CN104560833B - 一种嗜碱微球菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种嗜碱微球菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用。该嗜碱微球菌，是从深圳红树林土壤中筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株。本发明还公开了上述嗜碱微球菌产生的碱性木聚糖酶，该酶具有pH适应范围广，耐热、碱、金属离子和表面活性剂等适用于造纸等工业的优良酶学特性，可在造纸等工业中应用。本发明的嗜碱微球菌属于耐碱的极端微生物，可在高碱性条件下培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。

Description

一种嗜碱微球菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种嗜碱微球菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用。
背景技术
木聚糖酶，广泛分布于细菌、真菌、酵母、放线菌、反刍动物瘤胃、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中，其中细菌来源的中性或碱性木聚糖酶具有较高的耐碱性和热稳定性。木聚糖酶具有广泛的应用，在造纸工业中，可应用于纸浆漂白、废纸脱墨；在饲料行业中，木聚糖酶可降低小麦型日粮水溶性木聚糖导致的食糜黏性增高，从而提高消化酶对底物的作用效率，同时木聚糖酶可作用于不溶性非淀粉多糖，破碎植物细胞壁，并释放出营养物质；在酿酒和食品行业中应用也非常广泛，如木聚糖酶添加到面粉中，可以改善面团的持水性、稳定性和对过度发酵的耐受性，提高入炉急涨性能，增大烘烤后面包的体积，改善面包心质地，降低面包的老化速率，延长货架寿命。
目前，工业上直接利用木聚糖酶还存在一些问题：稳定性差、底物特异性低、使用寿命短和成本高等。作为一种微生物制剂，木聚糖酶对温度、湿度和酸碱度都有一定的要求。为了适应不同饲料加工工艺及应用的需要，常需筛选耐高温的菌种，或采用基因工程及蛋白质工程手段改造木聚糖酶的属性，以满足各种因素对木聚糖酶的要求。现阶段生产的木聚糖酶均为真菌来源的木聚糖酶，这些酶的最适作用pH值普遍小于5.5。此外，木聚糖酶特异性低，直接利用效果较差，因此还应深入研究底物种类及质量浓度与木聚糖酶用量的关系，探讨不同酶制剂间的配伍效果，提高木聚糖酶的底物特异性。
地球上的一般自然环境pH值为5～8，碱性最强的自然环境是极端土壤、荒漠盐碱地等。鄂尔多斯高原土壤群、非洲乍得湖和墨西哥塔斯可可湖被称为世界三大土壤群，湖水pH值大于9。嗜碱菌是一个丰富多样的群体，目前已经从碱性土壤、盐土壤及海洋中分离得到多种多样的各种嗜碱菌。碱性木聚糖酶一般是由嗜碱菌分泌的。盐土壤和造纸工业废水废料中已分离出许多能适应碱性环境并产生碱性木聚糖酶的微生物。产碱性木聚糖酶的微生物主要为细菌，真菌也能产生但数量极少。
国内对于碱性木聚糖酶的研究起步较晚，研究工作主要集中于碱性木聚糖酶生产菌株的分离、纯化、产酶条件优化等。造纸制浆工业是我国国民经济的重要支柱产业，近十几年来，中国造纸工业飞速发展，到2011年，纸和纸板的产量和消费量都已超越美国跃居世界第一位。中国虽然已成为造纸生产大国，但还不是造纸强国，与世界造纸强国相比，仍存在相当大的差距。中国造纸工业高速发展的模式正面临着严峻的考验，其中面临的最大问题就是资源和环境的严重制约。
我国造纸用材料主要为非木材料。木聚糖酶在我国广泛地应用于麦草浆和竹浆漂白。但目前大多数研究的木聚糖酶最适反应pH和热稳定性都较低，限制了木聚糖酶的大规模应用。
因为造纸制浆工业的特点，要求木聚糖酶具有以下性能：1、为获得较佳漂白效果，并且不损伤纸浆纤维，酶液必须很低或者无任何纤维素酶活性。2、因纸浆采用碱法蒸煮，因此所采用的木聚糖酶必须有较宽的pH耐受性，要求在pH值大于9的情况大仍能保持较高活性。3、因木聚糖酶的处理在蒸煮完毕后进行，其中纸浆仍然处于高温状态，故需要酶蛋白有较好的耐热性能。因此，获得耐热碱性木聚糖酶显得尤为重要。随着基因工程和蛋白质工程的发展，碱性木聚糖酶将越来越广泛的应用于造纸工业，必将成为生物技术在造纸工业应用最成功的典范。
随着人类的发展进步，对生产效率及环境保护的要求也日益提高。工业酶天然具有高效、环保的属性，符合未来工业发展的要求。从极端环境中发掘有工业化应用潜力的新菌株，获得性质优良的新酶，以及建立在结构分析基础上将其按需进行蛋白质改造，将是碱性木聚糖酶研究发展的必然趋势。
木聚糖酶在木聚糖降解过程中发挥了重要作用，它是木聚糖降解酶系中最关键、最重要的酶，也是木聚糖降解相关酶中研究最多、最有应用价值的一类酶。碱性木聚糖酶是指最适反应条件为碱性的木聚糖酶。利用碱性木聚糖酶，可实现造纸工业的清洁生产，转变传统被动滞后的先污染后治理的环境污染治理模式，从源头控制，协调造纸工业发展与生态环境之间的关系，减低对环境的不利影响。国家发改委联合工信部、国家林业局在2011年十二月发布了《造纸工业发展“十二五”规划》，明确提出限制新上项目采用元素氯漂白工艺(现有企业逐步淘汰)，企业必须完善“三废”治理设施，严格控制污染物排放。对经限期治理仍不能达标的企业或生产线要依法整顿或关停。由此可见，开发新的环境友好型的高效耐热碱性木聚糖酶产品已迫在眉睫。
由于碱性木聚糖酶在造纸工业上的特殊用途，对碱性木聚糖酶进行开发及研究显得非常重要。国际上已进行了木聚糖酶工业应用的开发，但也仅有少量公司能生产用于造纸工业的木聚糖酶，其耐碱度及耐热性仍有提高空间；国内目前尚无对耐热碱性木聚糖酶的系统性研究，也无法规模工业化生产耐热碱性木聚糖酶。因此，寻找新的具有优良性质的碱性木聚糖酶对我国造纸工业的可持续发展具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种嗜碱微球菌Micrococcus sp.S1。该嗜碱微球菌可产生一种碱性木聚糖酶。
