CN106867929A

CN106867929A - 一种胡萝卜软腐欧文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及应用

Info

Publication number: CN106867929A
Application number: CN201611190279.XA
Authority: CN
Inventors: 贾振华; 宋水山; 刘方; 黄亚丽; 宋聪; 郝少彦; 李海利; 赵芊; 黄媛媛; 马宏; 刘昆昂
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2036-12-21
Also published as: CN106867929B

Abstract

本发明公开了一种胡萝卜软腐欧文氏菌，保藏号为：CGMCC No. 11751，其分泌的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR具有防治植物软腐病的效果。本发明还公开了所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR的蛋白序列以及表达该蛋白的基因序列，并进一步提供了获得所述植物免疫激活蛋白的方法。本发明利用筛选出的保藏号为CGMCC No.11751的菌株产生的激活蛋白HrpN_EccPR粗品对植物尤其是大白菜软腐病有良好的拮抗作用，其能够有效防治大白菜软腐病的发生。

Description

一种胡萝卜软腐欧文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胡萝卜软腐欧文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及应用。

背景技术

软腐欧文氏菌是一种广泛的致病菌，主要发生在大白菜、卷心菜、菜花、马铃薯等作物上，主要为害叶、茎及块茎。叶染病近地面老叶先发病，病部呈不规则暗褐色病斑，湿度大时腐烂。近些年来，由于多方面的原因，重大病害出现的频率和面积明显增加，造成的产量损失都在50-60%左右。而这些蔬菜是我国北方地区不可缺少的重要蔬菜，但每年因病害的损失估计可达数十亿元。为了对付严重的这些蔬菜软腐病害，农业生产者大量使用化学农药。化学农药的施用也确实对蔬菜病害的控制做出了巨大的贡献。但是，化学农药的大量施用也正在显示着严重的负面影响。因此，随着生物防治、绿色农业等呼声日益高涨，植物抗病免疫技术的研究成为近年兴起的重要研究领域。

植物免疫抗病激活剂是一些生物和非生物因子，能够诱导植物独特的生理状态，植物能够更好或更快或者既好又快的调配防卫反应的生理状态，使植物防御病虫害的状态处在临界，达到一触即发，当病害在侵染植物时，植物会在短时间内借助于诱导因子激发植物整体的抗性水平，调动整个植物的免疫能力，激活植物自身抗病相关基因的表达，抵抗病原物的侵染，自身不对病原菌起作用，不会使病原菌产生抗药性，用量低、高效、诱导的植物抗病谱广、抗病持续时间长，这对于植物病害的可持续控制具有重要的意义。

目前利用植物免疫激活剂生物防治蔬菜病害的研究相对较少，因此，迫切需要筛选出一种能够高效分泌植物蛋白激活剂的微生物菌株，从而通过植物免疫激活剂降低软腐欧文氏菌给蔬菜生产带来的危害。

发明内容

本发明的目的在于克服目前利用化学农药防治十字花科植物软腐病带来的环境危害，提供一种能够防治软腐病害，尤其是能够高效拮抗大白菜软腐病害的植物免疫蛋白激发子，并且本发明还提供了一种分泌上述植物免疫激活蛋白的生物菌株，并提供其能够表达该蛋白的基因序列和蛋白质序列，本发明还提供工程菌构建获得免疫激活蛋白。

为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明所述的胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora pv. Carotovora strain Ecc36（简称Ecc36）于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 11751。

进一步的，本发明所述的Ecc36能够分泌植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR，该蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，本发明所述的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR能引起植物对病原菌的拮抗作用。

进一步的，本发明所述的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR表达基因hrpNecc36的序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，本发明还提供所述的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR的制备方法为：将所述胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc 36发酵液离心收集菌体，用发酵液1/2倍质量的无菌水悬浮，将悬浮液煮沸30分钟，9000rpm离心30分钟，收集上清，冷冻干燥，获得所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR粗品，其中蛋白含量不低于43%。

进一步的，上述制备方法的具体步骤为：将所述胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株在LB固体培养基上采用划线法，25℃培养24小时，获得单菌落，挑取单菌落于液体LB培养基中，于25℃过夜培养，获得Ecc36菌株种子，然后以10%接种于液体LB培养基中，25℃培养48小时，9000rpm离心30分钟，收集菌体，加入原培养基1/2倍的无菌水悬浮，将其悬浮液煮沸30分钟，9000rpm离心30分钟，收集上清，冷冻干燥，获得所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR粗品。

