CN104322530A - 重组蛋白HarpinZΔ89-124的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组蛋白HarpinZ_Δ89-124的应用。本发明获得了一个HarpinZ_PsgS1蛋白的功能片段HarpinZ_Δ89-124，该蛋白能够在大肠杆菌体内稳定表达，并且在植物上具有比全长HarpinZ_PsgS1更好的生物学效应，同浓度的两个蛋白处理烟草、水稻后，HarpinZ_Δ89-124对烟草抗花叶病毒病效果、水稻根部促生长效果、水稻抗白叶枯病效果都显著高于全长HarpinZ_PsgS1，因此能在提高烟草抗烟草花叶病毒病效果、提高水稻抗白叶枯病效果、促进水稻生长中应用。

Description

重组蛋白HarpinZΔ89-124的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及重组蛋白HarpinZ_Δ89-124的应用。

背景技术

Harpin蛋白是由植物病原细菌产生的一类蛋白质激发子，可以激发非寄主植物产生过敏性细胞死亡((hypersensitive cell death,HCD)，诱导植物产生防卫反应，促进植物生长。Harpin蛋白的这些有益效应，可能是通过蛋白质不同的功能域实现的，因此分离、鉴定Harpin蛋白中与抗病、促生有关的功能区域至关重要。

在丁香假单胞菌属中，对于菜豆致病变种P.syringae pv.phaseolicola功能域的研究最透彻，认为C-末端对其功能行使至关重要(M.Haapalainen et al,2011)，但其中对功能域的研究仅仅局限于理化性质研究，如多肽结合位点，原生质膜脂类结合部位及孔洞的形成等方面，缺乏对植物促生抗病方面的研究。因此，研究Harpin蛋白中与植物抗病、促生等在植物上的有益效应相关的功能区域具有重要意义，为harpin蛋白在农业生产中的应用提供基础。本实验室前期已经从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)S1菌株中克隆到大小为1038 bp的hrpZ基因，并利用大肠杆菌表达。研究表明，HarpinP_sgS1具有诱导烟草抗病和促生的效果。本发明在此基础上，通过研究HarpinP_sgS1中决定HR反应、抗病、促生等生物学效应的功能域，得到抗病、促生效果更好的短肽片段，更易于体外表达，提高产量和节约成本，利于微生物蛋白农药的产业化。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组蛋白HarpinZ_Δ89-124的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124在提高烟草抗烟草花叶病毒病效果、促进水稻生长、提高水稻抗白叶枯病中的应用。

其中，所述的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124通过以下步骤制备得到：

(1)以DH5α/pMD18-T-hrpZ_PsgS1菌株提取的质粒DNA为模板，用上游引物hrpZ_Δ89-124-P1、下游引物hrpZ_Δ89-124-P2进行反向PCR扩增，用凝胶回收试剂盒将反向PCR扩增的片段回收纯化，利用T4 DNA连接酶将回收后的片段进行DNA分子自行环化后，转入大肠杆菌DH5α，经酶切及测序验证得到阳性重组菌株DH5α/pMD18T-hrpZ_Δ89-124，其中上游引物hrpZ_Δ89-124-P1序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物hrpZ_Δ254-298-P2序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)阳性重组菌株DH5α/pMD18-T-hrpZ_Δ89-124提质粒DNA，经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET30a(+)上，转入大肠杆菌BL21后经质粒PCR及酶切鉴定出阳性菌株BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-₁₂₄；

(3)利用LB培养基培养阳性菌株BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124，并利用IPTG诱导重组蛋白表达，菌体经超声波破碎获得粗提蛋白，纯化后得纯化的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124。

有益效果：

1.本发明获得了一个HarpinZ_PsgS1蛋白的功能片段HarpinZ_Δ89-124，为HarpinZ_PsgS1截去第89-124位氨基酸之后的一个重组蛋白，该蛋白能够在大肠杆菌体内稳定表达，纯化后每升菌液可得到纯蛋白约40mg。

