CN104673771B

CN104673771B - 一种中性内切葡聚糖酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN104673771B
Application number: CN201510036517.0A
Authority: CN
Inventors: 刘森林; 区晓阳; 邢苗; 陈伟钊
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2035-01-23
Also published as: CN104673771A

Abstract

本发明公开一种中性内切葡聚糖酶及其编码基因与应用。该H31基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAG结束，共包括762个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。上述中性内切葡聚糖酶H31基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。本发明还公开了上述中性内切葡聚糖酶H31在洗涤及造纸等工业中的应用。

Description

一种中性内切葡聚糖酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种中性内切葡聚糖酶及其编码基因与应用。

背景技术

纤维素是植物纤维的主要成分，约占其干重的30～50％，是目前分布最广的天然碳水化合物，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。随着世界人口的激增、全球经济的飞速发展、粮食的短缺和石油、煤炭和天然气等不可再生资源正以惊人的速度减少，可再生纤维素资源的开发利用已引起全世界的普遍关注，成为世界各国研究的重大课题。纤维素酶的研究为此开辟了一条广阔的途径，特别是近10年来，随着现代生物技术迅速发展，基因重组技术及其一系列分子生物学技术的应用，使这一领域的研究更为深入，并在应用上将显示出其潜在的价值。

纤维素酶(cellulase)是降解天然纤维素生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。所以，纤维素酶不是单一成分的酶，而是一组酶系的总称。目前根据其催化功能的不同，普遍认为纤维素酶可分为由三类不同水解功能的酶组成：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶。

I、内切型葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D glucanase，EC3.2.1.4，简称EBG)，也称Cx酶、CMC酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性术端的小分子纤维素；

II、外切型葡萄糖苷酶(exo-1,4-β-D glucanase，EC3.2.1.91)，也称C1酶、微品纤维素酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，简称CBH)，这类酶从纤维长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；

III、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG)又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。

纤维素的降解必须依靠三种组分的协同作用才能完成。外切β-葡聚糖苷酶从纤维索的非还原多聚体末端水解1,4-β-糖苷键，将天然纤维素分解为直链纤维素，使其转变成水合非结晶纤维素；内切β-葡聚糖苷酶则水解纤维素的内在糖苷键，将直链纤维素内部切断，分解为纤维二糖和纤维寡糖；而β-葡萄糖苷酶则将纤维二糖分解成两个葡萄糖单位。

内切葡聚糖酶可以分为三种类型：酸性内切葡聚糖酶(最适pH3～5)、中性内切葡聚糖酶(最适pH6～8)和碱性内切葡聚糖酶(最适pH8～10)。酸性纤维素酶主要用于棉及其混纺织物的生物抛光整理上。而中性纤维素酶主要用于牛仔布及其服装的洗旧石磨处理上。碱性纤维素酶主要家用洗涤剂中，可增强洗涤剂的去污能力，经常使用还可改善织物的表面特性。

酸性内切葡聚糖酶主要由丝状真菌产生，其产生菌主要包括里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉等。酸性内切葡聚糖酶研究再早，但随着工业应用范围的不断扩展和应用研究的不断深入，酸性葡聚糖酶也显现出诸多不足。如中碱性条件下酶活性较低或根本没有活性、稳定性差、pH值食用范围窄，而且在酸性条件下处理纺织品后会产生褪色现象等，这极大限制了内切葡聚糖酶在碱性洗涤剂、纺织品酶洗整理等工业中的应用。因此，寻找新型、高效、稳定和pH值适应范围更广的内切葡聚糖酶意义重大。

由细菌产生的内切葡聚糖酶主要是中性和碱性内切葡聚糖酶，在中性和碱性条件下均具有一定的酶活性及稳定性。与真菌产生的酸性内切葡聚糖酶相比，由细菌产生的中性和碱性内切葡聚糖酶具有其共同而独特的优越性：(1)pH值适应范围广，一般在pH值6-10之间均具有较高的酶活性；(2)稳定性好，可以耐受60℃的高温；(3)酶成分单一，主要酶活性成分为内切葡聚糖酶，便于工业应用；(4)可用细菌发酵生产，发酵周期短；(5)可以承受很高的pH值，作为洗涤用酶可使衣物经过多次洗涤后手感、外观等保持鲜艳；(6)可以在中性环境中处理纺织品，不会造成纺织品褪色等。可见，对于条件要求甚高的洗涤和纺织工业用酶，细菌产中性纤维素酶有比传统酸性纤维素酶更好的优越性。因此，寻找新的具有优良性质的中性纤维素酶对我国造纸工业的可持续发展具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种中性内切葡聚糖酶H31基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本发明根据内切葡聚糖酶保守序列设计简并引物，用PCR的方法成功克隆出中性内切葡聚糖酶基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述含信号肽编码序列的H31基因的表达载体。

