CN1693468A

CN1693468A - 植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子HarpinEccs的高效分泌表达和应用

Info

Publication number: CN1693468A
Application number: CN 200510020664
Authority: CN
Inventors: 吴伯骥; 汤承; 崔亚亚
Original assignee: Chengdu Pairun Boilogical Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Wu Boji
Priority date: 2005-04-05
Filing date: 2005-04-05
Publication date: 2005-11-09

Abstract

本发明涉及植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的高效分泌表达和应用，克隆基因hrpN_Eccs的宿主菌是白菜软腐菌变种CSDS001菌株，该细菌在分类上属于胡萝卜软腐欧文氏杆菌，核甘酸序列为SEQ ID No. 1，Harpin_Eccs蛋白的氨基酸序列特征(N→C)为SEQ ID No. 2。克隆hrpN_Eccs基因，构建融合分泌表达载体pMAL(p2)－hrpN_Eccs，转化大肠杆菌JM109(DE3)和DH5α菌株，IPTG诱导表达，结果使可溶性的融合分泌表达蛋白MBP－Harpin_Eccs占细菌周质总蛋白的66％以上，实现了Harpin_Eccs蛋白的高效分泌表达，为Harpin类蛋白的快速纯化、检测、制备和应用打下了良好基础。hrpN_Eccs基因编码的蛋白激发子，能广泛诱导植物的广谱抗病性、驱虫性和抗逆性，并显著促进植物的生长发育和提高产量。

Description

植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子HarpinEccs的高效分泌表达和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株hrpN_Eccs基因以及此基因通过生物技术方法提高植物多功能活性和广谱抗性并改良植物品质的应用。

背景技术

微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物。按作用机理不同又可分为传统微生物蛋白农药和新型微生物蛋白农药。传统微生物蛋白农药主要是来自苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫晶体蛋白(ICP)，新型微生物蛋白农药主要是蛋白激发子类物质，它与传统微生物蛋白农药最大的区别在于其不直接杀灭害虫和病原物，而是激发植物自身的抗病防虫基因的表达，并促进植物生长发育。目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白农药主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受关注、最有应用前景的是Harpin类蛋白激发子。

Harpin蛋白主要是由欧文氏杆菌属(Erwinia)细菌产生的一类能激发植物过敏反应的蛋白质(30-40kda)，可诱导植物体内一系列基因的表达，激活植物自身的生长系统和防卫系统，从而使植物能抵御多种病害的侵染和逆境的胁迫，并获得促进生长发育和提高增产的效果。1992年，美国康乃尔大学的韦忠民等首先从梨火疫欧文氏杆菌(E.amylovora)中克隆出这类过敏蛋白基因，并首次提出Harpin蛋白诱导植物的过敏反应可能与其抗病性作用有关，由此推动了新型微生物蛋白农药研究的兴起。经过约10年的努力，以此为背景的美国Eden生物科技公司成功开发和研制出具有广谱抗病防虫功能的新型微生物蛋白农药Messenger，该产品以其对大田作物和经济作物抗病增产方面良好的效果以及对绿色无公害农业卓越的贡献，曾两度获美国环境保护委员会颁发的总统绿色化学挑战奖。

现代分子植物病理学揭示，植物病原细菌既有其致病性，也有诱导植物产生抗病性和促进生长的能力，而决定这种能力的基因是植物病原细菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response onnon-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity on host plants)。HR是植物一种局部的、快速的细胞编程死亡形式，是植物主动抗性的结果，其抗性作用不仅表现在对病原细菌侵染扩展的限制，而且能进一步诱导植物体内产生类似免疫机制的系统获得性抗性反应。

