CN104371947A

CN104371947A - 枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN104371947A
Application number: CN201410246944.7A
Authority: CN
Inventors: 宋水山; 黄亚丽; 李惠荣; 贾振华; 宋聪; 马宏; 黄媛媛
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为保藏编号CGMCC No.3665菌株或其直接传代物，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的菌株能够有效的分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶，能够防治梨黑斑病，是有效的生物防治剂，应用前景十分广阔。

Description

枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物和化肥化工领域，具体的涉及一种能够分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

我国是世界第一梨果生产大国，鲜梨产量约占世界总产量的2/3。许多品种如雪花梨、库尔勒香梨、鸭梨等以其优质而在国际享有盛誉。由半知菌亚门交链孢属链格孢霉[Alternaria alternate(Fr.)Keissler]引起的黑斑病是梨采后储藏期的主要病害之一，影响梨果的储藏时间以及品质，造成严重的经济损失。

对于梨采后病害的防治，目前仍以低温贮藏和化学保鲜剂为主，但不当的低温容易造成梨果冷害的发生，长期使用化学保鲜剂会促使某些病原真菌的抗性增加，且农药残留问题也对公众的健康和环境造成威胁。因此，安全、无污染、环境友好型生物保鲜技术越来越受到人们的重视.因此，如何得到能够防治梨黑斑病的生物保鲜剂是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选的，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为保藏编号CGMCC No.3665菌株或其直接传代物，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明另一方面还涉及一种含有枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)的菌剂。

本发明另一方面还涉及上述菌剂在防治梨黑斑病中的应用。

在本发明的另一方面，还涉及所述枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)在产β-1，3-1，4-葡聚糖酶中的应用，优选的，所述的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明的菌株能够有效的分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶，能够防治梨黑斑病，是有效的生物防治剂，应用前景十分广阔。

微生物信息

本发明所筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)J18已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.3665，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2010年03月12日。

附图说明

图1：重组蛋白的Western Blot检测

图2：SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白

M：蛋白质分子量标准；1，2：亲和纯化后的重组蛋白

图3：重组酶对梨链格孢霉菌丝的抑制作用

图4：重组酶在PDA平板上对梨链格孢霉的抑制

图5：重组酶对梨黑斑病的防治

左：重组酶；右：对照(无菌水)

图6：重组酶对梨黑斑病的防治效果

左：对照(只喷施病原菌)；右：重组酶处理

具体实施方式

实施例1

1.菌株的分离

从四川成都梨果园土样中筛选到一株枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis) J18，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国微生物菌种保藏中心登记编号CGMCC No.8343。

2.试验方法

2.1引物的设计与合成

通过在GenBank文库中进行序列查找与同源性比对，根据已登录的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因序列及表达载体pET28a(+)的多克隆位点设计引物，在正反向引物5’端分别引入BamH I和Xho I酶切位点，并加入相应的保护性碱基，由上海生物工程公司合成。

引物序列如下：

上游引物G1：5＇-CGGGATCCATGCAAACAGGTGGATCG-3＇

下游引物G2：5＇-CCGCTCGAGGCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3＇

2.2β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆

2.2.1枯草芽孢杆菌(B.substilis)J18基因组DNA的提取

对枯草芽孢杆菌J18基因组DNA进行提取，按照试剂盒说明书进行。具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌J18以1％(V/V)的接种量接种于LB培养基，在37℃条件下、200r/min振荡过夜培养。吸取10mL菌液5000r/min离心10min，保留菌体。

(2)用STE(1mM EDTA，pH8.0；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.1M NaCl)洗涤一次，5000r/min离心10min，弃上清。

(3)加4mL TE(1mmol/L EDTA，pH8.0；10mmol/L Tris-HCl，pH8.0)悬浮沉淀，并加8μL溶菌酶溶液(50mg/mL)，37℃静置20min。