本发明的另一目的在于提供含有上述含信号肽编码序列的H31基因的大肠杆菌菌株。

本发明的再一目的在于提供上述重组碱性木聚糖酶H31的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种中性内切葡聚糖酶H31基因，所述的H31基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示：

ATGCTCCTCGCCGCCGCCACTCCCGCCCGGGCGGACACCACGATCTGCGAGCCCTTCGGGTCGACCGTGATCCAGGGCCGCTACGTCGTCCAGAACAACCGCTGGGGCACCGGCGCCCCCCAGTGCGTCACCGCGACGGACACCGGCTTCCGGGTCATCCAGGCCGACGGCTCGGTGCCCACCGACGGCGCTCCCAAGTCGTACCCGTCGGTCTTCAACGGCTGCCACTACACCAACTGTTCGCCCGGGACCAGGCTCCCCGCACGGATCAGCACCATCTCCAGCGCGCCCAGCAGCATCTCCTACGGCTACGTGCCGGGCGGTGTGTACAACGCCGCGTACGACATCTGGCTGGACCCGACGCCCCGCACCGACGGTGTCAACCGGACCGAGATCATGATCTGGTTCAACCGGGTCGGCCCGGTCCAGCCGATCGGCTCTCCGGTCGCCACCGCAACCGTCGGTGGGCGCACCTGGGAGGTGTGGACGGGCAGCAACGGCACCAACGACGTGATCTCCTTCGTCGCCCCGTCGACCATCACGAGCTGGAGCTTCGACGTCATGGACTTCGTCGACCAGGCCGTCAACCGGGGCCTGGCGCAGCGCGACTGGTACCTGACGAGCGTTCAGGCCGGCTTCGAACCGTGGCGGGACGGCGTCGGACTGGCGGTGCACTCCTTCTCCTCCACCGTGAACGTCGGCGGTGACCCCGGCGGGCCGGGCGGGCCGGGTGCCCCGGCGCCCGCCTGCCAGGTGGTGTAG。

所述中性内切葡聚糖酶H31基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAG结束，共包括762个核苷酸。其中，前33个核苷酸为信号肽编码序列(ATGCTCCTCGCCGCCGCCACTCCCGCCCGGGCG)。

上述中性内切葡聚糖酶H31基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示：

MLLAAATPARADTTICEPFGSTVIQGRYVVQNNRWGTGAPQCVTATDTGFRVIQADGSVPTDGAPKSYPSVFNGCHY TNCSPGTRLPARISTISSAPSSISYGYVPGGVYNAAYDIWLDPTPRTDGVNRTEIMIWFNRVGPVQPIGSPVATATV GGRTWEVWTGSNGTNDVISFVAPSTITSWSFDVMDFVDQAVNRGLAQRDWYLTSVQAGFEPWRDGVGLAVHSFSSTV NVGGDPGGPGGPGAPAPACQVV-。

中性内切葡聚糖酶H31基因开放阅读框编码253个氨基酸，其中，MLLAAATPARA(前11个氨基酸)为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Ala¹¹位点被切除。因此，成熟的酶蛋白从第十二个氨基酸(Asp¹²)开始(用下划线表示)，共计242个氨基酸，其理论分子量(MWt)为25.51kD，酶蛋白的理论等电点(pI)为4.84。

一种含有上述中性内切葡聚糖酶H31基因的表达载体。

所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。

本发明的中性内切葡聚糖酶H31基因被插入至pET-28a(+)载体中。

本发明的中性内切葡聚糖酶H31基因被插入至pET-28a(+)载体中的EcoR I和HindIII酶切位点之间；

含有本发明的中性内切葡聚糖酶H31基因的大肠杆菌菌株。

所述的大肠杆菌菌株含有本发明的表达载体。

一株表达中性内切葡聚糖酶H31的菌株，是将上述中性内切葡聚糖酶H31基因序列构建成载体后转染到大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21 Star(DE3)得到。

一株表达中性内切葡聚糖酶H31的菌株的制备方法，包括如下步骤：

用PCR方法从Streptomyces sp.H31(CCTCC No：M 2015003)的基因组DNA中克隆出上述中性内切葡聚糖酶H31基因的酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a-H31，并转化大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)菌株；经过筛选后得到表达所述的中性内切葡聚糖酶H31的菌株E.coli BL21 Star(DE3)-H31；

所述的PCR的所用的引物的序列：

上游引物：5′-CCGGAATTCATGCTCCTCGCCGCCGCCACTC-3′；(下划线的序列表示的是EcoR I酶切位点)

下游引物：5′-CCCAAGCTTCTACACCACCTGGCAGGCGGGCG-3′；(下划线的序列表示的是Hind III酶切位点)

所述的PCR的反应体系为：

使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以Streptomyces sp.H31的基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：

ddH₂O 17.25μL；10×LA PCR Buffer Ⅱ 2.5μL；dNTP Mixture 2μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；模板2μL；LA Taq酶0.25μL；Total 25μL/Sample(样品)。

所述的PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s,55℃30s，72℃60s，30个Cycles；72℃7min；25℃保持。