本发明的另一目的在于提供上述嗜碱微球菌Micrococcus sp.S1产生的碱性木聚糖酶。该酶具有pH适应范围广，耐热、碱、金属离子和表面活性剂等适用于造纸等工业的优良酶学特性。
本发明的再一目的在于提供上述嗜碱微球菌及其产生的碱性木聚糖酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种嗜碱微球菌，是从深圳红树林土壤中筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株Micrococcus sp.S1。所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2014年6月27日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2014295。
菌落形态特征：在琼脂平板上的菌落直径一般为1.0～1.5微米，呈米白色，粗糙粒状，不规则圆形，突起，湿润，闪光，全缘。
所述的琼脂平板，其配方为琼脂20g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，KH2PO4 1g/L，MgCl2 0.2g/L，NaCl 50g/L，Na2CO3 10g/L，pH 9.0；
该菌株的选择培养基配方：木聚糖5～8.0g/L，KNO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 10～15g/L，KH2PO4 1.5g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH8.0～9.0；培养温度为30～37℃。
所述嗜碱微球菌Micrococcus sp.S1产生的碱性木聚糖酶，按下述方法制得：
(1)粗酶液的提取
将Micrococcus sp.S1菌种接到液体选择培养基中，于37℃、200rpm培养48h，将48h培养液以14000rpm的转速冷冻离心20min，取上清液；利用3000道尔顿超滤浓缩膜将上清液超滤浓缩，即得粗酶液，用于离子交换层析；
(2)碱性木聚糖酶的分离纯化
(a)阴离子交换层析
离子交换层析的介质为DEAE Sepharose Fast Flow；缓冲液体系采用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl pH 8.0 Tris-HCl缓冲液；取100mL介质小心灌入层析柱(规格为Φ2.6cm×30cm)中，使得凝胶均匀且无气泡；用300mL的平衡液进行平衡，直至A280稳定后上样(粗酶液)，待穿透峰出现之后收集穿透峰，透析、浓缩；
(b)阳离子交换层析
层析介质为SP Sepharose Fast Flow；缓冲液体系采用pH值为6.0的PBS缓冲液；把阴离子交换层析所得酶活峰透析浓缩，加入到预先用pH值为6.0的PBS缓冲液平衡好的层析柱上，以60mL·h-1的流速用含NaCl的pH6.0的PBS缓冲液洗脱，收集具有酶活性的洗脱峰，通过透析浓缩，得到碱性木聚糖酶，并置于4℃保存备用。
所述碱性木聚糖酶的蛋白分子量约为27KD，比活力达1412.8IU/mL；最适pH为8～10左右，在pH6～10范围内，酶活性均可保持在60％以上；最适反应温度为60～70℃左右；具有耐Co2+、Mn2+、Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Li+、Cu2+、Ag+、Al3+、Mg2+等金属离子的良好特性，但Fe3+对碱性木聚糖酶的酶活性有一定的抑制作用；SDS对碱性木聚糖酶的酶活性有部分抑制作用，但螯合剂EDTA对酶活性影响甚微。
所述嗜碱微球菌Micrococcus sp.S1及其产生的碱性木聚糖酶在造纸等工业中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明筛选得到的Micrococcus sp.S1属于耐碱的极端微生物，可在高碱性条件下(pH9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。
(2)本发明嗜碱微球菌Micrococcus sp.S1产生的碱性木聚糖酶的比活力达1412.8IU/mL；最适pH为8～10左右，在pH6～10范围内，酶活性均可保持在60％以上；最适反应温度为60～70℃左右；在65℃以下酶活性稳定。具有耐Co2+、Mn2+、Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Li+、Cu2+、Ag+、Al3+、Mg2+等金属离子的良好特性，但Fe3+对碱性木聚糖酶的酶活性有一定的抑制作用；SDS对碱性木聚糖酶的酶活性有部分抑制作用，但螯合剂EDTA对酶活性影响甚微。
附图说明
图1是Micrococcus sp.S1菌在1％刚果红平板上生长所产生的透明圈的结果图。
所述的1％刚果红平板的配方是：刚果红10g/L，木聚糖8.0g/L，KNO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0。
图2是Micrococcus sp.S1菌的菌落形态图。
图3是木聚糖标准曲线图。
图4是SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析结果图；
其中：1、pH6.00.1mol/L NaCl PBS洗脱峰；2、pH6.0 0.2mol/L NaCl PBS洗脱峰；3、pH6.0 1mol/L NaCl PBS洗脱峰。
图5是分离纯化的SDS-PAGE电泳结果图；其中：泳道M为marker，来自Fermentas公司；泳道1为粗酶液；泳道2为DEAE Sepharose Fast Flow酶活峰；泳道3为SP SepharoseFast Flow酶活峰。
图6是碱性木聚糖酶S1的最适反应pH的结果图。
图7是碱性木聚糖酶S1的最适反应温度(℃)的结果图。
图8是碱性木聚糖酶S1的pH稳定性的结果图。
图9是碱性木聚糖酶S1的温度稳定性的结果图。
