CN106937674A

CN106937674A - 用于肉品保鲜的抗菌剂

Info

Publication number: CN106937674A
Application number: CN201710042365.4A
Authority: CN
Inventors: 孙芝兰; 刘芳; 王道营; 王筱梦; 诸永志; 吴海虹; 张新笑; 徐为民
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: CN106937674B

Abstract

本发明公开了一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其包括：卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)K313的S层蛋白SlpB和乳酸链球菌素。本发明所述用于肉品保鲜的抗菌剂能够利用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与乳酸链球菌素Nisin协同作用，增强对肉品中常见腐败菌腐生葡萄球菌的抑制作用，用于肉品保鲜，延长货架期。

Description

用于肉品保鲜的抗菌剂

技术领域

本发明涉及肉及肉制品的保鲜领域。更具体地说，本发明涉及一种用于肉品保鲜的抗菌剂。

背景技术

肉及肉制品蛋白质和脂肪含量丰富，水活度较高，在加工、运输和贮存过程中易受到微生物的侵染而腐败变质。为延长肉品的货架期，利用防腐抗菌剂抑制或杀灭腐败微生物是有效的方法之一。随着肉类食品安全问题的突出和人们对健康的重视，生物防腐抗菌剂越来越受到企业和消费者的青睐。但是生物抗菌剂的抑菌范围相对较窄，常不能单一地使用，需要与其它抗菌剂联合使用。如Nisin乳酸链球菌素是目前应用最广泛的抗菌剂，但是它有效抑菌浓度较高且仅在低pH时有效，鉴于其在应用上的局限性，开发新的生物抗菌剂或者增效剂具有较强的应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明基于意想不到的发现，即卷曲乳杆菌S层蛋白SlpB与乳酸链球菌素Nisin协同作用时，能够杀死腐生葡萄球菌。

本发明还有一个目的是提供一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其能够利用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与乳酸链球菌素Nisin协同作用，增强对肉品中常见腐败菌腐生葡萄球菌的抑制作用，用于肉品保鲜，延长货架期。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用于肉品保鲜的抗菌剂，包括：一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其包括：卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)K313的S层蛋白SlpB和乳酸链球菌素Nisin。S层(Surface layer)是存在于细菌及古细菌细胞外由蛋白或糖蛋白亚单位组成的单分子层晶格状结构。S-层蛋白的功能包括:维持细胞的形态结构、吸附小分子和离子、黏附或免疫调节等。我们研究发现SlpB通过损伤细胞壁，使Nisin易进入细胞膜，起到穿孔作用，从而协助Nisin杀死细菌。二者协同作用能显著抑制S.saprophyticus P2的生长。

优选的是，所述用于肉品保鲜的抗菌剂包括：30-50重量份的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB以及100-500重量份的乳酸链球菌素。

优选的是，所述用于肉品保鲜的抗菌剂包括：40重量份的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB以及250-500重量份的乳酸链球菌素。研究发现，按照重量份进行如本发明所述配比后，二者的协同作用最优，杀菌效果最好。

优选的是，所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB通过以下步骤制备：

(1)以卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)K313基因组DNA为模板，利用如SEQID NO:2所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行PCR扩增，得到包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的基因片段，之后将该基因片段构建到pET-22b表达载体上得到重组载体pET-Slpb；

(2)将构建好的重组载体pET-Slpb以CaCl₂法转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建重组菌株，之后利用该重组菌株进行诱导表达，然后通过进行蛋白纯化，得到所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB，所述SlpB的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。利用工程菌株例如大肠杆菌进行异源表达，然后制备所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。该方法可以提高所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB的制备量，同时更容易纯化。

优选的是，所述PCR扩增程序依次包括：94℃预变性4min；94℃变性40s，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

优选的是，利用该重组菌株进行诱导表达，然后通过进行蛋白纯化，制得的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB的方法包括：

步骤一，挑取重组菌株单菌落于含抗生素的LB培养基中，37℃摇动培养过夜；将过夜培养物按2％的接种量转接到含抗生素的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.8；加入终浓度为1.0mM的IPTG诱导表达，18℃继续培养4h；

步骤二，5000-10000g离心5min收集诱导表达的大肠杆菌，用PBS缓冲液洗两遍，用1/10体积的Binding buffer缓冲液重悬菌体；将菌体置于冰水混合物中超声破碎，然后4℃，10000-15000g离心30min，上清液即为大肠杆菌可溶性蛋白成分；