(4)加10μLRnase(10mg/mL)，再加入0.5mL的10％SDS溶液，37℃静置30min。

(5)加10μL蛋白酶K(20mg/mL)，37℃静置60min。

(6)加入相同体积的Tris-饱和酚溶液，混匀，8000r/min离心5min，吸取上清转移至新的1.5mLEP管中。

(7)向上清液中加入相同体积的酚：氯仿，混匀，8000r/min离心5min，吸取上清转移至新的1.5mLEP管中。

(8)向上清液中加入1/5体积、浓度为10mol/L的醋酸铵和2倍体积无水乙醇，颠倒混合，静置10min，离心沉淀DNA。用70％乙醇洗涤，吸干，加500μL TE溶解DNA，-20℃保存。

2.2.2β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因PCR扩增

以提取的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)J18的基因组DNA为模板，G1和G2为引物进行PCR扩增，在0.2mL的PCR小管中加入以下成分。

PCR反应体系(20μL)如下：

PCR扩增程序：95℃5min；95℃45s，61℃50s，72℃90s，共进行30个循环；循环结束后，72℃延伸10min；4℃保存。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

2.2.3琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

(1)1.0％琼脂糖凝胶制备

将0.2g琼脂糖加入到20mL的1×TAE缓冲液(PH8.0)中，混匀以后放入微波炉中加热，直至琼脂糖全部溶解。待琼脂糖冷却以后，温度大约为40℃-60℃，吸取lμL的Gelred染料加入琼脂糖后混匀。选取适当的梳子插到制胶板上，把融化的琼脂糖倒入制胶槽中。待胶完全凝固后，小心拔去梳子，将带有琼脂糖凝胶的电泳板放入电泳槽中。

(2)上样：取5μLPCR产物和1μL6×DNA Buffer，混匀，加到点样孔里。

(3)电泳：在稳定电压90V条件下电泳30min。

(4)成像：将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中拍照保存。切下扩增目的基因片段的胶。

2.2.4目的基因片段的回收

将PCR扩增目的基因片段的胶用小量胶回收试剂盒进行回收，实验具体方法参照试剂盒的说明书。通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测回收情况，来估计DNA浓度

2.2.5目的基因片段与克隆载体pMD18-T的连接

按照TaKaRa(大连)公司的T-A克隆载体连接试剂盒说明书步骤将目的基因片段与克隆载体pMD18-T连接。

连接体系(5μL)如下：

回收目的基因片段 1～3μL

pMD18-T 1μL

ddH₂O 补足到5μL

离心混匀，16℃过夜连接。

2.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备

(1)取-80℃冻存的菌株于固体LB平板上划线，37℃培养箱中过夜培养；

(2)挑取平板上生长良好的单菌落，接种于3mL LB液体培养基的试管中，37℃，200r/min振荡过夜培养；

(3)取lmL的菌液接种于50mL的LB液体培养基中，37℃，200r/min下振荡培养至OD600约为0.3-0.5之间(即细菌生长处于指数生长前期到中期的阶段)；

(4)取出5mL菌液于10mL离心管中，在冰上放置30min。4℃，5000r/min下离心10min，弃上清，收集菌体；

(5)向菌体沉淀中加入5mL4℃预冷的CaCl2(0.1mol/L)溶液，轻轻悬浮菌体，冰浴60min；

(6)将悬浮的菌体4℃，5000r/min离心10min，弃上清；

(7)向沉淀的菌体中加入500μL预冷的CaCl₂(0.1mol/L)溶液轻轻悬浮，每管分装200μL，于-80℃保存，即为制备好的感受态细胞。

2.2.7载体pMDl8-T连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞

(1)取预先制备好的-80℃保存的E.coli DH5α感受态细胞，至于冰上解冻，待完全解冻后，加入5μL的连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；

(2)在42℃下热激90s，迅速置于冰中，继续冰浴2min；

(3)向热激后的感受态细胞中加入LB液体培养基800μL，37℃，130r/min缓摇孵育2h；

(4)将培养后的菌液4000r/min离心2min，弃部分上清，悬浮菌体。

(5)将剩余菌液100μL涂布到含有Amp的LB平板上(已涂过X-gal和IPTG)，37℃培养箱正放培养30min后，倒置培养16h，长出转化子。

2.2.8重组E.coli DH5a克隆子质粒的提取

挑取白色阳性克隆菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃，200r/min过夜培养，用小量质粒快速提取试剂盒提取质粒，具体方法参照试剂盒说明书进行。

