿主中或在植物核基因组中的核酸或蛋白质(序列)。

根据本发明，术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，是指由氨基酸链组成的分子，而不考虑任何具体作用方式、大小、三维结构或来源。因此，本发明ISLP蛋白质的片段或部分在本文仍称为“蛋白质”。本文使用的短语“分离的蛋白质”不局限于分离状态的蛋白质，还包括不再处于其天然环境的蛋白质。蛋白质的天然环境意指在其中该蛋白质能被从自然中找到的环境，即核苷酸序列最初被分离自的菌株。例如，分离的蛋白质可以体外存在，或是在另一细菌宿主或植物细胞中，或者其能分泌自另一细菌宿主或植物细胞。

根据本发明，编码新ISLP蛋白质的核酸序列，包括DNA序列，已被分离和表征，且通过DNA合成人工制备了新形式。本文所述的具体ISLP基因命名为islp1，而它编码的蛋白质命名为ISLP1。

根据本发明，“ISLP”或“ISLP蛋白质”是杀虫、特别是杀昆虫蛋白质，大约40到大约250kDa，特别是约50到约120kDa，或是约60到约100kDa，尤其是大约80或大约100kDa的蛋白质，分离或来源自细菌优选杆菌，和已知的S层蛋白质如苏云金芽孢杆菌CTC的CTC2蛋白质(GenBank登录号AAR23791)具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、优选至少85％或90％的序列同一性或序列相似性；及其任何毒性片段(如本文定义)或变体如前体蛋白质、成熟形式、或与信号肽、与选择性标记蛋白质、或与其他杀虫或杀昆虫蛋白质的融合蛋白质。本文使用的ISLP蛋白质的变体包括与ISLP蛋白质免疫相关的杀虫优选杀昆虫蛋白质，从而它们能被识别ISLP的抗体识别。本发明的ISLP优选来源于或见于厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)的细菌中(或其上)。在本发明的另一实施方案中，本发明ISLP来源于或见于芽孢杆菌目(Bacillale)细菌中(或其上)。而在本发明另一实施方案中，本发明ISLP来源于或见于芽孢杆菌科(Bacillaceae)细菌中(或其上)。在本发明另一实施方案中，ISLP来源于或见于蜡状芽孢杆菌群细菌中(或其上)、或见于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)或芽孢杆菌属(Bacillus)，优选蜡状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、炭疽芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和苏云金芽孢杆菌中(或其上)。根据本发明的ISLP蛋白质可以在细菌生命周期的营养生长期和/或芽孢形成期产生，并且一般本质上是分泌型蛋白质。根据本发明，ISLP蛋白质的毒性优选是特异性的，从而所述ISLP只对于一些害虫优选昆虫有毒性，而非目标生物如哺乳动物不受影响。本发明的一个实施方案中，ISLP蛋白质对于哺乳动物无毒，或易于在哺乳动物消化系统中被降解。

本文使用的“成熟ISLP蛋白质”意指本发明缺少其细菌信号肽的ISLP蛋白质。本文使用的ISLP蛋白质可以是有全长大小的蛋白质或是截短形式，只要其杀虫例如杀昆虫活性或控制害虫例如控制昆虫的活性能保留即可，或者可以是杂合或融合蛋白质形式的几个蛋白质或蛋白质结构域的组合。

在本发明一个实施方案中，ISLP蛋白质是杀虫蛋白质，特别是杀昆虫蛋白质，特异性地对某些害虫优选昆虫有毒性，能够形成晶体结构如晶格阵列或天然细菌细胞外侧的S层。本发明的一个实施方案中，这样的ISLP通常可在分离细菌如苏云金芽孢杆菌(Bt)的晶体/芽孢制品的操作中被分离或共纯化，不过它们与已知的细菌杀虫或杀昆虫毒素如苏云金芽孢杆菌Cry、VIP或Cyt蛋白质(见Crickmore等，1998和2005)、或其它已知的杀虫或杀昆虫细菌蛋白质如Bt蛋白质不具显著的序列同一性，优选低于40％、低于30％或低于20％的序列同一性。这些ISLP天然地见于细菌细胞壁的外侧，能够在芽孢形成时释放到细菌或芽孢的环境中。

在一实施方案中，ISLP是杀虫特别是杀昆虫蛋白质，包含三个S层同源(SLH)区域，这些区域各自与SEQ ID NO：2的S层同源区域具有至少50％、或至少60％、或至少70％、特别是至少85％或90％的序列同一性或相似性。本文使用的SEQ ID NO：2的ISLP蛋白质的“S层同源区域”是SEQID NO：2中第34-76位氨基酸的区域、第95-136位氨基酸的区域及第162-198位氨基酸的区域。

如本文定义，本发明还提供了ISLP蛋白质用于控制或杀死害虫例如昆虫的用途，例如通过在田间播种种子或种植表达ISLP蛋白质的植物，或者通过对植物上或动物应用ISLP蛋白质来保护不受害虫例如昆虫损伤。还提供了用于提高产率或增强作物生产力的方法，其包括培养含有编码本发明ISLP蛋白质的DNA的作物的步骤。

根据本发明，提供了用于自杆菌中分离ISLP蛋白质的步骤。在一实施方案中，杆菌在分离ISLP蛋白质之前无需或无需太多的传代培养步骤，因为延长传代会降低ISLP蛋白质的产量。可选的，自其中分离ISLP的杆菌可以生长在易感害虫优选昆虫害虫中，例如通过将其施加到它们的消化系统或血淋巴中。该杆菌生产的ISLP蛋白质然后可以从害虫如昆虫中例如从它的内脏或淋巴中分离，优选从那些在应用ISLP生产菌之后死亡的或显示出严重的生长抑制的害虫或昆虫中分离。在这个过程中，产生对于某个靶害虫例如昆虫害虫具高毒性的ISLP的细菌将很容易通过它们对于靶害虫的明显效应来鉴定。同样，优选靶害虫和体内靶害虫环境能诱导高水平的ISLP蛋白质。通常ISLP蛋白质能从细菌中分离，例如从培养上清液特别是离心后芽孢形成培养物、或像苏云金芽孢杆菌的Cry蛋白质那样一般被富集和分离。本文使用的术语“杆菌”意指杆状细菌。这些包括芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目或芽孢杆菌科的细菌，例如蜡状芽孢杆菌群的细菌，或芽孢杆菌属的细菌例如苏云金芽孢杆菌。

在本发明的一实施方案中，提供了用于分离新的杀虫优选杀昆虫ISLP蛋白质，特别是对于鳞翅目或鞘翅目昆虫有毒性的ISLP蛋白质的方法。这样的方法包括步骤：筛选杀虫(优选杀昆虫)杆菌(优选Bt)培养物中与ISLP具有高度序列相似性的基因，特别是在杀虫(例如杀昆虫)的杆菌菌株(优选Bt菌株)中，在PCR分析中Cry或VIP基因阴性，特别是在对于某些害虫显示出特异性毒性而不对其它害虫作用的菌株中。这样的具有高度序列相似性的基因可以用PCR技术和ISLP特异性引物(如针对ISLP蛋白质的S层同源区域的引物，例如ISLP1的S层同源区域)来识别。然后可以分离出相应的基因并通过重组表达技术生产新的ISLP蛋白质。

本文使用的“kDa”意指以千道尔顿表示的蛋白质分子量大小。本文与术语“大约”一起使用或就约数(“约80kDa”)而言的“kDa”，意指在标准的蛋白质SDS-PAGE/Western印迹(即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳/蛋白质分析)中与分子量标准相比观察到的分子量。SDS-PAGE/Western印迹使用标准技术进行。优选蛋白质或蛋白质片段通过免疫交叉反应(例如Western印迹)或通过其特征(例如S层蛋白质或其片段的典型蛋白质特征)证实为ISLP蛋白质。

本文使用的“S层蛋白质”或“表面层蛋白质”意指分泌自生产它的细胞的蛋白质，并且在原核生物特别是细菌表面能形成晶格阵列或点阵。此类点阵多数通过蛋白质亚基自组装形成于原核生物表面，因而形成平坦的晶体层面。例子有Luckevich和Beveridge(1989)、Sleytr和Beveridge(1999)及Mesnage等(2001)所述的S层蛋白质，特别是Bt菌株的S层蛋白质CTC，GenBank登录编号AAR23791的S层蛋白质。

ISLP蛋白质的一个例子是本发明的ISLP1蛋白质。根据本发明，“ISLP1蛋白质”意指包含保留杀昆虫活性的SEQ ID NO：2氨基酸序列的最小毒性片段(下文称为“最小ISLP1毒性片段”)的任何蛋白质，特别是包含SEQ ID NO：2中始于第1位氨基酸和第31位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列的任何杀昆虫蛋白质，或是含有SEQ IDNO：2中始于第1位氨基酸和第531位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列的任何杀昆虫蛋白质，或是含有来自SEQ ID NO：2蛋白质的蛋白酶消化特别是胰蛋白酶消化片段的氨基酸序列的任何杀虫蛋白质，特别是通过胰蛋白酶消化自SEQ ID NO：2成熟蛋白质得到的约30、约40、约50或约60kDa的蛋白质。本文包括ISLP1蛋白质与植物信号肽如叶绿体转运肽融合而产生融合蛋白质。这包括含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的最小毒性片段的杂合或嵌合蛋白质。本文使用的ISLP1蛋白质中包括SEQ ID NO.2蛋白质的杀昆虫蛋白质水解片段，优选胰蛋白酶消化片段，或SEQ ID NO.2蛋白质的任何杀昆虫有效片段，以及含有某些氨基酸缺失、添加或替换而仍保持全部或多数ISLP1蛋白质杀昆虫活性的其变体或等同体。本文包括成熟的ISLP蛋白质，缺少其信号肽或具有以甲硫氨酸或以Met-Ala或Met-Asp二肽替换的信号肽。

在本定义中还包括SEQ ID NO：2氨基酸序列的变体，如与SEQ ID NO：2基本上相似的氨基酸序列，在氨基酸序列水平上具有至少70％、或至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。在本发明上下文中，“序列同一性”可以使用威斯康星(Wisconsin)GCG包(麦迪逊，威斯康星，美国，第10.2版)的GAP程序用成对比对来确定。对于氨基酸序列比较GAP程序使用下列参数：‘blosum62’得分矩阵、‘空位建立罚分’(或‘空位权重’)为8、而‘空位延伸罚分’(或‘长度权重’)为2。根据本发明的杀昆虫蛋白质可能有一些氨基酸添加、替换或缺失而不会显著改变或降低蛋白质的杀昆虫活性。

本文使用的术语“包含”应被阐释为规定存在所提及的所述特征、要素、步骤或组分，但不排除存在或增加一个或多个特征、要素、步骤或组分或其群组。因此，此处提到的“包含序列或区域X”的DNA或蛋白质意指至少包括或含有该序列或区域X的DNA或蛋白质，因此其它核苷酸或氨基酸序列可包含在5’(或N-末端)和/或3’(或C-末端)端。例如，核苷酸序列可以包含编码转运肽和/或5’或3’前导序列的核苷酸序列。

本文使用的ISLP蛋白质的“毒性片段”是ISLP蛋白质的片段或部分，其保留一些或全部、优选多数杀虫(优选杀昆虫)成熟ISLP蛋白质的毒性。一般此类毒性片段通过剪切信号肽或通过酶促消化全长或成熟ISLP蛋白质获得，例如通过害虫优选昆虫肠道酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或其它在靶害虫消化系统中有活性的蛋白酶例如靶昆虫中肠消化酶来消化。一般此类毒性片段具有大约40到大约80kDa的分子量，优选大约50或大约60kDa。本发明ISLP1蛋白质的毒性片段是大约50kDa的胰蛋白酶消化片段。ISLP蛋白质的“最小毒性片段”是ISLP蛋白质的最小毒性的片段。这样的最小毒性片段可以通过酶促切割或通过表达具有核苷酸缺失的islp DNA来获得。编码毒性ISLP片段的DNA还可以是化学合成的，因此，毒性片段的定义包含可从转录和翻译合成DNA获得的毒性片段。包含最小ISLP毒性片段的任何蛋白质都可用于本发明，并且不仅仅是原始或成熟的ISLP蛋白质，因为对于毒性并非必需的氨基酸序列可以被缺失或被其他序列替换而仍保持ISLP蛋白质的特征。

ISLP蛋白质的毒性片段还可以通过细菌自溶时ISLP蛋白质的降解和溶解作用来获得，例如在害虫消化系统中，如昆虫的中肠里，或是在体外培养物的芽孢形成时获得。出现了仍然能被抗ISLP抗体免疫检测的更小更可溶的片段，并且能在自溶后用常规技术如抗体介导的纯化来鉴定或分离。

本文使用的“靶害虫”是害虫，优选昆虫，其能被ISLP所杀死或负面影响(例如抑制其生长)。当以此害虫或昆虫感染产ISLP蛋白质的细菌或以之为食时，或以含有分离的ISLP蛋白质的食物喂养时，所述害虫或昆虫显示出高于对照水平的毒性。

本发明ISLP蛋白质可能的鳞翅目靶昆虫包括但不限于：美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)、棉螟蛉(Helicoverpa armigera)、澳洲棉铃虫(Helicoverpapunctigera)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、三化螟(Scirphophaga incertulas)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、大螟(Sesamia inferens)、玉米斑点螟(Chilopartellus)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、大豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、大豆食心虫(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu。