所述的中性内切葡聚糖酶H31在洗涤及造纸等工业中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面与己知蛋白的差异判断，中性内切葡聚糖酶基因为一新发现的内切β-1,4-内切葡聚糖酶基因。

附图说明

图1是Streptomyces sp.H31基因组DNA电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL15000Marker；泳道1为基因组DNA。

图2是中性内切葡聚糖酶H31基因的保守序列PCR结果的电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL5000 Marker；泳道1为H31基因保守DNA序列。

图3是中性内切葡聚糖酶H31基因的保守序列的上游基因的PCR结果的电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL2000 Marker；泳道1、2分别为H31基因的保守序列的上游基因的AD1第2、3轮PCR结果；泳道3、4分别为H31基因的保守序列的上游基因的AD2第2、3轮PCR结果；泳道5、6分别为H31基因的保守序列的上游基因的AD3第2、3轮PCR结果；泳道7、8分别为H31基因的保守序列的上游基因的AD4第2、3轮PCR结果。

图4是中性内切葡聚糖酶H31基因的保守序列的下游基因的PCR结果的电泳图；其中，泳道M为takara公司的DL2000 Marker；泳道1、2分别为H31基因的保守序列的下游基因的AD1第2、3轮PCR结果；泳道3、4分别为H31基因的保守序列的下游基因的AD2第2、3轮PCR结果；泳道5、6分别为H31基因的保守序列的下游基因的AD3第2、3轮PCR结果；泳道7、8分别为H31基因的保守序列的下游基因的AD4第2、3轮PCR结果。

图5是中性内切葡聚糖酶H31基因的PCR结果的电泳图；其中，泳道M为takara公司的DL2000 Marker；泳道1和2为H31基因的PCR结果。

图6是重组质粒pET-28a-H31双酶切验证的结果图；其中，泳道M为takara公司的DL15000 Marker；泳道1为单酶切；泳道2为双酶切。

图7是重组中性内切葡聚糖酶H31蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道M为Marker，fermentas公司protein ladder；泳道1为无IPTG诱导；泳道2为1mM IPTG诱导后的粗酶液；泳道3为镍柱纯化蛋白。

图8是重组中性内切葡聚糖酶H31蛋白的最适反应pH的结果图。

图9是重组中性内切葡聚糖酶H31蛋白的pH稳定性的结果图。

图10是重组中性内切葡聚糖酶H31蛋白的最适反应温度(℃)的结果图。

图11是重组中性内切葡聚糖酶H31蛋白的温度稳定性的结果图。

图12是不同金属离子对重组中性内切葡聚糖酶H31蛋白的影响的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1

(一)材料

1、菌种。嗜碱链霉菌，是从深圳红树林土壤中筛选得到的产中性内切葡聚糖酶菌株Streptomyces sp.H31。所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间：2015年1月5日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2015003。E.coli TOP10F′购自Invitrogen公司；

2、载体。大肠杆菌克隆载体pMD-19T(simple)购自大连宝生物公司，大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(Novagen，KanR)购自Novagen公司。

3、培养基

(1)选择培养基：10g/L CMC-Na(羧甲基纤维素钠)，5g/L酵母粉，5g/L NaCl，2g/LKH₂PO₄，5g/L NH₄NO₃，0.3g/L MgSO₄，1g/L(NH₄)₂SO₄，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH9.0；培养温度为37℃。

(2)LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0，121℃高压灭菌20min。

4、主要试剂。DNA聚合酶、DNA分子量标记为宝生物公司产品；Lysozyme(DNaseRNase non-detected，>70,000U/mg)、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)为上海生工生物工程公司产品。PCR引物合成由上海生工完成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成；基因提取试剂盒、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Oemga公司产品。

5、仪器。Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies公司、DNA电泳系统为Bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为PharmaciaBiotech公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品；Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。

(二)实验方法和结果

1、基因组DNA的提取

在37℃、200r/min摇瓶培养Streptomyces sp.H31菌，48h后离心收集菌体，然后利用The E.Z.N.A Bacterial DNA Kit试剂盒提取基因组总DNA。其基本步骤如下：

(a)培养基接种Streptomyces sp.H31菌，放入温控摇床中，于37℃，200rpm摇瓶培养36h后取出分装备用。(b)将3mL Streptomyces sp.H31菌液在室温条件下8000rpm离心10min；(c)弃去上清液，保留沉淀，然后加入180μL TE buffer重悬菌体，再加入20μL 50mg/mL溶菌酶溶液30℃条件下水浴10min；(d)水浴完成后在室温条件下8000rpm离心5min，去掉上清，加入200μL BTL buffer，短暂涡旋；(e)加入25～40mg玻璃珠，高速涡旋5min；(f)加入25μL蛋白酶K溶液，短暂涡旋，然后55℃水浴60min；(g)加入5μL RNaseA溶液，反复颠倒，然后室温放置5min；(h)室温条件下12000rpm离心5min，吸取上清到另外一个干净的离心管中，避免吸到沉淀；(i)加入220μL BDL buffer，短暂涡旋，然后65℃水浴10min；(j)加入220μL无水乙醇，高速涡旋20s，然后将混合液转移到套有2.0mL收集管的Akibaiin Column中，12000rpm离心1min；(k)弃去收集管中的液体，加入500μL的HB buffer，然后10000rpm离心1min；(l)弃去收集管中的液体，加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min；(m)重复加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min；(n)弃去收集管中的液体，再用12000rpm离心2min以除尽剩余的Wash buffer；(h)将Akibaiin Column放入一个洁净的EP管中，然后在Akibaiin Column膜的中央处加入50～100μL的Elution Buffer，室温放置2min，10000rpm离心1min将DNA抽提下来。