2.2.9阳性克隆质粒的鉴定与测序

以阳性克隆质粒为模板，用原引物进行PCR扩增，反应体系及反应程序参照2.2.2，再进一步通过限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切鉴定是否为阳性克隆子。将阳性克隆委托上海生工公司测序。

2.3β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的序列分析

将测序所得基因序列利用NCBI网站上的Blast X工具、ExPASy数据库的ProtParam在线分析工具、DNAMAN、Clustal W、MEGA等软件对J18菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因核苷酸序列及氨基酸序列进行分析。将核苷酸序列提交稀有密码子在线分析工具Rare Codon Calculato分析其大肠杆菌稀有密码子的数量和位置，同时利用Graphical Codon Usage Analyzer分析系统对β-1，3-1，4-葡聚糖酶进行密码子偏好性分析。通过位于ExPASy数据库的ProtScale工具对β-1，3-1，4-葡聚糖酶的疏水性进行分析，为它的功能域和结构域的划分提供可靠依据。

2.4重组表达载体pET28a(+)-bgl的构建

2.4.1阳性克隆质粒和表达载体pET28a(+)的双酶切

用限制性内切酶BamH I和Xho I分别对表达载体pET28a(+)和阳性克隆质粒进行双酶切。

酶切反应体系(20μL)如下：

离心混匀，37℃酶切3h。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收目的基因片段，然后使用DNA小量凝胶回收试剂盒回收，具体步骤详见试剂盒说明书。

2.4.2目的基因与表达载体pET28a(+)的连接

将上述酶切及纯化后的目的基因片段与表达载体pET28a(+)样品各取4μL进行电泳，利用紫外投射仪来大致估测浓度。按照摩尔浓度比为DNA片段∶表达载体＝3∶1的比例进行连接。

连接体系(10μL)如下：

离心混匀，反应体系于16℃恒温水浴中过夜连接16h。

2.4.3表达载体pET28a(+)连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞

将连接产物转入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中的方法参照克隆宿主菌E.coli DH5α，详见2.2.2.7。转化后的产物涂布到含有Kan抗生素(50μg/mL) 的LB琼脂平板上，37℃培养箱正放培养30min后，倒置培养16h，长出转化子。

2.4.4阳性克隆鉴定

从培养好的平板上挑取单菌落过夜培养，提取重组质粒，通过PCR和质粒双酶切进行鉴定，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测是否出现目的基因大小的片段。构建的重组表达载体命名为pET28a(+)-bgl。

2.5重组酶的诱导表达

2.5.1重组蛋白的诱导表达

(1)将pET28a(+)-bgl工程菌和含有pET28a(+)空质粒的对照菌株分别接种于3mL含Kan(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，作种子液。

(2)以1.0％接种量将种子液接种到装有50mL含Kan(50μg/mL)的LB液体培养基的150mL三角瓶中，37℃、200r/min振荡培养2-3h至OD600值在0.4-0.6之间，加入IPTG诱导剂，诱导终浓度为1mM，于28℃、200r/min诱导表达。

(3)诱导4h后取菌液1mL，8000r/min离心10min，弃上清，用20μL磷酸缓冲液重悬沉淀，然后加入5×SDS缓冲液，100℃煮沸10min，然后进行SDS-PAGE。

(4)剩余菌液4℃下8000r/min离心20min，收集菌体。先用生理盐水清洗一次菌体，再用无菌水清洗一次，相同条件下离心。

(5)菌体用5mL Lysis buffer缓冲液重悬，然后超声波破碎菌体(冰浴，400w，超声3s，停3s，共超声27min)。菌体超声破碎后，4℃、12000r/min离心20min，收集上清和沉淀，用SDS-PAGE进行重组蛋白的可溶性分析。取出上清液进行重组蛋白的纯化。

2.5.2诱导条件优化

重组蛋白是否能够表达及其表达量的多少与很多因素有关，其中最主要的因素有以下几方面：菌液起始浓度、IPTG浓度、诱导时间及诱导温度。

(1)菌液起始浓度的优化：设定IPTG浓度为1.0mmol/L，调整菌液起始OD600分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2，28℃诱导培养5h。