本发明ISLP蛋白质的其它可能靶昆虫选自：苜蓿绿夜蛾(Plathypenascabra)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、黄斑夜蛾(Spodopteraornithogalli)、二化螟(Chilo suppressalis)、Hereitogramma licarisalis、稻螟蛉(Naranga aenescens)、稻眉眼蝶(Mycalesis gotama)、Marasmiapatnalis、稻显纹刷须野螟(Marasmia exigua)、Marasmia ruralis、三点水螟(Nymphula depunctalis)、稻白螟(Scirpophaga innotata)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、Chilo polychrysus、Rupela albinella、小蔗螟(Diatraeasaccharalis)、草地夜蛾、粘虫(Mythimna unipuncta)、Chilo zacconius和直纹稻弄蝶(Parnara guttata)、杨毛臀萤叶甲(Agelastica alni)、苜蓿叶象(Hypera postica)、Hypera brunneipennis、Haltica tombacina、墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、赤拟谷盗(Triboleumcastaneum)、稻铁甲虫(Dicladispa armigera)、Trichispa serica、稻负泥虫(Oulema oryzae)、Colaspis brunnea、稻水象甲(Lissorhorptrusoryzophilus)、黄曲条跳甲(Phyllotreta cruciferae)、黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata)、油菜蚤跳甲(Psylliodes punctulata)、芫菁红叶甲(Entomoscelisamericana)、油菜露尾甲(Meligethes aeneus)、Ceutorynchus sp.、油菜蓝跳甲(Psylliodes chrysocephala)、豌豆细纹跳甲(Phyllotreta undulata)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、黄瓜叶甲(Diabroticaundecimpunctata undecimpunctata)、黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpunctata howardi)、北部玉米食根虫(Diabrotica barberi)和西部食根虫(Diabrotica virgifera)。

本文使用的术语“islp DNA”或“ISLP DNA”意指编码ISLP蛋白质的任何DNA，例如编码如上文所定义的“ISLP1蛋白质”的DNA，如SEQID NO：1所示的islp1 DNA，特别是自第325位核苷酸到第2913位核苷酸，优选自第412位核苷酸到第2913位核苷酸。这包括编码SEQ ID NO：2蛋白质或如上文所定义的其毒性片段或变体的天然产生的人工或合成的DNA序列。本文还包括编码杀昆虫蛋白质的DNA序列，其与编码本发明ISLP蛋白质的DNA足够相似，从而能够(即具有能力)在严格杂交条件下与这些DNA序列杂交。

本发明还包括根据本发明分离的islp基因的任何启动子及其用途，例如SEQ ID NO：1的islp1 DNA的启动子区域，其能够提供用于细菌表达的强启动子。本文使用的islp1 DNA的启动子包含SEQ ID NO：1中第1位至第324位核苷酸的序列。

本文使用的“严格杂交条件”特别指下列条件：在滤膜上固定相应的DNA，并将滤膜在42℃于50％甲酰胺、5％SSPE、2×Denhardt’s试剂和0.1％SDS中预杂交1到2小时，或者在68℃于6×SSC、2×Denhardt’s试剂和0.1％SDS中预杂交1到2小时。然后直接把变性(地高辛或放射性)标记的探针加入到预杂交液中，并在上述的合适温度下进行孵育16到24小时。在孵育后，在室温于2×SSC、0.1％SDS中洗涤滤膜30分钟，继以在68℃于0.5×SSC和0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟。在-70℃利用增感屏通过曝光滤膜24到48小时到X光片(柯达XAR-2或等同物)来完成放射性自显影(20×SSC＝3M NaCl和0.3M柠檬酸钠；100×Denhardt’s试剂＝2％(w/v)牛血清白蛋白，2％(w/v)Ficoll^TM及2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮；SDS＝十二烷基硫酸钠；20×SSPE＝3.6M NaCl，0.2M磷酸钠和0.02MEDTA pH7.7)。本领域普通技术人员能容易地改良上面说明的具体条件和参数而保持期望的严格杂交条件。

对于分离本发明DNA序列的变体有很多本领域已知的方法。例如，变体可以通过在上面所述的杂交和/或通过本领域已知的PCR技术从细菌菌株如杆菌特别是芽孢杆菌属物种中检测和分离。可以制备islp DNA序列区域的特异性或简并引物，并用来扩增已知或新细菌菌株的变体。

本发明islp DNA的变体包括编码上述ISLP蛋白质变体的DNA序列，或编码与本发明islp DNA序列如SEQ ID NO：1、优选第412位至第2913位核苷酸具有至少60％、至少65％、至少70％、80％或90％同一性的杀昆虫蛋白质的DNA序列。提及的序列同一性利用威斯康星GCG包(麦迪逊，威斯康星，美国)第10.2版的GAP程序计算。对于核酸GAP程序使用下列参数：“nwsgapdna”得分矩阵，“空位建立罚分”(或“空位权重”)为50，而“空位延伸罚分”(或“长度权重”)为3。严格杂交条件如上文所定义。

本文使用的ISLP蛋白质的“杀昆虫活性”意味着当用此蛋白质喂养昆虫(优选通过在重组宿主例如植物中表达)时，此蛋白质杀死昆虫的能力。如果蛋白质在至少一个昆虫发育阶段(优选幼虫阶段)具有杀死昆虫的能力，就应理解为其具有杀昆虫活性。

本文使用的蛋白质的“昆虫控制量”意指足以将以植物为食的处于任何发育阶段(例如昆虫幼虫)的昆虫所导致的植物损伤的限制在商业上可接受水平的蛋白质的量。限制昆虫对植物的损伤可能是例如杀死昆虫或抑制昆虫发育、繁育或生长的结果，从而昆虫对植物造成的损伤更小，且植物产率不会被显著地不利影响。本文使用的“控制”昆虫意味着当用本发明ISLP蛋白质处理时获得至少显著的(高于对照值)对于昆虫的生长抑制、发育延迟或繁育抑制。

根据本发明，易感于本发明新ISLP蛋白质的昆虫接触昆虫控制量、优选杀昆虫剂量的蛋白质。本发明蛋白质的优选靶昆虫是，特别在欧洲、北美和南美国家、亚洲和澳大利亚，对玉米、棉花、稻、大豆、蔬菜植物、芸苔属物种的植物、欧洲油菜(Brassica napus)、花椰菜、胡萝卜、豌豆、小麦、大麦、黑麦、番茄、马铃薯、甜菜、切花、玫瑰、水果植物(苹果、梨、桃、草莓等)、树(如白杨和柳树)及莴苣经济上有害的昆虫害虫。本文使用的术语“植物”包括整个植物还有植物的部分如叶、茎、种子、花或根。

本文使用的ISLP蛋白质的“杀虫活性”意指蛋白质杀死、致病、抑制生长或以其他方式负面作用于所有或部分植物或动物害虫生物体例如某些节肢动物、线虫、螨、蚜虫、苍蝇、细菌、病毒、真菌等的活性。本文使用的植物或动物害虫生物体是任何的活的生物体，它能通过导致部分或全部植物或动物感染、疾病或死亡、或以其他方式抑制生长、使这样的植物或动物(优选这些是更小的生物体例如无脊椎动物)丧失能力或对其负面影响来对植物或动物包括人类导致损伤。能够将害虫生物体传递给植物或动物的媒介生物也被认为是本文所用的害虫生物体，例如诸如蚊子或螳螂的害虫。

编码本发明ISLP蛋白质的核酸序列特别是DNA序列可以合成制备，并插入到表达载体来生产大量的ISLP蛋白质。ISLP蛋白质可用于以常规方式(

等，1988；Harlow和Lane，1988)制备特异性单克隆或多克隆抗体。

在本发明一个实施方案中，提供了特异性结合ISLP蛋白质的抗体。特别是提供了结合ISLP蛋白质或其片段或变体的单克隆或多克隆抗体。还包括单克隆或多克隆抗体的片断，其保留结合用于产生它们(例如单链抗体)的ISLP蛋白质或片断的能力。ISLP蛋白质的抗体可以通过本领域已知的方法、使用ISLP蛋白质作为动物(例如兔或小鼠)体内的抗原来制备。用来制备抗体的合适的方法包括Harlow和Lane《抗体使用：实验室手册》(“Using Antibodies：A Laboratory Manual”)(纽约：冷泉港实验室出版社，1998)和Liddell和Cryer《单克隆抗体实用指南》(“A Practical Guide toMonoclonal Antibodies”)(Wiley和Sons，1991)中描述的那些。抗体可用于分离、鉴定、表征或纯化其与之结合的ISLP蛋白质。例如，抗体通过允许抗体和蛋白质形成免疫复合物并检测免疫复合物的存在，例如通过ELISA或免疫印迹法，可用于检测样品中的ISLP蛋白质。

本发明的另一实施方案中提供了用于检测ISLP DNA序列的PCR引物和/或探针及试剂盒。用于从样品中扩增本发明中植物优化的ISLP DNA的PCR引物对(其中每个引物长至少15到25、优选至少18或20个核苷酸)可以基于该ISLP序列例如ISLP1序列通过本领域已知的方法来合成(见例如Dieffenbach和Dveksler(1995)《PCR引物：实验室手册》（PCR Primer：ALaboratory Manual)，冷泉港实验室出版社及McPherson等(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第一版，德国施普林格出版社(Springer Verlag)。同样的，SEQ ID NO：1序列的DNA片段、特别是在多种细菌(优选杆菌)S层蛋白质中具有高度同源性的区域的部分，例如SLH区域(Mesnage等，2001，Microbiology 147，1343-1351)，如上述ISLP1的SLH区域，可以用作杂交探针。ISLP检测试剂盒可能含有ISLP特异性引物或者ISLP特异性探针，以及随附的使用所述引物或探针来检测样品中ISLPDNA的说明书。例如，此类检测试剂盒可用来确定是否植物已经被编码本发明ISLP蛋白质(或其部分)的基因所转化。

因为遗传密码的简并性，某些氨基酸密码可以为其它替换而不会改变蛋白质的氨基酸序列。此外，一些氨基酸可以被其他等同氨基酸取代而不改变或不显著改变蛋白质的杀虫优选杀昆虫活性，或至少不降低蛋白质的杀虫优选杀昆虫活性。例如，氨基酸取代包括同类的互换氨基酸：碱性(如Arg、His、Lys)，酸性(如Asp、Glu)，非极性(如Ala、Val、Trp、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp、Gly)及极性(如Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln)。只要ISLP蛋白质的杀虫活性基本上相同或并未降低至获得害虫控制例如昆虫控制所需的水平之下，这样的同类取代均落于本发明的范围之内。此外，只要ISLP蛋白质的杀虫活性基本上是相同或并未降低，非保守氨基酸取代落在本发明的范围之内。本发明DNA序列的变体或等同体包括编码本文定义的ISLP的DNA序列，在严格杂交条件下能与SEQ ID NO：1的ISLPDNA序列杂交。此类变体或等同体应编码与本发明蛋白质具有相同或基本上相同的杀虫特性的蛋白质，而其他特性例如热稳定性或对蛋白酶切割的易感性可以被改变。在某些情况下可优选获得毒性相同或大致相似但热稳定性较低或胃蛋白酶敏感性较高的毒性ISLP，且此类变体可以通过已知用于随机诱变和筛选的步骤，或通过定点突变本发明的ISLP蛋白质(例如通过在ISLP蛋白质中引入胃蛋白酶切割位点，见WO 02074799)来制备。本文使用的变体或等同体还包括这样的DNA序列，其与本发明天然ISLP基因相比具有不同的密码子利用，但编码具有相同杀虫活性并具有相同或基本上相同的氨基酸序列的蛋白质。ISLP DNA序列可以通过调整密码利用，使之成为植物基因，特别是目的植物属或种(即期望通过可用的密码子表而从中表达ISLP蛋白质的植物属或种)的天然基因中最优选的，来进行密码子最佳化(例如更适于在棉花、大豆、玉米或稻中表达)。

对于植物或其他真核生物中的表达，在本发明ISLP基因中要避免、去除或减少长链的AT或GC核苷酸(如6个或以上的A或T核苷酸链或6个或以上的G或C核苷酸链)，并可以引入合适的限制性位点。

此外，ISLP蛋白质的N-末端可以进行修饰，以使之具有最佳的翻译起始环境，由此在蛋白质的N-末端添加或缺失一个或多个氨基酸。在多数情况下，优选欲在植物细胞中表达的本发明蛋白质以Met-Asp或Met-Ala二肽起始，以进行最佳的翻译起始，因此有时需要在ISLP DNA中起始密码子的下游插入编码Asp或Ala氨基酸的密码子作为新的第二个密码子(如果此第二个密码子并不已经是Ala或Asp的话)。

DNA序列还可以进行修饰，以去除不合理的剪接位点或转录终止信号。因为细菌基因可能包含被其他宿主特别是真核宿主如植物识别为5’或3’剪接位点或转录终止信号的基序，在那些其他宿主中的转录可能无效或可能过早地终止。可以通过基于计算机的DNA序列分析和/或通过本领域已知的PCR分析来鉴别不合理的剪接位点或转录终止信号。