图10是Micrococcus sp.S1菌基因组DNA电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL15000 Marker；泳道1为基因组DNA。
图11是碱性木聚糖酶S1S1基因保守序列PCR结果的电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL5000 Marker；泳道1和2为S1基因保守DNA序列。
图12是碱性木聚糖酶S1基因的保守DNA序列的上游PCR结果的电泳图；
其中：泳道M为takara公司的DL5000 Marker；泳道1为S1基因的保守DNA序列的上游PCR结果。
图13是碱性木聚糖酶S1基因的保守DNA序列的下游PCR结果的电泳图；
其中：泳道M为takara公司的DL5000 Marker；泳道1为S1基因的保守DNA序列的下游PCR结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1 菌株的分离培养
1、富集培养
从深圳红树林土壤中筛选得到产碱性木聚糖酶菌株。称取1g土样，加入到100mL的无菌水中，充分摇匀，制成菌悬液，分别取1mL菌悬液接入到事先灭好菌的5mL富集培养基中，37℃、200rpm富集培养48h。
富集培养基：木聚糖8.0g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，Na2HPO4·12H2O 9.0g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，pH 9.0。
2、平板初筛
将富集培养后的菌液10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10-3、10-5、10-7的菌悬液0.5mL涂布于含有木聚糖的碱性选择培养基平板，37℃培养48h，将透明圈较大的单菌落挑入碱性斜面培养基，如此反复多次，直至确定为纯菌为止，使用斜面培养基保藏原始菌种。
选择培养基：木聚糖8.0g/L，KNO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH9.0；培养温度为37℃。
斜面培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，KH2PO4 1g/L，MgCl20.2g/L，NaCl 50g/L，Na2CO3 10g/L，pH 9.0。
3、产碱性木聚糖酶菌株的筛选结果
本发明从选取的土样中，经过含木聚糖的刚果红平板筛选，发现了一个能够产生明显透明圈的菌株(如图1)。3％麦麸发酵培养基(麦麸3.0g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，Na2HPO4·12H2O 9.0g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，pH 9.0)37℃、200rpm发酵培养7天后，测量粗酶液酶活，发现其活性高达1412.8IU/mL。表明其具有较高的产酶能力。利用PCR扩增该菌株的16S rDNA序列，到GENBANK上进行比对，比对结果显示，该菌株的16SrDNA序列与其它多株微球菌的16S rDNA序列有99％的相似性，初步判断为微球菌(Micrococcus sp.)，将其命名为Micrococcus sp.S1。
该嗜碱微球菌，名称为Micrococcus sp.S1，所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2014年6月27日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2014295。其菌落形态如图2所示。
与当前工业用酶菌株相比，Micrococcus sp.S1菌属于耐碱的极端微生物，可在高碱性条件下(pH9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。
Micrococcus sp.S1菌株的16S rDNA序列如下：全长1402bp
CTTCGACGGCTCCCCCACAAGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGGGATTAGCTCCACCTCACAGTATCGCAACCCATTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCCATGAGTCCCCACCATTACGTGCTGGCAACATGGAACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTGATCCCGCCCCAAAGGGGAAACCGTATCTCTACGGCGATCGAGAACATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTGCGGCGCGGAAACCGTGGAATGGTCCCCACACCTAGTGCCCAACGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCATGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTCCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTACTGCACTCTAGTCTGCCCGTACCCACCGCAGATCCGGGGTTAAGCCCCGGACTTTCACGACAGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTACTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGTCCATCCATGACCGATAAATCTTTCCAACACCCACCATGCGGTGGACGTTCCTATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAGGCTTATCCCAGAGTCAAGGGCAGGTTACTCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCACCCAGCAAGCTGGGCTTCATCGTTCGACTGCATGTGTAAG。