步骤三，纯化：用0.22μm滤膜过滤上清液；用5倍柱体积的水冲洗HisTrap^TM FFcrude columns，流速为1mL/min；用5倍柱体积的Binding buffer缓冲液平衡柱子；将所述上清液用针头吹打后上样，以打断样品中的DNA分子，之后用10倍体积的Binding buffer缓冲液冲洗柱子；用10倍体积的Washing buffer缓冲液冲洗柱子，洗掉未结合的蛋白样品；用5倍体积的Elution buffer缓冲液洗脱，将纯化的蛋白置于磷酸盐缓冲液中进行梯度透析，去除咪唑及盐离子，制得卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。纯化的蛋白浓度用Bradford蛋白定量试剂盒定量。

优选的是，所述超声破碎时，超声强度为25-30％，超声功率为300-400W，超声工作时间5s，停歇时间5s，处理99次，两个循环。

优选的是，所述Binding buffer缓冲液包含：20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl以及25mM咪唑，pH 7.4；

所述Washing buffer缓冲液包含：20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl以及50mM咪唑，pH 7.4；

所述Elution buffer缓冲液包含：20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl以及500mM咪唑，pH 7.4。

本发明至少包括以下有益效果：本发明所述用于肉品的抗菌剂选用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与Nisin两种组分进行混合制备。利用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与Nisin的协同作用，不仅可以抑制腐生葡萄球菌S.saprophyticus P2的生长，同时SlpB通过损伤S.saprophyticus P2的表面增强Nisin的杀菌作用；二者共同作用造成细胞的死亡。所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB的制备采用工程菌株进行异源表达，其制备方法简单，产量大，容易纯化。本发明所述用于肉品的抗菌剂利用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与Nisin的协同作用，增强对肉品中常见腐败菌腐生葡萄球菌的抑制作用，增强杀菌作用，应用于肉品保鲜，延长货架期。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为利用本发明各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticus P2生长曲线图；

图2为利用本发明各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticus P2的扫描电镜图；

图3为利用本发明各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticus P2的透射电镜图；

图4为利用本发明各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticus P2胞内和胞外ATP的含量曲线图；

图5为利用本发明各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticus P2的群体效应图；

图6为利用本发明各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticus P2膜电势差的变化图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其包括：卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)K313的S层蛋白SlpB和乳酸链球菌素。其中所述卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)K313的S层蛋白SlpB通过下述方法制备：

(1)以卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)K313基因组DNA为模板，利用如SEQID NO:2所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行PCR扩增，得到包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的基因片段，之后将该基因片段经内切酶NdeI-EcoRI消化，纯化后构建到经过相同内切酶消化的pET-22b表达载体上得到重组载体pET-Slpb；PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

上游引物中酶切位点引入了ATG起始密码子

(2)利用该重组菌株进行诱导表达，然后通过进行蛋白纯化，制到所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB

挑取重组菌单菌落于5mL含抗生素的LB培养基中，37℃摇动培养过夜；将过夜培养物按2％的接种量转接到含抗生素的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.8；加入终浓度为1.0mM的IPTG诱导表达，18℃继续培养4h；10，000g离心5min收集诱导表达的大肠杆菌，用PBS洗两遍，用1/10体积的Binding buffer(20mM磷酸盐缓冲液,500mM NaCl,25mM咪唑,pH 7.4)重悬菌体；菌体置冰水混合物中超声破碎，处理强度25～30％(400wt)，处理频率5s/5s，处理99次，两个循环；4℃10,000g离心30min，上清即为大肠杆菌可溶性蛋白成分，用0.22μm滤膜过滤上清液；用5倍柱体积的水冲洗HisTrap^TM FF crude columns，流速为1mL/min；用5倍柱体积的Binding buffer平衡柱子；将样品用针头吹打，以打断样品中的DNA分子，然后上样，上样速度为1mL/min；用10倍体积的Binding buffer冲洗柱子；用10倍体积的Washing buffer(20mM磷酸盐缓冲液,500mM NaCl,50mM咪唑,pH 7.4)冲洗柱子，洗掉未结合的蛋白样品；用5倍体积的Elution buffer(20mM磷酸盐缓冲液,500mM NaCl,500mM咪唑,pH 7.4)洗脱，将液体回收在1.5mL的离心管中；SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化；同时将纯化的蛋白于置磷酸盐缓冲液中梯度透析，去除咪唑及盐离子。纯化的蛋白浓度用Bradford蛋白定量试剂盒定量。