继韦忠民等(Wei et al.1992)成功克隆和表达hrpN_Ea基因之后，近10多年来人们又相继从E.carotovora subsp carotovora、E.chrysanthemi、P.s.syringae、P.s.pv.glycinea、、P.s.tomato、R.solanacearum中克隆到编码Harpin类蛋白的基因，并成功表达了这些蛋白，如Harpin_Ecc，36kda，MukherjeeA.1997；Harpin_Ech，36kda，Bauer D.W.1995；Harpin_Pss，34.7kda，Preston G.1995；Harpin_Psg，35.3kda，Preston G.1995；Harpin_Pst，36.5kda，Preston G.1995；Harpin_Xoo，15.3kda，闻伟刚2001；Harpin_Xooc，15.6kda，闻伟刚2001等。

最近的研究表明，Harpin类蛋白可能在植物的信号通路中起着重要作用。研究人员用Harpin处理拟南芥，发现拟南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn离子通道以及各种氧化酶被激活，这些氧化酶包括ACC合成酶、抗坏血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侣前体等等。现在通常认为，植物细胞壁中广泛存在Harpin蛋白的受体，即Harpin结合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通过与这些受体蛋白HrBP结合激活植物中的多条信号通路。

Harpin蛋白虽然来源于病原菌，但作为一类非特异性的激发蛋白因子，却能引起非寄主植物发生过敏反应，并诱导其抗病性、驱虫性和抗逆性的增加，以及促进生长、提高产量等。为达此目的，获取Harpin_Eccs的高效分泌表达就具有明显的现实意义。

发明内容

植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的高效分泌表达克隆hrpN_Eccs基因，其特征在于，构建融合分泌表达载体pMAL(p2)-hrpN_Eccs，转化大肠杆菌JM109(DE3)和DH5α菌株，IPTG诱导表达，使可溶性的融合分泌表达蛋白MBP-Harpin_Eccs占细菌周质总蛋白的66％以上，实现Harpin_Eccs蛋白的高效分泌表达。

具体实施方式

现将有关内容表述如下：

1、白菜软腐菌染色体DNA的制备从LB平板上挑取生长状态良好的菌落，于37℃下在LB液体培养基中振荡培养12小时，离心收集菌体，按分子克隆实验手册(Sambrook J等，1989)的方法提取、纯化细菌染色体DNA。

2、hrpN_Eccs基因的PCR扩增与纯化据GeneBank中已报道的胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)的hrpN_Ecc基因序列，设计一对PCR扩增引物，即P1：5′-TGTGGATCCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCGGAG-3′和P2：5′-TGTAAGCTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAACCC-3′。其中P1为Harpin_Ecc蛋白的N端编码序列，并在起始密码子ATG前引入了新的限制酶切位点BamH I(G/GATCC)，P2为Harpin_Ecc蛋白的C端编码序列的互补序列，引入了新的限制酶切位点HindIII(A/AGCTT)。用上面分离的白菜软腐菌的染色体DNA作模板，按如下扩增参数进行PCR反应：先95℃预变性5min，然后94℃/2min 1个循环；94℃/15sec+55℃/30sec+72℃/15sec 24个循环；94℃/1min+55℃/2min+72℃/3min 1个循环。经PCR扩增后，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳鉴定，得到了长度约1.1kb左右的DNA扩增带。扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。

3、hrpN_Eccs基因的克隆与测序纯化后的PCR目的产物用限制酶BamH I和HindIII双酶切，同时对克隆载体pET28a(+)也进行BamH I和HindIII双酶切，酶切产物分别用琼脂糖凝胶电泳回收，在T₄DNA连接酶作用下12℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109(DE3)，挑选阳性克隆，经鉴定后进行全自动序列分析。结果表明，hrpN_Eccs基因共计1071个核苷酸，序列如SEQ ID.No1。

与相关基因序列进行比较分析表明，hrpN_Eccs基因富含甘氨酸密码子，缺少半胱氨酸密码子；与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌褐腐致病菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)Ecc71和Ecc1菌株的hrpN_Ecc基因分别享有93％和92％的同源性；与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrosepitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpN_Ecc基因分别享有89％和88％的同源性。