(2)IPTG浓度的优化：设定菌液起始OD600＝0.4-0.6，调整IPTG终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mmol/L，28℃诱导培养5h。

(3)诱导时间的优化：设定IPTG浓度1.0mmol/L，菌液起始OD600＝0.4-0.6，28℃分别培养0、1、2、3、4、5、6、7h。

(4)诱导温度的优化：设定IPTG浓度1.0mmol/L，菌液起始OD600＝0.4-0.6，28℃、30℃、38℃诱导培养5h。

表达产物利用SDS-PAGE检测，并使用凝胶分析软件BandScan5.0对重组蛋白表达量进行分析。

2.5.3 SDS-PAGE电泳

(1)按照说明书将玻璃板和凝胶模具等组装起来。

(2)配制15％的电泳分离胶(见表2.3)。吸取正确体积的30％Acr/Bis、10％过硫酸铵、2M Tris-HCl(pH8.8)、TEMED、10％SDS和蒸溜水加入一个干净的小烧杯中，轻轻混匀，在两块玻璃板间加入分离胶，预留浓缩胶空间，加入ddH2O封闭。室温放置30min，弃去上层ddH2O，用滤纸吸出残留ddH2O；

(3)配制5％的电泳浓缩胶(见表2.3)。吸取确定体积的30％Acr/Bis、10％过硫酸铵、2M Tris-HCl(pH6.8)、TEMED、10％SDS和蒸溜水加入一个干净的小烧杯中混匀，向玻璃板夹缝中加入浓缩胶，之后将样品梳迅速插入凝胶内，室温静置使其完全聚合。，

(4)当凝胶完全聚合后，将梳子小心拔出，ddH2O清洗加样槽，除去未聚合的丙烯酰胺。将玻璃胶板放入电泳槽中，向电泳槽中注入电泳缓冲液。

(5)在1.5mL离心管中加入20μL蛋白质样品和5μL5×样品buffer，混合后加热煮沸10min，离心，用移液枪将样品加入加样孔中。

(6)电泳：接通电源，设定合适的电泳参数。本试验起始电压设置为80V，待溴酚蓝染色剂前行至分离胶时更换为120V，待溴酚蓝跑到凝胶底部停止电泳。

(7)电泳完毕，将凝胶放入染色液的托盘中震荡染色约2h，染色液回收再利用；然后将凝胶用蒸馏水漂洗数次，然后放入脱色液中脱色，直到显现出清晰的条带。

表1SDS-PAGE凝胶配制表

2.5.4免疫印迹Western Blot检测

(1)采用恒压将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。

(2)在电泳结束前20min前，取两个大培养皿分别倒入转膜缓冲液和甲醇。

(3)将PAGE胶切下来，浸泡在甲醇中；将PVDF膜剪成和PAGE胶一般大小，浸泡在转膜缓冲液中；剪6张滤纸和PAGE胶相同大小，浸入转膜缓冲液。

(4)在透明玻璃板上铺一层转膜缓冲液，把PAGE胶放在玻璃板上，用玻璃棒在PAGE胶上滚动赶出所以气泡。

(5)将PAGE胶、PVDF膜和滤纸按三明治形状铺好，将PAGE胶和PVDF膜夹在中间，保持湿润和无气泡。

(6)将电泳槽冲洗干净，用镊子将三明治至于转印仪上。恒压90V电转1h。

(7)转膜结束后，取出PVDF膜，用去离子水稍加漂洗，取出浸于封闭液中进行包被，可以4℃封闭过夜或者室温摇1h。

(8)包被结束后，用封闭液将一抗稀释1000倍加于膜上，摇晃孵育1h。

(9)一抗孵育结束后，用TBST漂洗，每次5min，洗5次。

(10)结合二抗，用封闭液将二抗稀释10000倍，摇晃孵育1h，同样TBST洗涤5次，每次5min。

(11)用镊子将PVDF膜夹出，吸去过多液体，置于洁净的保鲜膜上。按比例配好发光剂，滴加到PVDF膜上，浸泡5min，吸去多余发光剂，在暗室曝光，根据曝光条带判断蛋白的表达结果。