实施例1

本发明所述用于肉品的抗菌剂包括：100μg/mL乳酸链球菌素Nisin和40μg/mL卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。

实施例2

本发明所述用于肉品的抗菌剂包括：250μg/mL乳酸链球菌素Nisin和40μg/mL卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。

实施例3

本发明所述用于肉品的抗菌剂包括：500μg/mL乳酸链球菌素Nisin和30μg/mL卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。

实施例4

本发明所述用于肉品的抗菌剂包括：500μg/mL乳酸链球菌素Nisin和50μg/mL卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。

实施例5

一种用于肉品的抗菌剂包括：500μg/mL乳酸链球菌素Nisin。

实施例6

一种用于肉品的抗菌剂包括：40μg/mL卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。

下面对上述实施例制备的抗菌剂进行系列检测：

利用各实施例中所述的抗菌剂进行腐生葡萄球菌培养和肉品处理，并测定相关数据，具体如下：

1，腐生葡萄球菌生长曲线测定

将过夜培养的腐生葡萄球菌S.saprophyticus P2以2％的接种量接种到新鲜的培养基中，培养基中添加实施例1、实施例5和实施例6制备所述抗菌剂，37℃摇床培养，进行对比试验。测定OD₆₀₀并绘制它们的生长曲线，见图1。

由图1可知，当Nisin浓度为100μg/mL，SlpB 40μg/mL时，能降低S.saprophyticusP2的生长速度，但最终细胞密度未有明显变化。而当Nisin和SlpB协同作用时，无论生长速度还是最终细胞密度都显著降低，说明二者协同作用能显著抑制S.saprophyticus P2的生长。

2，腐生葡萄球菌细胞形态观察

将过夜培养的腐生葡萄球菌S.saprophyticus P2以2％的接种量接种到5mL新鲜的培养基中，待OD₆₀₀生长至1.0,5000r/min离心5min收集菌体，菌体悬浮在5mL的PBS中并添加实施例1、实施例5和实施例6制备所述抗菌剂。37℃处理2h，5000r/min离心5min收集菌体，并用PBS洗两遍，然后用2.5％(v/v)的戊二醛过夜固定。之后分成两份，一份用缓冲液(0.1mol·L^-1KH₂PO₄，pH 6.0)洗涤2次，以60％、70％、80％和90％乙醇，顺序脱水各一次，每次10min，然后以无水乙醇重复脱水2次，每次10min，再用100％丙酮脱水，挥发去溶剂，电镀喷金，扫描电镜观察，加速电压为20kV。结果见图2。另一份缓冲液(0.1mol·L^-1KH₂PO₄，pH6.0)洗涤2次，以60％、70％、80％和90％丙酮，顺序脱水各一次，每次10min，然后以无水丙酮重复脱水2次，环氧树脂Epon812包埋，梯度烘干，采用莱卡超薄切片机切成厚度为30nm的样品，醋酸铀和柠檬酸铅双染色，透射电镜观察、拍照，工作电压为80kV。结果见图3。

由图2可知，未处理的细胞具有完整的细胞膜。而经过Nisin处理后细胞扁平，暗示可能有胞内物质渗漏。经过SlpB处理后细胞表面有轻微的损伤，而经Nisin和SlpB协同作用后，细胞明显凹陷及皱缩，说明SlpB能损伤S.saprophyticus P2的表面，而增强Nisin的杀菌作用，进而造成大量胞内物质的渗漏。

由图3可知，未处理的细胞，细胞壁细胞膜界线清晰，结构完整。经Nisin处理后，未见细胞壁损伤。但是经SlpB处理后，细胞的细胞壁细胞膜界线不清，细胞壁损伤严重。而经Nisin和SlpB协同作用后，细胞的细胞壁细胞膜损伤严重。考虑到Nisin已知为膜穿孔细菌素，且观察到SlpB能损伤细胞壁，因此我们推测SlpB通过损伤细胞壁，使Nisin易进入细胞膜，起到穿孔作用，从而协助Nisin杀死细菌。