根据以上hrpN_Eccs基因的核苷酸序列，推出Harpin_Eccs蛋白的N→C氨基酸序列为SEQ ID.No2。

该蛋白具有以下分子属性：(1)356个氨基酸序列中各氨基酸组成分别为：Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ile13、Lys17、Thr13、Asp16、Phe10、Val7、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、His1、Pro9；(2)分子量35.58kda；(3)等电点pI：5.26；(4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovorasubsp carotovora)褐腐致病变种的Harpin_Ecc蛋白相比，分子中有6个位点发生了氨基酸替换，分别为Ser₇₀→Gly₇₀、Gly₁₁₃→Ser₁₁₃、Ala₁₁₅→Val₁₁₅、Gly₂₄₉→Ala₂₄₉、Arg₃₁₇→Ala₃₁₇、Lys₃₅₂→Gln₃₅₂；(5)富含甘氨酸Gly和较多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分别占氨基酸数目总量的21％和11％，尤其是在第1、2个突变氨基酸G₇₀和S₁₁₃之间，其丰度分别高达56％和28％；(6)缺乏半胱氨酸Cys；(7)对温度特稳定，在100℃沸水中耐受10-15分钟仍有活性；(8)没有四级结构。

4、hrpN_Eccs基因的融合基因克隆从上面pET28a(+)-hrpN_Eccs克隆载体中经BamH I和HindIII双酶切回收hrpN_Eccs基因片段，并与经同样限制酶双酶切的分泌表达载体pMAL(p2)相连接，构建融合分泌表达载体pMAL(p2)-hrpN_Eccs。

pMAL(p2)载体具有以下特征：(1)大小6.7kb；(2)有7个多克隆位点：Xmn I，EcoR I，BamH I，Xba I，Sal I，Pst I，HindIII；(3)选择标记Amp；(4)蓝白斑筛选；(5)单链复制子M13；(6)测序引物M13。

克隆后的融合分泌表达载体pMAL(p2)-hrpN_Eccs具有以下特征：(1)hrpN_Eccs基因被克隆进载体pMAL(p2)的BamH I-HindIII位点，该位点位于基因malE的下游序列中，因而形成malE-hrpN_Eccs融合基因；(2)malE基因的信号序列可指导融合蛋白分泌至细胞外；(3)malE基因编码麦芽糖结合蛋白2-β-半乳糖片段(maltose-binding protein，MBP2-β-gal，50.843kda)；(4)由强启动子tac启动和IPTG诱导表达。

5、hrpN_Eccs基因在大肠杆菌中的可溶性分泌表达将克隆的融合分泌表达载体pMAL(p2)-hrpN_Eccs转化宿主大肠杆菌JM109(DE3)和DH5α菌株，经质粒提取、酶切鉴定和PCR扩增筛选阳性表达克隆菌株JM109(DE3)-hrpN_Eccs和DH5α-hrpN_Eccs。选取含有表达质粒的单克隆菌落在LB培养基(含100μg/ml氨苄西林)中37℃过夜培养，然后按1％转接至新的LB摇瓶(含0.2％葡萄糖，100μg/ml氨苄西林)中，继续培养至0D₆₀₀值为0.4-0.6，加诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，诱导表达3-5小时，离心收集菌体，取其周质的渗透休克液进行10％SDS-PAGE电泳分析。结果表明，经诱导后细菌周质有大约86kda的外源蛋白表达带，与预期的MBP-Harpin_Eccs融合蛋白大小一致。进一步优化大肠杆菌的分泌表达条件，可使融合蛋白的表达量占细菌周质总蛋白的66％以上，从而实现了目的融合蛋白的高效分泌表达。