进一步的，本发明还提供所述的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR在制备用于防治植物软腐病生物制剂中的应用。

进一步的，所述防治植物软腐病生物制剂中植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR的含量为18-100mg/L。

本发明的有益效果为：

本发明的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR可以有效抑制欧文氏菌所致的十字花科植物尤其是大白菜软腐病害，具有高效的防治作用，有效率可以达到60%以上。作为生物介入手段，可以避免化学品如农药引起的残留和污染，是一种更经济、环保、绿色的植物病害防治手段。

本发明的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR可以制成多种生物制剂，或作为有效成分添加到现有生物菌剂中，可适应多种保存环境，并具有较长的保质期，在常温常压下，可保存1-3年，利于仓储和运输。

生物样品保藏信息

胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36，分类命名为Erwinia carotovora pv.Carotovora，已于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC No.11751。

附图说明

图1为 36号菌株对烟草形成坏死斑；

图2为欧文氏菌Ecc36致病性测定结果；

图3为欧文氏菌Ecc36水解酶测定结果；

图4为欧文氏菌Ecc36在固体LB培养基上培养48小时的菌落形态；

图5为激活蛋白HrpN_EccPR粗品活力检测结果；

图6为目的基因（hrpNecc36）的阳性克隆结果。

具体实施方式

实施例1 具有激活植物免疫抗病作用的菌株分离和筛选

采集大白菜发病严重地块中腐烂的大白菜作为试验材料，在实验室内从该样品中进行细菌分离，在LB培养基上进行多次分离纯化，得到纯培养菌落后，进行菌株鉴定。

具体步骤：上述土壤样品来自河北省、山东、山西等地的染有大白菜腐烂病的大白菜田中，将该样品经梯度稀释后涂布于LB培养基中，于28℃恒温培养箱培养。上述培养基根据“微生物培养基手册”的记载制备得到，培养基配方为：牛肉膏5g ，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，自来水1000ml，pH7.2~7.4，121℃灭菌20min后使用。待平板长出菌落后，挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到单菌落的纯培养物，纯化后的菌株保存于LB培养基斜面。

将上述筛选得到的单菌落分别培养，然后分别接种于烟草叶片，以水为阴性对照，以HrpN蛋白为阳性对照，在温度为25℃、湿度为50%情况下，正常培养接菌的烟草3天，然后挑选能使接种烟草叶片形成坏死斑的菌株，由于具有激活植物免疫抗病作用的菌株能使植物叶片产生抗性而形成坏死斑，根据坏死斑的大小来筛选具有最强激活植物免疫抗病作用的菌株，发现第36号菌株具有这些特征（图1）。并对该菌株进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.11751。

实施例2 具有激活植物免疫抗病作用的36号菌株毒性测试

将分离的36号菌株在LB液体培养基中活化，25℃培养24h，制成菌悬液。将健康的白菜叶片用酒精棉表面消毒3次后，以无菌水冲洗3次，用灭菌接种针在每个健康的白菜叶片上针刺5孔，之后在每孔中加入LB液体菌悬液2mL，每个处理设3次重复，以加入无菌的LB培养基为对照。将处理过的白菜叶放入白色培养盆中，用保鲜膜覆盖盆口保湿，置于恒温培养箱中25℃培养，24h后观察发病情况并比较是否与田间发病症状一致（图2）。

将分离的36号菌株接种到含0.5%蔗糖的微盐培养基，25℃摇瓶培养至OD600=2.5，离心(4℃，10000 r/min，10min)收集上清液，取30 μL 接到半定量酶活性检测平板，25℃培养。分别于18 h 后检测多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase, Peh)、果胶酶(Pectatelyase,Pel)及纤维素酶(Cellulase，Cel)活性，30 h后检测蛋白酶(Protease, Prt)活性。胞外酶分析平板上菌落周围透明圈大小反映其酶活性水平高低（图3）。

毒性检测实验证明分离的36号菌株具有胡萝卜软腐欧文氏菌特征，初步判断为胡萝卜软腐欧文氏菌。

实施例3 拮抗菌株的鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛得的保藏号为：CGMCC No.11751进行鉴定，挑取筛选的软腐病菌株的培养物，划线培养于LB培养基中，28℃培养48h后肉眼观察菌落形态并拍照。挑取软腐病菌的菌落进行涂片染色，4×100倍显微镜下观察其菌体特征。