2.本发明所获得的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124在植物上具有比全长HarpinZ_PsgS1更好的生物学效应，同浓度的两个蛋白处理烟草、水稻后，HarpinZ_Δ89-124对烟草抗花叶病毒病效果、对水稻抗白叶枯病效果、水稻促生长效果都显著优于全长HarpinZ_PsgS1。

3.本发明所获得的截短片段HarpinZ_Δ89-124在植物上有益的生物学效应证实了Harpin蛋白的不同区域调控不同的功能，对于揭示Harpin蛋白空间结构和功能域有重要的参考价值，并且相对表达全长来说，短肽片段更易于体外表达，节约成本，利于微生物蛋白农药的产业化。

附图说明

图1.hrpZ_Δ89-124反向PCR扩增

其中M1为DNA marker DL10000；M2为DNA marker DS2000；1为hrpZ_Δ89-124

图2.重组质粒pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124菌落PCR验证及双酶切验证

A重组质粒pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124的菌落PCR验证结果。其中M为DNA marker DS2000；1为hrpZ_Δ89-124.

B重组质粒pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124的双酶切验证结果。其中M1为DNA marker DL10000；M2为DNA marker DS2000；1为hrpZ_Δ89-124.

图3.IPTG诱导重组蛋白HarpinZ_Δ89-124表达及镍柱纯化

A IPTG诱导重组蛋白HarpinZ_Δ89-124表达的SDS-PAGE电泳图。其中M为protein marker；1为HarpinZ_Δ89-124；2为HarpinZ_PsgS1；3为pET30.

B HarpinZ_Δ89-124纯蛋白SDS-PAGE电泳图。其中M为protein marker；1为HarpinZ_Δ89-124；2为HarpinZ_PsgS1.

图4.重组蛋白HarpinZ_Δ89-124在烟草上诱导HR反应检测

其中纵排代表重组蛋白HarpinZ_Δ89-124及对照HarpinZ_PsgS1，横排代表不同的摩尔浓度。

图5.重组蛋白HarpinZ_Δ89-124诱导烟草抵抗花叶病毒(TMV)侵染

上图为不同蛋白处理后烟草花叶病毒在烟草叶片上引起的病斑数目示意图。下表为不同蛋白处理后诱导烟草对TMV抗病效果的统计结果，横坐标为不同的处理，纵坐标为诱导烟草抗TMV效果百分比。

图6.重组蛋白HarpinZ_Δ89-124对水稻种子的促生作用

左图为不同蛋白处理后对水稻种子的促生作用示意图，其中1为重组蛋白HarpinZ_Δ89-124，2为全长对照HarpinZ_PsgS1，3为对照水。

右图为不同蛋白处理后对水稻根长促生效果的统计结果，横坐标为不同的处理，纵坐标为水稻根的长度。

图7.重组蛋白HarpinZ_Δ89-124诱导水稻抗白叶枯病菌的侵染

左图为不同蛋白处理后对水稻诱导抗白叶枯病示意图，其中1为重组蛋白HarpinZ_Δ89-124，2为全长对照HarpinZ_PsgS1，3为对照水。

右图为不同蛋白处理后对水稻病斑长度的统计结果，横坐标为不同的处理，纵坐标为水稻白叶枯病斑的长度。

图8.重组蛋白HarpinZ_Δ89-124诱导烟草HCD标志基因hsr515(A图)、防卫相关基因NPR1(B图)表达情况。

图9.重组蛋白HarpinZ_Δ89-124诱导水稻生长相关基因OsEXP1(A图)、抗病相关基因OsMAPK(B图)表达情况

生物材料保藏信息

S1菌株，分类命名为丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6699，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年10月22日。