采用1％琼脂糖凝胶电泳对提取产物进行检测。结果如图1所示，能看到一条较为明显的条带，所用DNA Ladder Marker最大条带为15,000bp，基因组条带在Marker最大条带之上，说明其大小超过15,000bp，符合基因组大小要求。

2、TouchDown PCR克隆内切葡聚糖酶基因保守序列

(1)使用PrimerPremier 5.0软件设计上下游引物。根据已知的链霉菌属内切葡聚糖酶保守序列设计上游引物(TNCARAAYAAYMGNTGGGG)和下游引物(CCANGGYTCRAANCCNGCYTG)，送去合成。

(2)使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：

然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：

采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。结果如图2所示。在泳道1中，有一条大小约为560bp的条带，符合已知的12家族的内切葡聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行回收。

3、Touchdown PCR产物回收

PCR产物回收使用的是Omega公司生产的Gel Extraction Kit(100)D2500-01，主要步骤如下：(1)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率，之后放入EP管中。(注意切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤)。(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤(3)的胶块融化时间，提高DNA的回收率。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μL进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液BindingBuffer。(3)50℃溶解7～15min，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。(4)将溶胶放入层析柱中(不超过700μL)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。(5)加入300μL的Binding Buffer，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。(6)加入700μL的SPW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。(7)重复步骤(6)。(8)将空柱13,000rpm离心2min，以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续DNA的回收。(9)弃掉收集管，换成干净的EP管，往吸附柱正中间的吸附膜小心加入15μL Elution Buffer，室温静置3min，13,000rpm离心2min，不立即用的话保存于-20℃冰箱中。

4、感受态细胞制备

感受态细胞的制备使用TaKaRa公司的Competent Cell Prepatation Kit试剂盒制备，步骤如下：(1)用接种针挑取大肠杆菌在含氨苄青霉素(AMP，终浓度为100μg/mL)的LB固体培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜，37℃过夜培养。(2)挑取菌落置于含20mL液体LB培养基的三角烧瓶中，37℃、220rpm培养。(3)测定OD值，当OD600值达到0.35～0.5时，放置冰中停止培养，若OD值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率。(4)取1mL上述菌液于1.5mL EP管中，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。(5)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的Solution A，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。(6)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的SolutionB，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。感受态细胞制备完成，若不立即使用，置于-80℃保存。

5、Touchdown PCR产物的连接、转化和测序

(1)从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，冰中使其解冻。(2)将4.5μL回收的PCR产物、1.5μL pMD18-T(Simple Vector)和4μL Solution I转化酶(TaKaRa公司生产)加入100μL感受态细胞中混匀，16℃水浴连接3h。(3)加入连接后的重组DNA溶液轻轻摇匀，冰上放置30min。(4)42℃水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。(5)向管中加入1mLLB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，以表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp)。(6)取1mL上述菌液6,000rpm离心5min，去除约1mL上清，剩下的混匀。取100μL涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。(7)用接种环挑选长出的单菌落放于1mL LB培养基(加入1μL氨苄青霉素，终浓度为100μg/mL)中，37℃、250rpm摇菌直至菌液变浑浊(4～10h)，每组选取1个送去测序。

测序得到Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下：

(a)核苷酸序列如SEQ ID No：3所示(569bp)。

(b)编码的氨基酸(189个)：如SEQ ID No：10所示。

(c)NCBI氨基酸序列比对结果

将该氨基酸序列在NCBI数据库上进行比对(BLAST)，发现该保守序列与1,4-β-内切葡聚糖酶(Streptomyces davawensis JCM 4913)具有85％的较高相似性，可推断克隆的保守序列所在的基因属于1,4-β内切葡聚糖酶基因。

6、TAIL-PCR克隆内切葡聚糖酶基因保守序列的上下游基因

(1)TAIL-PCR是为了得到Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列上游和下游的基因，使用PrimerPremier 5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据TouchdownPCR产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性引物(Upstream primer，简称USP)和下游特异性引物(Downstream primer，简称DSP)各有3个嵌套的引物用于TAIL-PCR的三轮反应。同时设计出7对随机引物(Arbitrarydegenerate primer，简称AD)。保守序列和引物序列见表1。引物送去合成后，即可进行下一步实验。