6、hrpN_Eccs基因融合表达蛋白的纯化和检测利用MBP纯化模块可直接对hrpN_Eccs基因融合表达蛋白MBP-Harpin_Eccs进行纯化。

除酶切、电泳及HR等分析手段以外，最可靠的检测手段是免疫印迹分析。将hrpN_Eccs基因融合表达蛋白和高分子量标准蛋白一起电泳，分子量标准凝胶经考马斯亮蓝染色后电转移到硝酸纤维素膜上，而制备的目的蛋白直接电转移后进行免疫印迹分析，用兔抗MBP或兔抗Harpin做一抗，结果在约86kda处出现一条阳性反应带。

另外，Xa因子可识别融合蛋白的蛋白酶切位点并将MBP从融合蛋白中切下。

7、Harpin_Eccs蛋白的功能和应用目前的研究结果表明，Harpin类蛋白的主要功能有以下几个方面：(1)促进植物生长发育、提高产量；(2)增强植物的广谱抗病性，包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物获得对某些有害昆虫的驱虫性；(4)增强植物的抗逆性；(5)延长植物产品的储存时间；(6)对盆花、苗木还有良好的塑型作用。

由此可见，Harpin_Eccs蛋白可直接应用于植物的生长发育调节和病虫害防治，包括粮食作物、经济植物、蔬菜、水果、花卉以及园林和草场的养护等；使用方法有浸种、拌种、蘸根、种子包衣、植株注射、叶面喷施、花果喷涂等；使用剂量因使用方法和品种而异，一般5μg/ml-80μg/ml均为有效浓度；施用后2-12小时内即发生作用，药效可持续20天左右，一个生长季节可用药2-3次；本产品属天然有机蛋白，对人畜无毒性，既不会引起病虫害的抗药性，也不会诱发植物遗传结构(基因组DNA)的改变，在自然界能很快被光分解或被微生物降解，对环境不会造成残留或积累污染，在使用过程中无需特殊防护措施，是未来替代高毒、高残留化学农药和有公害的化学调节剂的理想的环保型生物产品。

本发明中所使用的工程菌E.coli JM109(DE3)和DH5α菌株及hrpN_Eccs基因的克隆和融合表达载体pET28a(+)和pMAL(p2)质粒在国内外分子生物学研究及医药工业中已广泛应用，对环境安全可靠。

本发明中使用的缩略语：LB(细菌培养基，酵母粉5g/L+蛋白胨10g/L+NaC110g/L，pH7.0)；Amp(氨苄西林)；IPTG(异丙基硫代-β-半乳糖苷)。

下面通过应用实施例对本发明作进一步说明：

实施例1 Harpin_Eccs蛋白的适用植物

Harpin_Eccs蛋白适用的植物包括：各种自然条件和栽培条件下的所有被子植物和裸子植物，以及某些观赏性蕨类植物。其中，适用的粮食作物、蔬菜作物、经济作物和果树包括：水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、青稞、大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、甘薯、马铃薯、莴苣、蕃茄、甘蓝、菠菜、萝卜、胡萝卜、洋葱、茄子、芹菜、白菜、大蒜、小白菜、花椰菜、南瓜、冬瓜、西瓜、丝瓜、黄瓜、瓠瓜、空心菜、青菜、韭菜、辣椒、姜、葱、菜花、豇豆、四季豆、菜豆、甜菜、苜蓿、向日葵、花生、芝麻、蓖麻、油菜、棉花、亚麻、桑、甘蔗、烟草、胡椒、花椒、苹果、梨、柑桔、柚、橘、葡萄、草莓、桃、杏、李、枇杷、荔枝、桂圆、波萝、香蕉等；适用的观赏性花卉植物和藤蔓植物包括：兰花、牵牛、郁金香、风信子、百合、月季、玫瑰、菊花、牡丹、康乃馨、蔷薇等；适用的各种药用植物包括：川芎、天麻、当归、芍药、紫苏、薄荷、板兰根、连翘、金银花、薯蓣、山药、杜仲、丁香、人参、三七、贝母、枸杞子等；此外还适用于各种经济用林木或苗木、绿化用林木或苗木以及各种牧草和绿化用草皮等。