3，胞内胞外ATP的测定

菌体处理如上所述。每隔30min取样测定胞内和胞外ATP含量，结果见图4。将处理的菌株5000r/min离心5min，上清用来测定胞外ATP含量，菌体重悬于PBS中，沸水浴10min，12000r/min离心5min，收集上清用来测定胞内ATP含量，ATP测定利用ATP检测试剂盒(Beyotime,中国)按说明进行。化学发光检测利用Infinite 200PRO微孔板发光检测仪。

ATP含量反映出细胞膜非特异性穿孔指数。由图4可知，对照和经SlpB处理后的细胞，胞外ATP含量维持在10nmol/OD左右，经Nisin处理2.5h后，胞外ATP的含量达为29.3nmol/OD，而经Nisin和SlpB协同处理后，胞外ATP的含量在0.5h时即达到144.5nmol/OD，而2.5h后能达到322.4nmol/OD。与此相对应地，经Nisin和SlpB协同作用，2.5h后胞内ATP的含量从395降到34.2nmol/OD。结果说明SlpB和Nisin协同作用能增强质膜的渗透性并诱导ATP的释放。

4，流式细胞仪分析

菌体处理如上所述。处理的菌体首先加入50μM二醋酸羧基荧光素(cFDA)于37℃染色15min，随后用15μM碘化丙锭染色10min后，收集菌体，用PBS清洗两遍后，重悬于PBS中，用于流式细胞仪检测(Accuri C6，Becton,Jersey USA)，流速为400-600events/s，收集20,000events。结果见图5。

由图5可知，94.2％的S.saprophyticus细胞位于第三象限，表明大多数未处理的细胞具有较高的酯酶活性和完整的细胞膜。经过Nisin处理后，活细胞和亚致死细胞数量分别为6.44％和52.0％，死细胞数量为32％。经SlpB处理后，活细胞数量从94.2％降为38.3％(P<0.05)，亚致死细胞数量从2.56％增大至40.8％，但是死细胞数量没有明显的变化，说明细胞膜渗透性增加，但是大多数胞内酶的活性未受影响。而经Nisin和SlpB协同作用后，死细胞数量增至82.3％，表明SlpB能显著增加Nisin的抗菌效果，二者共同作用造成细胞的死亡。

5，膜电势差的测定

过夜培养的腐生葡萄球菌S.saprophyticus P2以2％的接种量接种到5mL新鲜的培养基中，待OD₆₀₀生长至1.0，5000r/min离心5min收集菌体，用HEPES缓冲液(50mmol/LHEPES、0.6mmol/L KCL和0.2％葡萄糖，pH7.5)清洗两遍后，悬浮在等体积的HEPES缓冲液中。制备好的菌液加入0.5μM DISC3(5)，待荧光稳定后加入100μg/mL Nisin；40μg/mLSlpB；100μg/mL Nisin+40μg/mL SlpB，以5mmol/L尼日利亚菌素和缬氨霉素做阴性和阳性对照，每隔两分钟检测荧光值(激发波长622nm，发射波长670nm)。结果见图6。

由图6可知，40μg/mL SlpB大约消散-57.4％的膜电势差，而Nisin和SlpB协同作用时，可以瞬间造成膜电势差的完全消散。据已知报道，Nisin作用于细胞膜可干扰膜的完整性，从而消散膜电势差。我们的结果说明SlpB可能增强消散膜电势差，从而增强Nisin的抗菌作用。

6，将对数生长期的S.saprophyticus P2用生理盐水稀释成10⁴CFU/mL备用。取新鲜的鸡胸肉，绞碎，20g一袋包装后辐照灭菌，然后将制备的菌液加入1mL。随后添加实施例2-6制备的抗菌剂，7℃冷藏保存，于0,3,6,9,12天取样测定挥发性盐基氮(TVB-N)值和活菌数。挥发性盐基氮测定参考国标GB/T 5009.44-1996。结果见表1和表2。

表1不同抗菌剂处理条件下贮藏鸡肉的活菌书

a代表标准方差.不同字母表示纵向的差异显著性(p<0.05).

由表1可知，鸡肉的起始菌数为2.6log cfu/g。贮藏6天后，对照样品的活菌数达到6log cfu/g，经SlpB和Nisin单独处理的鸡肉样品，贮藏9天后活菌数达到6log cfu/g。在12天的贮藏期间，SlpB和Nisin共同处理的鸡肉样品，活菌数仍未达到6log cfu/g，货架期可延长6天。

表2不同抗菌剂处理条件下贮藏鸡肉的TVB-N含量

a代表标准方差.不同字母表示纵向的差异显著性(p<0.05).