表1 Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列的用于TAIL-PCR的引物

名称	序列(5′-3′)
		H31-USP1	AGCATCTCCTACGGCTACGTGC；
H31-USP2	ACGGGCAGCAACGGCAC；
		H31-USP3	CCATCACGAGCTGGAGCTTCG；
H31-DSP1	GCACGTAGCCGTAGGAGATGCT；
		H31-DSP2	GGCGAACAGTTGGTGTAGTGGC；
H31-DSP3	GTGTAGTGGCAGCCGTTGAAGA；
		AD1	NTCGASTWTSGWGTT；
AD2	NGTCGASWGANAWGAA；

AD3	WGTGNAGWANCANAGA；
		AD4	TGWGNAGWANCASAGA；
AD5	AGWGNAGWANCAWAGG；
		AD6	CAWCGICNGAIASGAA；
AD7	TCSTICGNACITWGGA；

(2)TAIL-PCR克隆上游基因

使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：

然后按照以下条件进行第一轮TAIL-PCR反应：

第二轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第一轮反应的PCR产物用ddH₂O稀释100倍后作为模板DNA，USP1换为USP2，反应条件如下：

第三轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的PCR产物用ddH₂O稀释100倍后作为模板DNA，USP2换为USP3，反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第二轮、第三轮PCR产物进行检测。

通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物AD1、AD2、AD3及AD4进行TAIL-PCR，克隆出Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列的上游基因，其PCR产物电泳图如图3所示。从图3中可以看出，经过3轮PCR，此时泳道2、4出现了明显条带，大小约为400bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。

经过测序，Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如下(425bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

(3)TAIL-PCR克隆下游基因

反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性引物。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第二轮、第三轮PCR产物进行检测。

通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物AD1、AD2、AD3及AD4进行TAIL-PCR，克隆出Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列的下游基因，其PCR产物电泳图如图4所示。从图4中可以看出，经过3轮PCR，此时泳道2、8出现了明显条带，大小约为250bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列下游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。

经过测序，Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如下(227bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

7、获得Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因全长序列

根据TAIL-PCR克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶完整的酶基因序列。其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

中性内切葡聚糖酶基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAG结束，共包括762个核苷酸。其中，前11个核苷酸为信号肽编码序列。

中性内切葡聚糖酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

经DNAssist Version 2.2软件分析得到，中性内切葡聚糖酶基因开放阅读框编码253个氨基酸，其中，前11个氨基酸为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Ala¹¹位点被切除。因此，成熟的酶蛋白，共计242个氨基酸，其理论分子量(MWt)为25.51kD，与分离得到的天然酶蛋白分子量一致；酶蛋白的等电点(pI)4.84。

将该氨基酸序列在NCBI数据库进行比对(BLAST)，发现该氨基酸序列与同为12家族的内切葡聚糖酶(Streptomyces davawensis)具有最高的同源性，其相似性仅为84％，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的内切葡聚糖酶基因。

根据序列分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面的差异判断，中性内切葡聚糖酶基因为一新发现的内切β-1,4-内切葡聚糖酶基因。

实施例2

(一)材料

1、菌种。嗜碱链霉菌Streptomyces sp.H31菌株(CCTCC No：M 2015003)。宿主菌E.coli BL21 Star(DE3)、E.coli TOP10F′均购自Invitrogen公司；

2、载体。大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(Novagen，Kan^R)购自Novagen公司。

3、培养基及缓冲液

(1)选择培养基：10g/L CMC-Na(羧甲基纤维素钠)，5g/L酵母粉，5g/L NaCl，2g/LKH₂PO₄，5g/L NH₄NO₃，0.3g/L MgSO₄，1g/L(NH₄)₂SO₄，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0；培养温度为37℃。

(3)TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0。

(4)碱裂解液I、II、III(质粒提取)：碱裂解液I：葡萄糖50mmol/L，Tris-HCl(pH8.0)25mmol/L，EDTA 10mmol/L。每瓶约100mL，灭菌后4℃贮存。碱裂解液II：NaOH 0.2mmol/L，SDS 1％(w/v)。溶液不可贮存，现用现配。碱裂解液III：乙酸钾5mmol/L，冰乙酸11.5％(v/v)。

4、主要试剂。Acrylamide、N,N-甲叉双丙烯酰胺由Serva进口分装。DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA分子量标记、T4连接酶为宝生物公司产品；Lysozyme(DNase RNase non-detected，>70,000U/mg)、IPTG、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)为上海生工生物工程公司产品；蛋白分子量标记为Takara公司产品；PCR引物合成由上海生工完成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成；基因提取试剂盒、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Oemga公司产品。

5、仪器。Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies公司、DNA及蛋白电泳系统为Bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为PharmaciaBiotech公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品；Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。