可根据具体的目的来构建密码子利用不同但编码具有基本上相同的杀虫活性的相同蛋白质或相似蛋白质的任何DNA序列。已描述在原核和真核表达系统中改成宿主细胞的密码子利用有助于异质宿主中的基因表达(Bennetzen和Hall，1982；Itakura等，1977)。在文献(Wada等，1990；Murray等，1989)和主要的DNA序列数据库(如位于德国海德堡的EMBL)及如Nakamura等(2000)所述中可找到密码子利用表。相应地，本领域普通技术人员能容易地构建合成的DNA序列，以生产相同或基本相同的蛋白质。显而易见的是，一旦知道了本发明ISLP蛋白质的氨基酸序列，就可以制备可选的DNA序列。此类可选的DNA序列包括合成的或半合成的DNA序列，为使基因中某些位点失活，所述序列已经被改变。这种失活作用可以通过例如使整体密码子利用情况调整成更为相关的宿主生物(例如希望在其中进行表达的宿主生物)的密码子利用来实现。用于将密码子利用改变成宿主细胞优选的多种技术可以在专利和科学文献中找到。只要多数或全部密码子调控序列或加工元件(如植物多聚腺苷酸信号和剪接位点)为其他序列所替换，并优选编码区域的AT含量接近宿主生物，确切的密码子利用改变的方法在本发明中并非关键。

例如上述的对DNA序列的小的修饰可以常规进行，例如通过PCR介导的诱变(Ho等，1989；White等，1989)。通过使用可用的技术从头DNA合成期望的编码区可以对DNA序列常规地进行的更为大量的修饰。

短语“基本上相同”当在这里用于指ISLP蛋白质的氨基酸序列时，意指与相比较的蛋白质氨基酸序列的差异不超过5％或不超过2％(如果一个蛋白质较小，则是对于相同长度的区域而言)的氨基酸序列。当指ISLP蛋白质的毒性时，短语“基本上相同”意指蛋白质与相比较的蛋白质得到的平均LC₅₀值比，其平均LC₅₀值相差不超过2-5倍，优选2倍。本上下文中，“平均LC₅₀”是导致测试种群50％死亡率的蛋白质浓度，从三次使用相同生物测定条件进行的独立生物测定计算而来。用Probit分析、使用程序POLO PC(来自LeOra软件，1987，伯克利，加利福尼亚州)计算LC₅₀值。可以理解，为了确定LC₅₀值是否存在统计学显著差异，对两比较蛋白质中每一个的LC₅₀值计算95％(或90％)的置信限度(用Probit分析计算的一个相关参数)。在本发明一个实施方案中，在使用适当对照的相同或可比试验设置中，可以看到如果置信限度重叠，两个蛋白质的毒性基本上相同，如果置信限度不重叠则基本上不同。

从总DNA制备的本发明的ISLP DNA序列可以被连接进合适的表达载体并转化到细菌菌株例如大肠杆菌或其他细菌菌株中，优选在其他杆菌如苏云金芽孢杆菌中。在本发明的一个实施方案中，为在细菌中表达，在DNA构建体中纳入了编码ISLP蛋白质细菌信号肽或适合的其他细菌信号肽(例如来源于宿主细胞产生的分泌蛋白质的信号肽)的DNA序列。然后可以通过常规的克隆免疫探测方法(French等，1986)用针对ISLP蛋白质制备的单克隆或多克隆抗体来筛选表达毒素的克隆。

可以筛选细菌克隆用于生产ISLP蛋白质(细胞裂解液或上清液可使用标准方法跑SDS-PAGE胶并进行标准的western印迹步骤)，细菌或纯化或半纯化的ISLP蛋白质可以使用本领域已知或在下面所述的方法检测其相比于对照细菌的杀虫活性。还可以使用标准PCR方法如RT-PCR分析克隆中编码ISLP蛋白质的mRNA的存在情况。

可以常规的方式对编码本发明ISLP蛋白质的基因进行测序(Maxam和Gilbert，1980；Sanger，1977)来得到DNA序列。

序列比较显示islp基因和以前所述的编码杀虫特别是杀昆虫的细菌毒素的基因不同，且属于一类新的基因，编码与细菌优选杆菌S层蛋白质具有显著序列同一性的杀虫或杀昆虫蛋白质。

编码新鉴定ISLP蛋白质的杀虫有效部分的DNA序列的杀虫有效部分可以在基因序列分析之后以常规的方式制备。ISLP蛋白质的氨基酸序列可以由分离的DNA序列确定。短语编码ISLP蛋白质的DNA序列的“杀虫有效部分(或一部分或片段)”本文也称为“截短的基因”或“截短的DNA”，本文使用意指编码本文定义的ISLP蛋白质毒性片段的DNA序列。

为了在大肠杆菌、其他细菌菌株或植物中表达编码本发明ISLP蛋白质的DNA序列所有的部分或杀虫有效部分，可以在DNA序列侧翼引入合适的限制性位点。这可以用熟知的方法(见例如Stanssens等，1989；White等，1989)通过定点诱变来进行。为提高植物中的表达，本发明的ISLP基因或ISLP基因杀虫有效部分可以依据PCT出版物WO 91/16432和WO 93/09218和出版物EP 0 385 962、EP 0 359 472和US 5,689,052进行修饰来形成等同的、修饰的或人工基因或基因部分。ISLP基因或基因部分还可以插入到植物的质体(如叶绿体)或线粒体基因组中，并使用合适的启动子在那里表达(见例如McBride等，1995；US 5,693,507)。

为了增强单子叶植物例如玉米或稻中的表达，可在嵌合基因中添加内含子(例如单子叶内含子)。例如，在5’调控区添加玉米Adh1基因内含子已表明增强玉米中的表达(Callis等，1987)。同样地，如US 5,859,347中所述，HSP70内含子可以用于增强表达。ISLP基因的DNA序列或它的毒性片段还可以改变为翻译不确定方式。通过定点内含子插入和/或通过对密码子利用引入变化，此类改变可能修饰抑制基因部分中存在的DNA序列。密码子利用变化可以是例如调整密码子利用，使之成为植物，特别是宿主植物最优选的，而不改变或不显著改变编码的氨基酸序列。

根据本发明的一个实施方案，蛋白质可以靶向到植物细胞中的胞内细胞器，如质体(如叶绿体)、线粒体，或可能从细胞中分泌出去。为了这个目的，在本发明一个实施方案中，本发明嵌合基因包含编码信号肽或靶向肽的编码区，优选植物信号肽或靶向肽，连接于本发明ISLP蛋白质的编码区。可能包含在本发明蛋白质中的肽是用于叶绿体或其他质体靶向的转运肽，例如来自植物基因的重复转运肽区域，其基因产物被靶向到质体中，Capellades等(US 5,635,618)的经优化转运肽、菠菜中的铁氧还蛋白质-NADP⁺氧化还原酶的转运肽(Oelmuller等，1993)、Wong等(1992)所述的转运肽及PCT专利公开WO 00/26371中的靶向肽。可选的肽包括那些传导连接于此类肽的蛋白质分泌信号的肽，例如马铃薯蛋白酶抑制剂II的分泌信号(Keil等，1986)、稻α淀粉酶3基因的分泌信号(Sutliff等，1991)及烟草PR1蛋白质的分泌信号(Cornelissen等，1986)。

根据本发明有用的信号肽包括叶绿体转运肽(例如Van Den Broeck等，1985)，或US 5,510,471和US 5,635,618中经优化的导致蛋白质转运到叶绿体的叶绿体转运肽、分泌信号肽或将蛋白质靶向到其他质体、线粒体、内质网或其他细胞器的肽。在天然靶向或分泌蛋白质内可以找到用于靶向到胞内细胞器或用于分泌出植物细胞或靶向到细胞壁的信号序列，例如

等(1989)、

和Weil(1991)、Neuhaus和Rogers(1998)、Bih等(1999)、Morris等(1999)、Hesse等(1989)、Tavladoraki等(1998)、Terashima等(1999)、Park等(1997)、Shcherban等(1995)所述的那些，所有这些引入本文作为参考。可选的信号序列包括来自玉米、棉花、大豆或稻的靶向或分泌蛋白质的信号肽序列。

为使ISLP蛋白质分泌到转化的宿主细胞的外面，可以将适当的分泌信号肽融合到ISLP蛋白质的氨基末端(N-末端)。同样，任何天然细菌分泌信号肽可以被缺失或替换为二肽Met-Ala或Met-Asp或另一信号肽如上述的植物分泌信号肽。特别地，本发明ISLP蛋白质例如SEQ ID NO：2所示ISLP1蛋白质的第1-29位氨基酸包含细菌信号肽。可以移除第1-29位氨基酸，或将其替换为甲硫氨酸或Met-Ala或Met-Asp二肽，或替换为合适的信号肽例如上述的植物信号肽。信号肽可以使用基于计算机的分析(使用程序如信号肽搜索程序(SignalP V1.1或2.0)、使用合适的矩阵(如用于原核革兰氏阳性菌)和阈值分少于0.5、阈值分数为0.25或更小(见例如VonHeijne、Gunnar，1986和Bendtsen等，2004)，或通过与具有已知信号肽的相似蛋白质比对来检测。

此外，可以使用本领域已知方法(见例如Van Rie等，1990)计算本发明ISLP蛋白质的结合特性，来确定是否本发明ISLP蛋白质能结合害虫如昆虫内脏中不被其他细菌蛋白质识别(或竞争)的位点。和已知杀昆虫蛋白质例如Cry、Cyt或VIP毒素家族的Bt毒素相比，能结合相应易感昆虫的不同结合位点的一类新的杀昆虫蛋白质很有价值。此类蛋白质可以用来代替昆虫已经对于其具有抗性的已知细菌蛋白质，或用来与具有不同作用方式的杀昆虫细菌蛋白质联合来防止或延缓昆虫对细菌蛋白质抗性的发展，特别是在植物中(优选同时)表达的情况下。因为本发明的ISLP毒素的特性，它们尤其可用于转化植物例如单子叶如玉米和稻以及和双子叶如棉花、蔬菜作物、豌豆和大豆，来保护这些植物免受昆虫损伤。本发明ISLP蛋白质的作用方式和当前用于转基因植物产品的已知Bt毒素如杆菌的Cry或VIP蛋白质相比是不同的。此类结合特性可以通过如上面或美国专利6,291,156和6,137,033所述的常规结合测试来测定。

特别是出于对特定昆虫害虫的昆虫抗性管理目的，优选本发明的ISLP联合另一昆虫控制蛋白质特别是细菌Cry蛋白质例如Cry1F、Cry2A或Cry1Ac蛋白质或VIP或VIP样蛋白质如VIP3A，优选对于此类ISLP蛋白质识别的至少一个结合位点不识别的蛋白质。与本发明ISLP蛋白质联合的特别是在植物(例如玉米、棉花、芸苔属物种(例如花椰菜或甘蓝)、稻或大豆植物)中同时表达的合适的昆虫控制蛋白质包括，但不局限于：Cry蛋白质如Cry1B、Cry1C、Cry1D或Cry1E蛋白质或其毒性片段；包含Cry1F毒性片段的蛋白质或来源于Cry1F蛋白质的杂合蛋白(例如US 6,326,169、US 6,281,016、US 6,218,188中所述的杂合Cry1A-Cry1F蛋白质或其毒性片段)；包含Cry1A型蛋白质或其毒性片段的蛋白质，优选Cry1Ac蛋白质或来源于Cry1Ac蛋白质的杂合蛋白(例如US 5,880,275中描述的杂合Cry1Ab-Cry1Ac蛋白质)或如在EP451878中所述的包含Cry1Ab蛋白质或其杀昆虫片段；包含Cry2Ab蛋白质毒性片段的蛋白质，例如在美国专利6,489,542中描述的Cry2Ab蛋白质-转运肽融合蛋白质；包含如WO02/057664中所述Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag毒性片段的蛋白质；包含如WO01/47952中所述的Cry蛋白质毒性片段的蛋白质；包含如Estruch等(1996)及US 6,291,156所述的VIP3Aa蛋白质或其毒性片段的蛋白质；如WO98/50427所述来自致病杆菌属物种(Xenorhabdus spp.)的杀昆虫蛋白质；来自于沙雷氏菌属(Serratia)(特别来自嗜线虫沙雷氏菌(S.entomophila))或光杆菌属物种(Photorhabdus)菌株的杀昆虫蛋白质，例如在WO98/08932中所述来自光杆菌的Tc蛋白质(例如Waterfield等，2001；Ffrench-Constant和Bowen，2000)。在一实施方案中，此类共表达通过用编码本发明ISLP蛋白质的DNA转化已经表达昆虫控制蛋白质的植物、或是通过以已知昆虫控制蛋白质转化的植物和以一个或多个本发明ISLP蛋白质转化的植物杂交能容易地得到。对于玉米、稻、棉花或大豆植物，可以使用ISLP蛋白质作为第一个昆虫控制蛋白质，并使用Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ae或VIP3Aa蛋白质或包含它们毒性片段的蛋白质、杂合蛋白或其变体作为第二个昆虫控制蛋白质。在EP 0 408 403中描述了用于获得不同杀昆虫蛋白质在同一植物中的表达以致力于最小化或防止对于转基因昆虫抗性植物抗性发展的方法。不同的蛋白质可以表达于同一植物，或每一个能被表达于单一的植物尔后通过单一植物彼此杂交而在同一植物中组合。例如，在杂种种子生产中，每一亲本植物能表达单一蛋白质。通过杂交亲本植物来产生杂种，两蛋白质在杂合植物中被组合在一起。在某些情况中，可优选在植物的同一位点或遗传座位插入不同的毒性基因，以便于在该植物的后代中基因不会分离。

广为人知的是Bt Cry蛋白质表达成原毒素，通过在昆虫肠内蛋白质水解它可转化为毒性核心。当本发明ISLP蛋白质和Bt Cry蛋白质组合时，可以理解，可以使用编码全长原毒素或者毒性核心或者任何中间体形式的cry基因。