实施例2 嗜碱微球菌Micrococcus sp.S1产生的碱性木聚糖酶的分离纯化
(一)材料
1、菌种
嗜碱微球菌，是从深圳红树林土壤中筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株Micrococcus sp.S1(CCTCC NO:M 2014295)。
2、培养基
选择培养基：木聚糖8.0g/L，KNO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH9.0；培养温度为37℃。
3、主要试剂
离子交换层析介质DEAE Sepharose Fast Flow，SP-sepharose Fast Flow阳离子交换层析介质均购自GE公司。Acrylamide(丙烯酰胺)、N,N-甲叉双丙烯酰胺由Serva进口分装。DNA聚合酶、DNA分子量标记为宝生物公司产品；蛋白分子量标记为Fermentas(MBI)公司产品；乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、盐酸胍、甘氨酸、Triton X-100等其余试剂均为国产分析纯。PCR引物合成由上海生工完成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成；基因提取试剂盒为Oemga公司产品。
4、仪器
Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies公司、DNA及蛋白电泳系统为Bio-rad公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品；Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。
(二)实验方法
1、粗酶液的提取
将Micrococcus sp.S1菌种接到液体选择培养基中，于37℃、200rpm培养48h，将48h培养液以14000rpm的转速冷冻离心20min，取上清液；利用3000道尔顿超滤浓缩膜将上清液超滤浓缩，即得粗酶液，用于离子交换层析；
2、酶活测定方法
取1mL pH＝9的Tris-HCl缓冲液制备1％的木聚糖溶液，加入100μL经适当稀释的上述酶液，在40℃下振荡反应15min，终止反应后，迅速加1mL DNS(3,5-二硝基水杨酸)溶液沸水浴10min，然后加2mL去离子水，于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每分钟由底物产生1μmol木聚糖所需的酶量定义为一个酶活力国际单位，用IU/mL表示。
3、木聚糖标准曲线
准确称取无水木聚糖1g定容至100mL，然后分别取1％标准木聚糖液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5mL定容至100mL，再分别取上述不同浓度溶液各1.1mL于试管中(另设一管取1.1mL蒸馏水作对照)，各加1mL DNS，煮沸显色10min，冷却后测540nm处的吸光度(测3次取平均值)。以吸光度为纵坐标，对应标准木聚糖溶液含糖量为横坐标，绘制标准曲线(如图3)。
4、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
按常规方法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％，电极缓冲液为pH8.3Tris-Gly缓冲液，考马斯亮蓝染色。
5、碱性木聚糖酶的分离纯化
(a)阴离子交换层析
离子交换层析的介质为DEAE Sepharose Fast Flow；缓冲液体系采用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl pH 8.0 Tris-HCl缓冲液；取100mL DEAE Sepharose Fast Flow(GE)小心灌入规格为Φ2.6cm×30cm的层析柱(GE)中，使得凝胶均匀且无气泡；用300mL的平衡液进行平衡，直至A280稳定后上样(粗酶液)，待穿透峰出现之后收集穿透峰，透析、浓缩。
(b)阳离子交换层析
层析介质为SP Sepharose Fast Flow；缓冲液体系采用pH值为6.0的PBS缓冲液；把阴离子交换层析所得酶活峰透析浓缩，加入到预先用pH值为6.0的PBS缓冲液平衡好的层析柱上，以60mL·h-1的流速用含NaCl的pH6.0的PBS缓冲液洗脱，收集具有酶活性的洗脱峰，通过透析浓缩，得到碱性木聚糖酶纯酶液，并置于4℃保存备用。
(三)实验结果
1、阴离子交换层析
将适量的粗酶液加到预先用pH8.0 Tris-HCl缓冲液充分平衡的DEAE-SepharoseFast Flow层析柱，收集穿透峰进行酶活性检测，由于碱性木聚糖酶未能被DEAE-SepharoseFast Flow层析柱吸附，直接穿透出来。其余部分杂质被吸附在层析柱上，达到初步纯化的目的。将此酶活峰收集、合并、透析、浓缩后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测，结果如图5电泳图的泳道2。由图5电泳图的泳道2可见一条明显的蛋白条带，而其它杂带相对较暗。
2、阳离子交换层析