菌落形态观测是在LB培养基上进行的，将菌株划线接种后，于25℃恒温培养24 小时观察菌落形态。保藏号为CGMCC No. 11751的菌株的菌落圆形或不规则、稍凸起、呈灰白色、有光泽、半透明、表面光滑，与培养基结合不紧密（图4）。挑取培养24 小时菌苔革兰氏染色后在光学显微镜的100倍油镜下观察。在显微镜下可以看到，保藏号为CGMCC No. 11751的菌株为杆状细菌，该菌为革兰氏阴性，菌体两端钝圆、呈短杆状，大小（0.4-0.7）mm×（1.0-1.8）mm。

16SrDNA鉴定：将保藏号为CGMCC No. 11751菌株接种到LB培养基中，25℃摇床培养过夜，5000rpm离心获得菌体，利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取软腐病菌株的基因组DNA。以提取的DNA 作为模板，以引物fD1 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'、引物rp5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3'引物对进行PCR扩增。PCR 的反应体系配制为(50μL)：10×Buffer 5μL，10mmol/L dNTP 4μL， rTaq 1μL，模板 2μL，引物1 和引物2 各1μL，灭菌双蒸水36μL。PCR 扩增的条件是：94℃初始变性5min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，检测扩增序列大小，将正确的PCR扩增产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列（SEQ ID NO:3），输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较分析。利用MEGA4.1进行系统发育树的构建。经过序列分析显示，保藏号为CGMCC No. 11751的菌株属于胡萝卜软腐欧文氏菌。命名为 Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 36（简称Ecc36）。

实施例4 Ecc36-5的遗传稳定性

对筛选出的拮抗作用Ecc36菌株在LB培养基上采用划线法进行传代培养，培养15代后，采用接种烟草叶片方法检测其对植物诱导抗性的效果，以原始菌株为对照，该拮抗菌株经过15代培养后与原始菌株具有相同的拮抗作用，说明该Ecc36菌株具有良好的遗传稳定性，将抑菌效果稳定的Ecc36菌株进行LB培养基液体培养，吸取菌液进行-80℃甘油保存。

实施例5 激活蛋白HrpN_EccPR粗品的获得

将Ecc36（保藏号为CGMCC No. 11751）菌株在LB固体培养基上采用划线法，25℃培养24小时，获得单菌落，挑取单菌落于液体LB培养基中，于25℃过夜培养，获得Ecc36菌株种子，然后以10%接种于液体LB培养基中，25℃培养48小时，9000rpm离心30分钟，收集菌体，加入原培养基1/2倍的无菌水悬浮，将其悬浮液煮沸30分钟，9000rpm离心30分钟，收集上清，冷冻干燥，获得激活蛋白HrpN_EccPR粗品，其蛋白含量为43%。

实施例6 激活蛋白HrpN_EccPR粗品诱导植物抗性的活力检测

将不同稀释度的激活蛋白HrpN_EccPR粗品分别接种于烟草叶片，结果发现接种12h后，各浓度处理均出现水渍状坏死，72h后形成坏死斑（图5）。随着蛋白稀释倍数的增大，其坏死斑面积变小，而灭菌水对照的叶片组织无坏死情况的出现，说明该激活蛋白HrpN_EccPR粗品具有很强的活性。

实施例7基因组文库的筛选、基因扩增、克隆及测序

用EcoRⅠ消化Ecc36菌株染色体DNA，然后以地高辛标记的菌株Ecc71的hrpN DNA 为探针进行Southern blotting。杂交条件：温度65℃，杂交液6×SSC，5×Denhardt，5 g/L 十二烷基硫酸钠(SDS)和100 μg/mL 变性鲑精DNA；漂洗温度65℃，用2×SSC 漂洗30 min，再用1×SSC 和1 g/L SDS 漂洗30 min，最后用0.1×SSC和1 g/L SDS 漂洗30 min。从该文库中筛选出3个阳性菌落（图6），分别为34号克隆菌斑、63号克隆菌斑和89号克隆菌斑，之后选择89号菌斑。