出于筛选目的和/或增强控制杂草的选择，本发明的转基因植物也可以用赋予广谱除草剂(例如基于草丁膦或草甘膦的除草剂)抗性的蛋白质的编码DNA进行转化。

杀虫有效ISLP基因的部分或其等同体，优选ISLP嵌合基因，编码ISLP蛋白质的杀虫有效部分，可以用常规方式稳定地插入单一植物细胞的核基因组中。并且如此转化的植物细胞可以用常规方式用于产生控制害虫例如昆虫害虫的转化植物。在这一点上，在农杆菌中的包含编码ISLP蛋白质的DNA的T-DNA载体可用于转化植物细胞。其后，可以用例如在EP 0 116718、EP 0 270 822、PCT文献WO 84/02913和公开的欧洲专利申请EP0 242246及在Gould等(1991)中所述的方法从转化植物细胞再生转化植物。构建用于农杆菌介导的植物转化的T-DNA载体在本领域广为人知。T-DNA载体可以是如EP 0 120 561和EP 0 120 515所述的双元载体或者如EP 0 116718所述的能通过同源重组整合进农杆菌Ti质粒的共整合载体。优选T-DNA载体每个包含位于T-DNA边界序列之间的、或至少位于右边界序列左侧的有效连接于杀虫有效ISLP基因部分的启动子。Gielen等(1984)描述了边界序列。其它类型的载体可使用例如直接基因转移(例如在EP 0 223247中所述)、花粉介导的转化(例如在EP 0 270 356和WO 85/01856中所述)、原生质体转化(例如在US 4,684,611中所述)、植物RNA病毒介导的转化(例如在EP 0 067 553和US 4,407,956中所述)、脂质体介导的转化(例如在US 4,536,475中所述)的方法及如最近描述的用于转化某些玉米(例如US 6,140,553；Fromm等，1990；Gordon-Kamm等，1990)和稻(Shimamoto等，1989；Datta等，1990)品系的其它方法和一般用于转化单子叶的方法(PCT文献WO 92/09696)来转化植物细胞。合适的用于棉花转化的方法见述于PCT专利文献WO 00/71733。有关稻转化，参考在WO92/09696、WO94/00977和WO95/06722中所述的方法。

本文使用的术语“玉蜀黍”和“玉米”同义，指玉蜀黍(Zea mays)。本文使用的棉花指棉属物种(Gossypium spp.)，特别是陆地棉(G.hirsutum)和海岛棉(G.barbadense)。术语“稻”指稻属物种(Oryza spp.)，特别是水稻(O.sativa)。“大豆”指大豆属物种(Glycine spp)，特别是大豆(G.max)。本文使用的蔬菜植物或蔬菜指黄瓜、番茄、莴苣、布鲁塞尔菊苣、芸苔属植物如花椰菜或甘蓝、韭菜、生菜、洋葱、(西)瓜、朝鲜蓟、胡萝卜或胡椒。

除转化核基因组以外，本发明还包括转化质体基因组(例如叶绿体基因组)。Kota等(1999)已描述了在烟草叶绿体中过表达Cry2Aa蛋白质的方法。

产生的转化植物可以用于常规植物育种方案来生产更多的具有相同特征的转化植物，或用于向相同或相关植物种类的其它品种中引入杀虫有效ISLP基因的部分。从转化植物得到的种子包含编码ISLP蛋白质作为稳定的基因组插入物的基因。转化植物的细胞可以用常规方式培养来生产ISLP毒素或蛋白质的杀虫有效部分，它可以回收，用于常规杀昆虫组合物特别是抗鳞翅目的杀昆虫组合物。

杀虫有效ISLP基因部分插入于植物细胞基因组中，从而插入的基因位于指导植物细胞中基因部分表达的启动子的下游(即3’)并在其控制下。这可以通过在植物细胞基因组例如在细胞核或质体(例如叶绿体)基因组内插入ISLP嵌合基因来实现。

合适的启动子包括，但不局限于：强组成型花椰菜花叶病毒(CaMV)分离株CM 1841(Gardner等，1981)、CabbB-S(Franck等，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)的35S启动子(“35S启动子”)；Odell等(1985)所述的35S启动子；来自泛素家族的启动子(例如Christensen等，1992、EP 0 342 926、还见于Cornejo等，1993的玉米泛素启动子)；gos2启动子(de Pater等，1992)；emu启动子(Last等，1990)；拟南芥肌动蛋白启动子例如An等(1996)所述的启动子；稻肌动蛋白质启动子例如Zhang等(1991)所述的启动子及在US 5,641,876中描述的启动子；木薯叶脉花叶病毒启动子(WO 97/48819，Verdaguer等，1998)；来自Subterranean Clover Stunt病毒的pPLEX系列启动子(WO 96/06932，特别是S7启动子)；醇脱氢酶启动子例如pAdh1S(GenBank登录号X04049、X00581)及分别驱动T-DNA 1’和2’基因表达的TR1’启动子和TR2’启动子(分别为“TR1′启动子”和“TR2’启动子”)(Velten等，1984)。可选地，可以使用不是组成型的而是特异于一种或多种植物组织或器官(如叶子和/或根部)的启动子，由此插入的ISLP基因部分只表达于特异组织或器官的细胞中。例如，如US 5,254,799所披露，通过将杀虫有效基因部分放置在光诱导型启动子例如植物本身或另一植物如豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因启动子的控制下，杀虫有效ISLP基因部分可以选择性地表达在植物(如玉米、棉花、稻、大豆)叶子中。例如，可如此选择启动子以使本发明ISLP基因只表达于靶害虫如昆虫害虫以之为食的那些组织或细胞中，以便于易感靶害虫的吃食导致对于宿主植物相比于不表达ISLP基因的植物的损伤降低。因而，通过在根特异性启动子控制之下表达ISLP基因，可以有效控制主要损伤根部的害虫。在WO00/29566中叙述了优先在根部作用的启动子。用于根部优先表达的合适的启动子是在US 5,633,363中所述的ZRP启动子(及其修饰)。另一个可选的是使用其表达为诱导型的启动子，例如创伤诱导型启动子如例子：Cordera等(1994)叙述的MPI启动子，它是通过(如由昆虫吃食所导致的)创伤诱导，或是由化学品例如Aoyama和Chua(1997)所述的地塞米松诱导的启动子，或是由温度诱导的启动子例如US 5,447,858中描述的热休克启动子，或是由其它外部刺激诱导的启动子。在单子叶植物例如玉米和稻中，农杆菌TR2’启动子或其变体是优选的创伤诱导型启动子，用来驱动本发明嵌合ISLP基因的转录，见WO 03/093483。

杀虫有效ISLP基因可以插入植物基因组，以便所插入的基因部分是在合适的3’末端转录调控信号(即转录物形成和多腺苷酸化信号)的上游(即5’)。这优选通过将ISLP嵌合基因插入到植物细胞基因组内来获得。合适的多腺苷酸化和转录物形成信号包括CaMV 35S基因、胭脂碱合酶基因(Depicker等，1982)、章鱼碱合酶基因(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)的那些信号，其作用为转化植物细胞中的3’不翻译DNA序列。

使用已知的方法如电穿孔或三亲本交配能够将T-DNA载体引入至农杆菌。

杀虫有效ISLP基因部分可以任选地作为杂合基因(US 5,254,799；Vaeck等，1987)插入到植物基因组中，位于和选择性或能够做为标记的基因例如编码卡那霉素抗性的neo基因(EP 0 242 236)的同一启动子的控制下，以便于植物表达的融合蛋白质能够容易地检测。

还可以使用转化植物细胞来在植物细胞培养物中生产大量的本发明蛋白质，例如产生可以经合适的配制后应用于作物的ISLP蛋白质。当本文提及转基因植物细胞时，是指如此类分离状态或在组织培养物中的植物细胞(或也有植物原生质体)，或者包含在植物或在分化的器官或组织中的植物细胞(或原生质体)，两种可能性本文都特别包括进来。因此，在说明书或权利要求中涉及的植物细胞意味着不仅指培养物中分离的细胞，还指任何植物细胞，无论它可能位于或可能存在于哪种类型植物组织或器官中。

编码杀昆虫特别是抗鳞翅目蛋白质的所有或部分ISLP基因还可以用于转化其它微生物包括细菌如苏云金芽孢杆菌，其可能已经具有抗鳞翅目或鞘翅目的杀昆虫活性。因此，可以生产转化的Bt菌株，其可用于抗击广谱的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫害虫，或者用于抗击另外的鳞翅目昆虫害虫。用掺入适当克隆载体中的本发明全部或部分ISLP基因转化细菌例如假单胞菌属(Pseudomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、杆菌属(Bacillus)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，可用常规方式进行，使用例如在Mahillon等(1989)和在PCT专利文献WO 90/06999中所述的常规电穿孔技术。

包含本发明ISLP基因的转化杆菌属菌株可以用常规方法(Dulmage，1981；Bernhard和Utz，1993)发酵，来提供高产量的细胞。在合适的生长条件下，这些菌株可以产生高产量的ISLP蛋白质。

在其中能够表达ISLP基因的可选的合适的宿主微生物有真菌、藻类或病毒，特别是植物侵占物种(如(内)共生体)或害虫如昆虫害虫的病原体。

杀昆虫的特别是抗鳞翅目的本发明组合物可以使用以ISLP基因转化的微生物、或ISLP蛋白质、或杀昆虫有效ISLP部分作为活性成分加以合适的载剂、稀释剂、乳化剂和/或分散剂通过常规方式配制(例如，如Bernhard和Utz所述，1993)。这类杀昆虫组合物可以配制为可湿性散剂、丸剂、颗粒剂或尘剂或者作为以水性或非水性溶剂配成的液体像泡沫剂、凝胶剂、混悬剂、浓缩剂等。包含杀昆虫细菌芽孢的组合物的例子在WO96/10083中有描述。

根据本发明，控制昆虫特别是鳞翅目或鞘翅目的方法可包括：施加(如喷洒)杀昆虫量的ISLP蛋白质或包含本发明ISLP蛋白质或包含以本发明ISLP基因转化的宿主细胞的组合物到欲保护的地点(区域)。要保护的地点可包括例如昆虫害虫的栖息地或生长植被(如应用到树叶)或待生长植被的区域(如应用到土壤或水源)。在一实施方案中，依据本发明的组合物包括杀昆虫量的至少一种本发明的ISLP蛋白质，其可以由细菌宿主产生。此类组合物可以被应用于叶子、土壤或种皮。

本文使用的术语“接触”指“与...进行物理接触”。用杀昆虫蛋白质接触植物意思是使杀昆虫蛋白质接触植物细胞，或者在内部(例如通过在植物中表达)或者在外部(例如通过外部施加包含杀虫蛋白质的组合物于植物)。可以理解，该术语不指示接触时间长度，而是包含任何时间单位的接触。当提及包括用本发明杀昆虫蛋白质接触植物(或其细胞或组织)的保护所述植物抵抗昆虫损伤的方法时，接触可能是足够长而且足够广泛(使用足够高量的蛋白质接触足够大量的细胞)来预防或减轻昆虫损伤。

本发明还涉及用于控制鳞翅目或鞘翅目棉花害虫或摄取棉花昆虫害虫如棉籽象鼻虫、棉螟蛉、蚜虫或棉铃虫、棉蚜虫(Aphis gossypii)、桃蚜(Myzus persicae)、草盲蝽、粉虱、椿象、牧草虫或绿盲蝽(Creontiadesdilutus)的方法。可以用本发明方法控制的具体鳞翅目棉花害虫包括，但不局限于：选自美洲棉铃虫、棉螟蛉、澳洲棉铃虫(本地螟蛉)、烟芽夜蛾(烟草蚜虫)、草地夜蛾(秋粘虫)和棉红铃虫(粉红螟蛉)的那些。控制棉花昆虫害虫的方法包括向要保护的区域或植物施加本文定义的ISLP蛋白质。这可以通过以本发明ISLP蛋白质接触棉花植物来实现，例如通过种植以本发明ISLP基因转化的植物如棉花植物，或喷洒含有本发明ISLP蛋白质的组合物。本发明还涉及本发明ISLP蛋白质在抵抗鳞翅目、蚜虫或鞘翅目棉花昆虫害虫以最小化棉花植物损伤中的用途。

本发明ISLP蛋白质如ISLP1蛋白质的靶昆虫害虫还可以是墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)，一种墨西哥豆甲。这不但是北美多种豆科作物的一种严重的害虫，还是亚洲和非洲其他作物如葫芦、茄科植物、豆类、玉米、高粱、稻、小麦、棉花、芝麻、莴苣、大豆和豇豆的一个严重问题。

本发明还涉及控制鳞翅目或鞘翅目玉米害虫或蚜虫如玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)、麦二叉蚜(Schizaphis graminum)或桃蚜、棉铃虫、粘虫、夜蛾、茎杆钻心虫、线虫、玉米钻心虫或玉米根虫的方法。可以通过本发明的方法来控制的具体玉米害虫可以选自：美洲棉铃虫、小地老虎(黑夜蛾)、欧洲玉米螟、玉米食根虫(Diabrotica spp.)和草地夜蛾(秋粘虫)。该方法包括向要保护的区域或植物施加本文定义的ISLP蛋白质。这可以通过以本发明ISLP蛋白质接触玉米植物来实现，例如通过种植以本发明ISLP基因转化的玉米植物，或喷洒含有本发明ISLP蛋白质的组合物。本发明还涉及本发明ISLP蛋白质在抵抗鳞翅目玉米昆虫害虫以最小化玉米植物损伤中的用途。