由表2可知，空白对照与经各实施例抗菌剂处理后的鸡肉样品，其TVB-N的含量从最初的5.6mg/100g肉样品分别增至30.96,18.37，15.07，,10.23，10.07和15.35mg/100g肉样品。TVB-N含量在15–25mg/100g肉样品之间表明肉的新鲜度受到影响，而鸡肉样品中TVB-N含量超过25mg/100g意味着腐败。经Nisin+SlpB或0.5Nisin+SlpB处理，TVB-N含量降至10.07和15.35mg/100g肉样品，表明SlpB能显著增加Nisin的作用效果，而降低Nisin的用量。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 用于肉品保鲜的抗菌剂

<130> 2016

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> 卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus） K313

<400> 1

gcatctacta ctaacactgt taccaacact tatcttaaca aaggtgctaa ggttacttta 60

actgctgcat taaacactgc taaggctgca tcggatgtta tgactgttcc atcaactgat 120

gttagtgatc ctcaaggcca cgctgttcct aagggtactg aagttgaagt agttaacgct 180

actactactg aaaacgttgt tgttaaatac actggctctg acaagaagac ccactacgca 240

gttttgaacc aatcagcatt agttgctcaa gttccagcta agccagctac taagccaagt 300

acttcagaaa gcattaacgc tggtaacggt tcagtatttg acaacgctgc aaaccttgct 360

gtaaacatca ctgcagttgc ttcttcacaa gctactcatg gtgctatcag tggtaacgtt 420

gtatttactg atgcacaagg ccaagcccac actgctttat taaccaacga tgaaaacggt 480

gtaaacttca ctaaccttgt taacttgaag actggtaagt cacctctaag tttgaacgac 540

ttcccagcag gtcattaccg tgcaaacctt aacggtgtat ctttgaacct tggtaatgct 600

tactcaaaca agtcagtaac tattactttg ccaaagaacg ttgaagcagt tcaaattggt 660

gacaagtcat accttggtgg tgctacattt actgttactg cggatgcaaa cggtgttgta 720

aaccttggta ctttacgtgt taagttctgg gcatacgatc cagctgactt acaagaagtt 780

cacttctact cagttaagac tggtaacgtt gtaccttcag gctcagtaga tcttcacgct 840

gtaaacggta agcttactgt tcaatcagta tttgcagctt tgactcaaga atacagagct 900

tcacaattag accgtcacca caacgttgaa actcttatcc cagttaacga catcaaggca 960

caattggaaa aggctggtac taaggtagct gacgacggtt cattcactgc tccagcatca 1020

ttcagcctta acatgagcgc taagtcaaac aacaacggtg ctactgcttc attacctgta 1080

actgttaacg ttgacaacgt aactccagct gctgctcaag aaactaccaa gactgttaag 1140

attatgcaca tcgcaactat ctacgacaag aacggtaagg caactcacga accagcatta 1200

cgtgcttaca acactgtatc agtagtttca gaaccagttt cattgaagga tgaaaagggt 1260

aaagatgcag gtaagttcta caagcttgct ggcaaggacc aatacatcaa ggttggtaac 1320

gttgacggta cttcacgttc attgaggcac aactcatacg tttacaagtc aactggtaag 1380

cgtcgtggca agactgttct taagaagggc tcatcagtaa ctacttacgg taagtcattc 1440

atgatcgctg gtcaccaaat gtacagaatt ggtgaaaacc aatacgttaa gaaggcaaac 1500

ttc 1503

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgcatatgg catctactac taacactgtt ac 32

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actgaattca agaagtttgc cttctta 27