以Ecc71hrpN DNA序列为参考设计引物, 进行PCR 扩增。引物如下：hrpNEcc71-up: TGTGGATCCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCGGAG；hrpN Ecc71-down: TGTAAGCTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAA CCC。PCR 反应条件为94℃ 5 min; 94℃ 1 min, 55℃2 min, 72℃ 3min, 进行25 个循环；72℃ 8 min。将PCR 产物纯化, 经BamHⅠ-HindⅢ酶切, 克隆到质粒载体pET30(+)中，基因测序由大连宝生物科技公司完成。根据测序结果分析并确定hrpNecc36基因的开放阅读框，分析基因结构。该激活蛋白基因包括起始密码和终止密码在内的开放阅读框（ORF）共计1254bp，通过和其它hrpN基因编码的碱基序列相比较，同源性达到86.6%（SEQ ID NO:2），根据该基因的来源将其命名为HrpN_EccPR基因。该基因基因编码的蛋白由417个氨基酸残基组成，分子量45.27kD，理论等电点5.73，序列中富含甘氨酸（G），该蛋白与其他HrpN蛋白的同源性达到43%（SEQ ID NO:1），尤其是C末端和N末端的同源性非常高，推测是其功能区域，这也和hrpN基因编码的蛋白功能相一致。

实施例8-11激活蛋白HrpN_EccPR粗品防治田间大白菜软腐病的应用

将Ecc36-5（保藏号为CGMCC No. 11751）菌株接种到装有1000mL PB液体培养基的3000mL三角瓶中，按照实施例5的方法制备激活蛋白HrpN_EccPR粗品，获得蛋白含量为43%的激活蛋白HrpN_EccPR粗品。

在河北省泊头市和邢台县两个花生的主要种植区的大白菜软腐病发病田中进行激活蛋白HrpN_EccPR粗品的田间试验。将激活蛋白HrpN_EccPR粗品按照1:10000；1:30000；1:50000；1:60000比例进行稀释，分别形成浓度为100mg/L；34mg/L；20mg/L；18mg/L的药液，每亩地一次喷施50公斤药液，共喷施2次，在大白菜移栽后15天喷施1次， 10天后喷施第二次，常规对照使用常规剂量的化学农药作为防治药物，空白对照不施用防治药物但施加与实施例组相同重量的水；每个处理3次重复，于大白菜收获时调查大白菜软腐病的发病情况和产量。

调查方法：

采用5点取样法，每个点取10株白菜，记录大白菜的腐烂程度。

大白菜的腐烂程度分级标准：

0级：大白菜完好，无被害病斑；1级：大白菜受害，有明显的叶片病斑，但没有整个叶片腐烂；2级：大白菜外层叶片完全腐烂，里层叶片完好；3级：大白菜外层叶片完全腐烂，里层叶片完全腐烂。统计大白菜各级被害数。

防效计算方法：

大白菜发病率=被害大白菜数/总大白菜数×100

病情指数=∑（被害大白菜×该被害大白菜级值）/（总大白菜数×最高级值）×100

防治效果（%）=（对照区病情指数—处理区病情指数）/对照区病情指数 ×100

防治效果如表1所示，在河北的泊头市和邢台市田间防病试验表明对大白菜软腐病的防治效果在60%以上。

表1 不同不同浓度的激活蛋白施用对大白菜软腐病的防治效果

。

由表1结果显示，使用激活蛋白HrpN_EccPR粗品可有效防治大白菜软腐病，施用2次后，不同浓度激活蛋白HrpN_EccPR对大白菜软腐病的防效均在60%以上，明显高于化学农药的常规对照防治效果。

由上述结果可以看出，本发明利用筛选出的保藏号为CGMCC No.11751的菌株产生的激活蛋白HrpN_EccPR粗品对大白菜软腐病有良好的拮抗作用，其能够有效防治大白菜软腐病的发生。

以上仅为本发明的较佳实施方式，而非对其保护范围的限制，本领域技术人员在不需要付出创造性劳动的前提下对本发明做出的任何改进，均应认为在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科学院生物研究所

<120> 一种胡萝卜软腐欧文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及应用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 417

<212> PRT

<213> 胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc 36

<400> 1

Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Thr Ser Leu Gln Ile Thr Ile Ile