2.6重组酶的纯化

2.6.1重组酶的制备

操作方法如2.5.1。

2.6.2重组酶的纯化

(1)装柱：将lmL50％Ni-NTA His.bind树脂填料装入空的层析柱中，树脂自然沉降；用3倍柱体积的无菌水冲洗树脂(树脂沉降后体积为一个柱体积)；用结合缓冲液洗柱，打开层析柱底塞，让液体流出，重复2次。

(2)将4mL重组酶的粗提液通过0.45μm滤器过滤后加入层析柱中，把层析柱平放在冰上，摇晃结合60min。

(3)用4mL漂洗缓冲液洗柱3次，每次5min。

(4)用1mL洗脱缓冲液洗柱5次，每次10min，收集洗脱液体(之前可做预实验观察结果，若杂蛋白及目的蛋白洗脱不彻底，可提高各洗脱液中咪唑的量)；将收集的样品进行SDS-PAGE鉴定。

(5)将收集的洗脱液装在截留分子量为8000-14000的透析袋中，用PBS缓冲液4℃透析24小时，每8小时换一次透析液；最后分装，-20℃保存。

2.7重组酶抗真菌活性测定

2.7.1重组酶对梨链格孢霉孢子萌发的影响

在两个无菌管中均加入100μL梨链格孢霉孢子悬液和800μL的PDA液体培养基，然后分别加入100μL分离纯化并除菌的重组酶(60μg/mL)和100μL灭菌去离子水作为对照。28℃、200r/min倾斜震荡培养8h。在光学显微镜下每个处理观察100个孢子的萌发状态并测量芽管长度。实验重复3次。实验数据应用SPSS17.0软件进行方差分析(P＜0.05)。

2.7.2重组酶对梨链格孢霉菌丝的抑制作用

在两个无菌管中均加入100μL梨链格孢霉孢子悬液和800μL的PDA液体培养基，28℃、180r/min倾斜震荡培养。待孢子萌发(孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发)后分别加入100μL除菌的重组酶和100μL的无菌去离子水(空白对照)，培养8h和16h后，在光学显微镜下观察孢子菌丝的形态。

2.7.3重组酶对梨链格孢霉的抑制作用

从培养4d的梨链格孢霉PDA平板培养基上，取一个直径为5mm的菌块转接于另一个PDA培养平板中央，28℃培养至菌落大小为4cm左右时，在菌落前方0.5cm处呈等边三角形放置3个直径为5mm的无菌滤纸片，在滤纸片上分别滴加分离纯化后的重组酶10μL、20μL，以无菌去离子水作对照，28℃培养48h，观察抑菌效果。

2.7.4重组酶对梨黑斑病的防治效果

2.7.4.1在梨上损伤接种重组酶和病原菌

为了鉴定重组酶在梨果体内对梨黑斑病菌的抑制作用，把重组酶直接作用在受伤的梨果上。取无病无伤，大小和成熟度相似的雪花梨，用NaClO溶液(2％)消毒后，在梨果腰部打4个直径为5mm×3mm(深)的孔。在孔内滴加100μL重组酶溶液，室温下放置2h后接种20μL病原菌孢子悬液；以接种病原菌前滴加100μL无菌去离子水的梨果作为对照。自然晾干后将不同处理的梨果放在塑料盆内，用塑料薄膜封口保持95％的湿度，于室温下贮藏，7d后观察梨果的发病情况并测量梨果的病斑直径。每个处理6个梨果，实验重复3次。

2.7.4.2在梨上喷施重组酶和病原菌

取无病无伤、大小和成熟度相似的雪花梨，在重组酶溶液中浸果30s，把梨果放在塑料盆内，2h后喷施50mL的病原菌孢子悬液，晾干后用塑料薄膜保湿，之后室温下贮藏30d。以只喷施病原菌孢子悬液的处理为对照，统计梨果的发病情况。每个处理30个梨果，重复3次。

病果分级标准

0级：无病斑 1级：病斑直径≤1.0cm

2级：病斑直径1.1～2.0cm 3级：病斑直径2.1～3.0cm

4级：病斑直径3.1～4.0cm 5级：病斑直径≥4.1cm

病情指数＝∑(各级腐烂数×该级代表数)/(总数×最高级代表数)