本发明还涉及控制鳞翅目或鞘翅目稻害虫或摄取稻上的昆虫如稻叶蝉或稻蝗、稻(黑)蝽、稻钻心虫、稻苞虫、稻夜蛾、稻粘虫、稻螟虫和稻纵卷叶螟或蛴螬的方法。可以通过本发明的方法来控制的具体鳞翅目稻昆虫害虫可以选自：黄色螟虫(三化螟)、稻纵卷叶螟、粉色螟虫(大螟)和玉米斑点螟(Chilo partellus)。该方法包括向要保护的区域或植物施加本文定义的ISLP蛋白质。这可以通过以本发明ISLP蛋白质接触稻植物来实现，例如通过种植以本发明ISLP基因转化的稻植物，或喷洒含有本发明ISLP蛋白质的组合物。本发明还涉及本发明ISLP蛋白质在抵抗鳞翅目、蚜虫或鞘翅目稻昆虫害虫以最小化稻植物损伤中的用途。

本发明还涉及控制鳞翅目、蚜虫或鞘翅目大豆害虫的方法。可以通过本发明的方法来控制的具体大豆害虫可以选自：黎豆夜蛾、大豆夜蛾、甜菜夜蛾、黄斑粘虫(黄斑夜蛾)、美洲棉铃虫、大豆食心虫(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu。该方法包括向要保护的区域或植物施加本文定义的ISLP蛋白质如ISLP1。这可以通过以本发明ISLP蛋白质接触大豆植物来实现，例如通过种植以本发明ISLP基因转化的大豆植物，或喷洒含有本发明ISLP蛋白质的组合物。本发明还涉及本发明ISLP蛋白质在抵抗鳞翅目大豆昆虫害虫以最小化大豆植物损伤中的用途。

为获得ISLP毒素或蛋白质，可以用常规方式在适当的培养基中培养表达ISLP蛋白质的重组宿主细胞。产生的ISLP蛋白质可以分离和纯化自裂解的细胞或(当分泌时)来自培养基。如果蛋白质不是分泌的，细胞能够用常规方法如酶降解、通过超声或通过使用去垢剂等来裂解。然后可以通过标准技术例如层析、提取、电泳等来分离和纯化ISLP蛋白质。

本文使用的术语“基因”意味着包含可以在细胞内被转录成RNA分子(如mRNA)的区域(“转录区”)的任何DNA或RNA片段，有效连接于合适的调控区域例如植物可表达启动子。因而基因可能包含数个有效连接的片段如启动子、5’前导序列、编码区和含有多腺苷酸化位点的3’非翻译序列。特定生物体(如植物物种或细菌菌株)的内源基因是天然地见于该生物体的基因。当提及本发明ISLP DNA时，“嵌合基因”指具有不同于天然存在的、驱动ISLP基因在其天然宿主细胞中表达的细菌5’和/或3’调控序列的5’和/或3’调控序列的ISLP DNA序列。

当提及本发明ISLP基因时，术语“基因表达”意指在其中DNA编码区有效连接于合适的调控区如启动子、被转录并翻译成蛋白质的过程。

为本发明目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”表达为百分数，意指在两个最佳比对的序列中具有相同的残基的位置数(×100)除以比较的位置数。空位，即比对中残基于一条序列中存在但不在另一条中存在的位置，被认为是具有不同残基的位置(对于不同长度的序列，大小等于最短序列的大小，例如在比对ISLP片段和全长S层蛋白质的情况下，比较相对于S层蛋白质中相同大小的对应部分)。为本发明目的要计算两个序列间的序列同一性，可以使用GAP程序，它使用Needleman和Wunsch算法(1970)并由威斯康星包(第10.2版，遗传学计算机组(GCG)，575Science Drive，麦迪逊，威斯康星53711，美国)提供。使用的GAP参数为：空位建立罚分＝50(核苷酸)/8(氨基酸)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(氨基酸)，并且评分矩阵为“nwsgapdna”(核苷酸)或“blosum62”(氨基酸)。GAP使用Needleman和Wunsch全球比对算法来在其整个长度上比对两个序列，最大化匹配的数目并最小化空位的数目。缺省的参数为：空位建立罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核酸，使用的缺省的评分矩阵是“nwsgapdna”，而对于蛋白质缺省的评分矩阵是“blosum62”(Henikoff&Henikoff，1992)。类似的，序列相似性百分数可以在这类比对中用标准软件获得，它不仅显示相同残基的百分数还包括不同但具有相似性质(例如本文定义的对于蛋白质比对中保守氨基酸的差异)的残基。适用于确定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，在Altschul等(1977)和Altschul等(1990)中有描述。

本发明的这些和/或其他实施方案在权利要求书中有所反映，权利要求书构成本发明说明书的一部分。

序列表说明

下述实施例举例说明了本发明，并不是提供来限制本发明或要求保护的范围的。在实施例、权利要求书和说明书中提及的序列如下所述：

SEQ ID NO：1：islp1基因的DNA编码序列和氨基酸序列

SEQ ID NO：2：ISLP1蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID NO：3：PCR引物ISLP1Xder

SEQ ID NO：4：PCR引物ISLP1Xrev

SEQ ID NO：5：PCR引物BSLX-1

SEQ ID NO：6：PCR引物BSLX-4

SEQ ID NO：7：PCR引物BSLX-3

SEQ ID NO：8：PCR引物BSLX-2

SEQ ID NO：9：PCR引物BSLN-5

SEQ ID NO：10：PCR引物BSLN-6

SEQ ID NO：11：PCR引物BSLP-8

SEQ ID NO：12：PCR引物BSLP-7

SEQ ID NO：13：PCR引物EAGB-4

SEQ ID NO：14：分离的成熟ISLP1蛋白质N-末端的氨基酸序列

SEQ ID NO：15：ISLP1蛋白质N-末端大约50 kDa胰蛋白酶片段的氨基酸序列

除非在实施例中另外规定，所有重组DNA技术按照标准方法进行，见述于Sambrook和Russell(2001)《分子克隆：实验室指南》第三版，冷泉港实验室出版社，纽约；Ausubel等(1994)《现代分子生物学通用方法》第1、2卷，美国及Brown(1998)Molecular Biology LabFax第二版，卷I、II，Academic Press(UK)。用于植物分子操作的标准材料和方法见述于R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)，由BIOS ScientificPublications Ltd(UK)与Blackwell Scientific Publications，UK联合出版。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)《PCR引物；实验室指南》，冷泉港实验室出版社和McPherson等(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第一版，德国施普林格出版社中找到。

应该了解前述的仅仅是本发明具体实施方案的详细描述，并且对于公布的实施方案的众多改动可以根据本文的公开来进行而不悖离本发明的精神或范围。因此前面的描述不意味着限制本发明的范围。更准确的是，本发明的范围只由附加的权利要求书和其等同物来决定。

实施例

材料和方法

细菌菌株：苏云金芽孢杆菌(Bt)通过醋酸选择法(Travers等，1987)分离自死昆虫(墨西哥豆瓢虫)样品。在均质化和分离Bt菌株之前，墨西哥豆瓢虫死尸以1％次氯酸钠和灭菌水洗涤两次。

生物测定：使用叶浸技术用芽孢/晶体悬液进行抗墨西哥豆瓢虫的生物测定。菜豆(Phaseolus vulgaris)植物的叶子浸泡在毒素稀释液中，然后使之干燥。每个处理的叶子用一龄的五只幼虫测试不同的蛋白质浓度。每个浓度进行四次重复。6天后确定死亡率和叶子的损伤。如前所述(Bravo等，1998)在人工食料中进行抗烟草天蛾(Manduca sexta)或草地夜蛾一龄幼虫的生物测定。如Ibarra等(2003)所述在100ml水中进行抗埃及伊蚊(Aedesaegypti)幼虫的生物测定。

纯化ISLP1菌株中存在的晶体包涵体：ISLP1菌株在含固体营养肉汤芽孢形成培养基(Lereclus等，1995)的皮氏培养皿中生长。芽孢/晶体混合物收集于5ml灭菌水中，在10,000rpm离心10分钟，回收上清并丢弃只含芽孢的沉淀。为从上清中去除所有芽孢，重复此步骤5次。最后晶体包涵体通过在19,000rpm离心30分钟回收。晶体蛋白质溶解于pH10.5的50mM Na₂CO₃、0.2％β-巯基乙醇中并通过在Q-sepharose柱FPLCPharmacia(Q-琼脂糖柱快速液相色谱，法玛西亚)阴离子交换层析来纯化(Hill，1983)。

N-末端测序：在7％SDS-PAGE电泳并如厂商指示在半干式转膜室中将其转移至聚偏二乙烯二氟膜(马萨诸塞州贝德福德密理博公司：MilliporeCo.，Bedford，MA)上后，ISLP1菌株产生蛋白质的N端测序在美国马萨诸塞州剑桥市哈佛大学的哈佛大学微量化学研究室(HarvardMieroehemistry Facility)进行。还对利用HPLC分子筛层析(Güereca和Bravo，1999)纯化的ISLP1晶体蛋白质的胰蛋白酶片段的N端序列进行了分析。

免疫兔子：通过皮下注射以ISLP1蛋白质免疫新西兰白兔。溶于PBS中的1毫克ISLP1蛋白质以弗氏完全佐剂乳化后注射在兔子背部的五个位点。兔子以用不完全佐剂混合的1毫克ISLP1蛋白质加强免疫3次，每次间隔15天。在首次免疫后40天分离血液样品。

确定ISLP1基因的DNA序列：基于ISLP1蛋白质的N端序列，设计了扩增1536bp PCR产物的两个PCR引物，ISLP1Xder(ACGCTCTAGATAGCAGGTAAATCATTCCCAGACG，SEQ ID NO.3)和ISLP1Xrev(ACGCTCTAGATCGCCGTATTGGTCAGTTGTTAC，SEQ ID NO.4)。通过标准技术(Sambrook等，1989)用Pfu DNA聚合酶(Stratagene La Jolla，CA，因为其高保真性)进行了PCR反应。总DNA提取自ISLP1菌株(Msadek等，1990)并用作所有PCR反应的模板。PCR产物用来做Blast分析，并得到了两个S层基因相关序列(登录号u38842和x99724)。比对这些序列证明了它们具有相似的5’和3’末端。从这些S层基因的5’和3’末端及从ISLP1扩增片段的内部序列设计了4条PCR引物。引物BSLX-1(GCTCTAGATGAGAGTGCTTTATAGGAAAAT，SEQ ID NO：5)和BSLX-4(GCTCTAGATCTTCAGCCGGAGCGTATGTACC，SEQ IDNO：6)扩增553bp的5’端片段，而引物BSLX-3(GCTCTAGATACTGCTGAGGCTGCTGGTGAGG，SEQ ID NO：7)和BSLX-2(GCTCTAGATCCTCGACCTGCTTCACTATCA，SEQ ID NO：8)扩增1372bp的3’片段。每个PCR片段用Xba1(美国马萨诸塞州贝弗利纽英伦生物技术公司：New England BioLabs，Beverly，MA)消化，并克隆进事先经Xba1消化的pBluescript SK(Stratagene，La Jolla，CA)。连接产物通过酚/氯仿提取纯化、乙醇沉淀并电转化到TG1大肠杆菌电感受态细胞(Lereclus等，1989)。转化子克隆生长在补加有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，菌落与甘油(20％)混合并储存在-70℃。这些质粒命名为ISLP1-SL1、ISLP1-SL2和ISLP1-SL3，并对它们的插入DNA用自动DNA测序装置进行了测序。

在苏云金芽孢杆菌中克隆和表达ISLP1蛋白质：完整的islp1基因通过克隆三个PCR片段到质粒pHT315(Lereclus等，1989)中重构。第一个PCR产物包含启动子区域，用引物BSLX-1和BSLN-5(TCTTTGCCATGGTATAAATTTCCTCCTTC，SEQ ID NO：9)得到。引物BSLX-1在5’端具有多出的10bp，包含Xba1限制性位点，而引物BSLN-5具有内部的Nco1限制性位点。第二个PCR片段用含有内部Nco1限制性位点的引物BSLN-6(TTATACCATGGCAAAGACTAACTCTTAC，SEQ ID NO：10)和包括islp1基因的独特Pst1限制性位点的引物BSLP-8(AAAACTGCAGAAGTACCGTCAGCACTTGCTTC，SEQ ID NO：11)获得。最后，第三个PCR片段用也是用包括独特Pst1限制性位点的引物BSLP-7(AACGCTGCAGTTGTAACACTTGGTGGTAAAG，SEQ ID NO：12)和类似于BSLX-2但在5’端具有包含BamHI限制性位点的多余8bp的引物EAGB-4(CGGGATCCTCCTCGACCTGCGTCACTATCA，SEQ IDNO：13)扩增。纯化每个PCR产物并用相应的限制性酶消化，并分别亚克隆到pBluescript KS。纯化这些质粒中包含的DNA片段、连接并插入至事先以XbaI和BamHI消化的质粒pHT315中。连接反应的产物直接转化到由Didier Lereclus博士(法国巴斯德研究所：Pasteur Institute，France)友情提供的晶体缺陷型(acrystalliferous)苏云金芽孢杆菌菌株407(Lereclus等，1989)中，并在30℃生长于补加7.5μg/ml红霉素的LB中。产生的质粒命名为pHT-ISLP1。包含pHT-ISLP1的Bt菌株生长在含补加了红霉素的固体HCT培养基的皮氏平板中。芽孢/晶体混合物收集于2ml灭菌水并用于Western印迹试验。如厂家所述，用抗SL-ISLP1多克隆抗体(1/10,000；1小时)进行检测，并用偶联有辣根过氧化物酶(HR)的山羊抗兔抗体(Sigma，St.Louis，MO)(1/7,500；1小时)继以SuperSignal化学发光底物(Pierce，Rockford，Il)来显现。