层析介质为SP Sepharose Fast Flow。缓冲液体系采用pH值为6.0的PBS缓冲液。把阴离子交换层析所得酶活峰透析后适当浓缩，取适量加入到预先用pH值为6.0的PBS缓冲液平衡好的层析柱上(见图4)，待穿透峰完全流平后，以60mL·h-1的流速用含0.1mol/LNaCl的pH6.0的PBS缓冲液洗脱，收集流出峰。流出峰平稳后，再用0.2mol/L NaCl的pH6.0的PBS缓冲液洗脱，收集流出峰，最后用1mol/L NaCl的pH6.0的PBS缓冲液洗脱，收集流出峰。将收集到流出峰逐一测定酶活，发现0.2mol/L NaCl的pH6.0的PBS缓冲液洗脱峰为酶活峰。取适量进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图5所示的泳道3，泳道3可见一道明显目的蛋白条带，基本达到分离纯化要求。
用SDS-PAGE电泳法测定，结果如图5所示，电泳后用GelDoc2000(Bio-Rad)进行凝胶扫描。运用扫描系统自带软件Quantity One进行分子量测定，测得碱性木聚糖酶的蛋白分子量约为27KD。
实施例3 碱性木聚糖酶的酶学性质研究
(一)试验方法
1、最适反应pH及pH稳定性
取适量实施例2获得的碱性木聚糖酶的纯酶液，分别加入不同pH值的1％木聚糖溶液，按常规方法测定酶活力。同时，分别将纯酶液置于不同的预定pH条件下保存30min，再按常规方法于pH 9.0条件下测定其酶活力。
2、最适反应温度和温度稳定性研究
取适量实施例2获得的碱性木聚糖酶的纯酶液分别置于不同温度条件下反应20min，测定其酶活力。同时，将纯酶液分别置于不同的温度条件下(30℃～80℃)保温10min，然后于40℃反应20min测定其酶活力。
3、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
取适量实施例2获得的碱性木聚糖酶的纯酶液分别置于终浓度为10mM的各种金属离子以及0.05％EDTA，0.01％SDS(十二烷基磺酸钠)中，30℃保存10min后按照常规方法测定其酶活力。
(二)实验结果
1、最适反应pH
取适量纯酶液，分别加入不同pH值的1％木聚糖溶液，按常规方法测定酶活力，结果如图6所示。由图6可见，S1酶的最适pH为9左右，为一典型的碱性木聚糖酶。
2、最适反应温度
将纯酶液分别置于不同温度条件下反应20min，测定其酶活力，结果如图7。由图7可见，S1酶的最适反应温度为65℃。
3、pH稳定性
为研究S1蛋白的pH稳定性，分别将纯酶液置于不同的预定pH条件下保存30min，再按常规方法于pH 9.0条件下测定其酶活力。结果(如图8)表明，该酶在pH 6～10的范围内，酶活性可保持60％以上。可见该碱性木聚糖酶酶在弱酸和中碱性条件下均具较强的稳定性。
4、温度稳定性研究
将纯酶液分别置于不同的温度条件下(30℃～80℃)保温30min，然后于40℃反应20min测定其酶活力。结果(如图9)表明，该酶65℃以下具有较好稳定性，表明S1酶蛋白为优良的耐热性碱性木聚糖酶，在生产应用方面显示了良好的应用前景。
5、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
把纯化得到的S1酶蛋白分别置于终浓度为10mM的各种金属离子，质量百分比0.05％EDTA和0.01％SDS中，30℃保存10min后按照常规方法测定其酶活力，结果如表1所示。结果表明，S1酶蛋白在10mM Co2+、Mn2+、Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Li+、Cu2+、Ag+、Al3+、Mg2+等金属离子中的酶活均保持在80％以上，具有耐多种金属离子的良好特性，但Fe3+对酶活有一定的抑制作用。SDS对S1酶活性有部分抑制作用，但螯合剂EDTA对酶活性影响甚微。可见，S1酶具有耐多种金属离子和表面活性剂的优良特性，符合造纸等工业用酶的基本要求。
表1 金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
化学试剂 相对酶活(％)
对照 100±5.35
108.16±4.34
100±2.38
85.6±3.64
23.14±2.52
109.25±2.27
147.09±1.67
80.94±3.81
132.53±2.98
107.25±2.11
133.87±2.34
106.13±3.42
112.97±2.26
105.40±2.45
0.05％EDTA 94.54±3.44
0.01％SDS 23.34±1.45
实施例4
(一)材料
1、菌种
嗜碱微球菌，是从深圳红树林土壤中筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株Micrococcus sp.S1(CCTCC NO:M 2014295)。E.coli TOP10F′购自Invitrogen公司；
2、载体。大肠杆菌克隆载体pMD18-T购自大连宝生物公司，大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(Novagen，KanR)购自Novagen公司。
3、培养基
(1)选择培养基：木聚糖8.0g/L，KNO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0；
(2)LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0，121℃高压灭菌20min。
4、主要试剂
DNA聚合酶、DNA分子量标记为宝生物公司产品；Lysozyme(DNase RNase non-detected，>70,000U/mg)、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)为上海生工生物工程公司产品。PCR引物合成由上海生工完成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成；基因提取试剂盒、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Oemga公司产品。
5、仪器
Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies公司、DNA电泳系统为Bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为Pharmacia Biotech公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品；Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。
(二)实验方法和结果
1、基因组DNA的提取
在37℃、200r/min摇瓶培养Micrococcus sp.S1菌，48h后离心收集菌体，然后利用The E.Z.N.A Bacterial DNA Kit试剂盒提取基因组总DNA。其基本步骤如下：
(a)培养基接种Micrococcus sp.S1菌，放入温控摇床中，于37℃，200rpm摇瓶培养36h后取出分装备用。
(b)将3mL Micrococcus sp.S1菌液在室温条件下8000rpm离心10min；
(c)弃去上清液，保留沉淀，然后加入180μL TE buffer重悬菌体，再加入20μL50mg/mL溶菌酶溶液30℃条件下水浴10min；
(d)水浴完成后在室温条件下8000rpm离心5min，去掉上清，加入200μL BTLbuffer，短暂涡旋；
(e)加入25～40mg玻璃珠，高速涡旋5min；
(f)加入25μL蛋白酶K溶液，短暂涡旋，然后55℃水浴60min；
(g)加入5μL RNaseA溶液，反复颠倒，然后室温放置5min；
(h)室温条件下12000rpm离心5min，吸取上清到另外一个干净的离心管中，避免吸到沉淀；
(i)加入220μL BDL buffer，短暂涡旋，然后65℃水浴10min；
(j)加入220μL无水乙醇，高速涡旋20s，然后将混合液转移到套有2.0mL收集管的Akibaiin Column中，12000rpm离心1min；
(k)弃去收集管中的液体，加入500μL的HB buffer，然后10000rpm离心1min；
(l)弃去收集管中的液体，加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min；
(m)重复加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min；
(n)弃去收集管中的液体，再用12000rpm离心2min以除尽剩余的Wash buffer；
(h)将Akibaiin Column放入一个洁净的EP管中，然后在Akibaiin Column膜的中央处加入50～100μL的Elution Buffer，室温放置2min，10000rpm离心1min将DNA抽提下来。
采用1％琼脂糖凝胶电泳对提取产物进行检测。结果如图10所示，能看到一条较为明显的条带，所用DNA Ladder Marker最大条带为15,000bp，基因组条带在Marker最大条带之上，说明其大小超过15,000bp，符合基因组大小要求。
2、TouchDown PCR克隆木聚糖酶基因保守序列
(1)使用PrimerPremier 5.0软件设计上下游引物。根据已知的11家族木聚糖酶保守序列设计上游引物(GCTACCTGKCNNTNTAYGGNTGG)和下游引物(GACCAGTAYTGNKIRAANGT)，送去合成。
(2)使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：
然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：
采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。结果如图11所示。在泳道1、2中，有一条大小约为200bp的条带，符合已知的11家族木聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行回收。
3、Touchdown PCR产物回收
PCR产物回收使用的是Omega公司生产的Gel Extraction Kit(100)D2500-01，主要步骤如下：
(1)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率，之后放入EP管中。(注意切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤)
(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤(3)的胶块融化时间，提高DNA的回收率。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μL进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液Binding Buffer。
(3)50℃溶解7～15min，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。
(4)将溶胶放入层析柱中(不超过700μL)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(5)加入300μL的Binding Buffer，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(6)加入700μL的SPW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(7)重复步骤(6)。
(8)将空柱13,000rpm离心2min，以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续DNA的回收。
(9)弃掉收集管，换成干净的EP管，往吸附柱正中间的吸附膜小心加入15μLElution Buffer，室温静置3min，13,000rpm离心2min，不立即用的话保存于-20℃冰箱中。
4、感受态细胞制备
感受态细胞的制备使用TaKaRa公司的Competent Cell Prepatation Kit试剂盒制备，步骤如下：