防效％＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

2.8重组酶的特性研究

2.8.1温度对重组酶抑菌活性的影响

将重组酶经30、35、40、45、50、55、60、65、70℃分别处理30min，采用平板对峙法检测其抑菌效果，设未处理样品的抑菌活性为100％计算相对抑菌活性。

2.8.2pH值对重组酶抑菌活性的影响

配制pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液，高压灭菌后处理重组酶，4℃下静置8h，采用平板对峙法检测其抑菌效果，设最高抑菌活性为100％计算相对抑菌活性。

2.8.3光照对重组酶抑菌活性的影响

将重组酶放入培养皿中，在800Lx光强下照射6、12、18、24、30、36h，采用平板对峙法检测其抑菌效果，设未照射样品的抑菌活性为100％计算相对抑菌活性。

2.8.4金属离子对重组酶抑菌活性的影响

重组酶中加入几种常见金属离子(Zn²⁺，Ni²⁺，Mn²⁺，Na⁺，Fe²⁺，K⁺，Mg²⁺，Cu²⁺和Ca²⁺)，最终浓度均为1mmol/L，采用平板对峙法检测其抑菌效果，以未加金属离子样品的抑菌活性为100％计算相对抑菌活性。

3结果与分析

3.1β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因克隆

以枯草芽孢杆菌(B.substilis)J18的基因组DNA为模板，G1和G2为引物进行PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，可清晰见到约650bp大小的特异条带，DNA片段大小与预期结果相符，说明通过PCR的方法成功扩增出β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因。

3.2阳性克隆质粒的鉴定

PCR产物经胶回收试剂盒回收后，与克隆载体pMD18-T连接，然后转化E.coli DH5α感受态，从转化子中提取质粒。PCR产物与pMD18-T连接后的重组质粒命名为pMD18T-bgl，对该质粒进行PCR和双酶切鉴定。PCR得到一条650bp的条带，双酶切得到大小约为650bp和2700bp左右的两条特异条带，与预计大小吻合。鉴定结果表明重组质粒pMD18T-bgl构建成功。

3.3重组表达载体的构建

重组质粒pMD18T-bgl和表达载体pET28a(+)经BamH I和Xho I双酶切后，连接得到重组表达载体pET28a(+)-bgl，转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。

3.4重组表达载体的鉴定

对阳性重组表达载体pET28(+)-bgl进行PCR和双酶切鉴定。PCR显示一条650bp的特异条带，双酶切得到大小约为650bp和5600bp左右的两条特异条带，与预计大小一致。鉴定结果表明重组表达载体pET28a(+)-bgl构建成功。

3.5重组酶的诱导表达

pET28a(+)表达载体采用T7启动子融合表达。T7启动子是目前大肠杆菌中最强的启动子，T7启动子只有在T7噬菌体RNA聚合酶的作用下才能被启动，T7噬菌体RNA聚合酶基因通过溶原途径，整合在E.coli BL21(DE3)大肠杆菌lacUV5启动子之下。在IPTG的诱导下，lacUV5启动子导致合成大量的外源基因的mRNA，促使目的基因的表达。

3.6重组酶的SDS-PAGE检测

将pET28a(+)-bgl工程菌和含有pET28a(+)空载质粒的对照菌株同时进行培养和诱导。对照菌株诱导前后蛋白表达没有明显变化，而pET28a(+)-bgl工程菌经诱导后有一条分子量约为27kDa的新生蛋白带(图3)。β-1，3-1，4葡聚糖酶的理论分子量约为24.3kDa，加上其N端由36个氨基酸编码的6个His标签(分子量约为3kDa)，可以推测表达的重组蛋白分子量与带有His标签的β-1，3-1，4葡聚糖酶的理论分子量大小相一致。因此可知，该重组蛋白在受体菌株E.coli BL21(DE3)中得到了表达。

3.7免疫印迹Western-Blot检测

将重组蛋白进行SDS-PAGE后转印PVDF膜，进行Western Blot检测，以Anti-his为一抗，HRP标记的羊抗鼠重组蛋白G作为二抗。由图1可知，在 27kDa处有一条特异性条带，其大小与预测的重组蛋白是一致的，而对照菌株没有检测到任何条带，表明已成功表达目的蛋白。