S层蛋白质的化学提取

ISLP1菌株即含pHT-ISLP1的Bt菌株及晶体缺陷型的Bt菌株407生长于BHI(Difco)肉汤培养基中至600nm O.D.值达0.9，以获得全部为旺盛生长的细胞。通过离心(10,000rpm 10分钟)来沉淀细胞。如Luckevich和Beveridge(1989)所述洗涤沉淀，并重悬于初始体积的1/50的1、1.5或2M盐酸胍(pH2.5)中，来特异性地提取细胞表面锚定的蛋白质。样品在10,000rpm离心10分钟，含细菌细胞的沉淀和含提取蛋白质的上清接着通过加入三氯乙酸(TCA)到终浓度10％(20分钟，-20℃)来沉淀，在10,000rpm离心10分钟，以水洗涤两次并悬浮于0.03N NaOH。加入等体积的Laemmli 2×样品上样缓冲液。样品煮沸5分钟，并上样于两块10％SDS-PAGE胶。一块胶以考马斯亮蓝染色，而另一块重复的胶电转至聚偏二乙烯二氟(PVDF)Immobilon(止动剂)膜(安玛西亚生物技术公司：Amersham Biosciences)上，如上所述使用抗SL-ISLP1多克隆抗体来进行Western印迹检测。

结果

分离对墨西哥豆瓢虫有活性的Bt菌株：在墨西哥从墨西哥豆瓢虫死尸上分离的四个Bt菌株被用于抗墨西哥豆瓢虫幼虫(鞘翅目：瓢虫科(Coccinellidae))的毒性测定。这些菌株非常相似，因为它们全都生产相似的由100kDa蛋白质构成的晶体，并具有相同的总蛋白质模式。当以100和1000ng/cm²进行测试时，四株菌显示了对于墨西哥豆瓢虫幼虫100％的致死率。我们选择了这些菌株中的一个，命名为ISLP1，并如材料和方法中所述，通过连续的离心继以阴离子交换层析来纯化晶体包涵体。用此菌株的芽孢/晶体混合物进行的抗墨西哥豆瓢虫幼虫的生物测试显示16ng/cm²的致死浓度(LC₅₀)(7-25的95％置信限度)，发现使用纯晶体蛋白质的LC₅₀为8.6ng/cm²(4-14的95％置信限度)。纯晶体或芽孢/晶体混合物(高达10,000ng/cm²)对于鳞翅目昆虫烟草天蛾或草地夜蛾的一龄幼虫不显示毒性，且对于双翅目(dipteran)埃及伊蚊的四龄幼虫未发现毒性。

通过使用通用的和特异于cry1、cry3、cry5、cry7、cry8、cry9、cry11、cry13、cry14和cyt1A基因的引物的PCR反应来表征ISLP1菌株(Bravo等，1998；Ceron等，1994；Ceron等，1995)，所有PCR反应均为阴性。然后使用Aguino de Muro和Priest(Aguino de Muro和Priest，1993)设计的引物扩增了ISLP1菌株的16S RNAr基因，该16SDNA序列的Blast分析证实了该ISLP1菌株属于苏云金芽孢杆菌类。

表征在晶体包涵体中发现的ISLP1蛋白质

ISLP1菌株产生的100kDa蛋白质通过阴离子交换层析纯化后，转膜到Immobilon PSQ，并得到了蛋白质的氨基端序列。此氨基酸序列(AGKSFPDVPAGH，SEQ ID NO：14)对应于于来自地衣芽孢杆菌OlpA(GenBank登录号U38842，GenPept登录号AAC44405)和炭疽芽孢杆菌EA1(GenBank登录号X99724，GenPept登录号CAA68063)的S层蛋白质前体前导肽之后的头12个氨基酸。进行了纯ISLP1蛋白质的胰蛋白酶消化，并通过HPLC分子筛层析纯化了约50kDa的片段。获得的内部18个氨基酸的序列也见于Olp1和EA1 S层蛋白质：KLPVTFVTTDQYGDPYGAN(SEQ ID NO：15)。

根据此蛋白质得到的两个N-末端序列设计了PCR引物(ISLP1Xder和ISLP1Xrev)，并用于扩增经DNA测序的内部片段。所产生序列的Blast分析显示与两个S层基因olpA和eag(GenBank登录号u38842和x99724)序列具有高分。使用此信息及这些基因的DNA序列比对，设计了新的PCR引物，用于扩增两个其它的重叠PCR产物。一个包括ATG密码子的上游500bp，以含有推定的启动子，而另一个包括推定的终止密码子之后的200bp。获得了完整的islp1基因的序列(SEQ ID NO：1)，此序列中发现的开放阅读框(ORF)包含2,589个核苷酸，它之前为Shine-Dalgarno序列。在终止密码子下游的22个核苷酸处观察到回文结构。比较测序蛋白质的N-末端和从核苷酸序列推断的氨基酸序列的N-末端，证实了此蛋白质也是合成为具有29个氨基酸信号肽的前体多肽。切除信号序列的成熟蛋白质的N-末端在SEQ ID NO：2第30位氨基酸位点处。在蛋白质序列中存在3个S层同源基序(SLH)，观察到第一个位于第34-76位氨基酸区域，第二个位于第95-136位氨基酸区域，而第三个在第162-198位氨基酸区域(全部为SEQ ID NO：2中的氨基酸位点)。

最后，如在材料和方法中所述，通过分别扩增三个在NcoI和Pst1限制性位点重叠的PCR片段，完整的islp1基因被直接克隆进晶体缺陷型苏云金芽孢杆菌菌株407。不可能得到含有此构建体的大肠杆菌转化子。其他作者发现在许多情况下在大肠杆菌中克隆具有其调控区的S层基因会导致问题(Mesnage等，2001；Sun等，2001)。产生的表达ISLP1蛋白质的Bt菌株通过用针对纯ISLP1蛋白质生产的多克隆抗体免疫检测蛋白质来判断。当在100和1000ng/cm²测定时，相比于转化有pHT315穿梭载体、不表达ISLP1蛋白质、对墨西哥豆瓢虫幼虫不显示任何毒性的对照菌株，此菌株的生孢培养物显示了对于墨西哥豆瓢虫幼虫的100％致死率。

在ISLP1菌株中表达ISLP1

我们分析了在SP芽孢形成培养基中生长期间ISLP1蛋白质的表达。此蛋白质表达于营养生长期和芽孢形成期。在营养生长期，该蛋白质和细菌缔合，因为所有通过Western印迹检测到的蛋白质都发现在离心培养物后获得的细菌沉淀里。然而，在芽孢形成期ISLP1蛋白质也发现在离心培养物的上清中。

Luckevich和Beveridge(1989)描述了用于苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种S层蛋白质的特异性提取方法。我们使用此方法来检测是否ISLP1具有结合来自初始菌株和转化菌株的细胞表面的能力。在低pH条件下用2M离液剂处理营养生长期细胞，导致SL-ISLP1蛋白质的特异性提取，这通过SDS-PAGE和Western印迹分析提取蛋白质可以判断。SL-ISLP1蛋白质只存在于ISLP1菌株和Bt转化子菌株中，此蛋白质在407晶体缺陷型菌株中没有。与Luckevich和Beveridge(1989)报道类似的是，只有用2M离液剂处理才能提取该ISLP1蛋白质，用低些浓度的离液剂(1-1.5M)不能从细菌细胞中提取该蛋白质。

也在其它Bt菌株如Bt库斯塔克(kurstaki)亚种HD1和HD73、Bt以色列(israelinsis)亚种HD567、Bt鲇泽(aizawai)亚种HD137、Bt多窝(tolworthi)亚种HD125、Bt莫里逊(morrisoni)拟步行甲(tenebrionis)亚种中进行了此蛋白质的Western印迹检测，显示此蛋白质并不产生于这些菌株。使用引物ISLP1Xder和ISLP1Xrev来PCR分析这些菌株也证实了这些Bt菌株不含ISLP1编码序列。

ISLP1蛋白质(SEQ ID NO：2)与来自炭疽芽孢杆菌的EA1 S层蛋白质(对于包括信号肽的蛋白质有92％的序列同一性)及在苏云金芽孢杆菌中报道的CTC2蛋白质(对于包括信号肽的蛋白质有89％的序列同一性)具有高度的序列同一性。ISLP1蛋白质与另一炭疽芽孢杆菌S层蛋白质SAP的氨基酸序列同源性只有32％。

参考文献

Aguino de Muro和Priest.(1993)FEMS Microbiol Lett.112：205-210.

Altschul等(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402.

Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410.

An等(1996)Plant J.10，107.

Aoyama和Chua(1997)Plant Journal 11：605-612

Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，卷1和2，USA.

Bennetzen&Hall(1982)J.Biol.Chem.257，3026-3031

Bendtsen等(2004)J.Mol.Biol.，340：783-795.

Bernhard，K.和Utz，R.(1993)″Production of Bacillus thuringiensisinsecticides for experimental and commercial uses″，In Bacillusthuringiensis，An Environmental Biopesticide：Theory and Practice，255-267页，编辑Entwistle，P.F.，Cory，J.S.，Bailey，M.J.和Higgs，S.，John Wiley and Sons，New York.

Beveridge等(1997)FEMS Microbiol Rev 20：99-149

Bih等(1999)，J.Biol.Chem.274，22884-22894.

Bravo等(1998)Appl.Environm.Microbiol.64：4965-4972

Brown(1998)Molecular Biology LabFax，卷I和II，第二版，AcademicPress(UK)

Callis等(1987)Genes Developm.1：1183-1200

Cerón等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：353-356.

Cerón等(1995)Appl.Environ.Microbiol.61：3826-3831.

Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18，675-689.

Cordera等(1994)The Plant Journal 6，141.

Cornejo等(1993)Plant Mol.Biol.23，567-581.

Cornelissen等(1986)EMBO J.5，37-40.

Crickmore等(1998).Microbiology and Molecular Biology Reviews 62：807-813.

Crickmore等(2005).

http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html

Croy R.D.D.(1993)Plant Molecular Biology Labfax，由BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版

Datta等(1990)Bio/Technology 8，736-740.

De Pater等(1992)Plant J.2，834-844.

Depicker等(1982)J.Molec.Appl.Genetics 1，561-573.

Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press

Dulmage，H.T.(1981)″Production of Bacteria for Biological Control ofInsects″in Biological Control in Crop Production，编辑Paparizas，D.C.，Osmun Publishers，Totowa，N.J.，USA，129-141页.struch等(1996)ProcNatl Acad Sci USA 93，5389-94.

Estruch等(1996)PNAS USA 93(11)，5389-5394.

Franck等(1980)Cell 21，285-294.

French等(1986)Anal.Biochem.156，417-423

Ffrench-Constant和Bowen(2000)Cell Mol Life Sci 57，828-33.

Fromm等(1990)Bio/Technology 8，833-839

Gardner等(1981)Nucleic Acids Research 9，2871-2887

Gielen等(1984)EMBO J 3，835-845

Gordon-Kamm等(1990)The Plant Cell 2，603-618

Gould等(1991)Plant Physiol.95，426-434

Güereca和Bravo.(1999)Biochim.Biophys.Acta.1429：342-350

Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Manual Laboratory，Cold SpringHarbor Lab Press NY

Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Academy Science 89(10)：915-919Hesse等(1989)，EMBO J.8 2453-2461.

Hill(1983)Epilachna spp.In：Agricultural Insect pests of the tropics andtheir control.Cambridge University press.438页.ISBN 0 521 24638 5.

Ho等(1989).Gene 77，51-59.

等(1988)Appl.and Environm.Microbiol.54，2010-2017

Hull和Howell(1987)Virology 86，482-493

Ibarra等(2003)Appl.Environm Microbiol.69：5269-5274

Itakura等(1977).Science 198，1056-1063.

Keil等(1986)，Nucl.Acids Res.14，5641-5650.

等(1989)，Mol.Gen.Genet.217，155-161.

和Weil(1991)，Mol.Gen.Genet.225，297-304.

Kota等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，1840-1845.

Kotiranta等(1998)Infect Immunol.66：4895-4902.

Last等(1990)Theor.Appl.Genet.81，581-588

Lereclus等(1989)FEMS Microbiol.Lett.60：211-218.

Lereclus等(1995)Bio/Technology 13，67-71.

Luckevich和Beveridge(1989)J.Bacteriol.171，6656-6667.

Mahillon等(1989)，FEMS Microbiol.Letters 60，205-210.

Maxam和Gilbert(1980)Methods in Enzymol.65，499-560.

McBride等(1995)Bio/Technology 13，362

McPherson等(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany

Mesnage等(1998)J.Bacteriol.180：52-58

Mesnage，S.等(2001)Microbiology 147：1343-1351

Mignot等(2002)Mol.Microbiol.43：1615-1627

Morris等(1999)，Biochem.Biophys.Res.Commun.255，328-333.

Msadek等(1990)J.Bacteriol.172：824-834

Murray等(1989)Nucleic Acids Research 17(2)，477-498.

Nakamura等(2000)Nucl.Acids Res.28，292.