<210> 4

<211> 501

<212> PRT

<213> 卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus） K313

<400> 4

Ala Ser Thr Thr Asn Thr Val Thr Asn Thr Tyr Leu Asn Lys Gly Ala

1 5 10 15

Lys Val Thr Leu Thr Ala Ala Leu Asn Thr Ala Lys Ala Ala Ser Asp

20 25 30

Val Met Thr Val Pro Ser Thr Asp Val Ser Asp Pro Gln Gly His Ala

35 40 45

Val Pro Lys Gly Thr Glu Val Glu Val Val Asn Ala Thr Thr Thr Glu

50 55 60

Asn Val Val Val Lys Tyr Thr Gly Ser Asp Lys Lys Thr His Tyr Ala

65 70 75 80

Val Leu Asn Gln Ser Ala Leu Val Ala Gln Val Pro Ala Lys Pro Ala

85 90 95

Thr Lys Pro Ser Thr Ser Glu Ser Ile Asn Ala Gly Asn Gly Ser Val

100 105 110

Phe Asp Asn Ala Ala Asn Leu Ala Val Asn Ile Thr Ala Val Ala Ser

115 120 125

Ser Gln Ala Thr His Gly Ala Ile Ser Gly Asn Val Val Phe Thr Asp

130 135 140

Ala Gln Gly Gln Ala His Thr Ala Leu Leu Thr Asn Asp Glu Asn Gly

145 150 155 160

Val Asn Phe Thr Asn Leu Val Asn Leu Lys Thr Gly Lys Ser Pro Leu

165 170 175

Ser Leu Asn Asp Phe Pro Ala Gly His Tyr Arg Ala Asn Leu Asn Gly

180 185 190

Val Ser Leu Asn Leu Gly Asn Ala Tyr Ser Asn Lys Ser Val Thr Ile

195 200 205

Thr Leu Pro Lys Asn Val Glu Ala Val Gln Ile Gly Asp Lys Ser Tyr

210 215 220

Leu Gly Gly Ala Thr Phe Thr Val Thr Ala Asp Ala Asn Gly Val Val

225 230 235 240

Asn Leu Gly Thr Leu Arg Val Lys Phe Trp Ala Tyr Asp Pro Ala Asp

245 250 255

Leu Gln Glu Val His Phe Tyr Ser Val Lys Thr Gly Asn Val Val Pro

260 265 270

Ser Gly Ser Val Asp Leu His Ala Val Asn Gly Lys Leu Thr Val Gln

275 280 285

Ser Val Phe Ala Ala Leu Thr Gln Glu Tyr Arg Ala Ser Gln Leu Asp

290 295 300

Arg His His Asn Val Glu Thr Leu Ile Pro Val Asn Asp Ile Lys Ala

305 310 315 320

Gln Leu Glu Lys Ala Gly Thr Lys Val Ala Asp Asp Gly Ser Phe Thr

325 330 335

Ala Pro Ala Ser Phe Ser Leu Asn Met Ser Ala Lys Ser Asn Asn Asn

340 345 350

Gly Ala Thr Ala Ser Leu Pro Val Thr Val Asn Val Asp Asn Val Thr

355 360 365

Pro Ala Ala Ala Gln Glu Thr Thr Lys Thr Val Lys Ile Met His Ile

370 375 380

Ala Thr Ile Tyr Asp Lys Asn Gly Lys Ala Thr His Glu Pro Ala Leu

385 390 395 400

Arg Ala Tyr Asn Thr Val Ser Val Val Ser Glu Pro Val Ser Leu Lys

405 410 415

Asp Glu Lys Gly Lys Asp Ala Gly Lys Phe Tyr Lys Leu Ala Gly Lys

420 425 430

Asp Gln Tyr Ile Lys Val Gly Asn Val Asp Gly Thr Ser Arg Ser Leu

435 440 445

Arg His Asn Ser Tyr Val Tyr Lys Ser Thr Gly Lys Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Thr Val Leu Lys Lys Gly Ser Ser Val Thr Thr Tyr Gly Lys Ser Phe