(二)实验方法和结果

1、目的基因的分离。采用PCR的方法从Streptomyces sp.H31菌中分离目的基因。在37℃，220r/min摇瓶培养Streptomyces sp.H31菌，48h后离心收集菌体，然后利用TheE.Z.N.A Bacterial DNA Kit试剂盒提取基因组总DNA。根据目的基因的全长序列，设计引入Hind III和EcoR I酶切位点(下划线)的PCR引物：

所述的PCR的所用的引物的序列：

所述的PCR的反应体系为：

采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

反应完成后，取8μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。由于大肠杆菌表达载体pET-28a(+)可使目的蛋白实现胞内表达，因此在设计PCR引物时按照H31蛋白的编码序列进行设计。由图5可见，PCR扩增产物的大小为762bp，与含信号肽编码序列的H31基因大小相符。将PCR产物回收、连接、转化并送Invitrogen公司进行测序鉴定。测序结果表明所扩增的序列与含信号肽编码序列的目的基因的序列一模一样。

2、重组质粒的构建

将克隆得到的含信号肽编码序列的H31基因经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后与采用同样酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a(+)连接，得到重组质粒pET-28a-H31。

连接反应体系如下：

16℃水浴中连接过夜后转化感受态细胞(连接反应中基因和质粒的摩尔比为9：1)。

3、E.coli TOP10F′和E.coli BL21 Star(DE3)感受态细胞的制备

(a)接种E.coli TOP10F′和E.coli BL21 Star(DE3)至LB培养基中，240r/min、37℃培养过夜；(b)吸取0.1mL菌液至10mL LB培养基中，300r/min、37℃培养至OD600达0.5～0.7；(c)吸取1mL OD600达0.5～0.7的菌液至1.5mL离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；(d)加入100μL冰预冷的SSCS(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成感受态细胞。可立即转化或于-70℃冻存。

4、转化E.coli TOP10F′感受态细胞

(a)10μL连接产物与100μL感受态细胞混匀，冰浴30min；(b)42℃水浴90秒，冰浴2min；(c)加入1mL LB培养基，混匀，37℃180r/min温浴1h；(d)3000r/min离心1min，吸底部沉淀200μL至LB(含选择抗生素Kan，终浓度为50μg/mL)平板，用涂布器涂匀，37℃培养过夜。同时做两个对照：

对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。

对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上。

5、转化子的培养及检测

(a)转化16h后，观察实验组的平板，看是否长出菌落(没有的话就继续培养或者重新做转化)，然后用标记笔在培养皿的背面该菌落处划上圆圈，并标记“1”、“2”等数字，以便识别；

(b)在无菌条件下，向试管中加入5mL LB液体培养基，然后再往其中加入5μL的1000×氨苄青霉素溶液，使其终浓度为100μg/mL。随后在试管上标记“1”、“2”等数字；

(c)利用接种环，小心地将相应数字编号的菌落挑落进相应的试管中，混合均匀；

(d)将试管放入温控摇床，37℃、200rpm振荡培养16～24h；

(e)16h后，观察试管中的LB液体培养基是否变混浊(若无菌生长就继续培养或者重新转化)，在无菌条件下，在两个洁净的EP管中分别加入500μL的菌液和500μL 60％的甘油，混合均匀，并标记相应的数字，然后用封口膜将EP管封好，其中一管用于保留菌种之用，另一管为测序做准备，将两个EP管都放入-80℃贮存，剩余的菌液放入4℃冰箱中保存备用；

(f)利用菌液PCR的方法进行检测。

模板用1μL菌液代替，用上游引物EcoR I和下游引物Hind III进行PCR反应，再将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，将阳性克隆菌株经鉴定后甘油保存，送公司进行测序。

6、重组质粒的中量制备

使用Omega Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒，制备重组质粒，步骤如下：

(a)挑取抗性平板上的重组菌落至50mL LB(含选择抗生素Kan，终浓度为50μg/mL)液体培养基中，200r/min、37℃培养过夜。(b)将1～5mL培养液12000r/min离心3min，弃上清，收集菌体。(c)将菌体加入250μL冰预冷的裂解液Ⅰ中，剧烈振荡，将细胞完全打散；(d)加入250μL裂解液Ⅱ，轻柔反复颠倒数次(切勿涡旋振荡)后，室温静置2min；(e)加入350μL裂解液Ⅲ，盖紧管口，立即颠倒数次，直至出现白色絮状沉淀；(f)微量离心机12000r/min、4℃冷冻高速离心5min，上清液移至另一离心管中；(g)将离心管置入离心机，12000r/min、室温离心10min；上清转入一支新管中；(h)将试剂盒中的Akibaiin Column安置于CollectionTube中；(i)将离心管中的上清液转移至Akibaiin Column中，注意别吸入沉淀，12000r/min离心1min，弃去滤液；(j)加入500μL HB Buffer至Akibaiin Column中，12000r/min离心1min，弃去滤液；(k)加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min，弃去滤液；(l)重复加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min，弃去滤液；(m)再用12000rpm离心2min以除尽剩余的Wash buffer；(n)将Akibaiin Column放入一个洁净的EP管中，然后在Akibaiin Column膜的中央处加入30～50μL的Elution Buffer，室温放置2min，10000rpm离心1min将重组质粒pET-28a-H31抽提下来。采用1％琼脂糖凝胶电泳对质粒回收产物进行双酶切鉴定，结果如图6所示。重组质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切得到大小为5.37kb和762bp的片段，分别对应于pET-28a(+)和含信号肽编码序列的H31基因的大小。同时，将重组质粒送Takara公司进行测序，测序结果显示重组质粒所携带的基因为目的基因。