1 5 10 15

Ser Val Arg Gln Gly Glu Leu Phe His Cys Gln Ser Pro Gln Asn Gly

20 25 30

Glu Ala Leu Ser Gln Leu Cys Ser Gly Leu Gly Asp Ser Asp Ala Glu

35 40 45

Leu Gln Asn Ser Cys Arg Ile Ser Arg Pro Trp Ile Met Gly Ser Met

50 55 60

Met Phe Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Met Ala Gly Gly Leu Gly

65 70 75 80

Gly Ala Leu Gly Gly Leu Val Ser Ser Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly

85 90 95

Leu His Gly Ser Gly Leu Gly Gly Gly Leu Ala Gly Gly Leu Ser Ser

100 105 110

Arg Leu Gly Ser Gly Leu Gly Gly Ala Val Gly Cys Gly Leu Gly Gly

115 120 125

Ser Leu Arg Gly Gly Met Asn Ala Met Lys Ala Ser Leu Val Leu Gly

130 135 140

Ser Leu Leu Val Gly Val Leu Glu His Leu Met Gly Gly Gly Met Ser

145 150 155 160

Arg Trp Arg Val Gly Leu Phe Ala Ile Lys His Ala Ala Ser Leu Gly

165 170 175

Thr Ser Pro Tyr Met Gly Ser Phe His Asp Thr Trp Ser Ala Ile Ser

180 185 190

Gly Asn Gly Leu Ser Gln Ala Glu Arg Cys Val Ser Gly Leu Gln Leu

195 200 205

Arg Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Lys

210 215 220

Leu Cys Ser Thr Leu Gly Met Ala Val Gly Gln Lys Ala Gly Leu Gln

225 230 235 240

Arg Arg Ile Gln Arg Tyr Asn Phe Gly Ser Gln Arg Ser Ala Arg Leu

245 250 255

Glu Arg Arg Arg Gly Val Gln Pro Thr Glu Gln Ala Arg Trp Gly Trp

260 265 270

Phe Trp Ala Arg Lys Leu Val Cys Arg Ser Tyr Thr Thr Ser Ala Arg

275 280 285

Thr Ser Ala Ala Ala Pro Val Thr Ser Trp Ile Arg Lys Ile Gly Trp

290 295 300

Glu Trp Arg Lys Arg Leu Val Ser Met Asp Gln Tyr Pro Glu Leu Phe

305 310 315 320

Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gln Pro Val Trp Gln Thr Glu Gln Glu