具体实施方式

本发明中使用的缩略语：

LB：细菌培养基，酵母粉5g/L+胰蛋白胨10g/L+Nacl10g/L，PH7.0；

Km50：50μg/ml的卡那霉素；IPTG：异丙基硫代-β-半乳糖苷；PBS:磷酸缓冲液

实施实例1：hrpZ_PsgS1基因重组片段的设计、克隆与测序

根据Genbank中登录号为L41862的hrpZ序列，设计完整开放阅读框(ORF)引物，在5’端和3’端分别引入BamH1和EcoR1酶切位点；

hrpZ_PsgS1-P1：5’-GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC-3’(SEQ ID No.1)；

hrpZ_PsgS1-P2：5’-GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG-3’(SEQ ID No.2)。

以S1菌株(CGMCC No.6699，下同)的基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增hrpZ_PsgS1基因全长序列，反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，循环35次，72℃延伸10min。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经质粒PCR和酶切验证得到阳性转化子。提取重组质粒DNA送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序。对重组质粒pMD18-T-hrpZ_PsgS1序列测定结果显示，hrpZ_PsgS1基因大小为1038bp，编码345个氨基酸，其编码的蛋白质富含甘氨酸(12.75％)，不含半胱氨酸。

以已构建好的DH5α/pMD18-T-hrpZ_PsgS1菌株提取的质粒DNA为模板进行反向PCR扩增，引物设计根据本实验室克隆的hrpZ_PsgS1序列(Genbank中登录号为HM358043)，设计扩增重组蛋白HarpinZ_Δ89-124编码基因的引物：

hrpZ_Δ89-124-P1:5’-CTGAATGATCTTCTGACCAAGCAGGA-3’(SEQ ID No.3)；

hrpZ_Δ89-124-P2:5’-AAGCGTGTCCAGCGCAGCCTTGATGT-3’(SEQ ID No.4)。

反应条件：95℃预变性4min，98℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸4min，循环30次，72℃延伸10min。反向PCR扩增成功后(图1)用凝胶回收试剂盒将扩增片段回收纯化，利用T4 DNA连接酶将回收后的片段进行DNA分子自行环化后，转入大肠杆菌DH5α，经酶切验证得到阳性转化子。提取转化子质粒DNA送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序，利用NCBI网站的BLAST功能，将所测定的序列进行比对分析。结果表明：阳性转化子测序正确，得到大小为930bp的hrpZ_Δ89-124重组片段，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQID No.6所示，将阳性重组菌株命名为DH5α/pMD18T-hrpZ_Δ89-124。

实施例2：HarpinZ_Δ89-124重组蛋白的表达及纯化

2.1 hrpZ_Δ89-124基因工程表达菌株的构建

测序正确的阳性重组菌株DH5α/pMD18-T-hrpZ_Δ89-124提质粒DNA，经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET30a(+)上，转入大肠杆菌BL21后经质粒PCR(图2A)及酶切(图2B)鉴定出阳性菌株，测序正确。同时DH5α/pMD18-T-hrpZ_PsgS1以同样的方法连接pET30a(+)，转化大肠杆菌BL21，作为全长对照，将这两个菌株分别命名为BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124、BL21/pET30a(+)-hrpZ_PsgS1。

2.2 HarpinZ_Δ89-124重组蛋白的表达

(1)IPTG诱导重组蛋白表达：重组菌株BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124、BL21/pET30a(+)-hrpZ_PsgS1接种于LB液体培养基(km50μg/ml)中37℃(200rpm/min)振荡培养过夜，次日按照1％的比例转接到含km50的液体LB中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃振荡培养3-4h。

(2)超声波破碎获得粗提蛋白：收集菌液12000rpm/min，常温离心10min收集菌体，重溶于1/20原菌体培养体积的PBS中，悬浮菌体后用超声波破碎仪进行破碎，破碎后12000rpm/min，4℃离心10min，得到上清液即为HarpinZ粗提蛋白。SDS-PAGE检测HarpinZ_Δ254-298蛋白大小为37.8KD，HarpinZ_PsgS1蛋白大小为42kD(图3A)。