(1)用接种针挑取大肠杆菌在含氨苄青霉素(AMP，终浓度为100μg/mL)的LB固体培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜，37℃过夜培养。
(2)挑取菌落置于含20mL液体LB培养基的三角烧瓶中，37℃、220rpm培养。
(3)测定OD值，当OD600值达到0.35～0.5时，放置冰中停止培养，若OD值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率。
(4)取1mL上述菌液于1.5mL EP管中，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。
(5)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的Solution A，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。
(6)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的Solution B，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。感受态细胞制备完成，若不立即使用，置于-80℃保存。
5、Touchdown PCR产物的连接、转化和测序
(1)从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，冰中使其解冻。
(2)将4.5μL回收的PCR产物、1.5μL pMD18-T(Simple Vector)和4μL Solution I转化酶(TaKaRa公司生产)加入100μL感受态细胞中混匀，16℃水浴连接3h。
(3)加入连接后的重组DNA溶液轻轻摇匀，冰上放置30min。
(4)42℃水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。
(5)向管中加入1mL LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，以表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。
(6)取1mL上述菌液6,000rpm离心5min，去除约1mL上清，剩下的混匀。取100μL涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。
(5)用接种环挑选长出的单菌落放于1mL LB培养基(加入1μL氨苄青霉素，终浓度为100μg/mL)中，37℃、250rpm摇菌直至菌液变浑浊(4～10h)，每组选取1个送去测序。
测序得到Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下：
(a)核苷酸序列如SEQ ID No：2所示(193bp)。
(b)NCBI核苷酸序列比对结果
将该核苷酸序列在NCBI数据库上进行比对(BLAST)，发现该保守序列与同为11家族的木聚糖酶(Micrococcus thermoviolaceus stxII,stxIII genes for xylanase II)具有88％的较高相似性，可推断克隆的保守序列所在的基因属于11家族木聚糖酶基因。
6、TAIL-PCR克隆木聚糖酶基因保守序列的上下游基因
(1)TAIL-PCR是为了得到Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列上游和下游的基因，使用PrimerPremier 5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据Touchdown PCR产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性引物(Upstream primer，简称USP)和下游特异性引物(Downstream primer，简称DSP)各有3个嵌套的引物用于TAIL-PCR的三轮反应。同时设计出7对随机引物(Arbitrary degenerateprimer，简称AD)。保守序列和引物序列见表2。引物送去合成后，即可进行下一步实验。
表2 Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列及用于TAIL-PCR的引物
(2)TAIL-PCR克隆上游基因
使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：
然后按照以下条件进行第一轮TAIL-PCR反应：
第二轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第一轮反应的PCR产物用ddH2O稀释100倍后作为模板DNA，USP1换为USP2，反应条件如下：
第三轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的PCR产物用ddH2O稀释100倍后作为模板DNA，USP2换为USP3，反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。
通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物AD3进行TAIL-PCR，克隆出Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列的上游基因，其PCR产物电泳图如图12所示。从图12中可以看出，经过3轮PCR，此时出现的明显条带只有一条，大小约为600bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。