Needleman和Wunsch algorithm(1970)J.Mol.Biol.48：443-453

Neuhaus&Rogers(1998)Plant Mol.Biol.38，127-144.

Odell等(1985)Nature 313，810-812.

Oelmuller等(1993)Mol.Gen.Genet.237，261-272.

Park等(1997)J.Biol.Chem.272，6876-6881.

Pei和Blaser.(1990)J.Clin Invest.85：1036-1043

Sambrook等(1989)Molecular Cloning.A laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY

Sanger(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74(12)，5463-5467.

Sára和Sleytr(2000)J.Bacteriol.182：859-868

Schnepf等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：775-806.

Shcherban等(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci USA 92，9245-9249.

Shimamoto等(1989)Nature 338，274-276

Sleytr和Beveridge(1999)Trends in Microbiology 7，253-260.

Stanssens等(1989)Nucleic Acids Research 12，4441-4454.

Sun等(2001)Acta Microbiol Sin.41：141-147.

Sutliff等(1991)Plant Molec.Biol.16，579-591.

Tavladoraki等(1998)，FEBS Lett.426，62-66.

Terashima等(1999)，Appl.Microbiol.Biotechnol.52，516-523.

Travers等(1987)Appl.Environ.Microbiol.53：1263-1266.

Vaeck等(1987)Nature 328，33-37.

Van Den Broeck等(1985)Nature 313，358.

Van Rie等(1990)Science 247，72.

Velten等(1984)EMBO J 3，2723-2730

Velten和Schell(1985)，Nucleic Acids Research 13，6981-6998

Verdaguer等(1998)，Plant Mol.Biol.37，1055-1067

Von Heijne，Gunnar(1986)Nucleic Acids Research.14：11，4683-4690

Wada等(1990).Nucl.Acids Res.18，2367-1411.

Waterfield等(2001)Trends Microbiol 9，185-91.

White等(1989).Trends in Genet.5，185-189

Wong等(1992)，Plant Molec.Biol.20，81-93.

Xu等(2004)Parasitology Research 92(1)：53-7.

Zhang等(1991)The Plant Cell 3，1155-1165.

序列表

<110>墨西哥国立自治大学生物技术学院

<120>新的具有杀虫活性的细菌蛋白质

<130>BCS 05-2014

<150>US 60/697,391

<151>2005-07-08

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3117

<212>DNA

<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<220>

<221>CDS

<222>(325)..(2916)

<400>1

actttattca ttttatattt gagtattact gatatattaa taatacgatt aaaagactga 60

attatcagaa tgtgtcgaat cttcttttga gaaagttctt gataacgaat ggttttgtat 120

agtatgatga acttgtttca gaaaatggta tttaaacctt atatttacat ctaacggttt 180

atatcatttt tttatgtgaa ctacttttca ttatagtatt tttgtttatg tttttattgt 240

tttatggctt ttctaactag ctagttttca aatttaatat gatgtgaaac tagtagcata 300

ttcctgaagg aggaaattta taaa atg gca aag act aac tct tac aaa aaa 351

Met Ala Lys Thr Asn Ser Tyr Lys Lys

1 5

gta atc gca ggt aca atg aca gca gca atg gta gca ggt gtt gtt tct 399

Val Ile Ala Gly Thr Met Thr Ala Ala Met Val Ala Gly Val Val Ser

10 15 20 25

cca gta gca gca gca ggt aaa tcg ttc cca gac gtt cca gct ggt cat 447

Pro Val Ala Ala Ala Gly Lys Ser Phe Pro Asp Val Pro Ala Gly His

30 35 40

tgg gga tta gat tct atc aat tac tta gta gat aaa ggt gca atc gaa 495

Trp Gly Leu Asp Ser Ile Asn Tyr Leu Val Asp Lys Gly Ala Ile Glu

45 50 55

ggt aag cca gat ggt aca tac gct ccg gct gaa gaa att gat cgt gct 543

Gly Lys Pro Asp Gly Thr Tyr Ala Pro Ala Glu Glu Ile Asp Arg Ala

60 65 70

tct gct gcg aaa att atg gca att aca tta ggt tta aaa gtt gaa gag 591

Ser Ala Ala Lys Ile Met Ala Ile Thr Leu Gly Leu Lys Val Glu Glu

75 80 85

ggt gca caa cca tct ttc aaa gat gct aaa aat cat tgg gct tct aaa 639

Gly Ala Gln Pro Ser Phe Lys Asp Ala Lys Asn His Trp Ala Ser Lys

90 95 100 105

tac att gca gcg gtt gaa aaa gcg ggt gtt gtt aga ggt gat ggt aaa 687

Tyr Ile Ala Ala Val Glu Lys Ala Gly Val Val Arg Gly Asp Gly Lys

110 115 120

gaa aac ttc tct cca gat aaa aag att gac cgt gct tct ttc gct tct 735

Glu Asn Phe Ser Pro Asp Lys Lys Ile Asp Arg Ala Ser Phe Ala Ser

125 130 135

atg atc gta ggt gct tat aac tta aaa gat aaa gtt aac ggc gag tta 783

Met Ile Val Gly Ala Tyr Asn Leu Lys Asp Lys Val Asn Gly Glu Leu

140 145 150

gtt aca aaa ttt gaa gat tta tta gac cat tgg ggt gaa gaa aaa gct 831

Val Thr Lys Phe Glu Asp Leu Leu Asp His Trp Gly Glu Glu Lys Ala

155 160 165

aac atc cta atc cat ctt gga ctt tct gaa gga aca gga gga aac aag 879

Asn Ile Leu Ile His Leu Gly Leu Ser Glu Gly Thr Gly Gly Asn Lys

170 175 180 185

tgg gag cca aat aaa tct gta tct cgt gca gaa gca gct aaa ttt atc 927

Trp Glu Pro Asn Lys Ser Val Ser Arg Ala Glu Ala Ala Lys Phe Ile

190 195 200

gca gta gca gat aaa aaa tat ggc aaa aaa gat aat gca caa gca tat 975

Ala Val Ala Asp Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Asp Asn Ala Gln Ala Tyr

205 210 215

gta act gat gtg aaa gtt tct gaa cca acg aaa tta aca tta act ggt 1023

Val Thr Asp Val Lys Val Ser Glu Pro Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly

220 225 230

act ggt tta gat aag ctt gct gct gaa gat gta act ctt gag gga gac 1071

Thr Gly Leu Asp Lys Leu Ala Ala Glu Asp Val Thr Leu Glu Gly Asp

235 240 245

aaa gct gtt gcg att gaa gca agt gct gac ggt act tct gca gtt gta 1119

Lys Ala Val Ala Ile Glu Ala Ser Ala Asp Gly Thr Ser Ala Val Val

250 255 260 265

aca ctt ggt ggt aaa gtt gct cca aat aaa aat ctt act gta aaa gtg 1167

Thr Leu Gly Gly Lys Val Ala Pro Asn Lys Asn Leu Thr Val Lys Val

270 275 280

aaa aat caa tca ttc gta acg aaa ttt gta tac gaa gtg aaa aaa tta 1215

Lys Asn Gln Ser Phe Val Thr Lys Phe Val Tyr Glu Val Lys Lys Leu

285 290 295

gca gta gaa aaa ctt aca ttt gat gat gat cgt gct ggt caa gca gtt 1263

Ala Val Glu Lys Leu Thr Phe Asp Asp Asp Arg Ala Gly Gln Ala Val

300 305 310

gct ttc aaa tta aac gat gaa aaa ggt aac gct gat gtt gaa tac tta 1311

Ala Phe Lys Leu Asn Asp Glu Lys Gly Asn Ala Asp Val Glu Tyr Leu

315 320 325

aac tta gca gac cat gac gtc aaa ttt gta gca aat aac tta gat ggt 1359

Asn Leu Ala Asp His Asp Val Lys Phe Val Ala Asn Asn Leu Asp Gly

330 335 340 345

tca tca gca aac atc ttt gaa ggt gga gta gct act tct act aca ggc 1407

Ser Ser Ala Asn Ile Phe Glu Gly Gly Val Ala Thr Ser Thr Thr Gly

350 355 360

aaa cta gct gtt ggc att aaa cca gct gac tac aaa gta gaa gta caa 1455

Lys Leu Ala Val Gly Ile Lys Pro Ala Asp Tyr Lys Val Glu Val Gln

365 370 375

gtt aca aaa cgc ggt ggt tta aca gtt tct aac act ggt att att aca 1503

Val Thr Lys Arg Gly Gly Leu Thr Val Ser Asn Thr Gly Ile Ile Thr

380 385 390

gtg aaa aac ctt gat aca cca gct tct gca atc aaa aat gct gta ttt 1551

Val Lys Asn Leu Asp Thr Pro Ala Ser Ala Ile Lys Asn Ala Val Phe

395 400 405

gca tta gat gct gat aat gat ggt gtt gta aac tac ggt agc aaa ctt 1599

Ala Leu Asp Ala Asp Asn Asp Gly Val Val Asn Tyr Gly Ser Lys Leu

410 415 420 425

tct ggt aaa gac ttt gct tta aat agc caa aac tta gtt gtt ggt gaa 1647

Ser Gly Lys Asp Phe Ala Leu Asn Ser Gln Asn Leu Val Val Gly Glu

430 435 440

aaa gca tct ctt aat aaa tta gtt gct aca att gct gga gaa gat aaa 1695

Lys Ala Ser Leu Asn Lys Leu Val Ala Thr Ile Ala Gly Glu Asp Lys

445 450 455

gta gtt gat cca gga tca att agc att aag tct tca aac cac ggt att 1743

Val Val Asp Pro Gly Ser Ile Ser Ile Lys Ser Ser Asn His Gly Ile

460 465 470

att tct gta gta aat aac tac att act gct gag gct gct ggt gag gca 1791

Ile Ser Val Val Asn Asn Tyr Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Glu Ala

475 480 485

aca ctt act att aaa gta ggt gac gca acg aaa gat gtt aaa ttt aaa 1839

Thr Leu Thr Ile Lys Val Gly Asp Ala Thr Lys Asp Val Lys Phe Lys

490 495 500 505

gta acg act gat tct cgt aaa tta gca tca gta aaa gct aac cca gat 1887

Val Thr Thr Asp Ser Arg Lys Leu Ala Ser Val Lys Ala Asn Pro Asp

510 515 520

aaa tta caa gtt gtt caa aat aaa aaa tta cct gtt aca ttc gta aca 1935

Lys Leu Gln Val Val Gln Asn Lys Lys Leu Pro Val Thr Phe Val Thr

525 530 535

act gac caa tat ggc gat cca ttt ggt gct aac cca gat gca att aaa 1983

Thr Asp Gln Tyr Gly Asp Pro Phe Gly Ala Asn Pro Asp Ala Ile Lys

540 545 550

gaa gtt ctt ccg aaa act ggt gta gtt gca gaa ggt gga tta gat gta 2031

Glu Val Leu Pro Lys Thr Gly Val Val Ala Glu Gly Gly Leu Asp Val

555 560 565

gta acg act gac tct ggt tca att ggt acg aaa aca ctt gat gtt aca 2079

Val Thr Thr Asp Ser Gly Ser Ile Gly Thr Lys Thr Leu Asp Val Thr

570 575 580 585

ggt aac gaa gta ggc gaa ggt aca gtt cac ttc caa aac ggt aac ggt 2127

Gly Asn Glu Val Gly Glu Gly Thr Val His Phe Gln Asn Gly Asn Gly

590 595 600

gct act tta ggc tca tta tat gtg aat gta aca gaa gga aac gtg gca 2175

Ala Thr Leu Gly Ser Leu Tyr Val Asn Val Thr Glu Gly Asn Val Ala

605 610 615

ttt aaa aac ttt gaa ctt gta tct aaa gta ggt caa tac ggt gca tca 2223

Phe Lys Asn Phe Glu Leu Val Ser Lys Val Gly Gln Tyr Gly Ala Ser

620 625 630

cct gat aca aaa ctt gac ctt aat gtt tct gac aca gtt gca tat caa 2271

Pro Asp Thr Lys Leu Asp Leu Asn Val Ser Asp Thr Val Ala Tyr Gln

635 640 645

tta tct aag tac act tca gat cgc gta tac tct gat cct gaa aac tta 2319

Leu Ser Lys Tyr Thr Ser Asp Arg Val Tyr Ser Asp Pro Glu Asn Leu

650 655 660 665

gaa ggt tat gca gtt gag tct aaa aac gaa aaa gta gct aca gct aaa 2367

Glu Gly Tyr Ala Val Glu Ser Lys Asn Glu Lys Val Ala Thr Ala Lys

670 675 680

att gtt gga aat aaa gtt gtt gtt aca ggt aaa gct cca ggt aaa gtt 2415

Ile Val Gly Asn Lys Val Val Val Thr Gly Lys Ala Pro Gly Lys Val

685 690 695

gat atc cac tta acg aaa aat ggt gca act gct ggt aaa gca act atc 2463

Asp Ile His Leu Thr Lys Asn Gly Ala Thr Ala Gly Lys Ala Thr Ile

700 705 710

gaa atc gtc caa gag aca att gct att aaa tct gta aac ttc aaa cca 2511

Glu Ile Val Gln Glu Thr Ile Ala Ile Lys Ser Val Asn Phe Lys Pro

715 720 725

gtt caa aca gaa aac ttc gtt gag aag aaa atc aac atc ggt act gtg 2559

Val Gln Thr Glu Asn Phe Val Glu Lys Lys Ile Asn Ile Gly Thr Val

730 735 740 745

tta gag ctt gag aag agt aac ctt gat gat atc gta aaa ggt att aac 2607

Leu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Leu Asp Asp Ile Val Lys Gly Ile Asn