3.8诱导表达条件的优化

优化试验结果表明，J18菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶工程菌的最佳诱导条件为：在菌液起始浓度OD₆₀₀达0.4-0.6后加入终浓度为lmmol/L的诱导剂IPTG开始诱导，28℃震荡培养4h后目的蛋白的表达量达到最大值。

3.9重组酶的纯化

利用浓度为250mmo1/L咪唑的洗脱缓冲液把目的蛋白洗脱出来，通过SDS-PAGE电泳分析纯化效果(图2)。BandScan5.0软件对SDS-PAGE电泳图分析显示，经纯化后的目的蛋白量占蛋白总量的86.81％，纯化效果较好。

3.10重组酶对梨链格孢霉孢子萌发的影响

重组酶处理梨链格孢霉孢子8h后，在显微镜下观察到与对照相比病原菌孢子萌发率显著从99.08％降低到27.95％，芽管长度由218.34μm显著降低到66.57μm(如表2)。

表2重组酶对梨链格孢霉孢子的影响

注：单因素方差分析(P＜0.05)

3.11重组酶对梨链格孢霉菌丝生长的抑制作用

由图3可以看出，梨链格孢霉孢子在PDA液体培养基中萌发后，用重组酶处理8h后，孢子变黑，菌丝生长缓慢并且出现畸变和菌丝顶端膨胀的现象，而对照组的菌丝生长正常，没有出现畸变。处理16h后，菌丝膨胀状态更加明显，并且出现破裂等现象。

3.12重组酶对梨链格孢霉的抑制作用

由图4可以看出，重组酶在PDA平板上对梨链格孢霉的生长表现出明显抑制活性，在滴加有重组酶附近的地方呈凹进状，而对照处的菌丝生长正常。

3.13在梨上损伤接种重组酶和病原菌

7d后观察梨果的发病情况并测量梨果的病斑直径(图5)。在纯化重组酶存在的情况下，由链格孢霉引起的病斑直径(直径6.12mm)明显小于只接种病原菌的病斑直径(直径13.37mm)，且腐烂程度也明显低于对照。

3.5.4.2在梨上喷施重组酶和病原菌

30d后统计梨果的发病情况(图6)，梨果经重组β-1，3-1，4-葡聚糖酶液处理后，发病率和病情指数都明显下降，其发病率为33.61％，比对照下降32.33％，防病效果为66.25％。

4重组酶的特性研究

4.1温度对重组酶抑菌活性的影响

重组酶在55℃以下处理30min后抑菌活性与对照相比差异不显著，超过55℃抑菌活性开始缓慢下降，至65℃时相对抑菌活性为57.13％，70℃时相对抑菌活性仍有14.91％。

4.2 pH值对重组酶抑菌活性的影响

在pH3.0-9.0范围内，抑菌活性因pH的不同而变化。当pH小于6.0时，抑菌活性随pH增加而升高；当pH大于6.0时，抑菌活性随pH的增加而降低；在5.0-8.0之间仍然处于较高的抑菌活性状态。

4.3光照对重组酶抑菌活性的影响

重组酶在800Lx的光照条件下处理，随着时间的延长，抑菌活性缓慢降低，处理48h后，其抑菌活性较未处理时仅降低14.91％，这表明光照对重组酶的抑菌活性影响不大。

4.4金属离子对重组酶抑菌活性的影响

经过不同金属离子处理后，重组酶的抑菌活性变化见表3。浓度为1mmol/L的不同金属离子对重组酶的抑菌活性影响不大，仅有一些离子如Ca2+、Mn2+和Cu2+能够增强重组酶的抑菌活性，而Fe2+和Zn2+对重组酶活性有抑制作用。

表3金属离子对重组酶抑菌活性的影响

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选的，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为保藏编号CGMCC No.3665菌株或其直接传代物，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种含有上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌剂。

3.上述菌剂在防治梨黑斑病中的应用。

4.上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在产β-1，3-1，4-葡聚糖酶中的应用，优选的，所述的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。