7、E.coli BL21 Star(DE3)的转化

(a)将从重组E.coli TOP10F′中提取的质粒100μg与100μL感受态细胞混匀，冰浴30min。42℃水浴90秒，冰浴2min。(b)加入1mL LB培养基，混匀，37℃、180r/min温浴1h。(c)3000r/min离心1min，吸底部沉淀200μL至LB(含选择抗生素Kan，终浓度为50μg/mL)平板，用涂布器涂匀，37℃培养过夜。

经过筛选后得到可以高效表达的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21 Star(DE3)-H31。从E.coli BL21 Star(DE3)-H31菌株中提取质粒为模板，用上游引物EcoR I和下游引物Hind III进行PCR反应，将PCR产物回收、连接、转化并送Invitrogen公司进行测序鉴定。测序结果表明重组质粒所携带的基因序列与含信号肽编码序列的目的基因的序列一模一样。可见，pET-28a-H31重组质粒已经成功转入E.coli BL21 Star(DE3)。

8、重组大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)的诱导表达

(a)将筛选得到的阳性菌株E.coli BL21 Star(DE3)-H31接种到装有5mL LB培养基中培养过夜。(b)取过夜培养菌液100μL接种到装有20mL LB培养基的250mL摇瓶中培养。(c)待OD值达到0.6时加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导。(d)于37℃诱导30小时后进行取样的。取1mL发酵液离心，去除上清液加入100μL pH 8.8Tris-HCl缓冲液，重悬后液氮反复冻融使细胞破碎，10000r/min高速离心2min后取上清液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(结果见图7泳道2)。

9、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

以Sambrook等的实验方法为基础，分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％，电极缓冲液为pH 8.3Tris-Gly缓冲液，考马斯亮蓝染色。

(a)聚丙烯酰胺凝胶的配制

分离胶的配制：

浓缩胶的配制：

(b)将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15～30min；

样品处理：将样品加入等量的2×Loading buffer，100℃加热3～5min，煮沸完毕后，立即放入到冰浴或者冷水中，使其冷却。然后12000rpm离心10min，取上清作分析；

(c)上样：将15μL样品加入到孔道中，并在其中一个孔道中加入5μL的预染蛋白Marker；

(d)电泳：在电泳槽中加入电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止；

(e)染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4～6h；

(f)脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图7所示，可见到分子量约为27KD的明显条带，表明Streptomyces sp.H31中性内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到高效表达。并且在培养液中能检测到内切葡聚糖酶酶活性。

10、重组中性内切葡聚糖酶H31的分离纯化

将筛选得到的阳性菌株E.coli BL21 Star(DE3)-H31接种到50mL LB培养基中培养，待OD值达到0.6时加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，于37℃诱导30小时，收集发酵液；将发酵液离心，去除上清液加入pH 8.8Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl缓冲液与发酵液的体积比为1:10)，重悬后液氮反复冻融使细胞破碎，10000r/min高速离心2min后去沉淀即得粗酶液。

将粗酶液用3000道尔顿超滤浓缩膜进行浓缩10倍，再用0.45μm滤膜进行抽滤，然后用亲和层析(HisTrap FF crude层析柱，GE公司)进行蛋白分离纯化，最后用3000道尔顿超滤浓缩膜进行浓缩10倍后，即得镍柱纯化蛋白。

镍柱纯化的中性内切葡聚糖酶H31经SDS-PAGE电泳(见图7泳道3)，得到纯的单一条带，分子量大约为32KDa，与重组蛋白理论值(31.22KDa)一致。其中，重组蛋白理论值31.22KDa是中性内切葡聚糖酶H31的分子量27.4KDa加上表达载体表达的36个氨基酸分子量3.838KDa。

实施例3重组中性内切葡聚糖酶H31的酶学性质研究

(一)试验方法

1、最适反应pH及pH稳定性

取适量实施例2获得的重组中性内切葡聚糖酶H31的镍柱纯化蛋白，分别加入不同pH值的1％CMC-Na溶液，按常规方法测定酶活力。同时，分别将镍柱纯化蛋白置于不同的预定pH条件下保存30min，再按常规方法于pH 7.0条件下测定其酶活力。

2、最适反应温度和温度稳定性研究

取适量实施例2获得的重组中性内切葡聚糖酶H31的镍柱纯化蛋白，分别置于不同温度条件下反应30min，测定其酶活力。同时，将镍柱纯化蛋白分别置于不同的温度条件下(30℃～80℃)保温30min，然后于50℃反应30min测定其酶活力。