经过测序，Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如下(344bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
(3)TAIL-PCR克隆下游基因
反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性引物。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。
通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物AD3进行TAIL-PCR，克隆出Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列的下游基因，其PCR产物电泳图如图13所示。从图13中可以看出，经过3轮PCR，此时出现的明显条带只有一条，大小约为339bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列下游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。
经过测序，Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如下(339bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
7、获得Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因全长序列
根据TAIL-PCR克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到Micrococcus sp.S1木聚糖酶完整的酶基因序列。其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
碱性木聚糖酶基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括609个核苷酸。其中，前21个核苷酸为信号肽编码序列。
碱性木聚糖酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示。
经DNAssist Version 2.2软件分析得到，碱性木聚糖酶基因开放阅读框编码202个氨基酸，其中，前9个氨基酸为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Ala9位点被切除。因此，成熟的酶蛋白，共计191个氨基酸，其理论分子量(MWt)为27kD，与分离得到的天然酶蛋白分子量一致；酶蛋白的等电点(pI)8.84。
将该氨基酸序列在NCBI数据库进行比对(BLAST)，发现该氨基酸序列与同为11家族的木聚糖酶(Thermobifida halotolerans)具有最高的同源性，其相似性仅为79％，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的木聚糖酶基因。
根据序列分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面的差异判断，碱性木聚糖酶基因为一新发现的内切β-1,4-木聚糖酶基因。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种嗜碱微球菌，其特征在于：名称为嗜碱微球菌(Micrococcus sp.)S1，于2014年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014295。
2.根据权利要求1所述的嗜碱微球菌，其特征在于：用于培养权利要求1所述的嗜碱微球菌的液体选择培养基的配方为：木聚糖5～8.0g/L，KNO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 10～15g/L，KH2PO4 1.5g/L，pH8.0～9.0。
3.根据权利要求2所述的嗜碱微球菌，其特征在于：所述的液体选择培养基的配方为：木聚糖8.0g/L，KNO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，pH9.0。
4.一种碱性木聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述的碱性木聚糖酶按下述方法制得：
(1)粗酶液的提取
将权利要求1所述的嗜碱微球菌S1菌种接到液体选择培养基中，于37℃、200rpm培养48h，将48h培养液以14000rpm的转速冷冻离心20min，取上清液；利用3000道尔顿超滤浓缩膜将上清液超滤浓缩，即得粗酶液，用于离子交换层析；
(2)碱性木聚糖酶的分离纯化
(a)阴离子交换层析
离子交换层析的介质为DEAE Sepharose Fast Flow；缓冲液体系采用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为pH 8.0Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl pH8.0Tris-HCl缓冲液；取100mL介质小心灌入规格为Φ2.6cm×30cm的层析柱中，使得凝胶均匀且无气泡；用300mL的平衡液进行平衡，直至A280稳定后上样，待穿透峰出现之后收集穿透峰，透析、浓缩；
(b)阳离子交换层析
层析介质为SP Sepharose Fast Flow；缓冲液体系采用pH值为6.0的PBS缓冲液；把阴离子交换层析所得酶活峰透析浓缩，加入到预先用pH值为6.0的PBS缓冲液平衡好的层析柱上，以60mL·h-1的流速用含NaCl的pH6.0的PBS缓冲液洗脱，收集具有酶活性的洗脱峰，通过透析浓缩，得到碱性木聚糖酶，并置于4℃保存备用。
5.权利要求1所述的嗜碱微球菌在造纸工业中的应用。
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