465 470 475 480

Met Ile Ala Gly His Gln Met Tyr Arg Ile Gly Glu Asn Gln Tyr Val

485 490 495

Lys Lys Ala Asn Phe

500

<210> 5

<211> 1599

<212> DNA

<213> 卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus） K313

<400> 5

atgaagaaaa atttaagaat tgttagcgcc gctgctgctg ctttattagc tgttgctcct 60

gttgctgcta ctgttgctcc agcacctgta tctgctgcat ctactactaa cactgttacc 120

aacacttatc ttaacaaagg tgctaaggtt actttaactg ctgcattaaa cactgctaag 180

gctgcatcgg atgttatgac tgttccatca actgatgtta gtgatcctca aggccacgct 240

gttcctaagg gtactgaagt tgaagtagtt aacgctacta ctactgaaaa cgttgttgtt 300

aaatacactg gctctgacaa gaagacccac tacgcagttt tgaaccaatc agcattagtt 360

gctcaagttc cagctaagcc agctactaag ccaagtactt cagaaagcat taacgctggt 420

aacggttcag tatttgacaa cgctgcaaac cttgctgtaa acatcactgc agttgcttct 480

tcacaagcta ctcatggtgc tatcagtggt aacgttgtat ttactgatgc acaaggccaa 540

gcccacactg ctttattaac caacgatgaa aacggtgtaa acttcactaa ccttgttaac 600

ttgaagactg gtaagtcacc tctaagtttg aacgacttcc cagcaggtca ttaccgtgca 660

aaccttaacg gtgtatcttt gaaccttggt aatgcttact caaacaagtc agtaactatt 720

actttgccaa agaacgttga agcagttcaa attggtgaca agtcatacct tggtggtgct 780

acatttactg ttactgcgga tgcaaacggt gttgtaaacc ttggtacttt acgtgttaag 840

ttctgggcat acgatccagc tgacttacaa gaagttcact tctactcagt taagactggt 900

aacgttgtac cttcaggctc agtagatctt cacgctgtaa acggtaagct tactgttcaa 960

tcagtatttg cagctttgac tcaagaatac agagcttcac aattagaccg tcaccacaac 1020

gttgaaactc ttatcccagt taacgacatc aaggcacaat tggaaaaggc tggtactaag 1080

gtagctgacg acggttcatt cactgctcca gcatcattca gccttaacat gagcgctaag 1140

tcaaacaaca acggtgctac tgcttcatta cctgtaactg ttaacgttga caacgtaact 1200

ccagctgctg ctcaagaaac taccaagact gttaagatta tgcacatcgc aactatctac 1260

gacaagaacg gtaaggcaac tcacgaacca gcattacgtg cttacaacac tgtatcagta 1320

gtttcagaac cagtttcatt gaaggatgaa aagggtaaag atgcaggtaa gttctacaag 1380

cttgctggca aggaccaata catcaaggtt ggtaacgttg acggtacttc acgttcattg 1440

aggcacaact catacgttta caagtcaact ggtaagcgtc gtggcaagac tgttcttaag 1500

aagggctcat cagtaactac ttacggtaag tcattcatga tcgctggtca ccaaatgtac 1560

agaattggtg aaaaccaata cgttaagaag gcaaacttc 1599

Claims

1.一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，包括：卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)K313的S层蛋白SlpB和乳酸链球菌素。

2.如权利要求1所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，包括：30-50重量份的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB以及100-500重量份的乳酸链球菌素。

3.如权利要求2所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，包括：40重量份的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB以及250-500重量份的乳酸链球菌素。

4.如权利要求1所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB通过以下步骤制备：

(1)以卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)K313基因组DNA为模板，利用如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行PCR扩增，得到包含如SEQID NO:1所示的核苷酸序列的基因片段，之后将该基因片段构建到pET-22b表达载体上得到重组载体pET-Slpb；

(2)将构建好的重组载体pET-Slpb以CaCl₂法转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建重组菌株，之后利用该重组菌株进行诱导表达，然后通过进行蛋白纯化，得到所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB，所述SlpB的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.如权利要求4所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，所述PCR扩增程序依次包括：94℃预变性4min；94℃变性40s，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

6.如权利要求4所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，利用该重组菌株进行诱导表达，然后通过进行蛋白纯化，制得的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB的方法包括：

步骤三，纯化：用0.22μm滤膜过滤上清液；用5倍柱体积的水冲洗HisTrap^TM FF crudecolumns，流速为1mL/min；用5倍柱体积的Binding buffer缓冲液平衡柱子；将所述上清液用针头吹打后上样，之后用10倍体积的Binding buffer缓冲液冲洗柱子；用10倍体积的Washing buffer缓冲液冲洗柱子，洗掉未结合的蛋白样品；用5倍体积的Elution buffer缓冲液洗脱，将纯化的蛋白置于磷酸盐缓冲液中进行梯度透析，去除咪唑及盐离子，制得卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。

7.如权利要求6所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，所述超声破碎时，超声强度为25-30％，超声功率为300-400W，超声工作时间5s，停歇时间5s，处理99次，两个循环。

8.如权利要求6所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，所述Binding buffer缓冲液包含：20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl以及25mM咪唑，pH 7.4；

所述Washing buffer缓冲液包含：20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl以及50mM咪唑，pH7.4；

所述Elution buffer缓冲液包含：20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl以及500mM咪唑，pH7.4。