2.3 HarpinZ_Δ89-124重组蛋白的纯化

使用HisTrap^TMHP(GE Healthcare)预装柱对重组蛋白进行纯化，具体步骤参照说明书。纯化之前，用0.22μm滤膜过滤harpinZ粗提蛋白，去除粗提蛋白中一些细胞碎片或其它杂质，以免阻塞纯化柱，纯化时使用蠕动泵上样。纯化后的洗脱液经Millipore公司的截留分子量为30KD的超滤管进行超滤、浓缩，最终得到单一的纯蛋白条带(图3B)。利用BSA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，纯蛋白于-70℃保存。

实施例3：HarpinZ_Δ89-124重组蛋白在植物上的应用

3.1 HarpinZ_Δ89-124重组蛋白增强烟草诱导HR反应能力

在烟草上检测重组蛋白HarpinZ_Δ89-124诱导产生HR的能力，同时以HarpinZ_PsgS1和清水处理为对照，用无头的注射器向烟草叶背面细胞间隙注射200μl，所用纯蛋白浓度为10nmol/ml、7nmol/ml、2.5nmol/ml、1.5nmol/ml、1.2nmol/ml、0.5nmol/ml，24h后观察叶片HR发展情况。

结果表明重组蛋白HarpinZ_Δ89-124与HarpinZ_PsgS1相比，诱导HR反应的浓度更低，可低至0.5nm/ml，说明HarpinZ_Δ89-124诱导HR能力高于全长HarpinZ_PsgS1(图4)。

3.2 HarpinZ_Δ89-124重组蛋白有效提高烟草对花叶病毒病的抗性

使用终浓度为7nmol/ml纯蛋白HarpinZ_Δ89-124预先喷雾处理烟草叶片，以同浓度的HarpinZ_PsgS1、清水喷雾处理为对照。12h后摩擦接种烟草花叶病毒，3天后，观察叶片发病情况，统计病斑数目。

结果显示，HarpinZ_Δ89-124、HarpinZ_PsgS1处理烟草叶片后，与清水处理相比发病程度显著减轻，并且HarpinZ_Δ89-124蛋白的诱导烟草抗TMV效果达到94％，显著高于全长对照HarpinZ_PsgS166％(图5)，上述结果表明，我们得到的HarpinZ_Δ89-124重组蛋白具有更好的抗花叶病毒效果，显著高于全长HarpinZ_PsgS1。

3.3 HarpinZ_Δ89-124重组蛋白促进水稻根部生长

使用终浓度为7nmol/ml纯蛋白HarpinZ_Δ89-124浸泡消毒后的水稻种子，以同浓度的HarpinZ_PsgS1、清水处理为对照。12h后吸出蛋白液，灭菌水清洗三次后倒置于灭菌的滤纸上，待种子吸干水后包裹于方形滤纸中，每张滤纸包裹8枚种子，将滤纸卷竖直放入盛有清水的塑料杯中，水面不超过种子所在位置，置于光照培养箱中培养，每个处理设置10个重复。10天统计不同处理的水稻根长、苗长，应用SPSS软件对数据进行统计分析。

统计结果表明，HarpinZ_Δ89-124、HarpinZ_PsgS1与水相比，对水稻的根长有明显的促生长作用，并且重组蛋白HarpinZ_Δ89-124对水稻的促生作用明显高于HarpinZ_PsgS1全长对照，两者之间存在显著性差异(图6)。此结果表明，我们得到的HarpinZ_Δ89-124重组蛋白在促水稻根部生长方面高于全长HarpinZ_PsgS1。

3.4 HarpinZ_Δ89-124重组蛋白提高水稻对白叶枯病菌的抗性

同样使用终浓度为7nmol/ml纯蛋白HarpinZ_Δ89-124喷雾处理生长40天左右的水稻叶片，以同浓度的HarpinZ_PsgS1、清水处理为对照。12h后剪叶法接种水稻白叶枯病菌PXO99，置于光照培养箱中，10天统计不同处理的水稻病斑长度。