325 330 335

Tyr Glu Arg Asn Val Leu Arg Pro Lys Arg Trp Thr Ser Ala Asn Gln

340 345 350

Leu Thr Met Glu Ser Thr Ile Gly Ser Met His Arg Phe Met Lys Ala

355 360 365

Val Gly Ile Arg Gln Glu Arg Trp Ala Cys Glu Tyr Pro Cys Lys Ser

370 375 380

Thr Ser Thr Leu Val Gly Thr Gly Arg Arg Phe Ala Gly Ile Asp Ala

385 390 395 400

Ala Ile Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Gln Lys Leu Ser

405 410 415

Ser

<210> 2

<211> 1254

<212> DNA

<213> 胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc 36

<400> 2

atgcttaatt ctcttggtgg cggtacttct ttgcaaatca cgatcatcag cgtgcggcag 60

ggcgaattat ttcattgtca gtctccacaa aatggcgaag cgctctcgca gttgtgctct 120

gggttgggtg acagcgatgc agaattgcag aacagttgtc gcatatcacg accatggatt 180

atgggcagca tgatgttcgg tggtctcggt ggtctcggtg gtatggcagg cggtttgggc 240

ggtgcgctcg gtggtctggt aagtagtctg ggcggattag gtggcggcct tcatgggtcg 300

ggccttggtg gaggactggc aggtgggctc agcagtaggc ttgggagtgg tctaggcggc 360

gccgtcggct gtggtttagg cggttcgcta cgtggcggca tgaatgccat gaaggcatca 420

ttggtcttgg gcagcctgct cgttggcgtg ttggagcatc tgatgggtgg cggtatgtca 480

cgttggcgtg ttggcctgtt tgccattaag cacgctgcat cgctaggtac ttcgccgtat 540

atgggcagct ttcacgatac gtggtcggcg atttcaggca acggcctgag tcaggcagag 600

aggtgcgtct caggcttaca attgcgtaac aacggtctgc aaggcttgag cggcgcaggg 660

gcgttcaaca aactgtgtag cacgttaggg atggctgttg ggcaaaaagc tggtttgcag 720

cggcggattc agcgctacaa ttttgggtca caacggtctg caaggcttga gcggcgcagg 780

ggcgttcaac caactgagca agcacgttgg ggatggtttt gggctcggaa gctagtttgc 840

aggagctaca caacatcagc acgcacatcg gcagccgcac ccgttacttc gtggataagg 900

aagatcgggt gggaatggcg aaagagattg gtcagtatgg atcaatatcc tgaactcttc 960

aagccggaat accagaaaga tcagcctgtc tggcagacgg agcaagagta cgaacggaat 1020

gtcctcaggc caaagcggtg gacttcagca aaccagttga ctatggaatc gaccattggc 1080

agcatgcata gattcatgaa ggctgtcggc attcgccaag agcggtgggc gtgtgagtac 1140

ccgtgcaaat caacctcaac gctcgtcggt acaggccggc gcttcgctgg tattgatgcg 1200

gcgatcatcg gtgaccgtat cgtcaatatg gggctgcaga agctctccag ctaa 1254

<210> 3

<211> 1413

<212> DNA

<213> 胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc 36

<400> 3

ggtgacgagc ggcggacggg tgagtaatgt ctgggaaact gcctgatgga gggggataac 60

tactggaaac ggtagctaat accgcataac gtcttcggac caaagagggg gaccttcggg 120

cctcttgcca tcagatgtgc ccagatggga ttagctrgta ggtgaggtaa tggctcacct 180

aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga tgaccagcca cactggaact gagacacggt 240

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca 300

gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cactttcagc ggggaggaag 360

gcggtgagat taatactctc atcgattgac gttacccgca gaagaagcac cggctaactc 420

cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatga ctgggcgtaa 480

agcgcacgca ggcggtttgt taagtcagat gtgaaatccc cgagcttaac ttgggaactg 540

catttgaaac tggcaagcta gagtcttgta gaggggggta gaattccagg tgtagcggtg 600

aaatgcgtag agatctggag gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga caaagactga 660

cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgctgt 720

aaacgatgtc gatttggagg ttgtgccctt gaggcgtggc ttccggagct aacgcgttaa 780

atcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg 840

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctactcttg 900

acatccagag aattcggtag agataccttg gtgccttcgg gaactgtgag acaggtgctg 960

catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1020

cttatccttt gttgccagcg gttcggccgg gaactcaaag gagactgcca gtgataaact 1080

ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc tacacacgtg 1140

ctacaatggc gtatacaaag agaagcgacc tcgcgagagc aagcggacct cataaagtac 1200

gtcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1260

tagatcagaa tgctacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1320

tgggagtggg ttgcaaaaga agtaggtagc ttaaccttcg ggagggcgct taccactttg 1380

tgattcatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggt 1413

Claims

1.一种胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc36，该菌于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 11751。

2.权利要求1所述的胡萝卜软腐欧文氏菌分泌的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR，其特征在于：其具有SEQ ID NO:1所示的蛋白序列。

3.表达权利要求2所述蛋白的基因，其特征在于：其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

4.权利要求2所述的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR粗品的制备方法，其特征在于：将所述胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc 36发酵液离心收集菌体，用无菌水悬浮，将悬浮液煮沸，离心收集上清，冷冻干燥，获得所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR粗品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述无菌水的用量为发酵液质量的1/2，将所述悬浮液煮沸30分钟，在9000rpm下将悬浮液离心30分钟。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR粗品中蛋白含量不低于43wt%。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：其具体步骤为：将所述胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株在LB固体培养基上采用划线法，25℃培养24小时，获得单菌落，挑取单菌落于液体LB培养基中，于25℃过夜培养，获得Ecc36菌株种子，然后以10wt%接种于液体LB培养基中，25℃培养48小时，9000rpm离心30分钟，收集菌体，加入原液体LB培养基1/2倍的无菌水悬浮，将其悬浮液煮沸30分钟，9000rpm离心30分钟，收集上清，冷冻干燥，获得所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR粗品。

8.权利要求2所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR在制备防治植物软腐病生物制剂中的应用。

9.利用权利要求2所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR制备的喷施药液，其特征在于：其中植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR的含量为18-100mg/L。