实施例2 Harpin_Eccs蛋白对细菌类病害的防治

Harpin_Eccs蛋白能有效防治植物的细菌性病害包括：各种蔬菜、粮食和经济作物的软腐病、环腐病、黑腐病、黑斑病、黑胫病、黑星病、黑粉病、叶枯病、青枯病、斑枯病、蔓枯病、纹枯病、枯萎病、炭疽病、角斑病、褐斑病、褐纹病、紫斑病、疮痂病、菌核病、白叶枯病、白粉病、白斑病、白锈病、锈病等。

实施例3 Harpin_Eccs蛋白对真菌类病害的防治

Harpin_Eccs蛋白能有效防治植物的真菌性病害包括：各种蔬菜、粮食和经济作物的霜霉病、灰霉病、叶霉病、煤霉病、疫霉病、早疫病、晚疫病、绵疫病等。

实施例4 Harpin_Eccs蛋白对病毒类病害的防治

Harpin_Eccs蛋白能有效防治植物的病毒性病害包括：白菜孤丁病、蕃茄花叶病、烟草花叶病、白菜褪绿斑驳病毒病、白菜花叶斑驳病毒病以及由X-和Y-病毒复合感染引起的马铃薯病毒病等。

实施例5 Harpin_Eccs蛋白对有害昆虫类病害的防治

Harpin_Eccs蛋白能有效防治植物的有害昆虫包括：蚜虫、菜蛾、菜粉蝶、棉铃虫、烟青虫、玉米钻孔虫、马铃薯瓢虫、甜菜甲虫、粉螨、金针虫、蝼蛄、蝇、粉虱等。

实施例6 Harpin_Eccs蛋白的使用方法

Harpin_Eccs蛋白在使用上方法多样，可因处理材料、处理部位、处理时间以及处理目的不同而有所差异。具体可按以下方法使用：

(1)浸种：首先用水将Harpin_Eccs蛋白配成30-60μg/ml的浓度，然后将种子浸于其中8-12小时。此法适宜作催芽的作物或蔬菜种子。浸种结束后，将种子从Harpin_Eccs蛋白浸种液中取出，即可催芽或播种。出苗一周后，苗高比对照增长10％以上，生长量也提高10％以上，而且苗期抗猝倒病的能力也明显增强。

(2)拌种：将种子稍加湿润，加入种子量0.1％的Harpin_Eccs蛋白制剂，充分拌匀后播种。出苗后苗齐苗壮，增强苗期抗猝倒病的能力。

(3)蘸根：适于移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、棉花、玉米等。首先将Harpin_Eccs蛋白制剂配成30μg/ml的水溶液，然后将被移栽作物幼苗的根浸在该溶液中1-2小时。移栽后，植株恢复生长快，缓苗时间缩短，植株长势强劲。

(4)叶面喷雾：作物的整个生长季节均可进行喷施。将Harpin_Eccs蛋白制剂配成15-20μg/ml的水溶液，在作物的苗期、分蘖期、初花期、初果期或灌浆期进行喷雾使用。作物生长季节一般可喷雾2-3次。喷雾后，可提高作物营养体生长量15-30％，提高产量10-20％，而且整个生长季节可省掉80％以上的化学农药。某些作物如黄瓜可抗住60％的灰霉病、烟草可抗住60-80％的花叶病毒病。另外还有一定的抗逆(抗旱、抗寒、耐盐碱等)和驱虫效果。

实施例7 Harpin_Eccs蛋白的应用举例

目前已对数十种作物、蔬菜、水果、花卉作了Harpin_Eccs蛋白的施用效果试验，虽然在不同作物品种上表现程度有所不同，但Harpin_Eccs蛋白的促长增产、抗病驱虫、提高抗逆性以及盆花、苗木塑型等方面的作用是显著的。下面举几例加以说明：