750 755 760

tta acg aaa gat aca caa cat aaa gta cgt gtt gta aaa tct ggt gac 2655

Leu Thr Lys Asp Thr Gln His Lys Val Arg Val Val Lys Ser Gly Asp

765 770 775

gag caa ggt aaa ctt tac tta gat aga aac ggc gat gct gta ttt aac 2703

Glu Gln Gly Lys Leu Tyr Leu Asp Arg Asn Gly Asp Ala Val Phe Asn

780 785 790

gct ggc gat gta aac ctt ggt tat gta aca gta tct caa aca agt gat 2751

Ala Gly Asp Val Asn Leu Gly Tyr Val Thr Val Ser Gln Thr Ser Asp

795 800 805

tct gca ctt cca aac ttc aag gca gac ctt tac gat act tta act act 2799

Ser Ala Leu Pro Asn Phe Lys Ala Asp Leu Tyr Asp Thr Leu Thr Thr

810 815 820 825

aag tac act gac aaa ggt aca tta gta ttc aaa gta tta ggt gag aaa 2847

Lys Tyr Thr Asp Lys Gly Thr Leu Val Phe Lys Val Leu Gly Glu Lys

830 835 840

gat gtt cta aca agc gaa att ggt tca caa gct gta cac gtg aac gtt 2895

Asp Val Leu Thr Ser Glu Ile Gly Ser Gln Ala Val His Val Asn Val

845 850 855

ctt aac aac cca aat eta taa gtcgattata gataaagtga aaaatcagtg 2946

Leu Asn Asn Pro Asn Leu

860

gggatgaatt cccactgatt tttttgctgt caatagcgaa aagaagcctc ttgtgaaaaa 3006

tacaagaggc tcctttctat ttcttaaact taaacatatc cccactcaaa ttcgaatcac 3066

tatacacgaa caataccatg ttaatgttgt tgtctttcat gtattgatat a 3117

<210>2

<211>863

<212>PRT

<213>苏云金芽孢杆菌

<400>2

Met Ala Lys Thr Asn Ser Tyr Lys Lys Val Ile Ala Gly Thr Met Thr

1 5 10 15

Ala Ala Met Val Ala Gly Val Val Ser Pro Val Ala Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Ser Phe Pro Asp Val Pro Ala Gly His Trp Gly Leu Asp Ser Ile Asn

35 40 45

Tyr Leu Val Asp Lys Gly Ala Ile Glu Gly Lys Pro Asp Gly Thr Tyr

50 55 60

Ala Pro Ala Glu Glu Ile Asp Arg Ala Ser Ala Ala Lys Ile Met Ala

65 70 75 80

Ile Thr Leu Gly Leu Lys Val Glu Glu Gly Ala Gln Pro Ser Phe Lys

85 90 95

Asp Ala Lys Asn His Trp Ala Ser Lys Tyr Ile Ala Ala Val Glu Lys

100 105 110

Ala Gly Val Val Arg Gly Asp Gly Lys Glu Asn Phe Ser Pro Asp Lys

115 120 125

Lys Ile Asp Arg Ala Ser Phe Ala Ser Met Ile Val Gly Ala Tyr Asn

130 135 140

Leu Lys Asp Lys Val Asn Gly Glu Leu Val Thr Lys Phe Glu Asp Leu

145 150 155 160

Leu Asp His Trp Gly Glu Glu Lys Ala Asn Ile Leu Ile His Leu Gly

165 170 175

Leu Ser Glu Gly Thr Gly Gly Asn Lys Trp Glu Pro Asn Lys Ser Val

180 185 190

Ser Arg Ala Glu Ala Ala Lys Phe Ile Ala Val Ala Asp Lys Lys Tyr

195 200 205

Gly Lys Lys Asp Asn Ala Gln Ala Tyr Val Thr Asp Val Lys Val Ser

210 215 220

Glu Pro Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Thr Gly Leu Asp Lys Leu Ala

225 230 235 240

Ala Glu Asp Val Thr Leu Glu Gly Asp Lys Ala Val Ala Ile Glu Ala

245 250 255

Ser Ala Asp Gly Thr Ser Ala Val Val Thr Leu Gly Gly Lys Val Ala

260 265 270

Pro Asn Lys Asn Leu Thr Val Lys Val Lys Asn Gln Ser Phe Val Thr

275 280 285

Lys Phe Val Tyr Glu Val Lys Lys Leu Ala Val Glu Lys Leu Thr Phe

290 295 300

Asp Asp Asp Arg Ala Gly Gln Ala Val Ala Phe Lys Leu Asn Asp Glu

305 310 315 320

Lys Gly Asn Ala Asp Val Glu Tyr Leu Asn Leu Ala Asp His Asp Val

325 330 335

Lys Phe Val Ala Asn Asn Leu Asp Gly Ser Ser Ala Asn Ile Phe Glu

340 345 350

Gly Gly Val Ala Thr Ser Thr Thr Gly Lys Leu Ala Val Gly Ile Lys

355 360 365

Pro Ala Asp Tyr Lys Val Glu Val Gln Val Thr Lys Arg Gly Gly Leu

370 375 380

Thr Val Ser Asn Thr Gly Ile Ile Thr Val Lys Asn Leu Asp Thr Pro

385 390 395 400

Ala Ser Ala Ile Lys Asn Ala Val Phe Ala Leu Asp Ala Asp Asn Asp

405 410 415

Gly Val Val Asn Tyr Gly Ser Lys Leu Ser Gly Lys Asp Phe Ala Leu

420 425 430

Asn Ser Gln Asn Leu Val Val Gly Glu Lys Ala Ser Leu Asn Lys Leu

435 440 445

Val Ala Thr Ile Ala Gly Glu Asp Lys Val Val Asp Pro Gly Ser Ile

450 455 460

Ser Ile Lys Ser Ser Asn His Gly Ile Ile Ser Val Val Asn Asn Tyr

465 470 475 480

Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Glu Ala Thr Leu Thr Ile Lys Val Gly

485 490 495

Asp Ala Thr Lys Asp Val Lys Phe Lys Val Thr Thr Asp Ser Arg Lys

500 505 510

Leu Ala Ser Val Lys Ala Asn Pro Asp Lys Leu Gln Val Val Gln Asn

515 520 525

Lys Lys Leu Pro Val Thr Phe Val Thr Thr Asp Gln Tyr Gly Asp Pro

530 535 540

Phe Gly Ala Asn Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Leu Pro Lys Thr Gly

545 550 555 560

Val Val Ala Glu Gly Gly Leu Asp Val Val Thr Thr Asp Ser Gly Ser

565 570 575

Ile Gly Thr Lys Thr Leu Asp Val Thr Gly Asn Glu Val Gly Glu Gly

580 585 590

Thr Val His Phe Gln Asn Gly Asn Gly Ala Thr Leu Gly Ser Leu Tyr

595 600 605

Val Asn Val Thr Glu Gly Asn Val Ala Phe Lys Asn Phe Glu Leu Val

610 615 620

Ser Lys Val Gly Gln Tyr Gly Ala Ser Pro Asp Thr Lys Leu Asp Leu

625 630 635 640

Asn Val Ser Asp Thr Val Ala Tyr Gln Leu Ser Lys Tyr Thr Ser Asp

645 650 655

Arg Val Tyr Ser Asp Pro Glu Asn Leu Glu Gly Tyr Ala Val Glu Ser

660 665 670

Lys Asn Glu Lys Val Ala Thr Ala Lys Ile Val Gly Asn Lys Val Val

675 680 685

Val Thr Gly Lys Ala Pro Gly Lys Val Asp Ile His Leu Thr Lys Asn

690 695 700

Gly Ala Thr Ala Gly Lys Ala Thr Ile Glu Ile Val Gln Glu Thr Ile

705 710 715 720

Ala Ile Lys Ser Val Asn Phe Lys Pro Val Gln Thr Glu Asn Phe Val

725 730 735

Glu Lys Lys Ile Asn Ile Gly Thr Val Leu Glu Leu Glu Lys Ser Asn

740 745 750

Leu Asp Asp Ile Val Lys Gly Ile Asn Leu Thr Lys Asp Thr Gln His

755 760 765

Lys Val Arg Val Val Lys Ser Gly Asp Glu Gln Gly Lys Leu Tyr Leu

770 775 780

Asp Arg Asn Gly Asp Ala Val Phe Asn Ala Gly Asp Val Asn Leu Gly

785 790 795 800

Tyr Val Thr Val Ser Gln Thr Ser Asp Ser Ala Leu Pro Asn Phe Lys

805 810 815

Ala Asp Leu Tyr Asp Thr Leu Thr Thr Lys Tyr Thr Asp Lys Gly Thr

820 825 830

Leu Val Phe Lys Val Leu Gly Glu Lys Asp Val Leu Thr Ser Glu Ile

835 840 845

Gly Ser Gln Ala Val His Val Asn Val Leu Asn Asn Pro Asn Leu

850 855 860

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>3

acgctctaga tagcaggtaa atcattccca gacg 34

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>4

acgctctaga tcgccgtatt ggtcagttgt tac 33

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>5

gctctagatg agagtgcttt ataggaaaat 30

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>6

gctctagatc ttcagccgga gcgtatgtac c 31

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>7

gctctagata ctgctgaggc tgctggtgag g 31

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>8

gctctagatc ctcgacctgc ttcactatca 30

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>9

tctttgccat ggtataaatt tcctccttc 29

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>10

ttataccatg gcaaagacta actcttac 28

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>11

aaaactgcag aagtaccgtc agcacttgct tc 32

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>12

aacgctgcag ttgtaacact tggtggtaaa g 31

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>13

cgggatcctc ctcgacctgc gtcactatca 30

<210>14

<211>12

<212>PRT

<213>苏云金芽孢杆菌

<400>14

Ala Gly Lys Ser Phe Pro Asp Val Pro Ala Gly His

1 5 10

<210>15

<211>19

<212>PRT

<213>苏云金芽孢杆菌

<400>15

Lys Leu Pro Val Thr Phe Val Thr Thr Asp Gln Tyr Gly Asp Pro Tyr

1 5 10 15

Gly Ala Asn

Claims

1.分离的杀虫蛋白质，其特征在于：

a)对于一些害虫具有特异性杀虫活性，而对于其它害虫没有，且

b)与细菌S层蛋白质具有至少50％的序列同一性。

2.权利要求1的蛋白质，其特征在于：

a)对于一些昆虫具有特异性杀昆虫活性，而对于其它昆虫没有，

b)与细菌S层蛋白质具有至少70％的序列同一性，

c)大约50到大约120kDa的分子量。

3.权利要求1的蛋白质，其与SEQ ID NO：2的蛋白质或其毒性片段具有至少50％的序列同一性，并且其分子量为大约50到大约120kDa。

4.权利要求2的蛋白质，其与SEQ ID NO：2的蛋白质或其毒性片段具有至少50％的序列同一性，并且其分子量为大约50到大约120kDa。

5.权利要求4的蛋白质，包含SEQ ID NO：2中始于第1位氨基酸和第31位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列。

6.权利要求4的蛋白质，包含SEQ ID NO：2中始于第1位氨基酸和第531位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列。

7.权利要求4的蛋白质，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

8.分离的DNA，编码权利要求1到7中任一项的蛋白质。

9.嵌合基因，包含：

a)包含权利要求8的DNA的编码序列，及

b)允许在植物细胞中表达的启动子。

10.权利要求9的嵌合基因，其中所述编码序列是经优化的合成DNA序列，以便在宿主植物中进行表达。

11.权利要求10的嵌合基因，其中所述宿主植物选自玉米、棉花、大豆、稻、油菜、花椰菜和甘蓝。

12.植物转化载体，包含权利要求9到11中任一项的嵌合基因。

13.转基因植物、种子或植物细胞，包含权利要求9到11中任一项的嵌合基因。

14.权利要求13的植物、种子或细胞，其中所述植物选自玉米、棉花、大豆、稻、油菜、花椰菜和甘蓝。

15.保护植物抵抗由以所述植物所属的植物物种为食的植物害虫如昆虫害虫导致的损伤的方法，包括在所述植物的细胞中表达权利要求9到11中任一项的嵌合基因的步骤。

16.保护植物抵抗由以所述植物所属的植物物种为食的植物害虫如昆虫害虫导致的损伤的方法，包括以权利要求9到11中任一项的嵌合基因转化植物细胞，将所述细胞再生为植物，和获得含有所述嵌合基因的所述植物的后代和繁殖材料如种子的步骤。

17.杀死害虫的方法，包括用权利要求1到7中任一项的蛋白质接触所述害虫。

18.权利要求17的方法，其中所述害虫是昆虫害虫。

19.权利要求8的DNA在控制或杀死害虫如昆虫害虫中的用途。

20.权利要求9到11中任一项的嵌合基因在控制或杀死害虫如昆虫害虫中的用途。

21.权利要求1到7中任一项的蛋白质在控制或杀死害虫如昆虫害虫中的用途。

22.保护田间植物免受害虫如昆虫损伤的方法，包括：或者以包含权利要求1到7中任一项的蛋白质的杀虫组合物的形式，或者以表达所述蛋白质的重组生物体的形式，对田间植物应用权利要求1到7中任一项的蛋白质。

23.权利要求21的方法，其中所述重组生物体是表达权利要求1到7中任一项的蛋白质的转基因植物。