3、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响

取适量实施例2获得的重组中性内切葡聚糖酶H31的镍柱纯化蛋白，分别置于终浓度为10mM的各种金属离子以及不同浓度的表面活性剂SDS和金属螯合物EDTA后，按照常规方法测定其酶活力。

(二)实验结果

1、最适反应pH。分别取1mL pH分别为2、3、4、5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12的反应底物加入100μL的镍柱纯化蛋白在45℃下分别温浴，然后测定酶活，考察酶活力的最适pH。从图8中可以看出中性内切葡聚糖酶H31在pH5～9.5酶活大于50％，其中在pH为7时，酶活达到最大值；在酸性pH2～4与强碱性pH为12时，中性内切葡聚糖酶H31基本没有活性。

2、pH稳定性。分别取1mL pH为2、3、4、5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12的缓冲液加入100μL的镍柱纯化蛋白在37℃下分别温浴60min，然后加入一定量的反应底物在45℃反应30min，测定酶活，考察中性内切葡聚糖酶H31的pH的稳定性。从图9中可以看出中性内切葡聚糖酶H31在pH3～11的条件下，酶活都大于50％；在pH2时，酶活低于40％，在强碱性pH12时，中性内切葡聚糖酶H31的活性低于10％。综上所述，中性内切葡聚糖酶H31在pH3～11的条件下能保持一定的活性，pH稳定性的范围较大。

3、最适反应温度。重组中性内切葡聚糖酶H31在温度为60℃条件下，表现出最适的酶活性。在50℃到65℃条件下，剩余酶活力都能保持超过70％。结果见图10。

4、温度稳定性。从结果图11可以看出，该酶在低于50℃的条件下温育60min，绝大部分酶活力还是保持不变，而当温度高于50℃后，该酶的温度稳定下急速下降。在55℃，剩余酶活力还有60％。60℃以后，剩余酶活力几乎没有了。可以推断出，该酶的温度稳定性一般。

5、金属离子对酶活力的影响。取900μL的反应底物加入20μL终浓度为10mmol/L的金属离子及40μL的镍柱纯化蛋白，然后测定酶活，考察金属离子对中性内切葡聚糖酶H31活力的影响。从图12可以看出，Mn²⁺对酶的活力基本无影响；Co²⁺、Na⁺、Li⁺、Cu²⁺、Sn²⁺、Ag⁺对酶活有微弱的促进作用；而Ni²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、K⁺对酶活有明显的促进作用；Al³⁺、Mg²⁺和Fe³⁺对酶活则是抑制作用，其中Fe³⁺对酶活的抑制作用尤其明显。

6、表面活性剂SDS和金属螯合物EDTA对酶活力的影响

从表2可以看出，SDS浓度低于0.1％时，其作用对于内切葡聚糖酶的酶活性影响不大，而当SDS浓度高于0.2％以后，内切葡聚糖酶的酶活性被抑制的程度高。然而，高浓度金属螯合剂EDTA对该内切葡聚糖酶的酶活性几乎没有影响作用。这说明，该内切葡聚糖酶不是一种金属酶，并且在洗涤及造纸工业中有非常广泛的应用价值。

表2 SDS和EDTA对重组中性内切葡聚糖酶H31蛋白的影响

活性剂	浓度	相对酶活性(％)
			对照	-	100
SDS	0.01％	99.36
			SDS	0.05％	95.87
SDS	0.1％	92.38
			SDS	0.2％	59.21
SDS	0.5％	54.74
			EDTA	0.2％	99.16
EDTA	0.5％	98.03

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种中性内切葡聚糖酶H31，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

2.编码权利要求1所述的中性内切葡聚糖酶H31的基因，其特征在于：所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

3.一种含有权利要求2所述的基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：权利要求2所述的基因被插入至pET-28a(+)载体中。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：权利要求2所述的基因被插入至pET-28a(+)载体中的EcoR I和Hind III酶切位点之间。

7.一种中性内切葡聚糖酶H31的菌株，其特征在于：是将权利要求2所述的基因构建成载体后转染到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 Star(DE3)得到。

8.根据权利要求7所述的表达中性内切葡聚糖酶H31的菌株，其特征在于：所述的载体为权利要求3～6任一项所述的表达载体。

9.根据权利要求7或8所述的表达中性内切葡聚糖酶H31的菌株，其特征在于包括如下步骤：

用PCR方法从嗜碱链霉菌(Streptomyces sp.)H31的基因组DNA中克隆出权利要求2所述的中性内切葡聚糖酶H31基因的酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a-H31，并转化大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)菌株；经过筛选后得到表达所述的中性内切葡聚糖酶H31的菌株E.coli BL21 Star(DE3)-H31。

10.权利要求1所述的中性内切葡聚糖酶H31在洗涤及造纸工业中的应用。