(1)玉米：选取两块5分地大小的4叶期玉米苗田，分别用作对照和处理样块。处理块分别在4叶期和6叶期用15-20μg/ml的Harpin_Eccs蛋白溶液作了叶面喷雾，此外不使用任何农药，其它方面的管理与对照块一样。在试验过程中发现，用药后一周，处理块平均株高比对照块高出10-15cm，玉米大小斑病发病率也比对照块低20-30％；同时处理块开花比对照块提前5-10天，灌浆期双苞率明显高于对照。收获后比较产量，处理块比对照块增产12％以上。

(2)黄瓜：选取三块5分地大小的3叶期黄瓜苗田，分别用作对照、Harpin_Eccs蛋白处理、络合Harpin_Eccs蛋白处理的样块。两种蛋白处理液的浓度均为20μg/ml。两个处理块都分别在3叶期、5叶期和7叶期进行过叶面喷雾，其它管理同对照。试验结果表明：络合Harpin_Eccs蛋白处理和Harpin_Eccs蛋白处理，开花分别比对照提前10天和8天；花叶病分别比对照减少70％和65％；灰霉柄分别比对照减少40％和30％；产量分别比对照增加26％和23％以上。

(3)草莓：选取约2分地大小的两厢3叶期草莓苗棚，分别作对照和Harpin_Eccs蛋白处理。处理苗棚的Harpin_Eccs蛋白使用浓度为20μg/ml。3叶期开始叶面喷雾，以后每间隔15天喷施一次，共计5次。结果显示，处理棚比对照棚提早10左右开花；单株花、果率平均比对照增加2-3个；灰霉病发生率明显少于对照；鲜果呈色好、果型优、畸形果率低，产量比对照增产25％以上。另外，通过对等量鲜果进行烘干称重，发现处理棚的干物质积累也比对照增加1-2％。(4)仙客来：仙客来是深受大众喜欢的盆花品种，但是由细菌性软腐病引起的死亡率很高，高温时休眠，而且因病毒病造成的畸形叶、花严重影响了其观赏价值和商业价值。我们选区了400盆3-4月龄仙客来作供试材料，随机分成两组，分别作对照和Harpin_Eccs蛋白处理。、Harpin_Eccs蛋白的使用浓度为20μg/ml。处理方法为叶面喷雾，每间隔10-15天喷施一次。结果表明，用药一周以后，处理组的叶色变深、有光泽，株型也明显变得挺拔、紧凑、活脱，并能打破高温休眠；用药一个月以后，以前因病毒病而畸形卷曲的幼叶开始逐渐伸展成正常形态，而对照组的幼叶则变得越来越畸形，连开出的花瓣也呈畸形扭曲。另外，Harpin_Eccs蛋白似乎对仙客来叶片上的白粉虱也有一定的驱赶作用。

序列表

<110>成都派润生物科技有限责任公司

<120>植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的高效分泌表达克隆hrpN_Eccs基因

<160>2

<170>PatentIn Version 2.1

<210>1

<211>1071

<212>DNA

<213>胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)

<221>1-1071

<400>1

1 atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac

61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt

121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcatgacgac tatgatgttt

181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg

241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt

301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaagcg gggtgctggg tgctggcatg

361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg

421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg

481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac

541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa

601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg

661 caaaaagccg gtttgcagga gttgaacaac atcagcacgc acaatgatag cccgacgcgt

721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa

781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag

841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc

901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact

961 ggcaacacta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg

1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgcagaagc tctccagcta a

<210>2

<211>356

<212>PRT

<213>胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)

<400>2

Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys

1 5 10 15

Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Ser Pro Ser Gln Ser Ala Phe Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala

35 40 45

Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met

50 55 60

Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu

85 90 95

Gly Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly Leu

100 105 110

Ser Gly Val Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met

115 120 125

Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly

130 135 140

Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Leu Gln Pro Ser Ser

145 150 155 160

Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu

180 185 190

Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe

195 200 205

Asn Gln Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Ser Val Gly Gln Leu Ala Gly