统计结果表明，HarpinZ_Δ89-124、HarpinZ_PsgS1与水相比，水稻病斑长度都明显缩短，发病程度明显减轻，HarpinZ_Δ89-124处理后病斑长度仅为1.15cm，HarpinZ_PsgS1和水分别为7.85cm、9.85cm(图7)，明显看出，HarpinZ_Δ89-124重组蛋白能显著提高水稻对白叶枯病菌的抗性，高于全长HarpinZ_PsgS1。

4.HarpinZ_Δ89-124重组蛋白诱导植物体内防卫反应相关基因、生长相关基因的表达

在烟草上，使用终浓度为7nmol/ml纯蛋白HarpinZ_Δ89-124喷雾处理叶片，以同浓度的HarpinZ_PsgS1、清水喷雾处理为对照，于0h、3h、6h、12h、24h，分别取样，提取叶部RNA，通过Real-time PCR检测烟草中过敏反应相关基因hsr515、防卫反应基因NPR1的表达情况。结果表明HarpinZ_Δ89-124、HarpinZ_PsgS1都可以引起hsr515、NPR1基因的上调表达，且HarpinZ_Δ89-124的hsr515基因、NPR1基因表达量都明显高于全长对照HarpinZ_PsgS1(图8)，这表明基因表达情况与在烟草上的表型检测结果相符。

在水稻上，终浓度为7nmol/ml纯蛋白HarpinZ_Δ89-124喷雾处理生长40天水稻叶片，以同浓度的HarpinZ_PsgS1、清水喷雾处理为对照，于12h后取样，提取叶部RNA，通过Real-time PCR检测生长相关基因OsEXP1、抗病相关基因OsMAPK的表达情况。结果表明HarpinZ_Δ89-124、HarpinZ_PsgS1都能引起OsEXP1、OsMAPK基因的上调表达，并且HarpinZ_Δ89-124的表达量明显高于全长对照HarpinZ_PsgS1(图9)，从基因水平验证了HarpinZ_Δ89-124促进水稻生长、提高水稻抗白叶枯病的生物学效应。

以上实例表明本发明获得的HarpinZ_PsgS1截短之后的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124在植物上能激发一系列有益的生物学效应。HarpinZ_Δ89-124在非寄主植物烟草上激发过敏反应的能力较全长HarpinZ_PsgS1增强；处理烟草后能够显著提高烟草对花叶病毒病的抗性，高于全长HarpinZ_PsgS1；处理水稻后对水稻的根长有明显的促生长作用，增强水稻对白叶枯病菌的抗性，高于全长HarpinZ_PsgS1；并且这些在植物上的有益效应都从基因水平得到了验证。

Claims (2)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124在提高烟草抗烟草花叶病毒病效果、促进水稻根部生长、提高水稻抗白叶枯病效果中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124通过以下步骤制备得到：

(1)以DH5α/pMD18-T-hrpZ_PsgS1菌株提取的质粒DNA为模板，用上游引物hrpZ_Δ89-124-P1、下游引物hrpZ_Δ89-124-P2进行反向PCR扩增，用凝胶回收试剂盒将反向PCR扩增的片段回收纯化，利用T4DNA连接酶将回收后的片段进行DNA分子自行环化后，转入大肠杆菌DH5α，经酶切及测序验证得到阳性重组菌株DH5α/pMD18T-hrpZ_Δ89-124，其中上游引物hrpZ_Δ89-124-P1序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物hrpZ_Δ89-124-P2序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)阳性重组菌株DH5α/pMD18-T-hrpZ_Δ89-124提质粒DNA，经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET30a(+)上，转入大肠杆菌BL21后经质粒PCR及酶切鉴定出阳性菌株BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124；

(3)利用LB培养基培养阳性菌株BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124，并利用IPTG诱导重组蛋白表达，菌体经超声波破碎获得粗提蛋白，纯化后得纯化的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124。