210 215 220

Leu Gln Glu Leu Asn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg

225 230 235 240

Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln

245 250 255

Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Ala Glu Tyr Gln Lys

260 265 270

Asp Asn Trp Gln Thr Ala Lys Gln Glu Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala

275 280 285

Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys

290 295 300

Phe Met Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asp Thr

305 310 315 320

Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly

325 330 335

Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Gln

340 345 350

Lys Leu Ser Ser

355

Claims

1、植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的高效分泌表达，其特征在于，构建融合分泌表达载体pMAL(p2)-hrpN_Eccs，转化大肠杆菌JM109(DE3)和DH5α菌株，IPTG诱导表达，使可溶性的融合分泌表达蛋白MBP-Harpin_Eccs占细菌周质总蛋白的66％以上，实现Harpin_Eccs蛋白的高效分泌表达。

2、根据权利要求1所述之植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的高效分泌表达，其特征在于，克隆基因hrpN_Eccs的宿主菌是白菜软腐菌变种CSDS001菌株，该细菌在分类上属于胡萝卜软腐欧文氏杆菌，核甘酸序列为SEQID.No1

3、根据权利要求1所述之植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的高效分泌表达，其特征在于，Harpin_Eccs蛋白的氨基酸序列特征(N→C)为SEQID.No2，且(1)序列中共356个氨基酸残基，其中各氨基酸组成分别为：Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ile13、Lys17、Thr13、Asp16、Phe10、Val7、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、His1、Pro9；(2)分子量35.58kda；(3)等电点pI：5.26；(4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)褐腐致病变种的Harpin_Ecc蛋白相比，分子中有6个位点发生了氨基酸替换，分别为Ser₇₀→Gly₇₀、Gly₁₁₂→Ser₁₁₃、Ala₁₁₅→Val₁₁₅、Gly₂₄₉→Ala₂₄₉、Arg₃₁₇→Ala₃₁₇、Lys₃₅₂→Gln₃₅₂；(5)富含甘氨酸Gly和较多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分别占氨基酸数目总量的21％和11％，尤其是在第1、2个突变氨基酸G₇₀和S₁₁₃之间，其丰度分别高达56％和28％；(6)缺乏半胱氨酸Cys；(7)对温度特稳定，在100℃沸水中耐受10-15分钟仍有生物学活性；(8)没有四级结构。

4、根据权利要求1所述之植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的高效分泌表达，其特征在于，克隆的融合分泌表达载体为pMAL(p2)-hrpN_Eccs，hrpN_Eccs基因被克隆进载体pMAL(p2)的BamH I-HindIII位点，即基因malE的下游序列中，形成malE-hrpN_Eccs融合基因。

5、根据权利要求3所述之植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的高效分泌表达，其特征在于，转化宿主菌大肠杆菌JM109(DE3)和DH5α菌株，获得的阳性表达工程菌为JM109(DE3)-pMAL(p2)-hrpN_Eccs和DH5α-pMAL(p2)-hrpN_Eccs。

6、根据权利要求4或5所述之植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的高效分泌表达，其特征在于，融合分泌表达产物为MBP-Harpin_Eccs融合蛋白，(1)分子量约86kda；(2)水溶性；(3)利用MBP纯化模块对融合蛋白进行纯化和检测；(4)用Xa因子识别融合蛋白的蛋白酶切位点并切开融合蛋白。

7、由权利要求1或2或3或4或5所得之植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Harpin_Eccs的应用，其特征在于，Harpin_Eccs蛋白的主要功能特征表现在：(1)促进植物生长发育、提高产量；(2)增强植物的广谱抗病性，包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物获得对某些有害昆虫的驱虫性；(4)增强植物的抗逆性，提高植物对包括干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性；(5)延长作物产品的储存时间；(6)对盆花、苗木有良好的塑型作用。